WO1996034115A1 - Tampon et methode d'evaluation des conditions optimales d'amplification de sequences cibles d'acide nucleique, et leurs applications - Google Patents

Tampon et methode d'evaluation des conditions optimales d'amplification de sequences cibles d'acide nucleique, et leurs applications Download PDF

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WO1996034115A1
WO1996034115A1 PCT/FR1996/000642 FR9600642W WO9634115A1 WO 1996034115 A1 WO1996034115 A1 WO 1996034115A1 FR 9600642 W FR9600642 W FR 9600642W WO 9634115 A1 WO9634115 A1 WO 9634115A1
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amplification
nucleic acid
temperature
buffer
agent
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Application number
PCT/FR1996/000642
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Inventor
Brigitte Fouque
Robert Teoule
Original Assignee
Cis Bio International
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction

Definitions

  • the present invention relates to an amplification buffer, facilitating the denaturation of nucleic acids, while preserving the structure of the enzymes used and significantly improving the performance of the amplification chain reaction, as well as its applications, in particular in a method for amplifying target nucleic acid sequences using several temperatures and in a method for evaluating the optimal conditions to be used in said amplification method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the PCR technique consists in performing n successive amplification cycles, during which two primers direct the amplification of the double-stranded DNA sequence which they frame.
  • a PCR amplification cycle essentially comprises 3 distinct steps:
  • Te generally between 60 ° C and 75 ° C ; under these conditions, each single strand of DNA gives rise to a double strand of DNA.
  • this step is carried out with Taq DNA polymerase, it is generally carried out at 72 ° C.
  • a "standard" PCR reaction is carried out in a volume of 50 or 100 ml and, in addition to the DNA sample to be amplified, contains an amplification buffer including: KCl 25-50 mM, Tris-HCl 10-20 mM (pH 8.4, at room temperature), 1.5 mM MgCl 2, gelatin 100 mg ml, 10-100 pmol of each primer, each of the 4 deoxyucleotide triphosphates (dNTPs) at a concentration between 125 and 200 mM and 2, 5 units of Taq DNA polymerase. A few drops of oil are generally added, in order to avoid in particular the evaporation of the buffer.
  • the cycles are generally carried out as follows:
  • PCR then allows the use, under suitable conditions, of all the n-cycle neosynthesized sequences as matrices for DNA polymerase at the n + 1 cycle.
  • This results in an exponential amplification of the number of target nucleic acid sequences, as a function of the number of cycles; during this amplification, the quantity of target sequences obtained can be linked to the quantity Qo of initial target sequences, to the amplification factor x and to the number of cycles n, by the formula Q Qo (l + x) n .
  • thermostable enzymes Although more thermostable enzymes have been proposed to replace Taq DNA polymerase, the disadvantage of using high denaturation temperatures remains; the use of very high temperatures and initial denaturation times ranging from 1 to 7 min at pH 7.0-8.0 is incompatible with good conservation of the DNA matrix and significant degradations of the biopolymer are observed, which prevent the amplification of very long DNA chains (CE. GUSTAFSON et al., Gene, 1993, 123, 241-244);
  • Tm melting temperature
  • concentration in duplex in accordance with the theoretical calculation of the hybridization of the nucleic acid duplexes by the thermodynamic method of BRESLAUER et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 3746-3750); there is therefore a theoretical limitation to hybridization, due to the amount of duplexes formed, regardless of the amounts of enzyme or nucleoside triphosphates present in the amplification buffer. Consequently, as stated above, the quantity of DNA produced is limited to a few tens of mg / ml.
  • thermostable cannot be incorporated into the amplification primers; however, for various reasons (fixing on supports, detection markers), it may be advantageous to work at lower temperatures (fixing of biopolymers, of heat-sensitive molecules for fixing or detection, etc.).
  • Th the self-matching of fragments of the same strand is a source of bad apartments between the primers and the matrix and of copying stops, which leads in particular to link the presence of secondary structures and the obtaining of several bands, after electrophoresis, whereas if the amplification is specific, a single product consisting of DNA double strand of the desired length should be produced and therefore only one band should be observed in electrophoresis.
  • Tri Th and Te - most commercial thermal cyclers do not provide uniform temperature in the various wells. This affects the reproducibility of the amplification and this is one of the reasons why it is difficult to make quantitative measurements with PCR.
  • thermostable DNA polymerases one having 3 '- 5' - exonuclease activity in the amplification buffer
  • the Applicant has set itself the goal of providing an amplification buffer and a method for amplifying target nucleic acid sequences, which limit the drawbacks specified above, in particular in that: the step of denaturing the DNA duplexes can be carried out at a temperature Td lower than that which is commonly used (94 ° C.) for PCR,
  • the denaturation of the initial DNA duplexes or obtained by the DNA polymerase can be carried out completely, whatever their length or their natural content in (G + C), without serious damage to the stability of the DNA polymerase and / or the integrity of the DNA template, and
  • the production of these DNA fragments opens in particular multiple applications, both in the field of genetic research and genome sequencing as in the field of diagnosis and therapy.
  • the subject of the present invention is a buffer, capable of being used in a method for amplifying at least one target nucleic acid sequence, of the type comprising n cycles, each of said cycles including a step of denaturing the sequence double-stranded target, carried out at a denaturation temperature Td, a hybridization step between the single-stranded target sequence and at least one appropriate primer, carried out at a hybridization temperature Th and a stage of elongation of l primer having hybridized, in the presence of a nucleic acid elongation enzyme and at an elongation temperature Te, which buffer is characterized in that it comprises, in addition to the constituents of a standard amplification buffer, a mixture of at least one isodestabilizing agent (AI) and at least one denaturing agent (AD), present at concentrations capable of reducing the melting temperature Tm of the target double-stranded nucleic acid sequence, even to formula 4 below:
  • AI isodestabilizing agent
  • AD denaturing agent
  • Tm (° C) 81.5 + 0.41 (% G + C) - ⁇ TmAi-675 N + 16.6.1ogM- ⁇ TmAD (formula 4), in which: G + C), (molarity of AI)] (formula 1),
  • ⁇ TmA D d (% denaturing agent) (formula 3), M: molarity of the monovalent cation (s) present in the buffer, N: number of nucleotides, and d: coefficient of efficacy of the denaturing agent (AD), for at least reducing the denaturation temperature Td of said target sequence of double-stranded nucleic acid, while allowing the enzymatic reaction of primer elongation to function properly.
  • AD coefficient of efficacy of the denaturing agent
  • the isodestabilizing agent and the denating agent cooperate (synergistic action), in the zones of defined concentrations, to decrease the melting temperature Tm; this decrease has the effect of reducing the maximum temperature of the amplification cycle Td (or denaturation temperature) and preferably, both the maximum temperature of the amplification cycle Td and the minimum temperature of the amplification cycle Th (or hybridization temperature).
  • said isodestabilizing agent (AI) is a substance whose main characteristic is to reduce the apparent stabilizing influence of base pairs (G + C) on the Tm of the nucleic acids.
  • said denaturing agent is a substance which decreases the melting temperature of a DNA fragment in proportion to its percentage in solution, almost independently of the nature of the bases which compose it. .
  • the melting temperature of a DNA duplex of great length (that is to say greater than 1 kb) is calculated approximately by the following empirical formula:
  • M molarity of the monovalent cation (s) present in the buffer (generally Na and / or),
  • N number of nucleotides
  • d coefficient of efficacy of the denaturing agent (AD), generally between 0.25 and 0.7.
  • the Tm is an average data.
  • the fusion of a large segment of DNA occurs locally in areas of a few tens to a few hundred base pairs, as can be observed with the electron microscope.
  • the zones which remain hydrated are the zones which are rich in G + C base pairs. Those where the single strands are separated are rich in A + T.
  • the classical hyperchroism curves do not allow to detect if 1% of DNA remains hybrid, that is to say if the two single-stranded DNA molecules remain physically attached by a small fraction of bases still hybridized.
  • the isodestabilizing agent decreases the value of Tm by an amount ⁇ Tm and, consequently, the apparent value of the coefficient 0.41 which enters into the expression of Tm.
  • the iso ⁇ destabilizing agent is selected from the group consisting of alkylammonium halides, dipolar ions (zwitterions) and trialkylamine N-oxides.
  • the zwitterion is preferably N, N, N trimethylglycine; the alkyl group is preferably at least C 2 .
  • the denaturing agent is selected from the group consisting of dimethylsulfoxide (DMSO), glycerol, formamide, dimethylformamide (DMF), ureides, polyols and detergents.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • glycerol glycerol
  • formamide dimethylformamide
  • DMF dimethylformamide
  • ureides polyols and detergents.
  • said mixture consists of N, N, N trimethylglycine (AI) and DMSO (AD).
  • the concentration in N, N, N trimethylglycine is between 0.05 and 4 M, preferably between 1 and 2.5 M, and the DMSO concentration is between 0.5 and 15%, preferably between 5 and 10%.
  • the concentration of N, N, N trimethylglycine is 1.5 M and the concentration of DMSO is 5 to 10%.
  • the decrease in Tdmin is greater than 10 ° C for 10% DMSO, added to N, N, N trimethylglycine 1.5 M.
  • said mixture consists of N, N, N trimethylglycine (AI), DMSO (AD) and glycerol (AD).
  • the concentration in N, N, N trimethylglycine is between 0.05 and 4 M, preferably between 1 and 2.5 M, the concentration of DMSO is between 0, 5 and 15%, preferably between 5 and 10% and the glycerol concentration is between 1 and 30%, preferably between 3 and 20%.
  • the buffer according to the invention very effective for denaturing sequences rich in (G + C), can advantageously be used in a process for chain amplification of at least one target nucleic acid sequence.
  • said buffer is advantageously used, and this in a nonlimiting manner:
  • standard amplification buffer means, for example: Tris-HCl 10 mM, pH 8.5, KCl 50 mM, MgCl 1.5-2.5 mM , mixture of the 4 deoxynucleotides, primers and Taq DNA polymerase, at different concentrations, depending on the case.
  • the amplification buffer according to the invention a) specifically facilitates the denaturation of zones rich in G + C, thanks to the isodestabilizing agent, allows the amplification of long fragments and / or with a high G + C content, which it would be impossible to amplify or amplify as effectively, in conventional buffers, with or without denaturing agent.
  • the denaturation of the amplification duplexes by heating to the maximum temperature of the PCR cycle is imperfect, that is to say if the simple chains produced remain attached by a small fraction of base pairs with high G content + C, the reclosing of the duplex during the cooling necessary for the hybridization of the primers will occur in a few seconds, even a few fractions of seconds (FIG. 1). In this case, the hybridization of the primers will be minimal because they will be rejected by the closure of the duplex before being sufficiently extended and thus stabilized by DNA polymerase. If single strands of long DNA are physically well separated, the initial nucleation, i.e.
  • the correct recognition and hybridization of a small part of the sequence between the two simple chains is the step limiting which governs their hybridization and it requires several minutes.
  • the molar concentration of the primers is thousands or even millions of times higher than that of the single strands of the amplification matrix, the probability of recognition between the primers and the single strand matrix is very high and the PCR reaction is very effective. .
  • b) also facilitates in a non-specific manner, that is to say independently of the nature of the bases, the denaturation of the DNA duplexes, by virtue of the denaturing agents and allows the synergism of the specific and non-specific effects to be greatly reduced the maximum and minimum temperatures Td and Th of the PCR cycle, c) sometimes makes it possible to improve the specificity of amplification by reducing or even eliminating the parasitic bands, d) makes it possible to achieve higher final yields of volume amplification, since the denaturation temperature of the duplexes increases with their concentration, e) improves the reproducibility and reliability of the PCR, by increasing the temperature range for denaturation of the duplexes, since the decrease in the limit temperature is considerable (in a typical experiment, it decreases by around 10 ° C: from 92.5 ° C to 82 ° C).
  • Said buffer can in particular be used in a polymerase chain reaction (PCR) method, comprising n cycles, each of said cycles including a step of denaturing the double-stranded target sequence, carried out at a denaturation temperature Td, a step of hybridization between the target single-stranded sequence and at least one suitable primer, carried out at a hybridization temperature Th and a step of elongation of the hybridized primer, in the presence of at least one DNA polymerase and at an elongation temperature Te.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the target nucleic acid sequence comprises more than 100 bases, preferably more than 1000 bases and / or has a high content of G + C bases.
  • such an embodiment of the method according to the invention presents a selection of conditions (primers of more than 30 seas and amplification buffer containing at least one isodestabilizing agent and optionally a denaturing agent) which, in synergy, cooperate for, simultaneously:
  • Said buffer can also be used in a method of chain amplification by ligase (LCR) or by ligase with repair.
  • LCR ligase
  • the present invention also relates to a method for evaluating the optimal conditions to be used in an amplification process as defined above, characterized in that it comprises the drawing of the temperature diagram defining the domains of Td and Th (maximum and minimum temperature of the amplification, PCR in particular), in accordance with the following steps:
  • Tdmin minimum denaturation temperatures
  • Tdmin j represents the value of the minimum denaturation temperature for a concentration XJ of denaturing agent and for the concentration y n chosen in isodestabilizing agent in step (2)
  • Tdo represents the value of the minimum denaturation temperature in the absence of additive (destabilizing agent or denaturing agent)
  • a represents the slope of the straight line and - the curve of maximum priming hybridization temperatures (Thmaxi), as a function of the concentration of denaturing agent x_ and for the concentration y n selected in step (2) of isodestabilizing agent (FIG. 2);
  • the amplification is carried out at two temperatures (Th ⁇ Te and Td), in a standard buffer, possibly containing other additives, on a series of samples comprising increasing concentrations x of denaturing agent (or iso ⁇ destabilizing agent) , see also concentrations Y n as defined above).
  • concentrations x of denaturing agent or iso ⁇ destabilizing agent
  • concentrations Y n as defined above.
  • denaturing agent makes it possible to act on two essential parameters of the amplification: a) the melting curve of the duplexes of the biological target, formed by the copies made with DNA polymerase (percentage of DNA single-stranded as a function of temperature) ( Figure 2).
  • the addition of denaturing agent to the PCR amplification buffer makes it possible to obtain suitable denaturation of the target duplexes at a temperature below that which is necessary with an ordinary buffer.
  • the concentration of denaturing agent and / or the denaturing temperature Td must be sufficient for a given concentration xl of denaturing agent.
  • the minimum limit value xl of the denaturing agent concentration corresponds to a minimum limit value of the denaturation temperature Tdmini (FIG. 2).
  • Tdmin which defines the minimum denaturation temperature, as a function of the concentration of a given denaturing agent and for a given sequence of DNA to be amplified.
  • the straight line Tdmin relates only to the phenomenon of denaturation of the DNA duplexes initial or formed by matrix copy. There is no interference with the processes of elongation or hybridization of the primers.
  • the straight line Tdmin does not depend on the nature of the primers, b) the hybridization curve of the primers (percentage of double-stranded DNA formed between the template and the primer, as a function of the temperature (FIG. 2)
  • the primers For there to be amplification, the primers must be able to hybridize on the simple DNA chains.
  • Th the concentration of the denaturing agent must not be too high because that it would prevent hybridization.
  • the maximum limit value of the concentration x2 of denaturing agent corresponds to a maximum limit value of the temperature of hybridization of the primers, Thma. ⁇ 2 .
  • Thmax which defines the maximum hybridization temperature of the primers as a function of the concentration of the denaturing agent. It is observed that Thmax is approximately parallel to Tdmin (denaturing agents). In the case of isodestabilizing agents Thmax is still a straight line, but it diverges with respect to Tdmin when x increases (see examples).
  • the hybridization temperature of the primers Th must be close to Thmax. At too low temperature, the saturation of the target sites by the primers is very high, but the specificity is lower. c) the concentration of denaturing agent that can be added is limited.
  • the denaturing agent (DMSO, formamide) is an inhibitor of DNA polymerase. At a very small amount (1%), it can facilitate the unfolding of the self-complementary regions rich in G + C and thus allow a better copy of the matrix. Quickly the inhibitory effect becomes preponderant.
  • DMSO at the concentration of 10% inhibits DNA synthesis by 53%, when Taq DNA polymerase is used at a temperature of 70 ° C.
  • the inhibition increases to 89%.
  • the elongation reaction of the primers is preferably carried out at a temperature Te close to the optimal operating temperature of the DNA polymerase. The copy time is adjusted to the speed of the enzymatic polymerization under the experimental conditions selected.
  • This speed is expressed in number of bases / minute. For example, if the speed is 1000 bases / min, it will take at least 4 minutes of elongation to amplify a 4 kilobase segment. e) The choice of optimal PCR operating temperatures is possible and easy, from the lines Tdmin and Thmax ( Figure 3).
  • Te is close to the optimum operating temperature of the DNA polymerase, for example 70 ° C. to 72 ° C. with Taq DNA polymerase.
  • PCR is a complex method and simply from the melting curves of duplexes or primers and, a fortiori from the knowledge of Tm, only the favorable effect or the inhibitory effect of a molé ⁇ cule on amplification.
  • the present invention also relates to a method for detecting at least one target nucleic acid sequence, implementing at least one amplification step by a chain amplification method, in the presence of suitable primers. and a hybridization step with a suitable probe, which method is characterized in that during the amplification step, a buffer in accordance with the invention is used.
  • the target nucleic acid sequence comprises more than 100 bases, preferably more than 1000 bases and / or has a high content of G + C bases
  • two primers carrying a fixing factor are used to detect the presence of the nucleic acid sequence amplified.
  • this double chain is denatured in the presence of a buffer in accordance with the invention, and the single-strands fixed on a solid support, then a probe carrying a detection marker is added.
  • the signal is improved for sequences that are difficult to denature.
  • the binding factor is biotin or a hapten and the detection is fluorescent, colorimetric or luminescent.
  • a buffer as defined above in a PCR amplification method, for example, makes it possible: - to amplify fragments having lengths of several tens of kb; therefore, whole viruses or plasmids can be amplified. This will make it possible to characterize and study them much more easily and in particular to facilitate the study of mutants of therapeutic and diagnostic interest.
  • viruses of the herpes family which contain sequences very rich in G + C, can be more easily amplified.
  • the fragments of some 30 to 40 kb which are unclonable can be obtained by amplification with oligonucleotides corresponding to the border sequences.
  • the primers of the J and cro genes can be used to amplify the inserts in almost all phage 1-based vectors.
  • the cosmid inserts can be amplified.
  • FIG. 1 illustrates the advantage, for PCR, of isodestabilizing agents which facilitate the denaturation of zones rich in base pairs (G + C),
  • FIG. 2 represents the plotting of the lines of minimum denaturation temperature of the Tdmin duplexes and of the lines of maximum temperature of hybridization of the Thmax primers, as a function of the quantity of denaturing agent or isodestabilizing agent,
  • FIG. 3 represents the areas of operation of the PCR as a function of the concentration of additive (denaturing or isodestabilizing),
  • - Figure 4 shows the curves of Td and Th determined for the amplification of a fragment of 870 bp (SEQ ID No: 1) with primers 50 bases in length in a medium containing N, N, N -trimethylglycine at different concentrations
  • - Figure 5 shows the Td and Th curves determined for the amplification of a fragment of 870 bp (SEQ ID No: 1) with primers 50 bases in length in a medium containing DMSO at different concentrations
  • FIG. 6 represents the Td and Th curves determined for the amplification of a fragment of 870 bp (SEQ ID No: 1) with primers 50 bases in length in a medium containing glycerol at different concentrations,
  • FIG. 7 shows the curves of Td and Th determined for the amplification of a fragment of 870 bp (SEQ ID No: 1) with primers 50 bases in length in a medium containing N, N, N -trimethylg_ycin 1.5 M and DMSO at different concentrations
  • FIG. 8 represents the curves of Td and Th determined for the amplification of a fragment of 810 bp, included in SEQ ID No: 1, with primers of 20 bases in length in a medium containing N, 1.5 M N, N-trimethylglycine and DMSO at different concentrations
  • FIG. 9 illustrates the amplification of a Ha-Ras region of the human proto-oncogene c-Ha-Ras in the DNA of lymphocytes in the presence of different agents
  • - Figure 10 illustrates the amplification of a Ha-Ras region of the human proto-oncogene c-Ha-Ras in DNA extracted from different tumors, lymphocytes and an MDA cell line
  • - Figure 11 illustrates amplification of long, GC-rich fragments from Rhodobacter capsulatus DNA.
  • Figures 2 to 8 illustrate, for each amplification, the positive (+) or negative (0) results as a function of the temperatures and / or the concentration of denaturing and / or isodestabilizing agents. It should be understood, however, that these examples are given solely by way of illustration of the subject of the invention, of which they do not in any way constitute a limitation.
  • the amplified fragment (sequence A) is SEQ ID No: 1.
  • the primers used are oligonucleotides 50 bases in length, which surround the preceding fragment.
  • DNA polymerase to which are added the various agents (AI and AD) according to the invention, used at different concentrations.
  • the minimum acceptable amplification criterion was set as follows: the clearly visible appearance of a double-stranded DNA band after electrophoretic separation and revelation with ethidium bromide under UV irradiation, having the characteristics of length and of exact sequence after 40 amplification cycles. In order for the results to be perfectly consistent, the same DNA segment and the same primers are used. In the positive experiments which were carried out, the amplification of the target was greater than 100,000. To evaluate the effectiveness of the additives (AI and AD) on the chain amplification, a comparative study, according to four methods was carried out , with primers 1 and 2 and duplex A above:
  • Thmax is only plotted for the zone where Th is less than 83 ° C. since the enzymatic reaction of elongation of the primers is carried out at the temperature Te which is equal to Th (positive results: +; negative results: 0).
  • the amplification of the 870 bp fragment was studied for different concentrations of N, N, N trimethylglycine varying from 0 to 3 M.
  • the lines Tdmin and Thmax for N, N, N trimethylglycine alone were established by a series of amplifications the parameters of which are as follows: after a first denaturation of 5 minutes at 94 ° C., a series of 40 cycles of d amplification (denaturation 1 min 30 to ⁇ 94 to 85 ° C>, hybridization 1 min 30 to ⁇ 80 to 50 ° C>, elongation 1 min 30 to ⁇ 80 to 72 ° C>). These cycles are followed by an additional elongation of 5 minutes at the amplification elongation temperature. The amplification is then analyzed on 2% agarose gel in buffer.
  • TAE 40 mM Tris HCl pH 7.8, 5 mM sodium acetate, 1 mM EDTA
  • the length of the bands is checked in relation to length indicators (VUE marker by Boehringer Mannheim).
  • N, N, N trimethylglycine gave interesting results and the same methodology which was exposed to determine the Tdmin and Thmax curves was used to analyze the effect of N, N, N trimethylglycine.
  • the addition of N, N, N trimethylglycine to the amplification buffer made it possible to decrease the minimum PCR temperatures for denaturing (Tdmin) of the double-stranded DNAs and the maximum temperatures for hybridization of the primers (Thmax).
  • the line Tdmin can be traced with precision from 0 to 2.5 M and the line
  • Thmax (which is not parallel to Tdmin), only from 1 to 2.5 M. Below 1 M in
  • Amplifications were carried out in the presence of N, N, N trimethylglycine 1.5 M, standard amplification buffer and with variable concentrations of DMSO (from 0 to 18%), in parallel in the various wells of the thermal cycler.
  • the amplification conditions of each series are different: after an initial denaturation of 5 min at 94 ° C, 40 cycles are carried out (denaturation 1 min 30 for a series of temperatures ranging from 90 to 78 ° C, hybridization 1 min 30 for a series of temperatures ranging from 78 to 60 ° C and elongation 1 min 30 for temperatures ranging from 78 to 72 ° C). There follows a final elongation of 5 minutes at the elongation temperature.
  • electrophoretic separation is carried out on 2% agarose gel in TAE buffer.
  • the amplification bands are shown by fluorescence with ethidium bromide.
  • Negative amplification for a lower DMSO concentration corresponds to conditions where the denaturation temperature is lower than the temperature Tdmin; negative amplification for a higher DMSO concentration corresponds to conditions where the hybridization temperature is higher than Thmax.
  • N, N, N trimethylglycine alone, at a concentration of 1.5 M, in a non-optimized buffer, gives results very close to the glycerol 8% -DMSO 5% mixture (Tdmin 89 ° C and 88 ° C respectively, with duplex A of 870 base pairs and 0.67% in G + C and primers 1 and 2).
  • N, N, N trimethylglycine considerably reduces the influence on Tm of areas rich in (G + C) according to the equation ⁇ T (° C) which has been proposed. It is obvious that its local influence on the Tm of the DNA chain is all the greater the higher the content of (G + C) and consequently on the residual zones of pairing after the stage of denaturation carried out. at the temperature Td which condition a lot amplification of long fragments.
  • the addition of N, N, N trimethylglycine alone made it possible to carry out the amplification of mini-satellite sequences with very high G + C content of length close to 2 kb (see example 6) when it was not obtained with the addition of 10% DMSO. This means that the action of N, N, N trimethylglycine is more potent than DMSO in the segments with a very high G + C content and greater than what has been determined for the DNA fragment A.
  • N, N, N trimethylglycine does not seem to modify the properties of DMSO on PCR.
  • DMSO does not appear to be more inhibitory than if it were added to a buffer without additive. This opens up an extraordinary possibility for reducing the denaturation temperature of duplexes in PCR and, consequently, facilitating the amplification of large genes which very frequently have one or more regions with very high G + C content.
  • EXAMPLE 6 Amplification according to the invention, in the presence of short primers.
  • short primers denotes those which are currently commonly used in PCR, that is to say about twenty bases and a Tm of 50 ° C. to 63 ° C.
  • thermostable enzyme for example Taq DNA polymerase
  • the thermostable enzyme does not work properly until temperatures much higher than 70 ° C., it is impossible to carry out the elongation reaction of the primers at the same temperature as that of their hybridization.
  • An intermediate temperature Te must be inserted (around 72 ° C for Taq DNA polymerase).
  • the line Tdmin is the same as that obtained with the long primers, since it only depends on the duplex to be amplified.
  • the line Thmax is still parallel to Tdmin, but it is further from Tdmin than in the case of long primers.
  • the sequence A was amplified by PCR with probes 1 and 2 on the one hand, and probes 3 and 4.
  • EXAMPLE 7 Amplification of minisatellites in the presence of N, N, N trimethyl ⁇ glycine.
  • a Ha-Ras minisatellite region of the human proto-oncogene c-Ha-Ras was amplified in the presence of N, N, N trimethylglycine. This region corresponds to four main alleles (92 to 95% of the population), of length greater than 1 kb. This region is characterized by repetitions of a consensual sequence of 28 base pairs. The variable number of these repetitions defines the different alleles.
  • This repeated fragment is very rich in GC, and the amplification primers which frame this region also: - repeated fragment: 5 'CAC TCC CCC TTC TCT CCA GGG GAC GCC
  • Amplification of the mini-satellites of the lymphocyte DNA An amplification of the Ha-Ras fragment from 50 ng of lymphocyte DNA in 50 ml of amplification solution (Kit AM-TAQ, CIS BIO INTERNATIONAL) and in the presence of 15 pmol of each of the primers was carried out without addition of reagent (1), with addition of N, N, N trimethylglycine 1.5 M (2), with addition of DMSO 10% (3), with addition of DMSO 5 % (4) or with the addition of N, N, N 1.5 M trimethylglycine and 5% DMSO (5) ( Figure 9).
  • the bands VIII and VI represent respectively the marker of length VIII and the marker of length VI of Boehringer.
  • 30 amplification cycles are carried out (denaturation 94 ° C, 1 min 30, hybridization 60 ° C, 1 min 30, and elongation 70 ° C, 2 min).
  • the amplifications are analyzed on agarose gel and fluorescence with ethidium bromide.
  • the preceding amplification conditions in the presence of N, N, N trimethylglycine 1.5 M and 5% DMSO are used to amplify the alleles of a series of human DNA extracted either from tumors (bands 2, 4 and 6 ), or corresponding healthy tissue (bands 3 and 5), and the DNA extracted from the lymphocytes (band 1) and from an MDA cell line (band 7).
  • the Tdmin and Thmax curves have been defined.
  • EXAMPLE 9 Application of a buffer according to the invention to a method for detecting a nucleic acid sequence.
  • a PCR reaction comprising two primers carrying a binding factor is carried out with sequence A and primers 1 and 2 to detect the presence of a nucleic acid sequence.
  • this double chain is denatured in the presence of the buffers described N, N, N trimethylglycine 1.5 M and DMSO 5% and the single strands fixed on a solid support, covered with avidin. Then a probe carrying a detection marker is added. The colorimetric signal is improved and it appears that this is confirmed for the sequences which are difficult to denature.
  • EXAMPLE 10 Amplification of fragments of great length, rich in GC. Long length amplifications were carried out using Rhodobacter capsulatus DNA, rich in GC bases. The average GC composition of the fragment studied is 64.8%.
  • the amplification primers used made it possible to amplify fragments of length between 1206 bp and 12798 bp. Primers:
  • Amplifications were carried out using 50 ng of DNA from
  • Rhodobacter capsulatus in 50 ⁇ l of PCR amplification buffer (25 mM Tricin pH
  • SEQ ID NO: 2 CCGATCATCA GGGCCACCGC GAGGGCCCCG ATGGTTTGCG GTGGGGTGTC 50

Abstract

Tampon d'amplification, facilitant la dénaturation des acides nucléiques, tout en préservant la structure des enzymes mises en ÷uvre et améliorant significativement les performances de la réaction d'amplification en chaîne, et ses applications, notamment dans un procédé d'amplification de séquences cibles d'acide nucléique mettant en ÷uvre plusieurs températures et dans une méthode d'évaluation des conditions optimales à mettre en ÷uvre dans ledit procédé d'amplification. Ledit tampon comprend, outre les constituants d'un tampon d'amplification standard, un mélange d'au moins un agent isodéstabilisant (AI) et d'au moins un agent dénaturant (AD), présents à des concentrations aptes à réduire la température de fusion Tm de la séquence cible d'acide nucléique double-brin, conformément à la formule (4) ci-après: Tm(°C)=81,5+0,41(% G+C)-ΔTmAI-675/N+16,6.logM-ΔTmAD, dans laquelle: ΔTmAI=f[(% G+C), (molarité de AI)](formule 1), ΔTmAD=d(% agent dénaturant)(formule 3), M: molarité du/des cations monovalents présents dans le tampon, N: nombre de nucléotides, et d: coefficient d'efficacité de l'agent dénaturant (AD), pour diminuer au moins la température de dénaturation Td de ladite séquence cible d'acide nucléique double-brin, et ce tout en permettant un bon fonctionnement de la réaction enzymatique d'élongation des amorces.

Description

TAMPON ET METHODE D ' EVALUATION DES CONDITIONS OPTIMALES D 'AMPLIFICATION DE SEQUENCES CIBLES D ' ACIDE NUCLEIQUE, ET LEURS APPLICATIONS
La présente invention est relative à un tampon d'amplification, facilitant la denaturation des acides nucléiques, tout en préservant la structure des enzymes mises en oeuvre et améliorant significativement les performances de la réaction d'amplification en chaîne, ainsi que ses applications, notamment dans un procédé d'amplification de séquences cibles d'acide nucléique mettant en oeuvre plusieurs températures et dans une méthode d'évaluation des conditions optimales à mettre en oeuvre dans ledit procédé d'amplification.
Plusieurs méthodes d'amplification de séquences d'acides nucléiques ont été décrites ; ces différentes méthodes comprennent de manière générale une étape de denaturation de la séquence d'acide nucléique double-brin, une .étape d'hybridation d'amorces et une étape d' élongation desdites amorces en présence d'une enzyme d'élongation (polymérase (PCR), ligase (LCR), OCR).
La réaction de polymérisation en chaîne (PCR), telle que décrite, notamment par SAIKI R. et al. (Science, 1985, 230, 1350 ; Brevets européens CETUS 201 184 et 258 017), permet d'amplifier des séquences d'acide nucléique double-brin (ou duplex). Elle est basée sur le fonctionnement cyclique d'une ADN polymérase, capable de copier un brin d'ADN, utilisé comme matrice, en un brin complémentaire, par élongation à partir de l'extrémité 3' OH libre d'une amorce oligonucléotidique.
La technique PCR consiste à effectuer n cycles successifs d'amplification, au cours desquels deux amorces dirigent l'amplification de la séquence d'ADN double-brin qu'elles encadrent. Un cycle d'amplification PCR comporte essentiellement 3 étape dis¬ tinctes :
. une étape de denaturation du double-brin d'ADN à amplifier, par chauf¬ fage à une température Td,
. une étape d'hybridation des amorces oligonucléotidiques, à une tempé- rature Th, généralement comprise entre 37°C et 60°C, avec chacun des simples-brins d'ADN ; la longueur des amorces utilisées pour amplifier un fragment d'ADN est généra¬ lement comprise entre 18 et 30 nucléotides, et
. une étape d'élongation de l'amorce par copie enzymatique de chaque simple-brin d'ADN, qui joue le rôle de matrice, par une ADN polymérase, à une tempéra- ture Te, généralement comprise entre 60°C et 75°C ; dans ces conditions, chaque simple- brin d'ADN donne naissance à un double-brin d'ADN. Lorsque cette étape est effectuée avec la Taq ADN polymérase, elle est généralement réalisée à 72°C.
Une réaction PCR "standard" est effectuée dans un volume de 50 ou 100 ml et outre l'échantillon d'ADN à amplifier, contient un tampon d'amplification incluant : KCl 25-50 mM, Tris-HCl 10-20 mM (pH 8,4, à température ambiante), MgCl2 1,5 mM, gélatine lOO mg ml, 10-100 pmoles de chaque amorce, chacun des 4 désoxy- nucléotide triphosphates (dNTPs) à une concentration comprise entre 125 et 200 mM et 2,5 unités de Taq ADN polymérase. Quelques gouttes d'huile sont généralement ajoutées, de manière à éviter notamment l'évaporation du tampon. Les cycles sont généralement effectués comme suit :
Cycle Denaturation Hybridation Elongation
1er cycle 5 min. à 94°C 2 min. à 50 -55°C 3 min à 72°C cycles suivants 20 sec. à 1 min. à 20 sec. à 55°C ou 2 30 sec. à 3 min. à 94°C min. à 50°C 72°C. dernier cycle 1 min. à 94°C 2 min. à 50°C 10 min. à 72°C
La PCR permet alors l'utilisation, dans des conditions adéquates, de toutes les séquences néosynthétisées au cycle n, comme matrices pour l'ADN polymérase au cycle n+1. Il en résulte une amplification exponentielle du nombre de séquences d'acides nucléiques cibles, en fonction du nombre de cycles ; au cours de cette amplification, la quantité de séquences cibles obtenues peut être reliée à la quantité Qo de séquences cibles initiales, au facteur d'amplification x et au nombre de cycles n, par la formule Q = Qo (l+x)n.
La PCR permet ainsi d'amplifier, de manière exponentielle, des séquen- ces d'acides nucléiques dites cibles, des milliers de fois. Malgré l'intérêt que représente cette technique et les nombreuses appli¬ cations auxquelles elle a donné lieu, elle est limitée à la fois :
- dans son rendement en ADN produit (de l'ordre de quelques dizaines de mg/ml), - dans sa spécificité (formations de bandes parasites d'amplification)
- dans la longueur du fragment, qui peut être effectivement amplifié et
- dans la difficulté, voire l'impossibilité à amplifier des segments d'ADN riches en paires de bases G+C.
Ce sont en particulier les températures très élevées, au voisinage de l'ébullition, que nécessite la PCR pour la denaturation des double-brins d'ADN, qui entraî¬ nent, en partie, ces limitations ; il en résulte un certain nombre d'inconvénients, qui conti¬ nuent à mettre un frein à son utilisation effective en routine tant dans le domaine de la production de séquences que dans le domaine du diagnostic.
Les inconvénients liés aux températures à sélectionner, au cours de cha- que étape de la PCR peuvent être résumés comme suit : ai inconvénients liés à la température de denaturation (Tri) :
- dans les cas où les températures utilisées pour la denaturation (Td : 95°C pendant 30 sec ou 97°C pendant 15 sec, par exemple) ne sont pas suffisantes (séquences cibles riches en G+C), elles conduisent à une denaturation incomplète des double-brins d'ADN ;
- des étapes de denaturation qui sont effectuées à des températures plus élevées (de l'ordre de 98°C) et/ou qui sont trop longues, conduisent à une perte d'activité de l'ADN polymérase ; en effet, la demi-vie de la Taq ADN polymérase, l'enzyme cou¬ ramment employée, est respectivement de > 2 h, 40 min et 5 min pour 92,5°C, 95°C et 97°C (SAIKI R.K., PCR Technology. Principles and applications for DNA amplification, éd. H. A. Erlich Stockton Press, 1989). Bien que des enzymes plus thermostables aient été proposées pour remplacer la Taq ADN polymérase, l'inconvénient de l'utilisation de hautes températures de denaturation demeure ; - l'utilisation de températures très élevées et de temps de denaturation initiaux allant de 1 à 7 min à pH 7,0-8,0 est incompatible avec une bonne conservation de la matrice d'ADN et des dégradations importantes du biopolymère sont observées, qui empêchent l'amplification de très longues chaînes d'ADN (CE. GUSTAFSON et al., Gène, 1993, 123, 241-244) ;
- la température très élevée qui est utilisée au cours de la denaturation des duplex (94-97°C), peut entraîner l'évaporation du milieu réactionnel ; pour l'éviter une couche d'huile est ajoutée, à l'intérieur de chaque tube réactionnel. Toutefois, la présence de cette huile peut présenter des inconvénients (inhibition de réaction, pollution des pro- duits formés, etc.).
- la température de fusion (Tm), température à laquelle 50 % de l'acide nucléique est sous la forme simple-brin, croît avec la concentration en duplex, conformé¬ ment au calcul théorique de l'hybridation des duplex d'acides nucléiques par la méthode thermodynamique de BRESLAUER et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 3746- 3750) ; il existe donc une limitation théorique à l'hybridation, due à la quantité de duplex formés, quelles que soient les quantités d'enzyme ou de nucléosides triphosphates présents dans le tampon d'amplification. En conséquence, comme précisé ci-dessus, la quantité d'ADN produite est limitée à quelques dizaines de mg/ml.
- les molécules qui ne sont pas thermostables ne peuvent pas être incor- porées dans les amorces d'amplification ; or, pour différentes raisons (fixation sur des supports, marqueurs de détection), il peut être intéressant de travailler à plus basses températures (fixation de biopolymères, de molécules thermosensibles pour la fixation ou la détection, etc.). h ι inconvénients liés à la température d'hvhridation (Th) : - l'autoappariement de fragments d'un même brin est source de mauvais appartements entre les amorces et la matrice et d'arrêts de copie, ce qui conduit en particu¬ lier à la présence de structures secondaires et à l'obtention de plusieurs bandes, après élec- trophorèse, alors que si l'amplification est spécifique, un seul produit constitué d'ADN double-brin de la longueur désirée doit être produit et en conséquence, une seule bande doit être observée en électrophorèse. ci en ce qui concerne l'ensemble des températures mises en oeuyres (Tri Th et Te) : - la plupart des thermocycleurs commerciaux n'assurent pas une homo¬ généité de température dans les différents puits. Cela affecte la reproductibilité de l'am¬ plification et c'est une des raisons pour lesquelles il est difficile de faire des mesures quanti¬ tatives avec la PCR.
Des températures maximales moins élevées et des variations extrêmes plus faibles atténueraient ce problème. Cela permettrait d'utiliser cette technique PCR in situ (intérêt d'utiliser des amplifications avec moins d'écart de température et une tempé¬ rature maximale plus faible sur des coupes cellulaires).
Pour augmenter le rendement et/ou la spécificité de la PCR et/ou la lon¬ gueur des séquences amplifiées, plusieurs solutions ont été proposées : - la technique du hot start : si le mélange de l'ensemble des réactifs de la
PCR est effectué à froid, l'hybridation des oligonucléotides est peu spécifique et des copies sont initialisées à des positions incorrectes. En effectuant le mélange à température élevée, supérieure à celle de l'hybridation, la réaction d'amplification démarre plus correctement. L'inconvénient pratique est évident : la manipulation des tubes à température élevée est peu commode et toute maladresse est source de contamination.
- la mise en oeuvre de l'étape d'hybridation et de l'étape d'élongation des amorces à une même température, supérieure à 55°C (KIM H.S. et al., 1988, Nucl. Acids Res., 16, 8887-8903).
- l'addition de certains dénaturants ou de cosolvants au mélange réac- tionnel PCR.
Un article récent, paru dans Gène (VARADARAJ K. et al. (1994, 140. 1-5), fait le point sur l'usage de certains dénaturants ou de cosolvants qui permettent d'améliorer le rendement et la spécificité de la PCR et dans certains cas, de la rendre possible (BOOKSTEIN R et al., Nucleic Acids Res., 1990, 18, 1666 ; CHESTER N. et al., Anal. Biochem., 1993, 209, 284-290 ; DUTTON CM. et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 2953-2954 ; HUNG T. et al., Nucleic Acids Res., 1990, 18, 4953 ; LU Y.H. et al., Trends Genêt, 1993, 9, sept, 297 ; SARKAR G. et al., Nucleic Acids Res., 1990, 18, 7465). On peut citer le DMSO (diméthyl sulfoxyde), le TMAC1 (chlorure de triméthyl ammonium), le glycérol, le formamide, des détergents, tels que le Tween 20 et le NP-40. Ces articles montrent que : a) les résultats obtenus par ces différents Auteurs sont contradictoires. Suivant les Auteurs, le même produit est décrit comme étant efficace ou inhibiteur. Par exemple, BOOKSTEIN R. et al. (1990, précité) décrivent l'amélioration de la PCR pour un fragment génique par addition de DMSO à 10 % ; INNIS M. A. et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, Académie Press, Inc, 1990) et SAIKI R.K. (1989, précité) décrivent l'effet néfaste du DMSO à 10 % sur le rendement et l'efficacité de la PCR ; SARKAR G. et al. (1990, précité) décrivent l'inefficacité du DMSO et proposent le formamide. VARADARAJ K. et al. (1994, précité) précisent que des concentrations supé- rieures à 5 % de DMSO inhibent la PCR.
Ceci est également confirmé dans un ouvrage, paru en 1994 (J.M. GRAHAM ET D. BILLINGTON Ed., Bios Scientific Publishers Ltd., Oxford, 1994) qui fait le point sur la PCR et dans lequel il est en particulier précisé que l'utilisation d'additifs pour augmenter l'efficacité ou la spécificité de la PCR, présente l'inconvénient majeur de ne pas être reproductible d'une PCR à l'autre : un certain nombre d'additifs améliorent la PCR à une concentration donnée, mais dans les mêmes conditions, n'ont aucun effet lorsqu'ils sont mis en œuvre dans une autre PCR.
La plupart de ces différents travaux ont été réalisés avec la Taq ADN polymérase et les effets divers obtenus sont dus, selon certains Auteurs au fait que ces agents dénaturants de l'ADN diminuent considérablement l'activité des ADN polymérases, alors que d'autres considèrent qu'ils facilitent la copie de la matrice. Toutefois aucune procédure formalisée et reproductible n'est décrite. b) les mécanismes spécifiques responsables de l'accroissement de l'ampli¬ fication de l'ADN par des détergents, des chaotropiques ou des cosolvants ne sont ni connus (VARADARAJ K. et al., 1994, précité, page 4), ni formalisés, ni reproductibles.
Des articles très récents (W. BARNES, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 2216-2220 ; S. CHENG et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, juin 1994, 5695- 5699) décrivent l'amplification de très longues chaînes d'ADN (42 kb) qui ont été obte¬ nues à partir du phage 1 (contenu en G+C = 49 %). Les Auteurs utilisent différentes amé¬ liorations dont beaucoup ont été décrites antérieurement (voir références ci-dessus) :
- temps de denaturation très précis et très courts : 5 s à 94°C, qui néces- site un thermocycleur spécial et une technologie difficile à maîtriser en routine,
- technique du « hot-start »,
- temps d'extension compris entre 10 et 22 min,
- addition au tampon d'amplification, de DMSO et de glycérol,
- utilisation de deux ADN polymérases thermostables, l'une ayant une activité 3 ' -5 ' -exonucléasique dans le tampon d ' amplification,
- augmentation du pH.
Des pointes de température au delà de 94°C pour résoudre le problème des zones riches en G+C n'ont pas apporté le bénéfice espéré (CHENG et al., 1994, pré¬ cité). Toutefois, ces modifications ne permettent pas d'obtenir une méthode reproductible (BARNES, 1994, précité).
Toutefois dans ces travaux récents (CHENG et al., 1994, BARNES, 1994), comme dans ceux décrits antérieurement et concernant des fragments plus grands que 800 nucléotides, la réaction de denaturation du cycle PCR s'effectue, en fait au minimum à la température Td=94°C Aucune étude chiffrée précise et systématique n'est donnée pour analyser les résultats et orienter de façon corrélée le choix des températures de denaturation Td et d'hybridation Th, en fonction de la concentration en additifs.
En conséquence, la Demanderesse s'est donné pour but de pourvoir à un tampon d'amplification et à un procédé d'amplification de séquences cibles d'acide nucléique, qui limitent les inconvénients spécifiés ci-dessus, notamment en ce que : - l'étape de denaturation des duplex d'ADN puisse s'effectuer à une température Td inférieure à celle qui est couramment utilisée (94°C) pour la PCR,
- la denaturation des duplex d'ADN initiaux ou obtenus par l'ADN polymérase puisse s'effectuer complètement, quelle que soit leur longueur ou leur contenu naturel en (G+C), sans dommage sérieux pour la stabilité de l'ADN polymérase et/ou l'intégrité de la matrice d'ADN, et
- le procédé soit facilement reproductible.
C'est également un but de l'invention de fournir une méthode d'évalua¬ tion des conditions optimales à mettre en oeuvre dans un procédé d'amplification conforme à l'invention, pour obtenir aisément des produits d'amplification longs et ou à forte teneur en (G+C). La production de ces fragments d'ADN ouvre en particulier de multiples applications, tant dans le domaine de la recherche génétique et du séquençage du génome que dans le domaine du diagnostic et de la thérapeutique.
La présente invention a pour objet un tampon, apte à être mis en oeuvre dans un procédé d'amplification d'au moins une séquence cible d'acide nucléique, du type comprenant n cycles, chacun desdits cycles incluant une étape de denaturation de la séquence cible double-brin, réalisée à une température de denaturation Td, une étape d'hy¬ bridation entre la séquence cible simple-brin et au moins une amorce appropriée, réalisée à une température d'hybridation Th et une étape d'élongation de l'amorce ayant hybride, en présence d'une enzyme d'élongation d'acide nucléique et à une température d'élongation Te, lequel tampon est caractérisé en ce qu'il comprend, outre les constituants d'un tampon d'amplification standard, un mélange d'au moins un agent isodéstabilisant (AI) et d'au moins un agent dénaturant (AD), présents à des concentrations aptes à réduire la température de fusion Tm de la séquence cible d'acide nucléique double-brin, confor- mément à la formule 4 ci-après :
Tm (°C)=81,5+0,41(% G+C)-ΔTmAi-675 N+16,6.1ogM-ΔTmAD (formule 4), dans laquelle :
Figure imgf000010_0001
G+C),(molarité de AI)] (formule 1),
ΔTmAD=d(% agent dénaturant)(formule 3), M : molarité du/des cations monovalents présents dans le tampon, N : nombre de nucléotides, et d : coefficient d'efficacité de l'agent dénaturant (AD), pour diminuer au moins la température de denaturation Td de ladite séquence cible d'acide nucléique double-brin, et ce tout en permettant un bon fonctionnement de la réaction enzymatique d'élongation des amorces.
En effet, de manière inattendue, l'agent isodéstabilisant et l'agent déna¬ turant coopèrent (action synergique), dans les zones de concentrations définies, pour dimi¬ nuer la température de fusion Tm ; cette diminution a pour effet de réduire la température maximale du cycle d'amplification Td (ou température de denaturation) et de préférence, à la fois la température maximale du cycle d'amplification Td et la température minimale du cycle d'amplification Th (ou température d'hybridation).
Conformément à l'invention, ledit agent isodéstabilisant (AI) est une substance dont la caractéristique principale est de diminuer l'influence stabilisatrice appa- rente des paires de bases (G+C) sur le Tm des acides nucléiques.
Également conformément à l'invention, ledit agent dénaturant (AD) est une substance qui diminue la température de fusion d'un fragment d'ADN de façon proportionnelle à son pourcentage en solution, à peu près indépendamment de la nature des bases qui le composent. La température de fusion d'un duplex d'ADN de grande longueur (c'est- à-dire supérieure à lkb) est calculée de façon approximative par la formule empirique sui¬ vante :
Tm (°C)=81, 5+0,41(% G+C)-675/N+16,6.1ogM-ΔTmAD (formule 2) dans laquelle : ΔTΠIAD = (% agent dénaturant) (formule 3)
M : molarité du/des cations monovalents présents dans le tampon (généralement Na et/ou ),
N : nombre de nucléotides, d : coefficient d'efficacité de l'agent dénaturant (AD), généralement compris entre 0,25 et 0,7.
Le Tm est une donnée moyenne. La fusion d'un grand segment d'ADN se produit localement par zones de quelques dizaines à quelques centaines de paires de bases, comme on peut l'observer au microscope électronique. Les zones qui restent hybri- dées sont les zones qui sont riches en paires de bases G+C. Celles où les simples brins sont séparés sont riches en A+T. Les courbes classiques d'hyperchroïsme ne permettent pas de déceler si 1 % d'ADN reste hybride, c'est-à-dire si les deux molécules d'ADN simple brin restent rattachées physiquement par une petite fraction de bases encore hybridées. L'agent isodéstabilisant diminue la valeur du Tm d'une quantité ΔTm et, par conséquent, la valeur apparente du coefficient 0,41 qui entre dans l'expression du Tm. Mais ce qui est le plus important, c'est la très grande efficacité de l'agent isodéstabilisant à jouer sur les zones à très forte teneur en G+C pour obtenir la séparation ultime et complète de deux molécules d'ADN simple brin des duplex d'amplification, au cours de leur denaturation, à la température maximale du cycle d'amplification PCR, par exemple.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit tampon, l'agent iso¬ déstabilisant est sélectionné dans le groupe constitué par les halogénures d'alkylammonium, les ions dipolaires (zwitterions) et les N-oxydes de trialkylamine.
Le zwitterion est, de préférence la N,N,N triméthylglycine ; le groupe- ment alkyle est de préférence au moins en C2.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit tampon, l'agent dénaturant est sélectionné dans le groupe constitué par le diméthylsulfoxyde (DMSO), le glycérol, le formamide, le diméthylformamide (DMF), les uréides, les polyols et les détergents. Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit tampon, ledit mélange est constitué de N,N,N triméthylglycine (AI) et de DMSO (AD).
Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, la concentra¬ tion en N,N,N triméthylglycine est comprise entre 0,05 et 4 M, de préférence entre 1 et 2,5 M, et la concentration en DMSO est comprise entre 0,5 et 15 %, de préférence entre 5 et 10 %.
De préférence, la concentration en N,N,N triméthylglycine est de 1,5 M et la concentration en DMSO est de 5 à 10 %. Pour la plupart des fragments d'ADN analysés, la diminution de Tdmin est supérieure à 10°C pour du DMSO à 10 %, additionné à la N,N,N triméthylglycine 1,5 M.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit tampon, ledit mélange est constitué de N,N,N triméthylglycine (AI), de DMSO (AD) et de glycérol (AD).
Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, la concentra¬ tion en N,N,N triméthylglycine est comprise entre 0,05 et 4 M, de préférence entre 1 et 2,5 M, la concentration en DMSO est comprise entre 0,5 et 15 %, de préférence entre 5 et 10 % et la concentration en glycérol est comprise entre 1 et 30 %, de préférence entre 3 et 20 %.
Le tampon conforme à l'invention, très efficace pour la denaturation des séquences riches en (G+C), peut avantageusement être mis en oeuvre dans un procédé d'amplification en chaîne d'au moins une séquence cible d'acide nucléique.
Conformément à l'invention, ledit tampon est avantageusement mis en oeuvre, et ce de manière non limitative :
- soit dans un procédé d'amplification en chaîne par polymérase,
- soit dans un procédé d'amplification en chaîne par ligase,
- soit dans un procédé d'amplification en chaîne par ligase avec répara¬ tion. Au sens de l'invention et dans le cas de la PCR, on entend par tampon d'amplification standard, par exemple : Tris-HCl 10 mM, pH 8,5, KCl 50 mM, MgCl 1,5- 2,5 mM, mélange des 4 désoxynucléotides, amorces et Taq ADN polymérase, à différentes concentrations, selon les cas.
De manière inattendue, dans le cas de l'amplification en chaîne par polymérase, par exemple, le tampon d'amplification conforme à l'invention : a) facilite spécifiquement la denaturation des zones riches en G+C, grâce à l'agent isodéstabilisant, permet l'amplification de fragments longs et/ou à haute teneur en G+C, qu'il serait impossible d'amplifier ou d'amplifier aussi efficacement, dans les tampons conventionnels, avec ou sans agent dénaturant. Si la denaturation des duplex d'amplification, par chauffage à la tempéra¬ ture maximale du cycle PCR est imparfaite, c'est-à-dire si les simples chaînes produites demeurent rattachées par une petite fraction de paires de bases à haute teneur en G+C, la refermeture du duplex au cours du refroidissement nécessaire pour l'hybridation des amorces se produira en quelques secondes, voire quelques fractions de secondes (figure 1). Dans ce cas, l'hybridation des amorces sera infime parce qu'elles seront rejetées par la fermeture du duplex avant d'avoir été suffisamment allongées et ainsi stabilisées par l'ADN polymérase. Si des simples brins d'ADN de grande longueur sont physiquement bien séparés, la nucléation initiale, c'est-à-dire la reconnaissance correcte et l'hybridation d'une petite partie de la séquence entre les deux simples chaînes est l'étape limitante qui gouverne leur hybridation et elle exige plusieurs minutes. La concentration molaire des amorces étant des milliers, voire des millions de fois plus élevée que celle des simples brins de la matrice d'amplification, la probabilité de reconnaissance entre les amorces et la matrice simple brin est très élevée et la réaction PCR est très efficace. b) facilite aussi de façon non spécifique, c'est-à-dire indépendamment de la nature des bases, la denaturation des duplex d'ADN, grâce aux agents dénaturants et permet par la synergie des effets spécifique et non spécifique d'abaisser fortement les températures maximales et minimales Td et Th du cycle PCR, c) permet parfois d'améliorer la spécificité d'amplification en diminuant ou même en éliminant les bandes parasites, d) permet d'atteindre des rendements finals d'amplification volumique plus élevés, puisque la température de denaturation des duplex augmente avec leur con¬ centration, e) permet d'améliorer la reproductibilité et la fiabilité de la PCR, en augmentant la plage de température pour la denaturation des duplex, puisque la diminution de la température limite est considérable (dans une expérience type, elle diminue d'environ 10°C : de 92,5°C à 82°C).
Ledit tampon peut notamment être mis en oeuvre dans un procédé d'amplification en chaîne par polymérase (PCR), comprenant n cycles, chacun desdits cycles incluant une étape de denaturation de la séquence cible double-brin, réalisée à une température de denaturation Td, une étape d'hybridation entre la séquence cible simple- brin et au moins une amorce appropriée, réalisée à une température d'hybridation Th et une étape d'élongation de l'amorce hybridée, en présence d'au moins une ADN polymérase et à une température d'élongation Te.
Selon un mode de mise en œuvre avantageux de ce procédé d'amplification PCR, la séquence d'acide nucléique cible comprend plus de 100 bases, de préférence plus de 1000 bases et/ou présente une haute teneur en bases G+C.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de ce procédé d'amplification PCR, chaque cycle est effectué avec deux températures Td (température de denaturation) et Th (température d'hybridation) = Te (température d'élongation), ledit procédé étant, de préférence, mis en oeuvre en présence d'amorces comprenant plus de 30 nucléotides, et dont la température de fusion Tm est élevée.
De manière inattendue, un tel mode de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, présente une sélection de conditions (amorces de plus de 30 mers et tampon d'amplification contenant au moins un agent isodéstabilisant et éventuellement un agent dénaturant) qui, en synergie, coopèrent pour, simultanément :
- réduire l'écart des températures Td-Th en utilisant des oligonucléotides de grande taille comme amorces, et - diminuer les températures Td et Th, du fait de la réduction des Tm d'au moins une quantité ΔTΠIAI.
En effet, l'utilisation d'amorces longues (plus de 30 mères) permet de réaliser l'élongation en présence d'une enzyme thermostable, à la température d'hybridation des amorces (Th=Te) ; elles présentent aussi l'avantage d'être plus spécifi- ques que les sondes courtes de 20 mères.
Ledit tampon peut également être mis en oeuvre dans un procédé d'amplification en chaîne par ligase (LCR) ou par ligase avec réparation.
La présente invention a également pour objet une méthode d'évaluation des conditions optimales à mettre en oeuvre dans un procédé d'amplification tel que défini ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend le tracé du diagramme des températures définissant les domaines de Td et Th (température maximale et minimale de l'amplification, PCR notamment), conformément aux étapes suivantes :
(1) la réalisation : - de la courbe des températures minimales de denaturation (Tdmin) des duplex d'acide nucléique cible, du type Tdminn=Tdo-byn, dans laquelle Tdmin,, représente la valeur de la température minimale de denaturation pour une concentration yn en agent isodéstabilisant, Tdo représente la valeur de la température minimale de denaturation en l'absence d'additif (agent déstabilisant ou agent dénaturant) et b représente la pente de la droite et
- de la courbe des températures maximales d'hybridation des amorces (Thmaχn), en fonction de la concentration yn en agent isodéstabilisant et en l'absence d'agent dénaturant (figure 2, application de la méthode à la PCR) ;
De façon inattendue, l'expérience montre que Tdmin et Thmax sont des droites, dans la limite des erreurs expérimentales et de la précision nécessaire, dans la zone utile de concentrations.
(2) la sélection d'au moins une concentration yn en agent isodéstabili¬ sant, pour laquelle la température de denaturation Td et la température d'hybridation Th satisfont aux conditions suivantes : Td>Tdminn>Thmaχn >Th (figure 3, application de la méthode à la PCR),
(3) la réalisation :
- de la courbe des températures minimales de denaturation (Tdmin) des duplex d'acide nucléique cible, du type Tdmin.≈Tdo-ax., dans laquelle Tdmin j représente la valeur de la température minimale de denaturation pour une concentration XJ en agent dénaturant et pour la concentration yn choisie en agent isodéstabilisant à l'étape (2), Tdo représente la valeur de la température minimale de denaturation en l'absence d'additif (agent déstabilisant ou agent dénaturant) et a représente la pente de la droite et - de la courbe des températures maximales d'hybridation des amorces (Thmaxi), en fonction de la concentration en agent dénaturant x_ et pour la concentration yn sélectionnée à l'étape (2) en agent isodéstabilisant (figure 2) ;
De façon inattendue, l'expérience montre que Tdmin et Thmax sont des droites, dans la limite des erreurs expérimentales et de la précision nécessaire, dans la zone utile de concentrations.
(4) la sélection d'au moins une concentration en agent dénaturant, pour laquelle Td et Th satisfont également aux conditions suivantes : Td>Tdminn>Thmaxn>Th (figure 3) et (5) la préparation d'un tampon d'amplification conforme à l'invention, dans lequel l'agent isodéstabilisant et l'agent dénaturant sont aux concentrations sélec¬ tionnées aux étapes (2) et (4) ci-dessus.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ladite méthode d'évaluation, lorsque les amorces sont courtes et de point de fusion faible, une étape d'élongation intermédiaire des amorces à une température Te est mise en oeuvre, avec
Td>Te>Th et avec Te, le plus près possible de la température optimale de fonctionnement de l'enzyme d'élongation (ADN polymérase, ligase...).
Dans les figures 2 et 3 et le texte qui suit, ladite méthode d'évaluation est illustrée pour la PCR et pour une gamme de concentrations x en agent dénaturant, mais la méthode est la même pour des variations de concentration x en agent isodéstabilisant comme le montre la figure 4.
Il faut noter que trois expériences PCR avec chacune une gamme de concentrations x sont généralement suffisantes pour définir Tdmin.
L'amplification est effectuée à deux températures (Th ≈ Te et Td), dans un tampon standard, contenant éventuellement d'autres additifs, sur une série d'échan¬ tillons comportant des concentrations croissantes x en agent dénaturant (ou agent iso¬ déstabilisant, voir également concentrations Yn telles que définies ci-dessus). De façon inattendue, on observe que la réaction d'amplification ne se produit que pour des concentrations comprises entre une valeur minimale (xl) et une valeur maximale (x2). On propose l'interprétation suivante illustrée par les figures 2 et 3.
L'addition d'agent dénaturant permet d'agir sur deux paramètres essen¬ tiels de l'amplification : a) la courbe de fusion des duplex de la cible biologique, formés par les copies réalisées avec l'ADN polymérase (pourcentage d'ADN simple-brin en fonction de la température) (figure 2).
L'addition d'agent dénaturant au tampon d'amplification PCR permet d'obtenir une denaturation convenable des duplex de la cible à une température inférieure à celle qui est nécessaire avec un tampon ordinaire. Il faut que la concentration d'agent dénaturant et/ou la température de denaturation Td soient suffisantes pour une concentra¬ tion donnée xl d'agent dénaturant. A la valeur minimale limite xl de la concentration en agent dénaturant correspond une valeur minimale limite de la température de denaturation Tdmini (figure 2). En effectuant une série d'expériences A, B, ..., avec des concentrations
Xi différentes, on s'aperçoit que l'ensemble des points de coordonnées (xl, Tdmini) est ali¬ gné sur une droite Tdmin qui définit la température minimale de denaturation, en fonction de la concentration d'un agent dénaturant donné et pour une séquence donnée d'ADN à amplifier. La droite Tdmin ne concerne que le phénomène de denaturation des duplex d'ADN initiaux ou formés par copie matricielle. Il n'y a pas d'interférence avec les processus d'élongation ou d'hybridation des amorces.
Par conséquent, la droite Tdmin ne dépend pas de la nature des amorces, b) la courbe d'hybridation des amorces (pourcentage d'ADN double-brin formé entre la matrice et l'amorce, en fonction de la température (figure 2). Pour qu'il y ait amplification, il faut que les amorces puissent s'hybrider sur les simples chaînes d'ADN. Pour une température donnée Th, il ne faut pas que la con¬ centration de l'agent dénaturant soit trop élevée parce qu'elle empêcherait l'hybridation. A la valeur limite maximale de la concentration x2 en agent dénaturant, correspond une valeur limite maximale de la température d'hybridation des amorces, Thma.\2. L'ensemble des points de coordonnées (x2,
Figure imgf000019_0001
résultant d'une série d'expériences effectuées avec des concentrations différentes est aligné sur une droite Thmax, qui définit la température maximale d'hybridation des amorces en fonction de la concentration de l'agent dénaturant. On observe que Thmax est approximativement parallèle à Tdmin (agents dénaturants). Dans le cas des agents isodéstabilisants Thmax est encore une droite, mais elle diverge par rapport à Tdmin quand x croît (voir exemples).
Thmax dépend essentiellement de la nature des amorces. Si les amorces sont courtes, la droite Thmax est encore parallèle à Tdmin, mais elle est plus éloignée de Tdmin. L'extrapolation de la droite Tdmin à x=0 permet de définir avec précision la valeur de TdO pour le tampon standard, sans agent dénaturant. La pente de la droite donne le coefficient d'efficacité d de l'agent dénaturant, sur la cible d'ADN étudiée.
Pour que l'amplification soit très spécifique, il faut que la température d'hybridation des amorces Th soit proche de Thmax. A température trop basse, la satura¬ tion des sites de la cible par les amorces est très élevée, mais la spécificité est plus faible. c) la concentration d'agent dénaturant qu'il est possible d'ajouter est limitée.
L'agent dénaturant (DMSO, formamide) est inhibiteur de l'ADN poly¬ mérase. A très faible quantité (1 %), il peut faciliter le déroulement des régions auto- complémentaires riches en G+C et permettre ainsi une meilleure copie de la matrice. Rapidement l'effet inhibiteur devient prépondérant. Par exemple, le DMSO à la con¬ centration de 10 % inhibe la synthèse de l'ADN de 53 %, quand on emploie la Taq ADN polymérase à la température de 70°C Pour du DMSO à 20 %, l'inhibition croît à 89 %. d) la réaction d'élongation des amorces est effectuée de préférence à une température Te voisine de la température optimale de fonctionnement de l'ADN polymé¬ rase. Le temps de la copie est ajusté à la vitesse de la polymérisation enzymatique dans les conditions expérimentales retenues. Cette vitesse s'exprime en nombre de bases/minute. Par exemple, si la vitesse est de 1 000 bases/min, il faudra au moins 4 minutes d'élongation pour amplifier un segment de 4 kilobases. e) Le choix des températures optimales de fonctionnement PCR est possible et aisé, à partir des droites Tdmin et Thmax(figure 3).
A la concentration en agent dénaturant ou isodéstabilisant xo, il faut que Td>Tdmino>Thmaxo>Th. Tdmino et Thmaxo sont les valeurs de Tdmin et Thmax pour x=xo.
De préférence, Te est voisin de la température optimale de fonctionne¬ ment de l'ADN polymérase, par exemple 70°C à 72°C avec la Taq ADN polymérase.
La PCR est une méthode complexe et simplement à partir des courbes de fusion des duplex ou des amorces et à plus forte raison de la connaissance de Tm seule- ment on ne peut pas prévoir actuellement l'effet favorable ou l'effet inhibiteur d'une molé¬ cule sur l'amplification.
Des molécules qui semblent a priori favorables se révèlent décevantes.
C'est le cas du chlorure de tétraéthylammonium qui est un excellent agent d' isodéstabilisation mais qui inhibe totalement l'amplification PCR. Cependant, aussi bien le procédé d'amplification que la méthode d'évaluation conformes à l'invention permettent effectivement de résoudre ce problème.
La présente invention a également pour objet un procédé de détection d'au moins une séquence d'acide nucléique cible, mettant en oeuvre au moins une étape d'amplification par une méthode d'amplification en chaîne, en présence d'amorces appro- priées et une étape d'hybridation avec une sonde convenable, lequel procédé est caracté¬ risé en ce que lors de l'étape d'amplification, l'on met en oeuvre un tampon conforme à l'invention.
Selon un mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé de détection, la séquence d'acide nucléique cible comprend plus de 100 bases, de préférence plus de 1000 bases et/ou présente une haute teneur en bases G+C
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé de détection, lors de l'étape d'amplification, l'on met en oeuvre deux amorces portant un fac¬ teur de fixation, pour détecter la présence de la séquence d'acide nucléique amplifiée. Après ladite amplification, cette double chaîne est dénaturée en présence d'un tampon conforme à l'invention, et les simple-brins fixés sur un support solide, puis une sonde portant un marqueur de détection est ajoutée. Le signal est amélioré pour les séquences difficiles à dénaturer. Selon une disposition préférée de ce mode de mise en oeuvre, le facteur de fixation est la biotine ou un haptène et la détection est fluorescente, colorimétrique ou luminescente.
La mise en oeuvre d'un tampon tel que défini ci-dessus, dans un procédé d'amplification par PCR, par exemple, permet : - d'amplifier des fragments ayant des longueurs de plusieurs dizaines de kb ; en conséquence, des virus ou des plasmides complets peuvent être amplifiés. Ceci va permettre de les caractériser et de les étudier beaucoup plus aisément et notamment de faciliter l'étude des mutants d'intérêt thérapeutique et diagnostique. En particulier, les virus de la famille de l'herpès, qui renferment des séquences très riches en G+C, pourront être plus facilement amplifiés.
- dans le diagnostic médical, de détecter les porteurs de gènes avec de grandes insertions ou de grandes délétions. Ceci a un intérêt évident pour les maladies génétiques et la cancérologie. Dans le processus de cancérisation, on observe, en effet, des remaniements chromosomiques avec des translocations pour lesquelles le point de fracture varie souvent de quelques kilobases. La possibilité d'amplifier des segments de grande taille va permettre de diagnostiquer aisément ces réarrangements par des procédés semblables aux systèmes ELISA (procédé Amplicis® par exemple).
- l'étude des séquences régulatrices de l'expression génique : ADNc de grande taille relatifs aux oncogènes. - de réduire les coûts et d'accélérer le séquençage du génome humain.
Dans la constitution des cartes génomiques, les fragments de quelques 30 à 40 kb qui sont inclonables peuvent être obtenus par amplification avec des oligonucléotides correspon¬ dant aux séquences frontières. - pour des études de transferts de gènes, la construction complète du vecteur et des gènes, sans clonage. Les amorces des gènes J et cro peuvent être utilisées pour amplifier les inserts dans presque tous les vecteurs basés sur le phage 1. Les inserts de cosmides pourront être amplifiés. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention, ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 illustre l'intérêt, pour la PCR, des agents isodéstabilisants qui facilitent la denaturation des zones riches en paires de bases (G+C),
- la figure 2 représente le tracé des droites de température minimale de denaturation des duplex Tdmin et des droites de température maximale d'hybridation des amorces Thmax, en fonction de la quantité d'agent dénaturant ou d'agent isodéstabilisant,
- la figure 3 représente les domaines de fonctionnement de la PCR en fonction de la concentration en additif (dénaturant ou isodéstabilisant),
- la figure 4 représente les courbes des Td et des Th déterminées pour l'amplification d'un fragment de 870 pb (SEQ ID No: 1) avec des amorces de 50 bases de longueur dans un milieu renfermant de la N,N,N-triméthylglycine à différentes concentrations, - la figure 5 représente les courbes des Td et des Th déterminées pour l'amplification d'un fragment de 870 pb (SEQ ID No: 1) avec des amorces de 50 bases de longueur dans un milieu renfermant du DMSO à différentes concentrations,
- la figure 6 représente les courbes des Td et des Th déterminées pour l'amplification d'un fragment de 870 pb (SEQ ID No: 1) avec des amorces de 50 bases de longueur dans un milieu renfermant du glycérol à différentes concentrations,
- la figure 7 représente les courbes des Td et des Th déterminées pour l'amplification d'un fragment de 870 pb (SEQ ID No: 1) avec des amorces de 50 bases de longueur dans un milieu renfermant de la N,N,N-triméthylg_ycine 1,5 M et du DMSO à différentes concentrations, - la figure 8 représente les courbes des Td et des Th déterminées pour l'amplification d'un fragment de 810 pb, inclus dans la SEQ ID No: 1, avec des amorces de 20 bases de longueur dans un milieu renfermant de la N,N,N-triméthylglycine 1,5 M et du DMSO à différentes concentrations, - la figure 9 illustre l'amplification d'une région Ha-Ras du proto- oncogène humain c-Ha-Ras dans l'ADN de lymphocytes en présence de différents agents,
- la figure 10 illustre l'amplification d'une région Ha-Ras du proto- oncogène humain c-Ha-Ras dans l'ADN extrait de différentes tumeurs, de lymphocytes et d'une lignée cellulaire MDA, - la figure 11 illustre l'amplification de fragments de grande longeur, riches en GC, à partir d'ADN de Rhodobacter capsulatus.
Les figures 2 à 8 illustrent, pour chaque amplification, les résultats positifs (+) ou négatifs (0) en fonction des températures et/ou de la concentration en agents dénaturants et/ou isodéstabilisants. II doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uni¬ quement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Dans les exemples 1 à 6 qui suivent, les études comparatives des tempé¬ ratures minimales de denaturation des duplex néosynthétisés (Tdmin) et des températures maximales d'hybridation des amorces (Thmax), en fonction des agents isodéstabilisants et/ou dénaturants, utilisés ont été effectués à partir de l'amplification d'un fragment de 870 pb du génome de Mycobacterium tuberculosis, qui est caractérisé par une grande proportion de bases GC : 64 %.
Le fragment amplifié (séquence A) est la SEQ ID No: 1. Les amorces employées sont des oligonucléotides de 50 bases de longueur, qui encadrent le fragment précédent.
L'amorce 1 de séquence :
5' CCGATCATCAGGGCCACC GCGAGGGCC CCGATGGTT TGCGGTGGGGTGTC3' (SEQIDNo: 2), comporte 68 % de bases GC et a un Tm de 93,3°C, calculé conformément à la formule 2, sans agent dénaturant.
L'amorce 2 de séquence :
5' TCG ACC GGC GGG ACG TCG CCG CAG TAC TGG TAG AGG CGG CGA TGG TTG AA 3' (SEQ ID No:3), comporte 66 % de bases GC et a un Tm de 90,9°C, calculé conformément à la formule 2, sans agent dénaturant.
Toutes les amplifications ont été effectuées dans un tampon d'amplification standard (Tris HCl 10 mM pH 8,5, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 200 mM de chaque dATP, dCTP, dGTP et dTTP, 4 pmoles de chacune des amorces, 2 U de Taq
DNA polymérase), auquel sont ajoutés les divers agents (AI et AD) selon l'invention, mis en oeuvre à différentes concentrations.
Le critère d'amplification minimale acceptable a été fixé comme suit : l'apparition bien visible d'une bande d'ADN double-brin après séparation électrophoré- tique et révélation au bromure d'éthidium sous irradiation UV, ayant les caractéristiques de longueur et de séquence exactes après 40 cycles d'amplification. Pour que les résultats soient parfaitement cohérents, le même segment d'ADN et les mêmes amorces sont utili¬ sées. Dans les expériences positives qui ont été conduites, l'amplification de la cible était supérieure à 100 000. Pour évaluer l'efficacité des additifs (AI et AD) sur l'amplification en chaîne, une étude comparative, suivant quatre modalités ont été réalisées, avec les amorces 1 et 2 et le duplex A précités :
- en présence seulement d'un agent dénaturant ou en présence de deux agents dénaturants (effet de compétition), ou en présence d'un agent isodéstabilisant comme seul additif d'une part et d'autre part, conformément à l'invention :
- en présence d'au moins un agent isodéstabilisant et d'au moins un agent dénaturant. EXEMPLE 1 : Amplification en présence d'au moins un agent dénaturant.
1) tampon contenant en tant qu'additif, seulement un agent déna¬ turant.
Avec la séquence A, les amorces 1 et 2 et sans que cela soit limitatif, il est possible de tracer la droite Tdmin de 0 à 20 % en DMSO avec précision.
Dans la zone à faible teneur en DMSO, quand la température Th de la PCR dépasse une valeur supérieure à 83°C, il est impossible de déterminer Thmin parce que la Taq ADN polymérase ne fonctionne plus correctement (pour une valeur de DMSO inférieure à 5 %), puisqu'on travaille à Te=Th. U est possible de tracer la droite Thmax entre 7 et 20 % de DMSO.
1) tampon sans agent dénaturant ou isodéstabilisant : Td0 (°C) = 92,5°C
2 tampon avec DMSO seulement : Tdmin (°C) = 92,5-0,62 (% DMSO) limite DMSO = 15 %
3) tampon avec glycérol seulement : Tdmin (°C) = 92,5-0,30 (% glycérol) limite glycérol = 30 %.
Les droites Tdmin et Thmax (figures 5 et 6) ont été établies pour des concentrations en chaque agent dénaturant utilisé seul (DMSO de 0 à 20 % et glycérol de
0 à 40 %). Thmax n'est tracé que pour la zone où Th est inférieure à 83°C puisqu'on effectue la réaction enzymatique d'élongation des amorces à la température Te qui est égale à Th (résultats positifs : + ; résultats négatifs : 0).
2) en présence de deux agents dénaturants : effet de compétition : L'expérience est effectuée en ajoutant au milieu réactionnel renfermant un agent dénaturant en concentration déterminée, un deuxième agent dénaturant avec une gamme de concentrations croissantes. L'ensemble des échantillons est amplifié en parallèle avec des amorces longues à deux températures Th et Td. A titre d'exemple, et sans que ce soit limitatif avec la séquence A, les amorces 1 et 2 et les tampons standards, les valeurs sont les suivantes :
1) tampon avec glycérol 5 % et DMSO variable :
Tdmin (°C) = 91,2-0,55 (% DMSO) 2) tampon avec glycérol 8 % et DMSO variable :
Tdmin (°C) = 90,5-0,55 (% DMSO).
La pente observée (0,55) de Tdmin est plus faible que celle qu'on obtient avec DMSO pur (0,62). Ceci montre qu'il n'y a pas additivité de l'action des deux agents dénaturants. On peut émettre l'hypothèse qu'ils sont en compétition pour les mêmes sites de l'ADN.
EXEMPLE 2 : Amplification en présence de N.N.N triméthylglycine.
L'amplification du fragment de 870 pb a été étudiée pour différentes concentrations de N,N,N triméthylglycine variant de 0 à 3 M.
On a établi les droites Tdmin et Thmax pour la N,N,N triméthylglycine seule par une série d'amplifications dont les paramètres sont les suivants : après une première denaturation de 5 minutes à 94°C, on effectue une série de 40 cycles d'amplification (denaturation 1 min 30 à <94 à 85°C>, hybridation 1 min 30 à <80 à 50°C>, élongation 1 min 30 à <80 à 72°C>). Ces cycles sont suivis d'une élongation supplémentaire de 5 minutes à la température d'élongation de l'amplification. L'amplification est ensuite analysée sur gel d'agarose 2 % en tampon
TAE (Tris HCl 40 mM pH 7,8, acétate de sodium 5 mM, EDTA 1 mM) par fluorescence avec le bromure d'éthidium. La longueur des bandes est contrôlée par rapport à des témoins de longueur (marqueur VUE de Boehringer Mannheim).
Pour chaque amplification, les résultats positifs (+) ou négatifs (0), en fonction des températures et de la concentration en N,N,N triméthylglycine sont rapportés dans un diagramme (figure 4), et à la fin de la série d'amplification les droites Tdmin et Thmax peuvent être tracées. Tdo est évalué à 92,7°C
La N,N,N triméthylglycine a donné des résultats intéressants et la même méthodologie qui a été exposée pour déterminer les courbes Tdmin et Thmax a été utilisée pour analyser l'effet de la N,N,N triméthylglycine. L'ajout de N,N,N triméthylglycine au tampon d'amplification a permis de diminuer les températures PCR minimales de denatu¬ ration (Tdmin) des ADN double-brins et les températures maximales d'hybridation des amorces (Thmax). La droite Tdmin peut être tracée avec précision de 0 à 2,5 M et la droite
Thmax (qui n'est pas parallèle à Tdmin), seulement de 1 à 2,5 M. En dessous de 1 M en
N,N,N triméthylglycine, le Thmax est trop élevé pour un fonctionnement correct de l'enzyme (Te = Thmaxo)- Lorsque le tampon comprend de la N,N,N triméthylglycine, la réaction est à une concentration de 1,5 M, les résultats obtenus sont les suivants avec la séquence A et les amorces 1 et 2 : a) tampon sans agent dénaturant ou isodéstabilisant : Tdmin (°C) = 92,7°C Thmax (°C) = limitation 83°C (extrapolation 89°C). b) tampon avec N.N.N triméthylglycine 1.5 M : Tdmin (°C) = 89
Thmax (°C) = 82,5.
L'amplification perd de son efficacité à 2,5 M en N,N,N triméthyl- glycine. En fait, le gain obtenu sur le Tdmin en PCR est de 92,7-89°C=3,7°C (voir figure
4)-
EXEMPLE 3 : Amplification en présence d'un agent isodéstabilisant et d'un agent dénaturant :
Cas de la N,N,N triméthylglycine et de diméthylsulfoxyde (DMSO) : effet synergique :
La supériorité du mélange DMSO-N,N,N triméthylglycine apparaît de différentes façons par l'analyse des droites obtenues.
1) N,N,N triméthylglycine 1,5 M-DMSO (N,N,N triméthylglycine pure, Tdmin : 89°C, voir exemple 2 ; pente DMSO 0,76) : Td (°C) = 89-0,76 (% DMSO) limite DMSO : 15 %.
2) N,N,N triméthylglycine 1,5 M -glycérol : Td (°C) = 89-0,35 (% glycérol) limite glycérol 20 %. Conformément à l'invention et sans que cela soit limitatif, avec le duplex
A des amorces 1 et 2, l'amplification PCR est réalisée avec un excellent résultat à deux températures Td=82°C et Th=70°C, dans le tampon d'amplification classique contenant
1,5 M en N,N,N triméthylglycine et 10 % de DMSO comme additifs. Ceci représente un abaissement de plus de 10°C par rapport au tampon sans additif.
EXEMPLE 4 : Amplification en présence de N,N,N triméthylglycine et de DMSO. a) Détermination des courbes Tdmin et Thmax avec des amorces de 50 bases :
Des amplifications ont été effectuées en présence de N,N,N triméthyl- glycine 1,5 M, de tampon d'amplification standard et avec des concentrations variables de DMSO (de 0 à 18 %), de manière parallèle dans les différents puits du thermocycleur.
Les conditions d'amplification de chaque série sont différentes : après une denaturation initiale de 5 min à 94°C, on effectue 40 cycles (denaturation 1 min 30 pour une série de températures s' échelonnant de 90 à 78°C, hybridation 1 min 30 pour une série de températures s' échelonnant de 78 à 60°C et élongation 1 min 30 pour des températures s'échelonnant de 78 à 72°C). Suit une élongation finale de 5 minutes à la température d'élongation.
Après amplification, on effectue une séparation électrophorétique sur gel d'agarose 2 % dans du tampon TAE. On fait apparaître les bandes d'amplification par fluorescence avec le bromure d'éthidium.
Lorsque l'amplification est positive, c'est que les deux températures Td et Th conviennent. Une amplification négative pour une concentration en DMSO plus faible correspond à des conditions où la température de denaturation est inférieure à la température Tdmin ; une amplification négative pour une concentration de DMSO plus élevée correspond à des conditions où la température d'hybridation est supérieure à Thmax.
On peut ainsi tracer le diagramme des températures Td et Th pour les différentes concentrations de DMSO (figure 7). On obtient ainsi deux droites pratiquement parallèles. Leurs ordonnées à l'origine sont identiques aux valeurs déterminées expérimentalement dans l'exemple précédent pour 1,5 M en N,N,N triméthyl¬ glycine :Td=89°C et Th=78,2°C b) Détermination des courbes Td et Th pour des amorces plus courtes : On effectue les mêmes séries d'amplifications que dans l'exemple précé¬ dent mais à partir d'amorces de 20 bases de longueur. Le fragment d'amplification est de 810 paires de bases, inclus dans le fragment précédent, le contenu en bases GC est de 63,2 %. Les amorces sont :
- amorce 3 : 5' ATG GTT TGC GGT GGG GTG TC 3' (SEQ ID No:4) Tm=59,0°C
- amorce 4 : 5' TAG AGG CGG CGA TGG TTG AA 3' (SEQ ID No:5) Tm=57,9°C Le milieu et les conditions d'amplification (températures et nombre de cycles) sont les mêmes que dans l'exemple précédent. Seules les amorces sont différentes.
Les résultats obtenus sont rapportés dans la figure 8. On remarque que la droite des Td est superposable à la précédente. Ce résultat montre que la température de denaturation concerne le fragment d'amplification et non les amorces, et le fragment amplifié ici est pratiquement identique à celui de l'exemple précédent. En revanche, la droite des Th est abaissée par rapport à celle de l'exemple précédent. Cela est dû à ce que les amorces étant plus courtes, leurs températures d'hybridation sont plus basses. EXEMPLE 5 : Comparaison de l'efficacité de l'additif N,N,N triméthylglycine-
DMSO à l'additif glycérol-DMSO. De façon surprenante, le mélange N,N,N triméthylglycine-DMSO donne des résultats bien supérieurs aux mélanges d'agents dénaturants, actuellement connus. En effet :
1) la N,N,N triméthylglycine seule, à la concentration de 1,5 M, dans un tampon non optimisé, donne des résultats très proches du mélange glycérol 8 %-DMSO 5 % (Tdmin=89°C et 88°C respectivement, avec le duplex A de 870 paires de bases et de 0,67 % en G+C et les amorces 1 et 2).
2) la N,N,N triméthylglycine réduit considérablement l'influence sur le Tm des zones riches en (G+C) selon l'équation ΔT (°C) qui a été proposée. Il est évident que son influence locale sur le Tm de la chaîne d'ADN est d'autant plus grande que la teneur en (G+C) est élevée et par conséquent sur les zones residuaires d'appariement après l'étape de denaturation effectuée à la température Td qui conditionnent beaucoup l'amplification des fragments longs. L'addition de la N,N,N triméthylglycine seule a permis de réaliser l'amplification de séquences minisatellites à très forte teneur en G+C de longueur voisine de 2 kb (voir exemple 6) alors qu'elle n'a pas été obtenue avec l'addition de 10 % de DMSO. Ceci signifie que l'action de la N,N,N triméthylglycine est plus puis- santé que le DMSO dans les segments à très forte teneur en G+C et supérieure à ce qui a été déterminé pour le fragment A d'ADN.
3) pour les mélanges d'agents dénaturants, on observe un effet de compétition (pente de Tdmin du DMSO en présence de glycérol 5 %, a=0,55) alors que pour le mélange N,N,N triméthylglycine DMSO, on observe un effet synergique inattendu (pente de Tdmin du DMSO, a=0,76). La pente du DMSO pur est intermédiaire (a=0,62).
4) la présence de N,N,N triméthylglycine ne semble pas modifier les propriétés du DMSO sur la PCR. Additionné au tampon d'amplification contenant déjà de la N,N,N triméthylglycine, le DMSO n'apparaît pas davantage inhibiteur que s'il était addi¬ tionné à un tampon sans additif. Ceci ouvre une possibilité extraordinaire pour diminuer la température de denaturation des duplex en PCR et, par conséquent, faciliter l'amplification des gènes de grandes dimensions qui ont très fréquemment, une ou plusieurs régions à teneur en G+C très élevées. EXEMPLE 6 : Amplification selon l'invention, en présence d'amorces courtes.
On désigne par amorces courtes, celles qui sont actuellement couram- ment utilisées dans la PCR, c'est-à-dire d'une vingtaine de bases et d'un Tm de 50°C à 63°C
L'enzyme thermostable, par exemple la Taq ADN polymérase, ne fonc¬ tionnant correctement qu'à partir de températures bien supérieures voisines de 70°C, il est impossible d'effectuer la réaction d'élongation des amorces à la même température que celle de leur hybridation. Il faut insérer une température intermédiaire Te (vers 72°C pour la Taq ADN polymérase). La droite Tdmin est la même que celle qui est obtenue avec les amorces longues, puisqu'elle ne dépend que du duplex à amplifier. La droite Thmax est encore parallèle à Tdmin, mais elle est plus éloignée de Tdmin que dans le cas des amorces longues. A titre de comparaison et sans que ce soit limitatif, la séquence A a été amplifiée par PCR avec les sondes 1 et 2 d'une part, et les sondes 3 et 4.
1) Tampon sans agent dénaturant ou déstabilisant : Tdmin (°C) = 92,5 (avec les amorces 1 et 2 ou 3 et 4) amorces 1 et 2, Thmax (°C) = 83,C (limitation due à l'enzyme) amorces 3 et 4, Thmax (°C) = 77,5.
2) Tampon avec N.N.N triméthylglycine 1.5 M : Tdmin (°C) = 89 quel que soit le couple d'amorces Thmax (°C) = 82,5 (amorces 1 et 2) Thmax (°C) = 71 (amorces 3 et 4).
3) Tampon avec N.N.N triméthylglycine 1.5 M et DMSO : Tdmin (°C) = 89-0,76 (% DMSO)
Thmax (°C) = 82,5-0,76 (% DMSO) Thmax (°C) = 71-0,76 (% DMSO). EXEMPLE 7 ; Amplification de minisatellites en présence de N,N,N triméthyl¬ glycine.
Une région minisatellite Ha-Ras du proto-oncogène humain c-Ha-Ras a été amplifiée en présence de N,N,N triméthylglycine. Cette région correspond à quatre allèles principaux (92 à 95 % de la population), de longueur supérieure à 1 kb. Cette région est caractérisée par des répétitions d'une séquence consen¬ sus de 28 paires de bases. Le nombre variable de ces répétitions définit les différents allèles.
Ce fragment répété est très riche en GC, et les amorces d'amplification qui encadrent cette région aussi : - fragment répété : 5' CAC TCC CCC TTC TCT CCA GGG GAC GCC
A 3' (SEQ ID No:6), (GC))=67,9 %
- amorce 1 : 5' GAG CTA GCA GGG CAT GCC GC 3' (SEQ ID No:7) (GC)=70 %, Tm=61,6°C,
- amorce 2 : 5' AGC ACG GTG TGG AAG GAG CC 3' (SEQ ID No: 8) (GC)=65 %, Tm=64,5°C a) Amplification des minisatellites de l'ADN de lymphocytes : Une amplification du fragment Ha-Ras à partir de 50 ng d'ADN de lymphocytes dans 50 ml de solution d'amplification (Kit AM-TAQ, CIS BIO INTERNATIONAL) et en présence de 15 pmoles de chacune des amorces a été effectuée sans adjonction de réactif (1), avec addition de N,N,N triméthylglycine 1,5 M (2), avec addition de DMSO 10 % (3), avec addition de DMSO 5 % (4) ou avec addition de N,N,N triméthylglycine 1,5 M et DMSO 5 % (5) (figure 9). Dans cette figure 9, les bandes VIII et VI représentent respectivement le marqueur de longueur VIII et le marqueur de longueur VI de Boehringer. Après une denaturation de 5 minutes à 94°C, on effectue 30 cycles d'amplification (denaturation 94°C, 1 min 30, hybridation 60°C, 1 min 30, et élongation 70°C, 2 min). Après une élongation supplémentaire de 5 minutes à 70°C, les amplifications sont analysées sur gel d'agarose et fluorescence par le bromure d'éthidium.
Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 9. On note que seules les amplifications en présence de N,N,N triméthylglycine aboutissent à la mise en évidence de l'allèle majoritaire (1 kb). De plus, le mélange N,N,N triméthylglycine-DMSO donne un signal plus net et plus intense. Les amplifications en présence de DMSO seul (5 ou 10 %) ne permettent aucune mise en évidence des différents allèles. Ce réactif seul ne permet pas une bonne denaturation de la séquence riche en GC. b) Amplification des allèles Ha-Ras pour de l'ADN extrait de tumeurs :
Les conditions d'amplifications précédentes, en présence de N,N,N triméthylglycine 1,5 M et de DMSO 5 % sont utilisées pour amplifier les allèles d'une série d'ADN humains extraits soit de tumeurs (bandes 2, 4 et 6), soit du tissu sain correspon¬ dant (bandes 3 et 5), et les ADN extraits des lymphocytes (bande 1) et d'une lignée cellu- laire MDA (bande 7).
Les résultats ont été la mise en évidence des trois allèles principaux : 1 kb, 1,7 kb et >2 kb (figure 10) dans tous les ADNs extraits, avec une excellente spéci¬ ficité : bande 1 : lymphocytes (allèle 1 kb) ; bande 2 : tumeur du sein (allèle 1 kb) ; bande 3 : patient 1, colon sain (allèles 1 kb et 1,7 kb) ; bande 4 : patient 1, tumeur du colon (allèles 1 kb et 1,7 kb) ; bande 5 : patient 2, colon sain (allèles 1 kb et >2 kb) ; bande 6 : patient 2, tumeur du colon (allèles 1 kb et >2 kb) ; bande 7 : lignée MDA (allèle 1 kb). Les bandes VIII et VI représentent respectivement le marqueur de longueur VIII et le marqueur de longueur VI de Boehringer. EXEMPLE 8 : Application d'un tampon conforme à l'invention à la réaction de ligation en chaîne :
Pour le procédé d'amplification LCR (ligase chain reaction) utilisant les tampons d'amplification tels que définis ci-dessus et qui fonctionne à deux températures Td et Th, comme la PCR, les courbes Tdmin et Thmax ont été définies.
La méthode est aussi appliquée au procédé d'amplification LCR avec réparation utilisant les tampons d'amplification tels que définis ci-dessus. EXEMPLE 9 : Application d'un tampon conforme à l'invention à une méthode de détection d'une séquence d'acide nucléique. Une réaction PCR comportant deux amorces portant un facteur de fixa¬ tion est effectuée avec la séquence A et les amorces 1 et 2 pour détecter la présence d'une séquence d'acides nucléiques. Après amplification, cette double chaîne est dénaturée en présence des tampons décrits N,N,N triméthylglycine 1,5 M et DMSO 5 % et les simple- brins fixés sur un support solide, recouvert d'avidine. Puis une sonde portant un marqueur de détection est ajoutée. Le signal colorimétrique est amélioré et il apparaît que ceci se confirme pour les séquences difficiles à dénaturer. Cet exemple est donné à titre indicatif et n'est pas exhaustif. D'autres modes avantageux de fixation et de détection peuvent être utilisés avec succès. EXEMPLE 10 : Amplification de fragments de grande longueur, riches en GC. Des amplifications de grande longueur ont été réalisées à partir d'ADN de Rhodobacter capsulatus, riche en bases GC. La composition moyenne en GC du frag¬ ment étudié est de 64,8 %.
Les amorces d'amplification utilisées ont permis d'amplifier des frag¬ ments de longueur comprise entre 1206 pb et 12798 pb. Amorces :
F10 GCC GTG CTG GCG GGG ATC (SEQ ID No: 9) 64°C
F21 GCT GGA GCG GCT GAT CGA CG (SEQ ID No: 10) 68°C
F22 GAT TGA CCG CTG ATG CTG CGC CGC TTG >70°C
(SEQ ID No: 11) PF4 GTC GCC CCC TAT CTG GCC (SEQ ID No: 12) 62°C
NuoAF TGC TCT AGA CCx GGG GGC AAA AGG GGT CAA AAG <70°C
(SEQ ID No: 13) R35 AGC GCC GGT CCG ATG CTC TC (SEQ ID No: 14) 68°C
R36 AGT CTT CAG ATC AGT ATT CCG TC (SEQ ID No: 15) 66°C
NuoHR CTG GAG CAT AGG AGC ATG AAC GTG AGG TAC CCC G <70°C
(SEQ ID No: 16) Couples amplifiés :
F22 R36 1206 pb FF1100 RR3355 5494 pb F21 NuoHR 7790 pb NuoAF NuoHR 11097 pb PF4 NuoHR 11537 pb FI 0 NuoHR 12798 pb. Protocole d'amplification :
Des amplifications ont été effectuées à partir de 50 ng d'ADN de
Rhodobacter capsulatus dans 50 μl de tampon d'amplification PCR (Tricine 25 mM pH
8,8, acétate de potassium 85 mM, acétate de magnésium 1,5 mM, dATP, dCTP, dGTP et dTTP 200 μM chacun, rTth DNA polymérase XL (Perkin Elmer Cetus) 4 unités) conte- nant de la bétaïne 1,4 M, du DMSO 5 % et 20 pmoles de chacune des amorces.
Après une denaturation de 1 minute à 94°C, on a effectué 30 cycles d'amplification comprenant 30 secondes de denaturation à 94°C, 1 minute d'hybridation à
65°C et 3 à 7 minutes d'élongation à 72°C Après une incubation supplémentaire de 5 minutes à 72°C, les produits d'amplification sont conservés à 8°C jusqu'au contrôle sur gel.
5 μl de chacun des solutions d'amplification sont analysés sur gel d'agarose à 0,6 % additionné de bromure d'éthidium, dans du tampon TAE IX. Après migration 1 heure 30 à 30 volts, les gels sont observés sous irradiation UV à 254 nm puis photographiés. Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 11. On peut noter que des fragments, même très longs (12798 pb) sont amplifiés sans la technique « hot start », avec de bons rendements et avec une excellente spécificité.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nulle- ment à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: CIS BIO INTERNATIONAL
(B) RUE: RN 306
(C) VILLE: SACLAY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 91400
(A) NOM: FOUQUE Brigitte
(B) RUE: 3 rue Aristide Berges
(C) VILLE: SEYSSINET
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 38170
(A) NOM: TEOULE Robert
(B) RUE: 52 rue Thiers
(C) VILLE: GRENOBLE
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 38000
(ii) TITRE DE L' INVENTION: TAMPON, PROCEDE ET METHODE
D'EVALUATION DES CONDITIONS OPTIMALES, D'AMPLIFICATION
DE SEQUENCES CIBLES D'ACIDE NUCLEIQUE, ET LEURS APPLICATIONS.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 16
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE LA DEMANDE: FR 9505053
(B) DATE DE DEPOT: 27-APR-1995
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 870 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: CCGATCATCA GGGCCACCGC GAGGGCCCCG ATGGTTTGCG GTGGGGTGTC GAGTCGATCT 60 GCACACAGCT GACCGAGCTG GGTGTGCCGA TCGCCCCATC GACCTACTAC GACCACATCA 120 ACCGGGAGCC CAGCCGCCGC GAGCTGCGCG ATGGCGAACT CAAGGAGCAC ATCAGCCGCG 180 TCCACGCCGC CAACTACGGT GTTTACGGTG CCCGCAAAGT GTGGCTAACC CTGAACCGTG 240 AGGGCATCGA GGTGGCCAGA TGCACCGTCG AACGGCTGAT GACCAAACTC GGCCTGTCCG 300 GGACCACCCG CGGCAAAGCC CGCAGGACCA CGATCGCTGA TCCGGCCACA GCCCGTCCCG 360 CCGATCTCGT CCAGCGCCGC TTCGGACCAC CAGCACCTAA CCGGCTGTGG GTAGCAGACC 420 TCACCTATGT GTCGACCTGG GCAGGGTTCG CCTACGTGGC CTTTGTCACC GACGCCTACG 480 TCGCAGGATC CTGGGCTGGC GGGTCGCTTC CACGATGGCC ACCTCCATGG TCCTCGACGC 540 GATCGAGCAA GCCATCTGGA CCCGCCAACA AGAAGGCGTA CTCGACCTGA AAGACGTTAT 600 CCACCATACG GATAGGGGAT CTCAGTACAC ATCGATCCGG TTCAGCGAGC GGCTCGCCGA 660 GGCAGGCATC CAACCGTCGG TCGGAGCGGT CGGAAGCTCC TATGACAATG CACTAGCCGA 720 GACGATCAAC GGCCTATACA AGACCGAGCT GATCAAACCC GGCAAGCCCT GGCGGTCCAT 780 CGAGGATGTC GAGTTGGCCA CCGCGCGCTG GGTCGACTGG TTCAACCATC GCCGCCTCTA 840 CCAGTACTGC GGCGACGTCC CGCCGGTCGA 870
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
• (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 50 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: CCGATCATCA GGGCCACCGC GAGGGCCCCG ATGGTTTGCG GTGGGGTGTC 50
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 50 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: TCGACCGGCG GGACGTCGCC GCAGTACTGG TAGAGGCGGC GATGGTTGAA 50
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: ATGGTTTGCG GTGGGGTGTC 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: TAGAGGCGGC GATGGTTGAA 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 28 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: CACTCCCCCT TCTCTCCAGG GGACGCCA 28 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: GAGCTAGCAG GGCATGCCGC 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: AGCACGGTGT GGAAGGAGCC 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: GCCGTGCTGG CGGGGATC 18
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: GCTGGAGCGG CTGATCGACG 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: GATTGACCGC TGATGCTGCG CCGCTTG 27
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: GTCGCCCCCT ATCTGGCC 18
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: TGCTCTAGAC CNGGGGGCAA AAGGGGTCAA AAG 33 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14: AGCGCCGGTC CGATGCTCTC 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15: AGTCTTCAGA TCAGTATTCC GTC 23
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 34 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: CTGGAGCATA GGAGCATGAA CGTGAGGTAC CCCG 34

Claims

REVENDICATIONS 1°) Tampon, apte à être mis en oeuvre dans un procédé d'amplification d'au moins une séquence cible d'acide nucléique, du type comprenant n cycles, chacun desdits cycles incluant une étape de denaturation de la séquence cible double-brin, réalisée à une température de denaturation Td, une étape d'hybridation entre la séquence cible simple-brin et au moins une amorce appropriée, réalisée à une température d'hybridation Th et une étape d'élongation de l'amorce ayant hybride, en présence d'une enzyme d'élongation d'acide nucléique et à une température d'élongation Te, lequel tampon est caractérisé en ce qu'il comprend, outre les constituants d'un tampon d'amplification standard, un mélange d'au moins un agent isodéstabilisant (AI) et d'au moins un agent dénaturant (AD), présents à des concentrations aptes à réduire la température de fusion Tm de la séquence cible d'acide nucléique double-brin, conformément à la formule 4 ci- après : Tm (°C)=81,5+0,41(% G+C)-ΔTmAi-675/N+16,6.1ogM-ΔTmAD (formule 4), dans laquelle : G+C),(molarité de AI)] (formule 1), ΔTmAD=d(% agent dénaturant)(formule 3), M : molarité du/des cations monovalents présents dans le tampon, N : nombre de nucléotides, et d : coefficient d'efficacité de l'agent dénaturant (AD), pour diminuer au moins la tem¬ pérature de denaturation Td de ladite séquence cible d'acide nucléique double-brin, et ce tout en permettant un bon fonctionnement de la réaction enzymatique d'élongation des amorces. 2°) Tampon selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent iso- déstabilisant est sélectionné dans le groupe constitué par les halogénures d'alkylammonium, les ions dipolaires (zwitterions) et les N-oxydes de trialky lamine. 3°) Tampon selon la revendication 2, caractérisé en ce que le zwitterion est, de préférence la N,N,N triméthylglycine. 4°) Tampon selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent déna¬ turant est sélectionné dans le groupe constitué par le diméthylsulfoxyde (DMSO), le gly¬ cérol, le formamide, le diméthylformamide (DMF), les uréides, les polyols et les déter¬ gents. 5°) Tampon selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit mélange est constitué de N,N,N triméthylglycine et de DMSO. 6°) Tampon selon la revendication 5, caractérisé en ce que la concentra¬ tion en N,N,N triméthylglycine est comprise entre 0,05 et 4 M, de préférence entre 1 et 2,5 M, et la concentration en DMSO est comprise entre 0,5 et 15 %, de préférence entre 5 et 10 %. 7°) Tampon selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit mélange est constitué d'un agent isodéstabilisant et de deux agents déna¬ turants. 8°) Tampon selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit mélange est constitué de N,N,N triméthylglycine, de DMSO et de glycérol. 9°) Tampon selon la revendication 8, caractérisé en ce que la concen¬ tration en N,N,N triméthylglycine est comprise entre 0,05 et 4 M, de préférence entre 1 et 2,5 M, la concentration en DMSO est comprise entre 0,5 et 15 %, de préférence entre 5 et 10 % et la concentration en glycérol est comprise entre 1 et 30 %, de préférence entre 3 et 20 %. 10°) Tampon selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caracté¬ risé en ce qu'il est mis en oeuvre dans un procédé d'amplification en chaîne par polymé¬ rase. 11°) Tampon selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caracté- risé en ce qu'il est mis en oeuvre dans un procédé d'amplification en chaîne par ligase. 12°) Tampon selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caracté¬ risé en ce qu'il est mis en oeuvre dans un procédé d'amplification en chaîne par ligase avec réparation. 13°) Application d'un tampon selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, à l'amplification de séquences cibles d'acide nucléique contenant plus de 100 bases, de préférence plus de 1000 bases et/ou à haute teneur en bases G+C. 14°) Procédé d'amplification en chaîne d'au moins une séquence cible d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un tampon selon l'une quelconque des revendications 1 à 12. 15°) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique cible contient plus de 100 bases, de préférence plus de 1000 bases et/ou présente une haute teneur en bases G+C. 16°) Procédé selon la revendication 14 ou la revendication 15, pour l'amplification en chaîne, du type PCR comprenant n cycles, chacun desdits cycles incluant une étape de denaturation de la séquence cible double-brin, réalisée à une température de denaturation Td, une étape d'hybridation entre la séquence cible simple-brin et au moins une amorce appropriée, réalisée à une température d'hybridation Th et une étape d'élon- gation de l'amorce hybridée, en présence d'une ADN polymérase et à une température d'élongation Te, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un tampon selon la revendication 10. 17°) Procédé d'amplification selon la revendication 16, caractérisé en ce que chaque cycle est effectué avec deux températures Td (température de denaturation) et Th (température d'hybridation) = Te (température d'élongation), ledit procédé étant, de préférence, mis en oeuvre en présence d'amorces comprenant plus de 30 nucléotides, et dont la température de fusion Tm est élevée. 18°) Procédé d'amplification LCR (ligase chain reaction) d'au moins une séquence cible d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un tampon d'amplification selon la revendication 11. 19°) Procédé d'amplification LCR avec réparation, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un tampon d'amplification selon la revendication 12. 20°) Méthode d'évaluation des conditions optimales à mettre en oeuvre dans un procédé d'amplification selon l'une quelconque des revendications 14 à 19, carac- 43 térisée en ce qu'elle comprend le tracé du diagramme des températures définissant les domaines de Td et Th (température maximale et minimale de l'amplification), conformé¬ ment aux étapes suivantes :
(1) la réalisation : - de la droite des températures minimales de denaturation (Tdmin) des duplex d'acide nucléique cible, du type Tdminn=Tdo-byn, dans laquelle Tdminn représente la valeur de la température minimale de denaturation pour une concentration yn en agent isodéstabilisant, Tdo représente la valeur de la température minimale de denaturation en l'absence d'additif (agent déstabilisant ou agent dénaturant) et b représente la pente de la droite et
- de la droite des températures maximales d'hybridation des amorces (Thmaxn), en fonction de la concentration yn en agent isodéstabilisant et en l'absence d'agent dénaturant,
(2) la sélection d'au moins une concentration yn en agent isodéstabili- sant, pour laquelle la température de denaturation Td et la température d'hybridation Th satisfont aux conditions suivantes : Td>Tdminn>Thπ_axn>Th,
(3) la réalisation :
- de la droite des températures minimales de denaturation (Tdmin) des duplex d'acide nucléique cible, du type Tdminj≈Tdo-axi, dans laquelle Tdminj représente la valeur de la température minimale de denaturation pour une concentration x, en agent dénaturant et pour la concentration yn choisie en agent isodéstabilisant à l'étape (2), Tdo représente la valeur de la température minimale de denaturation en l'absence d'additif (agent déstabilisant ou agent dénaturant) et a représente la pente de la droite et
- de la droite des températures maximales d'hybridation des amorces (Thmax,), en fonction de la concentration en agent dénaturant x_ et pour la concentration yn sélectionnée à l'étape (2) en agent isodéstabilisant,
(4) la sélection d'au moins une concentration en agent dénaturant, pour laquelle Td et Th satisfont également aux conditions suivantes : Td>Tdminn>Thmaχn>Th et (5) la préparation d'un tampon d'amplification conforme à l'invention, dans lequel l'agent isodéstabilisant et l'agent dénaturant sont aux concentrations sélec¬ tionnées aux étapes (2) et (4) ci-dessus.
21°) Méthode d'évaluation selon la revendication 20, caractérisée en ce que lorsque les amorces sont courtes et de point de fusion faible, une étape d'élongation intermédiaire des amorces à une température Te est mise en oeuvre, avec Td>Te>Th et avec Te, le plus près possible de la température optimale de fonctionnement de l'enzyme d'élongation.
22°) Procédé de détection d'au moins une séquence d'acide nucléique cible, mettant en oeuvre au moins une étape d'amplification par une méthode d'amplification en chaîne en présence d'amorces appropriées et une étape d'hybridation avec une sonde convenable, lequel procédé est caractérisé en ce que lors de l'étape d'amplification, l'on met en oeuvre un tampon selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. 23°) Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que ladite séquence d'acide nucléique cible comprend plus de 100 bases, de préférence plus de 1000 bases et/ou présente une haute teneur en bases G+C.
24°) Procédé selon la revendication 22 ou la revendication 23, caracté¬ risé en ce que lors de l'étape d'amplification, l'on met en oeuvre deux amorces portant un facteur de fixation, pour détecter la présence de la séquence d'acide nucléique amplifiée.
25°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 22 à 24, carac¬ térisé en ce qu'après ladite amplification, cette double chaîne est dénaturée en présence d'un tampon selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, et les simple-brins fixés sur un support solide, puis une sonde portant un marqueur de détection est ajoutée. 26°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 22 à 25, carac¬ térisé en ce que le facteur de fixation est la biotine ou un haptène et la détection est fluo¬ rescente, colorimétrique, luminescente ou électrochimique. 27°) Kit d'amplification d'au moins une séquence cible d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il inclut un tampon selon l'une quelconque des revendica¬ tions 1 à 9.
28°) Kit de détection d'au moins une séquence cible d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il inclut un tampon selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
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