JPH02231100A - 伸長されたヌクレオチド配列 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は一般的には、ゲノムＤＮＡ試料を解析する方法
および該方法で使用されるヌクレオチド配列に関するも
のである。本発明は特に、含情報遺伝子座位に隣接した
領域にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含む
ヌクレオチド配列の使用に関するものである。本発明の
方法は例えば父権争議、法医学あるいは遺伝的疾患や素
因の予防、診断および治療に使用することができる。本
発明は、ゲノムＤＮＡ試料中にただ一分子の含情報座位
しか存在しないような場合にも用いることができる。
および該方法で使用されるヌクレオチド配列に関するも
のである。本発明は特に、含情報遺伝子座位に隣接した
領域にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含む
ヌクレオチド配列の使用に関するものである。本発明の
方法は例えば父権争議、法医学あるいは遺伝的疾患や素
因の予防、診断および治療に使用することができる。本
発明は、ゲノムＤＮＡ試料中にただ一分子の含情報座位
しか存在しないような場合にも用いることができる。
遺伝的解析法は本分野では既に知られている。
英国特許第２１６８４４５号（リスター・インスティテ
ユート）では、ヒトなどの動物および植物のゲノム中の
多数の多型性部位（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｉｔｅ
ｓ）に同時にハイブリダイズして、目印をつけた異なる
分子量のＤＮＡバンドからなる″ＤＮＡフィンガープリ
ント”の作成を可能にするプローブとして使用できる多
様なＤＮＡ配列について述べている。ＤＮＡフィンガー
プリントは全体としては、その個体に特徴的であり、異
なるバンドの由来はその個体の祖先から追跡することが
でき、特定の場合にはある遺伝的疾患と関連するものと
して見なすことができる。ヨーロッパ特許出願出版番号
第２３８３２９号では、ヒトなどの動物ゲノム中の個々
の多型性部位に独立にハイブリダイズするプローブとし
て使用される多様なＤＮＡ配列について記述している。
ユート）では、ヒトなどの動物および植物のゲノム中の
多数の多型性部位（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｉｔｅ
ｓ）に同時にハイブリダイズして、目印をつけた異なる
分子量のＤＮＡバンドからなる″ＤＮＡフィンガープリ
ント”の作成を可能にするプローブとして使用できる多
様なＤＮＡ配列について述べている。ＤＮＡフィンガー
プリントは全体としては、その個体に特徴的であり、異
なるバンドの由来はその個体の祖先から追跡することが
でき、特定の場合にはある遺伝的疾患と関連するものと
して見なすことができる。ヨーロッパ特許出願出版番号
第２３８３２９号では、ヒトなどの動物ゲノム中の個々
の多型性部位に独立にハイブリダイズするプローブとし
て使用される多様なＤＮＡ配列について記述している。
このようなプローブを一つ以上用いる遺伝的解析法が記
述されている。
述されている。
脊椎動物のＤＮＡ中のタンデム反復性ミニサテライト領
域はしばしば反復ユニット数において高レベルのアリル
多様性を示す（１〜４）。多様なミニサテライトを検出
し、個体特異的なＤＮＡフィンガープリントを産生でき
るハイブリダイゼーションブローブ（５〜７）、および
、個体超可変座位に対する座位特異的ブローブを与える
クローン化されたヒトミニサテライト（５，８〜１０）
が開発された。これらの高度に情報を含む遺伝的マーカ
ーは、連鎖解析（９． １１〜１３） 父権や移民争
議などにおける血縁関係の決定（６， １０， １４．
１５）、骨髄移植の追跡（１Ｂ， ｌ７） 、および法
医学における固体の同定（１０． １８． １９）を含
む遺伝学の多くの分野で広く応用されることが示されて
きた。しかしながら、座位特異的ミニサテライトプロー
ブでの分類には比較的分解されていないヒトＤＮＡが少
なくとも５０ｎｇ必要であり（１０） 、複数座位ＤＮ
Ａフィンガープリントプローブでの分析には０．０１μ
ｇのＤＮＡが必要である（６）ことから、血液および精
液や毛根などの法医学的試料の分類への応用は、ハイブ
リダイゼーションプローブの感度によって制約されてい
る。
域はしばしば反復ユニット数において高レベルのアリル
多様性を示す（１〜４）。多様なミニサテライトを検出
し、個体特異的なＤＮＡフィンガープリントを産生でき
るハイブリダイゼーションブローブ（５〜７）、および
、個体超可変座位に対する座位特異的ブローブを与える
クローン化されたヒトミニサテライト（５，８〜１０）
が開発された。これらの高度に情報を含む遺伝的マーカ
ーは、連鎖解析（９． １１〜１３） 父権や移民争
議などにおける血縁関係の決定（６， １０， １４．
１５）、骨髄移植の追跡（１Ｂ， ｌ７） 、および法
医学における固体の同定（１０． １８． １９）を含
む遺伝学の多くの分野で広く応用されることが示されて
きた。しかしながら、座位特異的ミニサテライトプロー
ブでの分類には比較的分解されていないヒトＤＮＡが少
なくとも５０ｎｇ必要であり（１０） 、複数座位ＤＮ
Ａフィンガープリントプローブでの分析には０．０１μ
ｇのＤＮＡが必要である（６）ことから、血液および精
液や毛根などの法医学的試料の分類への応用は、ハイブ
リダイゼーションプローブの感度によって制約されてい
る。
テスト試料中に試料ＤＮＡが十分世含まれている場合に
は、上記の開示は有効で信頼し得る遺伝的解析法を与え
る。しかし、テストＤＮＡ分子がわずかなコピー数しか
人手できない法医学的応用などで、テスト試料中のゲノ
ムＤＮＡｉが限られている場合には上記の技術の有用性
は低下する。
は、上記の開示は有効で信頼し得る遺伝的解析法を与え
る。しかし、テストＤＮＡ分子がわずかなコピー数しか
人手できない法医学的応用などで、テスト試料中のゲノ
ムＤＮＡｉが限られている場合には上記の技術の有用性
は低下する。
したがって、微量のゲノムＤＮＡ試料に特に適した遺伝
的解析法をさらに開発することが望まれている。
的解析法をさらに開発することが望まれている。
Ｋ．クレップ（Ｋｌｅｐｐｅ）らはＪ． Ｍｏｌ． Ｂ
ｌｏｔ．（１９７１）， ５６， ３４１−３６１で望
みのＤＮＡ配列の増幅法を示した。この方法はＤＮＡ二
本鎖を変性させて一本鎖を形成させることを含む。変性
過程は、目的とするＤＮＡ配列に隣接した領域にハイブ
リダイズする二つの核酸プライマーが大過剰量存在する
中で行なわれる。冷却の際に、それぞれプライマーと適
当に結合した全長の鋳型鎖を含む二つの構造体が得られ
る。ＤＮＡポリメラーゼおよび適量の必要な各ヌクレオ
チド３リン酸を加え、それによって元の二本鎖が２分子
得られる。変性、プライマー結合、および伸長の上記の
サイクルを、適当なコピー数の目的のＤＮＡ配列が得ら
れるまで繰り返す。プライマー濃度の適正化が必要であ
ることが示唆されている。
ｌｏｔ．（１９７１）， ５６， ３４１−３６１で望
みのＤＮＡ配列の増幅法を示した。この方法はＤＮＡ二
本鎖を変性させて一本鎖を形成させることを含む。変性
過程は、目的とするＤＮＡ配列に隣接した領域にハイブ
リダイズする二つの核酸プライマーが大過剰量存在する
中で行なわれる。冷却の際に、それぞれプライマーと適
当に結合した全長の鋳型鎖を含む二つの構造体が得られ
る。ＤＮＡポリメラーゼおよび適量の必要な各ヌクレオ
チド３リン酸を加え、それによって元の二本鎖が２分子
得られる。変性、プライマー結合、および伸長の上記の
サイクルを、適当なコピー数の目的のＤＮＡ配列が得ら
れるまで繰り返す。プライマー濃度の適正化が必要であ
ることが示唆されている。
上記の方法は現在、米国特許第４６８３１９５号および
第４６８３２０２号で記載されているように、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙａ＋ｅｒａｓｅ ｃｈａ１ｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）と呼ばれており、それによ
れば、鋳型上の与えられた核酸配列の増幅はＴａｑポリ
メラーゼあるいは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼｇのクレノ
ー断片の存在下で核酸プライマーの伸長によって行なわ
れる。増幅過程は一般的には約５０サイクルまで繰り返
される。与えられた実施例は、一般的には数百塩基対の
短いＤＮＡ配列に関するもののみである。
第４６８３２０２号で記載されているように、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙａ＋ｅｒａｓｅ ｃｈａ１ｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）と呼ばれており、それによ
れば、鋳型上の与えられた核酸配列の増幅はＴａｑポリ
メラーゼあるいは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼｇのクレノ
ー断片の存在下で核酸プライマーの伸長によって行なわ
れる。増幅過程は一般的には約５０サイクルまで繰り返
される。与えられた実施例は、一般的には数百塩基対の
短いＤＮＡ配列に関するもののみである。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ，（２０））によるＤＮ
Ａの酵素的増幅によって、極少量のヒトＤＮＡなどの解
析が可能になる。高温で安定なＴａｑボリメラーゼの注
目すべき特異性によって、ＰＣＲは非常に単純化され（
２１）、ヒトＤＮＡ多型性のいくつかのクラスの分類が
、単一の毛根（２２）および個々の体細胞および精子（
２３）にまで拡張して応用されるようになった。現在の
ほとんどの仕事では、ＰＣＲは通常数百塩基対の短い領
域のヒ｝ＤＮＡの増幅に用いられてきた（２１〜２３）
。塩基置換多型性は、ＰＣＲ産物をアリル特異性オリゴ
ヌクレオチドとハイブリダイズさせること（２２，２３
）、ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列解析（２４）、あるいは、
塩基置換が制限酵素部位に影響を与える場合にはＰＣＲ
産物の制限酵素による切断（２５）によって検出するこ
とができる。欠失／挿入多型性は同様にゲル電気泳動に
よるＰＣＲ産物の長さを調べることにより解析し得る（
２２）。しかしながら、これらのマーカー系のほとんど
は二型性であり、ヒト集団中での比較的低い多様性のた
めに、法医学などにおけるその利用は制限されている。
Ａの酵素的増幅によって、極少量のヒトＤＮＡなどの解
析が可能になる。高温で安定なＴａｑボリメラーゼの注
目すべき特異性によって、ＰＣＲは非常に単純化され（
２１）、ヒトＤＮＡ多型性のいくつかのクラスの分類が
、単一の毛根（２２）および個々の体細胞および精子（
２３）にまで拡張して応用されるようになった。現在の
ほとんどの仕事では、ＰＣＲは通常数百塩基対の短い領
域のヒ｝ＤＮＡの増幅に用いられてきた（２１〜２３）
。塩基置換多型性は、ＰＣＲ産物をアリル特異性オリゴ
ヌクレオチドとハイブリダイズさせること（２２，２３
）、ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列解析（２４）、あるいは、
塩基置換が制限酵素部位に影響を与える場合にはＰＣＲ
産物の制限酵素による切断（２５）によって検出するこ
とができる。欠失／挿入多型性は同様にゲル電気泳動に
よるＰＣＲ産物の長さを調べることにより解析し得る（
２２）。しかしながら、これらのマーカー系のほとんど
は二型性であり、ヒト集団中での比較的低い多様性のた
めに、法医学などにおけるその利用は制限されている。
上述のように、ＰＣＲは比較的短いＤＮＡ配列の増幅に
限られており、長いＤＮＡ配列の正確な再生が特に必要
な場合に、長いＤＮＡ配列に関してＰＣＲが正しく機能
するかどうかは深刻な疑問である。実際、２ｋｂがＰＣ
Ｈの絶対的な限界であると言われてきた（２１）。しか
し、高度に情報を含む超可変領域に見られるような特定
のコアあるいはコンセンサス配列のタンデム反復などの
反復配列を試料ＤＮＡが含む場合にはさらに困難が生じ
る。すなわち、増幅産物間のハイブリダイゼーションが
起こり、ネットワーク化およびアニールした部位でＰＣ
Ｒ反応の途中での停止が行なわれることが予想される。
限られており、長いＤＮＡ配列の正確な再生が特に必要
な場合に、長いＤＮＡ配列に関してＰＣＲが正しく機能
するかどうかは深刻な疑問である。実際、２ｋｂがＰＣ
Ｈの絶対的な限界であると言われてきた（２１）。しか
し、高度に情報を含む超可変領域に見られるような特定
のコアあるいはコンセンサス配列のタンデム反復などの
反復配列を試料ＤＮＡが含む場合にはさらに困難が生じ
る。すなわち、増幅産物間のハイブリダイゼーションが
起こり、ネットワーク化およびアニールした部位でＰＣ
Ｒ反応の途中での停止が行なわれることが予想される。
このような不完全なＰＣＲ産物は、相補的なミニサテラ
イト鎖との予定外のアニーリングによって次の増幅サイ
クルの際に伸長反応の基質として働き得る。これにより
、多様な疑似増幅産物が生成されることになる。ミニサ
テライト、特に多くの反復ユニットを含む長いミニサテ
ライトアリルの増幅へのＰＣＨの応用は、したがって配
列の正確さを失い、非常に多様な増幅産物が得られるた
め、このような過程の結果は無意味でかつ最初のゲノム
ＤＮＡ中のミニサテライトアリルを正確には反映しなく
なると予想される。
イト鎖との予定外のアニーリングによって次の増幅サイ
クルの際に伸長反応の基質として働き得る。これにより
、多様な疑似増幅産物が生成されることになる。ミニサ
テライト、特に多くの反復ユニットを含む長いミニサテ
ライトアリルの増幅へのＰＣＨの応用は、したがって配
列の正確さを失い、非常に多様な増幅産物が得られるた
め、このような過程の結果は無意味でかつ最初のゲノム
ＤＮＡ中のミニサテライトアリルを正確には反映しなく
なると予想される。
Ｅ．ベアウィンクル（Ｂｏｅｒｖｉｎｋｌｅ）とＬ．チ
ャン（Ｃｈａｎ）はニューオリンズでの米国ヒト遺伝学
会の第３９回年会の要旨集（１９８８年１０月） （
Ａｂｓｔｒａｃｔ（０５４８） １２． ５）でタンデ
ム反復超可変部位へのＰＣＨの試料について言及してい
るが、彼らが用いた標的領域の大きさは比較的小さく、
常に１キロ塩基対以下であった。さらに、彼らは配列を
正確に再生し、また意味があり正確な結果を出すための
ＰＣＲ法の適用法については述べていない。
ャン（Ｃｈａｎ）はニューオリンズでの米国ヒト遺伝学
会の第３９回年会の要旨集（１９８８年１０月） （
Ａｂｓｔｒａｃｔ（０５４８） １２． ５）でタンデ
ム反復超可変部位へのＰＣＨの試料について言及してい
るが、彼らが用いた標的領域の大きさは比較的小さく、
常に１キロ塩基対以下であった。さらに、彼らは配列を
正確に再生し、また意味があり正確な結果を出すための
ＰＣＲ法の適用法については述べていない。
方、Ｓ．オーデルベルグ（Ｏｄｅｌｂｅｒｇ）らは、米
国法医科学アカデミーへの報告（１９８８年２月）で、
大きなミニサテライトへのＰＣＨの応用が成功しなかっ
たことを述べ、検出された増幅産物の多様性の観点から
ＰＣＲを用いて意味のある、あるいは有用な結果を得る
ことはできないことにより、上述の予想された難点が確
証された。
国法医科学アカデミーへの報告（１９８８年２月）で、
大きなミニサテライトへのＰＣＨの応用が成功しなかっ
たことを述べ、検出された増幅産物の多様性の観点から
ＰＣＲを用いて意味のある、あるいは有用な結果を得る
ことはできないことにより、上述の予想された難点が確
証された。
本発明は、目的の増幅産物が検出には十分量産生される
が相補的なタンデム反復鋳型鎖間の実質的に予定外のハ
イブリダイゼーションが行なわれるには不十分な収量で
あるようにあ．る一定の枠内で増幅を行なうことによっ
て、ゲノムＤＮＡ試料中のわずかに１分子の含情報遺伝
子座位からも幾度も正確に増幅を行なって、遺伝的解析
の口的に有用な増幅産物を得ることができるという発見
に基づいている。本発明の一つの特徴は、一つ以上のコ
ントロールと比較することによりゲノムＤＮＡのテスト
試料を解析する方法を与えることであり、該方法は、 （１）増幅する各含情報座位に関するプライマーとテス
ト試料をハイブリダイズさせることであって、該プライ
マーは、テスト試料の一方の鎖に相補的でミニサテライ
ト配列にわたるプライマーの伸長産物が合成されるよう
な条件下で増幅される含情報座位のミニサテライト配列
に隣接する領域にハイブリダイズすることが可能である
こと；（１１）上記のように形成された伸長産物をそれ
が合成された鋳型から分離して一本鎖分子を得ること； （ｉｉｉ）必要であれば、ステップ（１１）によって得
られた一本鎖分子の少なくとも一つの鋳型からプライマ
ー伸長産物が合成されるような条件下で、ステップ（１
）のプライマーをステップ（１１）で得られた一本鎖分
子とハイブリダイズさせること；および、 （ｉｖ）増幅産物を検出すること、およびそれを一つ以
上のコントロールと比較すること；によってテスト試料
中の少なくとも一つの含情報座位のミニサテライト配列
を増幅することを含むものであって、 該方法は目的の伸長産物を検出するには十分量産生する
が、相補的なミニサテライト鋳型鎖間の予定外のハイブ
リダイゼーションが行なわれるには不十分な伸長産物量
となるように行なわれる。
が相補的なタンデム反復鋳型鎖間の実質的に予定外のハ
イブリダイゼーションが行なわれるには不十分な収量で
あるようにあ．る一定の枠内で増幅を行なうことによっ
て、ゲノムＤＮＡ試料中のわずかに１分子の含情報遺伝
子座位からも幾度も正確に増幅を行なって、遺伝的解析
の口的に有用な増幅産物を得ることができるという発見
に基づいている。本発明の一つの特徴は、一つ以上のコ
ントロールと比較することによりゲノムＤＮＡのテスト
試料を解析する方法を与えることであり、該方法は、 （１）増幅する各含情報座位に関するプライマーとテス
ト試料をハイブリダイズさせることであって、該プライ
マーは、テスト試料の一方の鎖に相補的でミニサテライ
ト配列にわたるプライマーの伸長産物が合成されるよう
な条件下で増幅される含情報座位のミニサテライト配列
に隣接する領域にハイブリダイズすることが可能である
こと；（１１）上記のように形成された伸長産物をそれ
が合成された鋳型から分離して一本鎖分子を得ること； （ｉｉｉ）必要であれば、ステップ（１１）によって得
られた一本鎖分子の少なくとも一つの鋳型からプライマ
ー伸長産物が合成されるような条件下で、ステップ（１
）のプライマーをステップ（１１）で得られた一本鎖分
子とハイブリダイズさせること；および、 （ｉｖ）増幅産物を検出すること、およびそれを一つ以
上のコントロールと比較すること；によってテスト試料
中の少なくとも一つの含情報座位のミニサテライト配列
を増幅することを含むものであって、 該方法は目的の伸長産物を検出するには十分量産生する
が、相補的なミニサテライト鋳型鎖間の予定外のハイブ
リダイゼーションが行なわれるには不十分な伸長産物量
となるように行なわれる。
形成された伸長産物をそれが合成された鋳型から分離す
ることによって得られた一本鎖分子の少なくとも一方に
プライマーをハイブリダイズさせ、つぎにさらに伸長産
物を合成するというサイクルを、一つには検出するのに
十分な伸長産物を生成するように、もう一つには相補的
なミニサテライト鋳型鎖間の予定外のハイブリダイゼー
ションが行なわれるには不十分な伸長産物を生成するよ
うに、必要とされるだけの回数繰り返し可能であること
は理解されるであろう。
ることによって得られた一本鎖分子の少なくとも一方に
プライマーをハイブリダイズさせ、つぎにさらに伸長産
物を合成するというサイクルを、一つには検出するのに
十分な伸長産物を生成するように、もう一つには相補的
なミニサテライト鋳型鎖間の予定外のハイブリダイゼー
ションが行なわれるには不十分な伸長産物を生成するよ
うに、必要とされるだけの回数繰り返し可能であること
は理解されるであろう。
各含情報座位に関して一つのプライマーを用いて本発明
の方法を実施する場合には、増幅に先立ちゲノムＤＮＡ
テスト試料を制限酵素処理することが有用である。一つ
の含情報座位に関して唯一つのプライマーが用いられる
ことによって、様々な長さの伸長産物が形成されること
が予測される。
の方法を実施する場合には、増幅に先立ちゲノムＤＮＡ
テスト試料を制限酵素処理することが有用である。一つ
の含情報座位に関して唯一つのプライマーが用いられる
ことによって、様々な長さの伸長産物が形成されること
が予測される。
例えば、同一の５′末端を有するが異なる３′末端を持
つような一連の産物が形成される。制限消化が行なわれ
るならば、いかなる適当な制限エンドヌクレアーゼも使
用可能である。適当な含情報座位に隣接した配列は既知
であり、既知の制限酵素の認識配列も知られているので
、専門家は容易に使用できる適当な制限酵素を選択でき
るであろう。各含情報座位に関して唯一つのプライマー
が用いられる場合には足し算的な増幅が行なわれるが、
このようなプライマーを二つ用いる場合には対数的な増
幅が得られるであろう。本発明の方法は、したがって、
増幅される各含情報座位に関して二つのプライマーを用
いて行なうことが望ましい。
つような一連の産物が形成される。制限消化が行なわれ
るならば、いかなる適当な制限エンドヌクレアーゼも使
用可能である。適当な含情報座位に隣接した配列は既知
であり、既知の制限酵素の認識配列も知られているので
、専門家は容易に使用できる適当な制限酵素を選択でき
るであろう。各含情報座位に関して唯一つのプライマー
が用いられる場合には足し算的な増幅が行なわれるが、
このようなプライマーを二つ用いる場合には対数的な増
幅が得られるであろう。本発明の方法は、したがって、
増幅される各含情報座位に関して二つのプライマーを用
いて行なうことが望ましい。
また、本発明のさらなる特徴としては、一つ以上のコン
トロールを参考にしてゲノムＤＮＡのテスト試料の解析
法を与えることであり、該方法は、（１）テスト試料を
増幅する各含情報座位に関して二つのプライマーとハイ
ブリダイズさせることであって、各プライマーはテスト
試料の一本鎖の、テスト試料の各鎖に相補的で該ミニサ
テライト配列にわたる各プライマーの伸長産物が合成さ
れるような条件下で増幅される含情報座位のミニサテラ
イト配列に隣接した領域にハイブリダイズすることが可
能であり、それによって一つのプライマーから合成され
た伸長産物が、その相補鎖から分離されるともう一方の
プライマーの伸長産物合成のための鋳型として働くこと
ができること；（１１）上記のように形成された伸長産
物をそれが合成された鋳型から分離して一本鎖分子を得
ること； （ｉｉｉ ）必要であれば、ステップ（１１）によって
得られたそれぞれの一本鎖分子の鋳型からプライマー伸
長産物が合成されるような条件下で、ステップ（１）の
プライマーをステップ（１１）で得られた一本鎖分子と
ハイブリダイズさせること；および（ｉｖ）増幅産物を
検出すること、および、それらを一つ以上のコントロー
ルと比較すること；によって、テスト試料中の少なくと
も一つの含情報座位のミニサテライト配列を増幅するこ
とからなり、 該方法は、目的の伸長産物が検出されるには十分量産生
されるが、相補的なミニサテライト鋳型鎖間の実質的に
予定外のハイブリダイゼーションが行なわれるには不十
分な伸長産物量となるように行なわれる。
トロールを参考にしてゲノムＤＮＡのテスト試料の解析
法を与えることであり、該方法は、（１）テスト試料を
増幅する各含情報座位に関して二つのプライマーとハイ
ブリダイズさせることであって、各プライマーはテスト
試料の一本鎖の、テスト試料の各鎖に相補的で該ミニサ
テライト配列にわたる各プライマーの伸長産物が合成さ
れるような条件下で増幅される含情報座位のミニサテラ
イト配列に隣接した領域にハイブリダイズすることが可
能であり、それによって一つのプライマーから合成され
た伸長産物が、その相補鎖から分離されるともう一方の
プライマーの伸長産物合成のための鋳型として働くこと
ができること；（１１）上記のように形成された伸長産
物をそれが合成された鋳型から分離して一本鎖分子を得
ること； （ｉｉｉ ）必要であれば、ステップ（１１）によって
得られたそれぞれの一本鎖分子の鋳型からプライマー伸
長産物が合成されるような条件下で、ステップ（１）の
プライマーをステップ（１１）で得られた一本鎖分子と
ハイブリダイズさせること；および（ｉｖ）増幅産物を
検出すること、および、それらを一つ以上のコントロー
ルと比較すること；によって、テスト試料中の少なくと
も一つの含情報座位のミニサテライト配列を増幅するこ
とからなり、 該方法は、目的の伸長産物が検出されるには十分量産生
されるが、相補的なミニサテライト鋳型鎖間の実質的に
予定外のハイブリダイゼーションが行なわれるには不十
分な伸長産物量となるように行なわれる。
上述のように、形成された伸長産物からそれが合成され
た鋳型から分離することによって得られたそれぞれの一
本鎖分子にプライマーをハイブリダイズさせ、つぎにさ
らに伸長産物の合成を行なうというサイクルが、一つに
は検出に十分な伸長産物を生成するように、もう一つに
は相補的なミニサテライト鋳型鎖間の実質的に予定外の
ノ１イブリダイゼーションが成されるには不十分な伸長
産物量が産生されるように、必要に応じた回数だけ繰り
返されることは理解されるであろう。
た鋳型から分離することによって得られたそれぞれの一
本鎖分子にプライマーをハイブリダイズさせ、つぎにさ
らに伸長産物の合成を行なうというサイクルが、一つに
は検出に十分な伸長産物を生成するように、もう一つに
は相補的なミニサテライト鋳型鎖間の実質的に予定外の
ノ１イブリダイゼーションが成されるには不十分な伸長
産物量が産生されるように、必要に応じた回数だけ繰り
返されることは理解されるであろう。
含情報座位はそれによって個体を区別することのできる
ゲノムＤＮＡ領域を含んでいる。超可変座位は、ヒトゲ
ノム中には１０００以上あると考えられているが、含情
報座位として有用であろう。含情報遺伝的座位の区別能
力は、しばしばアリル多様性あるいは多型性という語で
言及される。一般的に、個体間のアリル多様性あるいは
多型性の程度が大きいほど、問題の座位の区別能力は高
い。
ゲノムＤＮＡ領域を含んでいる。超可変座位は、ヒトゲ
ノム中には１０００以上あると考えられているが、含情
報座位として有用であろう。含情報遺伝的座位の区別能
力は、しばしばアリル多様性あるいは多型性という語で
言及される。一般的に、個体間のアリル多様性あるいは
多型性の程度が大きいほど、問題の座位の区別能力は高
い。
簡便な指標としては、含情報座位は、ランダムに選択し
た無関係な１００個体のあらゆる試料中に、少なくとも
３つの異なるアリルが区別されるものを含んでいる。個
体という語は上の場合、ヒトだけでなく、他の動物およ
び植物、またヒト、動物、植物由来の細胞系に関して用
いられたものであることは理解されるであろう。しかし
、各々の場合にランダムに選択された無関係な個体試料
は全て、同一の種からのものであろう。
た無関係な１００個体のあらゆる試料中に、少なくとも
３つの異なるアリルが区別されるものを含んでいる。個
体という語は上の場合、ヒトだけでなく、他の動物およ
び植物、またヒト、動物、植物由来の細胞系に関して用
いられたものであることは理解されるであろう。しかし
、各々の場合にランダムに選択された無関係な個体試料
は全て、同一の種からのものであろう。
本発明のヒトに応用する場合には、ここで用いる“含情
報遺伝子座位”という表現は、以下に示すアメリカン●
タイブ番カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託
されている細胞系から選択したいかなる２０の細胞系か
ら抽出したＤＮＡ中にも少なくとも３つの異なるアリル
が区別されるものとして定義することもできる： 細 胞 系 Ｈ ｅｌａ ＲＰＭＩ ２６５０ Ｄｅｔｒｏｉｔ ５３２ ｎｅｔｒｏｉｔ ５２５ Ｄｅｔｒｏｉｔ ５２９ Ｄｅｔｒｏｉｔ ５１０ Ｗｌ−３８ Ｃ１ｔｒｕｌｌｌｎｅｍｉａ ＥＢ−３ ＲＡＪＩ Ｊ Ｉ ＹＯＹＥ （Ｐ−２００３）Ｗｌ−２８ ＡＴＣＣ寄託番号 ＣＣＬ ２ ＣＣＬ３０ ＣＣＬ５４ ＣＣＬ６５ ＣＣＬ６６ ＣＣＬ７２ ＣＣＬ７５ ＣＣＬ７６ ＣＣＬ８５ ＣＣＬ８３ ＣＣＬ８７ ＣＣＬ９５ 細 胞 系 Ｄｅｔｒｏｉｔ ５５１ ＲＰＭ１ ８１３６Ｂ ＲＰＭＩ ７６６８ ＣＣＲＦ − ＣＥＭ ＣＣＲＦ−ＳＢ ＨＴ − １０８０ ＨＧ２６１ ＣＨＰ３ （Ｍ， Ｗ． ） ＬＬ４７（ＭａＤｏ） ＨＥＬ２９９ ＬＬ２４ ＨＦＬＩ ＷＩ−１００３ ＭＲＣ−５ ＩＭＲ−９０ ＬＳ１７４Ｔ ＬＬ ８Ｂ （ＬｅＳａ） ＬＬ ９７ Ａ （ＡＩＭｙ） ＨＬＦ − ａ ＡＴＣＣ寄託番号 ＣＣＬＩＩＯ ＣＣＬ１１３ ＣＣＬｌｌ４ ＣＣＬｌ１９ ＣＣＬｌ２０ ＣＣＬ１２１ ＣＣＬｌ２２ ＣＣＬ１３２ ＣＣＬ１３５ ＣＣＬ１３７ ＣＣＬ１５１ ＣＣＬ１５３ ＣＣＬｌ５４ ＣＣＬ１７１ ＣＣＬｌ８６ ＣＣＬ１８８ ＣＣＬｌ９０ ＣＣＬｌ９１ ＣＣＬｌ９９ 細 胞 系 ＡＴＣＣ寄託番号 ＣＯＤ−１３Ｌｕ ＣＣＬ ２００ＣＣ
Ｄ−８Ｌｕ ＣＣＬ ２０１ＣＣＤ−１
１Ｌｕ ＣＣＬ ２０２ＣＣＤ−１４Ｂ
ｒ ＣＣＬ ２０３ＣＣＤ−１６Ｌｕ
ＣＣＬ ２０４ＣＣＤ−１８Ｌｕ
ＣＣＬ ２０５ＣＣＤ−１９Ｌｕ
ＣＣＬ ２１０Ｈｓ８８８ Ｌｕ
ＣＣＬ ２１ＭＲＣ − ９
ＣＣＬ ２１２Ｄａｕｄｉ Ｃ
Ｃ Ｌ ２１３ＣＣＤ−２５Ｌｕ Ｃ
ＣＬ ２１５ＳＷ ４０３ ＣＣ
Ｌ ２３０ＮＡＭＡＬＷＡ ＣＲＬ １
４３２上述の全ての細胞系は、ＡＴＣＣ，１２３０１パ
ークローンドライブ，ロックビル，メリーランド州２０
８５２−１７７６， Ｕ Ｓ Ａから自由に入手するこ
とができ、細胞系およびハイブリドーマのＡＴＣＣカタ
ログに列挙されている。上述の全ての細胞系は１９８５
年以前にＡＴＣＣに寄託されたものである。
報遺伝子座位”という表現は、以下に示すアメリカン●
タイブ番カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託
されている細胞系から選択したいかなる２０の細胞系か
ら抽出したＤＮＡ中にも少なくとも３つの異なるアリル
が区別されるものとして定義することもできる： 細 胞 系 Ｈ ｅｌａ ＲＰＭＩ ２６５０ Ｄｅｔｒｏｉｔ ５３２ ｎｅｔｒｏｉｔ ５２５ Ｄｅｔｒｏｉｔ ５２９ Ｄｅｔｒｏｉｔ ５１０ Ｗｌ−３８ Ｃ１ｔｒｕｌｌｌｎｅｍｉａ ＥＢ−３ ＲＡＪＩ Ｊ Ｉ ＹＯＹＥ （Ｐ−２００３）Ｗｌ−２８ ＡＴＣＣ寄託番号 ＣＣＬ ２ ＣＣＬ３０ ＣＣＬ５４ ＣＣＬ６５ ＣＣＬ６６ ＣＣＬ７２ ＣＣＬ７５ ＣＣＬ７６ ＣＣＬ８５ ＣＣＬ８３ ＣＣＬ８７ ＣＣＬ９５ 細 胞 系 Ｄｅｔｒｏｉｔ ５５１ ＲＰＭ１ ８１３６Ｂ ＲＰＭＩ ７６６８ ＣＣＲＦ − ＣＥＭ ＣＣＲＦ−ＳＢ ＨＴ − １０８０ ＨＧ２６１ ＣＨＰ３ （Ｍ， Ｗ． ） ＬＬ４７（ＭａＤｏ） ＨＥＬ２９９ ＬＬ２４ ＨＦＬＩ ＷＩ−１００３ ＭＲＣ−５ ＩＭＲ−９０ ＬＳ１７４Ｔ ＬＬ ８Ｂ （ＬｅＳａ） ＬＬ ９７ Ａ （ＡＩＭｙ） ＨＬＦ − ａ ＡＴＣＣ寄託番号 ＣＣＬＩＩＯ ＣＣＬ１１３ ＣＣＬｌｌ４ ＣＣＬｌ１９ ＣＣＬｌ２０ ＣＣＬ１２１ ＣＣＬｌ２２ ＣＣＬ１３２ ＣＣＬ１３５ ＣＣＬ１３７ ＣＣＬ１５１ ＣＣＬ１５３ ＣＣＬｌ５４ ＣＣＬ１７１ ＣＣＬｌ８６ ＣＣＬ１８８ ＣＣＬｌ９０ ＣＣＬｌ９１ ＣＣＬｌ９９ 細 胞 系 ＡＴＣＣ寄託番号 ＣＯＤ−１３Ｌｕ ＣＣＬ ２００ＣＣ
Ｄ−８Ｌｕ ＣＣＬ ２０１ＣＣＤ−１
１Ｌｕ ＣＣＬ ２０２ＣＣＤ−１４Ｂ
ｒ ＣＣＬ ２０３ＣＣＤ−１６Ｌｕ
ＣＣＬ ２０４ＣＣＤ−１８Ｌｕ
ＣＣＬ ２０５ＣＣＤ−１９Ｌｕ
ＣＣＬ ２１０Ｈｓ８８８ Ｌｕ
ＣＣＬ ２１ＭＲＣ − ９
ＣＣＬ ２１２Ｄａｕｄｉ Ｃ
Ｃ Ｌ ２１３ＣＣＤ−２５Ｌｕ Ｃ
ＣＬ ２１５ＳＷ ４０３ ＣＣ
Ｌ ２３０ＮＡＭＡＬＷＡ ＣＲＬ １
４３２上述の全ての細胞系は、ＡＴＣＣ，１２３０１パ
ークローンドライブ，ロックビル，メリーランド州２０
８５２−１７７６， Ｕ Ｓ Ａから自由に入手するこ
とができ、細胞系およびハイブリドーマのＡＴＣＣカタ
ログに列挙されている。上述の全ての細胞系は１９８５
年以前にＡＴＣＣに寄託されたものである。
本発明で使用するための便利な含情報座位は、ヨーロッ
パ特許出願第２３８３２９号で開示されたヌクレオチド
配列およびプローブにハイブリダイゼーション可能な座
位、および、隣接する配列が本明細書に開示されている
含情報座位を含む。さらに、含情報座位はＳ． Ｊ．ジ
エンドラ−（Ｇｅｎｄｌｅｒ）らがＰＮＳ， ８４，
（１９８７）， ８０６０−８０６４で述べたミニサテ
ライトプローブによって同定されるゲノムＤＮＡ領域を
含む。特に情報を与える座位は、ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｌｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．
１９８８． ４３．２４９−２５６に示された５′ア
ルファグロビンＨＶＲである。
パ特許出願第２３８３２９号で開示されたヌクレオチド
配列およびプローブにハイブリダイゼーション可能な座
位、および、隣接する配列が本明細書に開示されている
含情報座位を含む。さらに、含情報座位はＳ． Ｊ．ジ
エンドラ−（Ｇｅｎｄｌｅｒ）らがＰＮＳ， ８４，
（１９８７）， ８０６０−８０６４で述べたミニサテ
ライトプローブによって同定されるゲノムＤＮＡ領域を
含む。特に情報を与える座位は、ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｌｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．
１９８８． ４３．２４９−２５６に示された５′ア
ルファグロビンＨＶＲである。
本発明で用いるための便利な含情報座位は１５キロ塩基
対までのものを含む。より便利な含情報座位としては、
短いアリルを与えるもの、例えば上限が１０キロ塩基対
以下であるもので、望ましくは８キロ塩基対以下、より
望ましくは６キロ塩基対以下のものである。アリルは、
少なくとも１キロ、望ましくは少なくとも１．５キロ、
より望ましくは少なくとも２キロ塩基対であることが便
利である。
対までのものを含む。より便利な含情報座位としては、
短いアリルを与えるもの、例えば上限が１０キロ塩基対
以下であるもので、望ましくは８キロ塩基対以下、より
望ましくは６キロ塩基対以下のものである。アリルは、
少なくとも１キロ、望ましくは少なくとも１．５キロ、
より望ましくは少なくとも２キロ塩基対であることが便
利である。
したがって、適当な範囲としては、１． １．５，
２，２．５、あるいは３から６． ７． ８． ９、
あるいは１０キロ塩基対のものを含む。１分子のみのＤ
ＮＡ試料から始めて本発明の方法を行なう場合には、ア
リルの長さは６キロ塩基対を越えないことが望ましい。
２，２．５、あるいは３から６． ７． ８． ９、
あるいは１０キロ塩基対のものを含む。１分子のみのＤ
ＮＡ試料から始めて本発明の方法を行なう場合には、ア
リルの長さは６キロ塩基対を越えないことが望ましい。
また、含済ｔｆＦ−座位のアリル長の範囲が制限されて
いることが望ましい。これらの望ましい条件は高度な含
情報座位には常に適用されるものではないことがこれま
で観察されてきたが、これはこれらが常に多数のミニサ
テライト反復ユニットおよび長いアリルを伴うためであ
る。しかしながら、技術に熟達したものは自分の目的の
ために便利な座位を容易に選択することができる。
いることが望ましい。これらの望ましい条件は高度な含
情報座位には常に適用されるものではないことがこれま
で観察されてきたが、これはこれらが常に多数のミニサ
テライト反復ユニットおよび長いアリルを伴うためであ
る。しかしながら、技術に熟達したものは自分の目的の
ために便利な座位を容易に選択することができる。
試料ＤＮＡの含情報座位に隣接する領域にハイブリダイ
ゼーション可能なプライマーは、含情報遺伝子座位にか
かる伸長産物の合成開始点を与えるために必要である。
ゼーション可能なプライマーは、含情報遺伝子座位にか
かる伸長産物の合成開始点を与えるために必要である。
このようなプライマーは一般にオリゴヌクレオチドであ
り、最大の効率で増幅を行なうためには一本鎖であるこ
とが望ましい。
り、最大の効率で増幅を行なうためには一本鎖であるこ
とが望ましい。
二本鎖である場合には、伸長ポリヌクレオチドの調製に
使用する前に、プライマーをまず各鎖を分離する処理を
行なう。プライマーは伸長ポリヌクレオチドの合成を開
始するのに十分長くなければならない。このようなプラ
イマーの正確な長さは、温度やプライマーの性質を含む
多くの因子に依存する。一般的には、プライマーは１５
〜２５ヌクレオチドのように少なくとも７ヌクレオチド
、例えば２０〜２５ヌクレオチドからなる。隣接した配
列は含情報座位の隣接領域の配列そのものを反映する必
要はないことは理解されるであろう。ただ、それぞれの
配列がハイブリダイゼーションを可能にする程度には相
同性を持つことは必要である。このようにして得られた
伸長産物はまた、プライマーがさらにハイブリダイゼー
ションするための鋳型として働くことができる。いかな
るプライマーも最大長は決定的なものではないと考えら
れており、実用的な理由によってのみ制限される。
使用する前に、プライマーをまず各鎖を分離する処理を
行なう。プライマーは伸長ポリヌクレオチドの合成を開
始するのに十分長くなければならない。このようなプラ
イマーの正確な長さは、温度やプライマーの性質を含む
多くの因子に依存する。一般的には、プライマーは１５
〜２５ヌクレオチドのように少なくとも７ヌクレオチド
、例えば２０〜２５ヌクレオチドからなる。隣接した配
列は含情報座位の隣接領域の配列そのものを反映する必
要はないことは理解されるであろう。ただ、それぞれの
配列がハイブリダイゼーションを可能にする程度には相
同性を持つことは必要である。このようにして得られた
伸長産物はまた、プライマーがさらにハイブリダイゼー
ションするための鋳型として働くことができる。いかな
るプライマーも最大長は決定的なものではないと考えら
れており、実用的な理由によってのみ制限される。
通常は、テスト試料ＤＮＡは二本鎖であり、したがって
試料ＤＮＡの異なる鎖に、一つのプライマーから合成さ
れた伸長産物がもう一方の伸長のための鋳型として働い
て決まった長さの核酸を合成するようにＤＮＡ配列上の
相対的な位置にハイブリダイズするプライマーを選択す
ることは容易である。
試料ＤＮＡの異なる鎖に、一つのプライマーから合成さ
れた伸長産物がもう一方の伸長のための鋳型として働い
て決まった長さの核酸を合成するようにＤＮＡ配列上の
相対的な位置にハイブリダイズするプライマーを選択す
ることは容易である。
上述の英国特許第２１６［３４４５号およびヨーロッパ
特許出願第２３８３９号で開示されたブローブ、および
それらにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列によっ
て同定されるいくつかの含情報遺伝子領域の隣接領域は
これまで示されておらず、いずれも独立に、どのような
組合せによっても本発明のさらなる局面を表す。配列は
実施例の前のページに示す。いくつかの配列中で含情報
遺伝子領域を“ミニサテライト゜の語で示す。上で説明
したように、あらゆる便利な配列をプライマーとして用
いることができる。便利なプライマー配列のいくつかの
例を下線で示した。明確化と簡便化のため、いくつかの
配列では各ミニサテライトタンデム配列の各側の最も外
側の反復ユニットのみを示し（大文字）、連続したＸで
分離してほとんどの反復の省略を示した。各反復配列に
リピートユニット数が完全に含まれていることは稀であ
るため、最も外側の反復はお互いに正しく一致しないで
あろうが、すぐ隣のＤＮＡに対しては正しい関係を保持
している。
特許出願第２３８３９号で開示されたブローブ、および
それらにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列によっ
て同定されるいくつかの含情報遺伝子領域の隣接領域は
これまで示されておらず、いずれも独立に、どのような
組合せによっても本発明のさらなる局面を表す。配列は
実施例の前のページに示す。いくつかの配列中で含情報
遺伝子領域を“ミニサテライト゜の語で示す。上で説明
したように、あらゆる便利な配列をプライマーとして用
いることができる。便利なプライマー配列のいくつかの
例を下線で示した。明確化と簡便化のため、いくつかの
配列では各ミニサテライトタンデム配列の各側の最も外
側の反復ユニットのみを示し（大文字）、連続したＸで
分離してほとんどの反復の省略を示した。各反復配列に
リピートユニット数が完全に含まれていることは稀であ
るため、最も外側の反復はお互いに正しく一致しないで
あろうが、すぐ隣のＤＮＡに対しては正しい関係を保持
している。
ｐ Ｍ Ｓ ３１ （ Ｅ Ｐ − ２３８３２９）の
塩基配列を決定することによって、それまで予想されな
かったタンデム反復領域が見いだされ、この反復配列は
腫瘍ミニサテライトからｌＯ塩基離れており、クローン
の末端を決定するＳａｕ３Ａ１部位まで延びる１９ｂｐ
のＧ／Ｃに富む配列の７回以上の繰り返しからなってい
た。３１Ｂと呼ばれるこの領域は、腫瘍ミニサテライト
サテライトのＧに富む鎖の逆側の鎖上でＧに富んでいる
。ゲノムのマッピングから、多様性があるとしても３１
Ｂはこの領域で長さの多様性に関しては最少の寄与しか
示さない（データは示さない）。
塩基配列を決定することによって、それまで予想されな
かったタンデム反復領域が見いだされ、この反復配列は
腫瘍ミニサテライトからｌＯ塩基離れており、クローン
の末端を決定するＳａｕ３Ａ１部位まで延びる１９ｂｐ
のＧ／Ｃに富む配列の７回以上の繰り返しからなってい
た。３１Ｂと呼ばれるこの領域は、腫瘍ミニサテライト
サテライトのＧに富む鎖の逆側の鎖上でＧに富んでいる
。ゲノムのマッピングから、多様性があるとしても３１
Ｂはこの領域で長さの多様性に関しては最少の寄与しか
示さない（データは示さない）。
厳しい条件下でｐ Ｍ Ｓ ２２８（アー？ （Ａｒ
ｍｏｕｒ）他， １９８９， ＮＡＲ． １７． １３
． ４９２５−４９３５）によって二つの座位が検出さ
れた。家系分析からこれらの座位は強く連鎖しているこ
とが示された。クローン化されたＤＮＡの制限酵素地図
から２２８Ａおよび２２８Ｂと呼ばれる二つの異なるタ
ンデム反復領域の存在が示され、これは後の塩基配列解
析によって確認された（第８図）。ヒトＤＮＡをｐ Ｍ
Ｓ ２２ｇ由来のサブクローンで再プロービングした
結果、２２８Ａはより長くより強くハイブリダイズする
座位を検出し、２２８Ｂは短くより弱くハイブリダイズ
する座位を検出することが示された。
ｍｏｕｒ）他， １９８９， ＮＡＲ． １７． １３
． ４９２５−４９３５）によって二つの座位が検出さ
れた。家系分析からこれらの座位は強く連鎖しているこ
とが示された。クローン化されたＤＮＡの制限酵素地図
から２２８Ａおよび２２８Ｂと呼ばれる二つの異なるタ
ンデム反復領域の存在が示され、これは後の塩基配列解
析によって確認された（第８図）。ヒトＤＮＡをｐ Ｍ
Ｓ ２２ｇ由来のサブクローンで再プロービングした
結果、２２８Ａはより長くより強くハイブリダイズする
座位を検出し、２２８Ｂは短くより弱くハイブリダイズ
する座位を検出することが示された。
これらのミニサテライトは、体細胞ハイブリッドと１７
ｐ １３ − ｐｔｅｒに対するｉｎ ｓｉｔｕ ハイ
ブリダイゼーションを用いて位置決定が行なわ・れた。
ｐ １３ − ｐｔｅｒに対するｉｎ ｓｉｔｕ ハイ
ブリダイゼーションを用いて位置決定が行なわ・れた。
ｐ Ｍ Ｓ ５１とｐ Ｍ Ｓ ２２ｇに検出される座
位、および他のミニサテライトに検出される座位の性質
を表２に要約した。
位、および他のミニサテライトに検出される座位の性質
を表２に要約した。
我々が英国特許出願第８８１３７８１．５号で示したｐ
Ｍ ３ ４３中の１対のミニサテライトの性質に関す
る以前の証拠は塩基配列のデータによって確認され、ま
た、二つの近接したタンデム反復配列を含むミニサテラ
イトクローンのさらなる二つの例（ ｐ Ｍ Ｓ ３１
およびｐＭ Ｓ ２２８）が明らかになった。
Ｍ ３ ４３中の１対のミニサテライトの性質に関す
る以前の証拠は塩基配列のデータによって確認され、ま
た、二つの近接したタンデム反復配列を含むミニサテラ
イトクローンのさらなる二つの例（ ｐ Ｍ Ｓ ３１
およびｐＭ Ｓ ２２８）が明らかになった。
“非主要“座位４３Ｂが低い（３０％）のへテロ接合性
を有しているｐ Ｍ Ｓ ４３とは異なり、ｐ Ｍ ３
２２８中のミニサテライトはどちらも８０％以上のへ
テロ接合性を持つ。ミニサテライト２２８Ｂ （第８図
，表２）は限られたアリルサイズ範囲（０．６〜５．５
ｋｂ）で高いヘテロ接合性（８５％）を併有する；この
組合せによって２２８Ｂはポリメラーゼ連鎖反応による
ミニサテライトの解，折のための非常に有用な座位と成
っている（２３）。一般的に、ほとんどの多様性座位は
、多くのアリルがこの方法によって現在のところ増幅可
能な最大長を越えるような広いアリルサイズを有してお
り、そのため不完全な側面を持つことになる。それに対
し７、２２８Ｂによって検出される座位では、４８人の
無関係な人を調べた結果、９５％のアリルは２ｋｂ以下
であり、最も長いもの（５．５ｋｂ）でも十分に増幅可
能な範囲にあることが示された（Ｊ．アーマー（Ａｒｍ
ｏｕｒ）とＡ，ジェフェリーズ（Ｊｅｆｆｒｅｙｓ）
．未発表）。我々は、この座位の最も長いアリルでも増
幅可能なことを示し、単独の座位の増幅から完全でさら
に有用な情報が得られる展望があることを示した。
を有しているｐ Ｍ Ｓ ４３とは異なり、ｐ Ｍ ３
２２８中のミニサテライトはどちらも８０％以上のへ
テロ接合性を持つ。ミニサテライト２２８Ｂ （第８図
，表２）は限られたアリルサイズ範囲（０．６〜５．５
ｋｂ）で高いヘテロ接合性（８５％）を併有する；この
組合せによって２２８Ｂはポリメラーゼ連鎖反応による
ミニサテライトの解，折のための非常に有用な座位と成
っている（２３）。一般的に、ほとんどの多様性座位は
、多くのアリルがこの方法によって現在のところ増幅可
能な最大長を越えるような広いアリルサイズを有してお
り、そのため不完全な側面を持つことになる。それに対
し７、２２８Ｂによって検出される座位では、４８人の
無関係な人を調べた結果、９５％のアリルは２ｋｂ以下
であり、最も長いもの（５．５ｋｂ）でも十分に増幅可
能な範囲にあることが示された（Ｊ．アーマー（Ａｒｍ
ｏｕｒ）とＡ，ジェフェリーズ（Ｊｅｆｆｒｅｙｓ）
．未発表）。我々は、この座位の最も長いアリルでも増
幅可能なことを示し、単独の座位の増幅から完全でさら
に有用な情報が得られる展望があることを示した。
ヒトＤＮＡ中の二つの可変性座位を常に検出する、Ｍ
Ｓ ２９と呼ばれるクローン化された新しいミニサテラ
イトが単離された。ヒト染色体６の短腕の末端領域に位
置する一つの座位は大型類人猿にも存在する。第二のミ
ニサテライト座位は染色体１Ｂｐｌｌ上に断続的に存在
し、ヒト以外の霊長類には存在せず、またこの座位を持
たないヒトもいる。ＭＳ２９は、ウォン（ Ｗｏｎｇ）
他， Ａｎｎ． Ｉｌｕａ＋．Ｇｅｎｅｔ． （１９８
７） ５１． ２６０−２８８に示されているようにミ
ニサテライト配列に富むＤＮＡから作成したＬ４７ゲノ
ミックライブラリーから単離された。
Ｓ ２９と呼ばれるクローン化された新しいミニサテラ
イトが単離された。ヒト染色体６の短腕の末端領域に位
置する一つの座位は大型類人猿にも存在する。第二のミ
ニサテライト座位は染色体１Ｂｐｌｌ上に断続的に存在
し、ヒト以外の霊長類には存在せず、またこの座位を持
たないヒトもいる。ＭＳ２９は、ウォン（ Ｗｏｎｇ）
他， Ａｎｎ． Ｉｌｕａ＋．Ｇｅｎｅｔ． （１９８
７） ５１． ２６０−２８８に示されているようにミ
ニサテライト配列に富むＤＮＡから作成したＬ４７ゲノ
ミックライブラリーから単離された。
Ｍ ８ ２９は３９ｂｐの反復配列を含む。これはトリ
ヌクレオチドＹＡＧの１３の発散した反復からなり、こ
こでＹはＡ， Ｇ， Ｃ，あるいはＴのいずれかを表す
。このミニサテライトに隣接した配列は既知の塩基配列
決定法を用いて明らかにすることができる。・ 要約すると、本発明に関連する新しい隣接配列は、ＭＳ
１，ＭＳ２９．ＭＳ３１ＡおよびＭＳ３１Ｂ．Ｍ Ｓ
２２８ＡおよびＭＳ２２８Ｂの隣接配列である。
ヌクレオチドＹＡＧの１３の発散した反復からなり、こ
こでＹはＡ， Ｇ， Ｃ，あるいはＴのいずれかを表す
。このミニサテライトに隣接した配列は既知の塩基配列
決定法を用いて明らかにすることができる。・ 要約すると、本発明に関連する新しい隣接配列は、ＭＳ
１，ＭＳ２９．ＭＳ３１ＡおよびＭＳ３１Ｂ．Ｍ Ｓ
２２８ＡおよびＭＳ２２８Ｂの隣接配列である。
それに加えて、我々はここに、ミニサテライトブローブ
ｐλｇ３（ウオン（ Ｗｏｎｇ）他． Ｎｕｅｌｅｔｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． １４． １１． （
１９８Ｂ）） 、およびブローブ３３．１． ３３．４
，および３３．８ （英国特許第２１８８４４５号／リ
スター予防医学研究所）に関する、さらに新しい隣接配
列の情報を示す。
ｐλｇ３（ウオン（ Ｗｏｎｇ）他． Ｎｕｅｌｅｔｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． １４． １１． （
１９８Ｂ）） 、およびブローブ３３．１． ３３．４
，および３３．８ （英国特許第２１８８４４５号／リ
スター予防医学研究所）に関する、さらに新しい隣接配
列の情報を示す。
隣接配列の一つの群は、ミニサテライトプローブＭＳ１
，ＭＳ２９，ＭＳ３１ＡおよびＭＳ３１Ｂ．ＭＳ３２．
ＭＳ４３ＡおよびＭＳ４３Ｂ，ＭＳ５１，Ｍ Ｓ ２２
８ＡおよびＭＳ２２８Ｂの隣接配列である。
，ＭＳ２９，ＭＳ３１ＡおよびＭＳ３１Ｂ．ＭＳ３２．
ＭＳ４３ＡおよびＭＳ４３Ｂ，ＭＳ５１，Ｍ Ｓ ２２
８ＡおよびＭＳ２２８Ｂの隣接配列である。
隣接配列のさらに別の群は、上記のミニサテライトプロ
ーブのいずれかの隣接配列から成るものである。
ーブのいずれかの隣接配列から成るものである。
上述のように、ミニサテライトＭ Ｓ ２９およびＭＳ
３１Ｂは新しいものであり、これらのミニサテライトの
いずれの反復配列および／または隣接配列もまた本発明
のさらに別の局面を表す。
３１Ｂは新しいものであり、これらのミニサテライトの
いずれの反復配列および／または隣接配列もまた本発明
のさらに別の局面を表す。
本発明の方法はあらゆる便利な含情報座位に関しても用
いることができる。したがって、例えば、ヒトインシュ
リン遺伝子の５′側の超可変領域（Ａｍ． Ｊ． Ｈｕ
ｓｈ． Ｇｅｎｅｔ．． １９８Ｂ， ３９． ２９１
−２２９）、５′アルファーグロビンＨＶＲ （Ａｍ．
Ｊ． Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．． １９８ｇ． ４３．
２４９−２５６）、アルファーグロヒン３’ ＨＶＲ
（ＥＭＢＯ Ｊ．． １９８Ｂ． ５． １９５７−
１８８３）、ゼーターグロビン座位の超可変領域（ＰＮ
ＡＳ，１９Ｂ３． ８０． ５０２２−５０２６）、あ
るいはＨａ−Ｒａｓ座位（Ｎａｔｕｒｅ， １９ｇ３，
３０２． ３３−３７）の隣接配列にハイブリダイゼ
ーションさせるためのプライマーが調製される。また、
本明細書に参考として含まれているのはレイーホワイト
（Ｒａｙ Ｗｈｉｔｅ）によって提案されたブローブの
パネルである。これらの隣接配列は既知の技術によって
明らかにすることができる。
いることができる。したがって、例えば、ヒトインシュ
リン遺伝子の５′側の超可変領域（Ａｍ． Ｊ． Ｈｕ
ｓｈ． Ｇｅｎｅｔ．． １９８Ｂ， ３９． ２９１
−２２９）、５′アルファーグロビンＨＶＲ （Ａｍ．
Ｊ． Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．． １９８ｇ． ４３．
２４９−２５６）、アルファーグロヒン３’ ＨＶＲ
（ＥＭＢＯ Ｊ．． １９８Ｂ． ５． １９５７−
１８８３）、ゼーターグロビン座位の超可変領域（ＰＮ
ＡＳ，１９Ｂ３． ８０． ５０２２−５０２６）、あ
るいはＨａ−Ｒａｓ座位（Ｎａｔｕｒｅ， １９ｇ３，
３０２． ３３−３７）の隣接配列にハイブリダイゼ
ーションさせるためのプライマーが調製される。また、
本明細書に参考として含まれているのはレイーホワイト
（Ｒａｙ Ｗｈｉｔｅ）によって提案されたブローブの
パネルである。これらの隣接配列は既知の技術によって
明らかにすることができる。
本発明の方法によって調製される、伸長された隣接ポリ
ヌクレオチドは本発明のさらに別の局面を表す。これら
のポリヌクレオチドは１コピーあるいは複数コピー存在
する。複数コピー存在する場合には、これらは正確なコ
ピーであり、実質的に個々の鎖間でネットワーク化ある
いは交叉を起こさないことが望ましい。正確な、という
語は、コピーの大きさおよび構造から得られる遺伝的性
質の情報が全てのコピーで実質的に同一であることを意
味する。伸長されたプライマーが１キロ塩基対以上の含
情報遺伝子座位と同一のあるいはそれに相補的な配列を
含んでいるものは便利である・。
ヌクレオチドは本発明のさらに別の局面を表す。これら
のポリヌクレオチドは１コピーあるいは複数コピー存在
する。複数コピー存在する場合には、これらは正確なコ
ピーであり、実質的に個々の鎖間でネットワーク化ある
いは交叉を起こさないことが望ましい。正確な、という
語は、コピーの大きさおよび構造から得られる遺伝的性
質の情報が全てのコピーで実質的に同一であることを意
味する。伸長されたプライマーが１キロ塩基対以上の含
情報遺伝子座位と同一のあるいはそれに相補的な配列を
含んでいるものは便利である・。
また、１．５キロ塩基対および２キロ塩基対も便利な値
である。便宜上、コピー数は本発明の増幅法の少なくと
も３． ５， ７， ９， １３，あるいは１′５
サイクルの産物を表す。
である。便宜上、コピー数は本発明の増幅法の少なくと
も３． ５， ７， ９， １３，あるいは１′５
サイクルの産物を表す。
本発明のさらに別の局面としては、伸長されたブライマ
−（上で既に定義）の複数の正確なコピーを含む混合物
が得られることである。上述のように、混合物は実質的
に個々の鎖の間でネットワーク化あるいは交叉を行なわ
ない。
−（上で既に定義）の複数の正確なコピーを含む混合物
が得られることである。上述のように、混合物は実質的
に個々の鎖の間でネットワーク化あるいは交叉を行なわ
ない。
本発明で用いられるプライマーは本分野で既知の方法と
同様に調製される。例えば、与えられた隣接配列が既知
の場合には、有用なヌクレオチドプライマーは直接合成
によっ゛て調製される。クローン化技術も含情報遺伝子
座位に隣接する配列を含むＤＮＡ断片の再生に用いられ
る。
同様に調製される。例えば、与えられた隣接配列が既知
の場合には、有用なヌクレオチドプライマーは直接合成
によっ゛て調製される。クローン化技術も含情報遺伝子
座位に隣接する配列を含むＤＮＡ断片の再生に用いられ
る。
あるいは、含情報遺伝子座位を含むＤＮＡ断片が同定さ
れ、上で示した方法と同様の方法を用いて、含情報遺伝
子座位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を伸長
することができる。このようにして得られた産物を、次
に例えば切断などで直接的に修飾して有用なプライマー
を調製するか、あるいはその配列を決定して便利なプラ
イマーを次に直接合成によって調製することができる。
れ、上で示した方法と同様の方法を用いて、含情報遺伝
子座位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を伸長
することができる。このようにして得られた産物を、次
に例えば切断などで直接的に修飾して有用なプライマー
を調製するか、あるいはその配列を決定して便利なプラ
イマーを次に直接合成によって調製することができる。
上述のように、試料ＤＮＡは一般的に二本鎖である。し
たがって、プライマーの伸長の鋳型として働くことがで
きる前に、核酸の各鎖を分離することが望ましい。鎖の
分離は、物理的、化学的あるいは酵素的方法を含む適当
な方法で行なうことができる。簡便には、熱変性が用い
られ、約９９％までの変性が行なわれる。用いられる温
度は、約１〜１０分の範囲の時間に対して、８５〜１０
５℃である。
たがって、プライマーの伸長の鋳型として働くことがで
きる前に、核酸の各鎖を分離することが望ましい。鎖の
分離は、物理的、化学的あるいは酵素的方法を含む適当
な方法で行なうことができる。簡便には、熱変性が用い
られ、約９９％までの変性が行なわれる。用いられる温
度は、約１〜１０分の範囲の時間に対して、８５〜１０
５℃である。
プライマーは試料ＤＮＡの各々別の鎖に対して用いられ
ることが望ましい。二本鎖ＤＮＡの場合には、したがっ
て通常二つのプライマーが用いられる。一般的には、双
方の鎖に沿って同じ方向に、すなわち５′から３′ある
いはその逆方向に、含情報座位を通過して伸長が行なわ
れるようにプライマーを選択する。伸長が５′から３′
方向に進むことが望ましい。
ることが望ましい。二本鎖ＤＮＡの場合には、したがっ
て通常二つのプライマーが用いられる。一般的には、双
方の鎖に沿って同じ方向に、すなわち５′から３′ある
いはその逆方向に、含情報座位を通過して伸長が行なわ
れるようにプライマーを選択する。伸長が５′から３′
方向に進むことが望ましい。
プライマーは既知の条件下でゲノムＤＮＡ試料に適切に
ハイプリダイズする。一般に、これは望ましくはｐｌｌ
が７〜９の緩衝水溶液中で行なわせる。
ハイプリダイズする。一般に、これは望ましくはｐｌｌ
が７〜９の緩衝水溶液中で行なわせる。
反応混合液に大過剰のプライマーが存在することが望ま
しい。ある種の診断的な応用の場合には、試料ＤＮＡの
量は不明であるが、過剰のプライマーが望ましいことは
理解されるであろう。
しい。ある種の診断的な応用の場合には、試料ＤＮＡの
量は不明であるが、過剰のプライマーが望ましいことは
理解されるであろう。
増幅反応は、デオキシリボヌクレオチド３リン酸ｄＡＴ
Ｐ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，およびｄＴＴＰを合成混合液
に適当量加えることによって簡便に行なわれ、得られた
溶液を次に、例えば約１〜ｌＯ分間、例えば約９０〜１
００℃で加熱する。
Ｐ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，およびｄＴＴＰを合成混合液
に適当量加えることによって簡便に行なわれ、得られた
溶液を次に、例えば約１〜ｌＯ分間、例えば約９０〜１
００℃で加熱する。
この加熱過程後、プライマーのハイブリダイゼーション
に適した３０〜７０℃まで溶液を冷却する。伸長反応を
促進するための誘導剤としてＴａｑボリメラーゼを用い
る場合には、プライマーハイプリダイゼーションは５０
〜７０℃、例えば５０〜Ｂ５℃、６０℃などの温度で行
なうことが望ましい。
に適した３０〜７０℃まで溶液を冷却する。伸長反応を
促進するための誘導剤としてＴａｑボリメラーゼを用い
る場合には、プライマーハイプリダイゼーションは５０
〜７０℃、例えば５０〜Ｂ５℃、６０℃などの温度で行
なうことが望ましい。
プライマーハイプリダイゼーションはイオン強度を低く
した緩衝液中で、また、アニーリング温度を高くすると
有効に行なわれることが見いだされた。これにより、ミ
スブライミングの可能性が減少する。“低くしたイオン
強度”および“高《したアニーリング温度゜という表現
は、普通の技術を持つ分子生物学者がある核酸の増幅反
応を行なうのに適当だと一般に考えるような範囲の限界
あるいはその範囲外の条件を意味することは理解される
であろう。例として、有用な緩衝液はａｌｌ７〜９を安
定に維持するのに十分なイオン強度を持つものであるが
、これのみに制限するものではない。有効なアニーリン
グ温度は一般に５０〜６０℃である。実際の反応条件は
用いるプライマーに依存することは理解されるであろう
。
した緩衝液中で、また、アニーリング温度を高くすると
有効に行なわれることが見いだされた。これにより、ミ
スブライミングの可能性が減少する。“低くしたイオン
強度”および“高《したアニーリング温度゜という表現
は、普通の技術を持つ分子生物学者がある核酸の増幅反
応を行なうのに適当だと一般に考えるような範囲の限界
あるいはその範囲外の条件を意味することは理解される
であろう。例として、有用な緩衝液はａｌｌ７〜９を安
定に維持するのに十分なイオン強度を持つものであるが
、これのみに制限するものではない。有効なアニーリン
グ温度は一般に５０〜６０℃である。実際の反応条件は
用いるプライマーに依存することは理解されるであろう
。
次に、伸長反応を誘導するあるいは触媒するために適当
な試薬をア二一ルさせた混合液に加え、本分野で知られ
ている条件下で反応を進行させる。
な試薬をア二一ルさせた混合液に加え、本分野で知られ
ている条件下で反応を進行させる。
誘導剤は酵素が有効である。適当な酵素としては、大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｔ４ ＤＮ
Ａポリメラーゼを含むが、’ｒａｑポリメラーゼが特に
望ましい。そのほかの入手可能なＤＮＡポリメラーゼ、
逆転写酵素、および伸長反応を促進する熱に安定な酵素
を含むそのほかの酵素も使用可能である。
菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｔ４ ＤＮ
Ａポリメラーゼを含むが、’ｒａｑポリメラーゼが特に
望ましい。そのほかの入手可能なＤＮＡポリメラーゼ、
逆転写酵素、および伸長反応を促進する熱に安定な酵素
を含むそのほかの酵素も使用可能である。
新しく合成された鎖およびそれに相補的な核酸鎖は本方
法の次の過程で用いられる二本鎖分子を形成する。二本
鎖分離通程、および配列伸長過程を上述の方法を用いて
必要なだけ繰り返す。このような方法に適当な条件は、
参考として上記に含めた米国特許第４６８３２０２号お
よび第４６８３１９５号に概述されている。上記の特許
明細書に記述されているように、分離および伸長サイク
ルは段階的に行なわれるか、あるいはより有利には、複
数のサイクルを例えば半自動化方式、あるいは完全自動
化方式で行なわれる。
法の次の過程で用いられる二本鎖分子を形成する。二本
鎖分離通程、および配列伸長過程を上述の方法を用いて
必要なだけ繰り返す。このような方法に適当な条件は、
参考として上記に含めた米国特許第４６８３２０２号お
よび第４６８３１９５号に概述されている。上記の特許
明細書に記述されているように、分離および伸長サイク
ルは段階的に行なわれるか、あるいはより有利には、複
数のサイクルを例えば半自動化方式、あるいは完全自動
化方式で行なわれる。
慣習的なＰＣＲ法では、増幅反応は一般に約５０サイク
ルまで行なわれる。一方、本方法によれば、１コピーの
試料ＤＮＡから開始した場合、増幅の上限は約２５サイ
クルであると考えられている。より多量のゲノムＤＮＡ
開始試料が入手可能な場合には、より少ない増幅サイク
ル数で行なうことができる。試料ＤＮＡ量および配列の
．性質に依存する増幅サイクルの有効な枠を、以下の分
析を参考としてここに示すが、これに制限されるもので
はない： 以下の分析は、体８２１０μｇで、１５分の伸長時間の
増幅反応に関するものである：アリルＡおよびＢに関し
てヘテロ接合性の個体を考え、ＡがＢよりも長い場合、
そのためにＡはＢほど有効に増幅されないであろうとい
うことは予想される。サイクル数の下限Ｃ１は、約ｏ．
ｔｐｇの産物を検出できる、ブローブの感度によって決
定される。アリルＡを検出するためには、０．１ｐｇ以
上のアリルＡ産物を生成するのに十分なサイクルが必要
である。同様に、どちらのアリルも検出するためには０
．ｌｐｇ以上のアリルＢが産生されなければならない。
ルまで行なわれる。一方、本方法によれば、１コピーの
試料ＤＮＡから開始した場合、増幅の上限は約２５サイ
クルであると考えられている。より多量のゲノムＤＮＡ
開始試料が入手可能な場合には、より少ない増幅サイク
ル数で行なうことができる。試料ＤＮＡ量および配列の
．性質に依存する増幅サイクルの有効な枠を、以下の分
析を参考としてここに示すが、これに制限されるもので
はない： 以下の分析は、体８２１０μｇで、１５分の伸長時間の
増幅反応に関するものである：アリルＡおよびＢに関し
てヘテロ接合性の個体を考え、ＡがＢよりも長い場合、
そのためにＡはＢほど有効に増幅されないであろうとい
うことは予想される。サイクル数の下限Ｃ１は、約ｏ．
ｔｐｇの産物を検出できる、ブローブの感度によって決
定される。アリルＡを検出するためには、０．１ｐｇ以
上のアリルＡ産物を生成するのに十分なサイクルが必要
である。同様に、どちらのアリルも検出するためには０
．ｌｐｇ以上のアリルＢが産生されなければならない。
サイクル数め上限Ｃ はアリルＡとＢの双方の収量にυ
よって制限される。
Ｃ１とＣｕは以下のように見積られる二Ｍ＝ヒトゲノム
ＤＮＡの開始ｆｆｉ（ビコグラム）とする。
ＤＮＡの開始ｆｆｉ（ビコグラム）とする。
ａ−アリルＡの長さ（ ｋｂ）
ｂ−アリルＢの長さ（ ｋｂ）
ｇａ − Ｐ Ｃ ＲサイクルあたりのアリルＡの収量
ｇｂ− Ｐ Ｃ ＲサイクルあたりのアリルＢの収量ヒ
トの二倍体ゲノムサイズは６Ｘｌ０６であるから、アリ
ルＡの開始量は、 ａ Ｍ． ６ｘ１ｏ６ｐｇ 同様に、アリルＢの開始量は、 ｂ Ｍ． ６ Ｘ １０’ ” Ｃサイクル後のアリルＡの収量は以下の式によって与え
られる： またアリルＢに関しても同様である。
ｇｂ− Ｐ Ｃ ＲサイクルあたりのアリルＢの収量ヒ
トの二倍体ゲノムサイズは６Ｘｌ０６であるから、アリ
ルＡの開始量は、 ａ Ｍ． ６ｘ１ｏ６ｐｇ 同様に、アリルＢの開始量は、 ｂ Ｍ． ６ Ｘ １０’ ” Ｃサイクル後のアリルＡの収量は以下の式によって与え
られる： またアリルＢに関しても同様である。
第３図から、サイクルあたりの収量は以下の次の式によ
ってアリル長と相関する。
ってアリル長と相関する。
ｇ Ｌ − ２− ０．０９３ Ｌ （ Ｌ − ０．
６ｋｂ）したがって、サイクルの下限Ｃ１はＣの最小値
によって決定され以下のようになる また、 同様に上限Ｃ も、双方のアリルの総収量がＵ ＜ ｔｏｏｏｐｇとなるＣの最大値によって決まり、以
下のようになる Ｃ１およびＣｕは計算機反復によって決定することがで
きる。いくつかの典型的な例としては以下に示すように
なる： ｐｇ ｋｂ ｋｂ １０．００Ｇ ５ １
７ ２０１．０００ ３ ２
１０ ２４Ｚｏｏ ６
０．５ １９ ２７＊ ８
６ １ ２７” ３２”十
枠が非常に狭くなり、アリルサイズが広く異なる微量
のＤＮＡの場合には消えることもあることに注意。
６ｋｂ）したがって、サイクルの下限Ｃ１はＣの最小値
によって決定され以下のようになる また、 同様に上限Ｃ も、双方のアリルの総収量がＵ ＜ ｔｏｏｏｐｇとなるＣの最大値によって決まり、以
下のようになる Ｃ１およびＣｕは計算機反復によって決定することがで
きる。いくつかの典型的な例としては以下に示すように
なる： ｐｇ ｋｂ ｋｂ １０．００Ｇ ５ １
７ ２０１．０００ ３ ２
１０ ２４Ｚｏｏ ６
０．５ １９ ２７＊ ８
６ １ ２７” ３２”十
枠が非常に狭くなり、アリルサイズが広く異なる微量
のＤＮＡの場合には消えることもあることに注意。
＊ 注 このモデルは、ヒトゲノムＤＮＡ＜ｉｏｏｐｇ
（１７細胞に相当）中の標的分子の数に顕著な確率論
的な多様性が存在することを考慮に入れていない。６ｐ
ｇのＤＮＡの分析は各アリルの単一の標的分子の増幅に
対応する。
（１７細胞に相当）中の標的分子の数に顕著な確率論
的な多様性が存在することを考慮に入れていない。６ｐ
ｇのＤＮＡの分析は各アリルの単一の標的分子の増幅に
対応する。
ホモ接合性は容易にこのモデルに適用することができる
。Ｃ は変化させずに、Ｃ１を、各アリＵ ルを＞０．０５ｐｇ （すなわち、合わせて＞０．ｌｐ
ｇ）得るのに必要なサイクル数として定義する。
。Ｃ は変化させずに、Ｃ１を、各アリＵ ルを＞０．０５ｐｇ （すなわち、合わせて＞０．ｌｐ
ｇ）得るのに必要なサイクル数として定義する。
異なる体積の反応も適用することができる。
Ｃ１を全反応液中で＞０．１ｐｇの各アリルを得るのに
必要なサイクル数として定義する。Ｃｕをｌθμｇの反
応液あたり＜ １０００１）ｇの全産物を得るのに必要
なサイクル数として定義する。大きな体積のＰＣＲ反応
に関しては、Ｃ１は変化させず、Ｃｕを１０μａの反応
液の場合よりも幾分大きくする。
必要なサイクル数として定義する。Ｃｕをｌθμｇの反
応液あたり＜ １０００１）ｇの全産物を得るのに必要
なサイクル数として定義する。大きな体積のＰＣＲ反応
に関しては、Ｃ１は変化させず、Ｃｕを１０μａの反応
液の場合よりも幾分大きくする。
解析のための増幅産物の適当ｆｆｉ（０．１〜４ｏｏｏ
ｐｇの産物）を産生ずる増幅サイクルの枠は、例えば１
００ｎｇのゲノムＤＮＡに対しては１０〜１５サイクル
、ｌｎｇに対しては１Ｂサイクル、単一の細胞増幅（６
ｐｇ）に対しては２５サイクルである。増幅効率が低い
大きいアリルを検出するためにはＰＣＲサイクル数を増
やす必要がある。アリルの長さに依存して１０００〜１
０６ｐｇの正確な増幅産物が得られる。
ｐｇの産物）を産生ずる増幅サイクルの枠は、例えば１
００ｎｇのゲノムＤＮＡに対しては１０〜１５サイクル
、ｌｎｇに対しては１Ｂサイクル、単一の細胞増幅（６
ｐｇ）に対しては２５サイクルである。増幅効率が低い
大きいアリルを検出するためにはＰＣＲサイクル数を増
やす必要がある。アリルの長さに依存して１０００〜１
０６ｐｇの正確な増幅産物が得られる。
本方法の特に有利な点は、ある含情報領域中の一つの反
復ユニットの違いでさえも同定し得ることである。本発
明の方法はまた、約１０ｋｂまでのような、例えば１５
ｋｂまでの大きな含情報座位の信頼し得る再現性を示す
と考えられている。
復ユニットの違いでさえも同定し得ることである。本発
明の方法はまた、約１０ｋｂまでのような、例えば１５
ｋｂまでの大きな含情報座位の信頼し得る再現性を示す
と考えられている。
試料ＤＮＡの増幅されたコピーがネットワークを形成す
ることおよび不完全な伸長産物の産生が関連する問題が
ヘテロな大きさの一本鎖ミニサテライトＤＮＡの顕著な
出現につながることも見いだされてきた。一本鎖のＤＮ
ＡはＰＣＲ反応液中に非特異的な産物をかなりの量産生
することができる。この問題は、一本鎖ＤＮＡを特異的
に消化あるいは分解し二本鎖ＤＮＡをもとのままに残す
ような酵素の使用によって克服、あるいは少なくとも軽
減することができる。望ましい酵素はＳ１ヌクレアーゼ
である。このような酵素でＰＣＲ最終産物を消化するこ
とにより、最後の検出過程でよりきれいなＰＣＲ産物像
が得られる。したがって、本発明の望ましい局面として
は、本発明の方法が一本鎖ＤＮＡを特異的に消化あるい
は分解するが二本鎖ＤＮＡはそのまま残すような少なく
とも一つの酵素の使用を含み、それによってＰＣＲ反応
の非特異的産物の問題は改善される。
ることおよび不完全な伸長産物の産生が関連する問題が
ヘテロな大きさの一本鎖ミニサテライトＤＮＡの顕著な
出現につながることも見いだされてきた。一本鎖のＤＮ
ＡはＰＣＲ反応液中に非特異的な産物をかなりの量産生
することができる。この問題は、一本鎖ＤＮＡを特異的
に消化あるいは分解し二本鎖ＤＮＡをもとのままに残す
ような酵素の使用によって克服、あるいは少なくとも軽
減することができる。望ましい酵素はＳ１ヌクレアーゼ
である。このような酵素でＰＣＲ最終産物を消化するこ
とにより、最後の検出過程でよりきれいなＰＣＲ産物像
が得られる。したがって、本発明の望ましい局面として
は、本発明の方法が一本鎖ＤＮＡを特異的に消化あるい
は分解するが二本鎖ＤＮＡはそのまま残すような少なく
とも一つの酵素の使用を含み、それによってＰＣＲ反応
の非特異的産物の問題は改善される。
増幅産物の検出は、あらゆる便利な手段で行なわれる。
例えばゲル電気泳動および、その後に、望むならばそれ
に含まれている含情報座位にハイプリダイズ可能なブロ
ーブとハイブリダイゼーションさせ、例えば放射性標識
されたブローブを用いた場合にはオートラジオグラフィ
ーを行なうことによって、増幅産物の同定および解析を
行なうことができる。便利な方法は、ヨーロッパ特許出
願出版番号第２３８３２９号に開示されている。あるい
はより直接的な方法が用いられる。増幅産物をゲルで分
離した後、それを直接視覚化する。産物が十分量得られ
る場合には、例えばエチジウムブロマイドによる直接染
色が行なわれる。隣接ヌクレオチド配列は標識あるいは
マーカー化合物のいずれかを有し、このような標識ある
いはマーカーを便利な方法の何れかで検出する。このよ
うな標識あるいはマーカーとしては、放射性および非放
射性化合物が含まれるが、後者の方が望ましい。
に含まれている含情報座位にハイプリダイズ可能なブロ
ーブとハイブリダイゼーションさせ、例えば放射性標識
されたブローブを用いた場合にはオートラジオグラフィ
ーを行なうことによって、増幅産物の同定および解析を
行なうことができる。便利な方法は、ヨーロッパ特許出
願出版番号第２３８３２９号に開示されている。あるい
はより直接的な方法が用いられる。増幅産物をゲルで分
離した後、それを直接視覚化する。産物が十分量得られ
る場合には、例えばエチジウムブロマイドによる直接染
色が行なわれる。隣接ヌクレオチド配列は標識あるいは
マーカー化合物のいずれかを有し、このような標識ある
いはマーカーを便利な方法の何れかで検出する。このよ
うな標識あるいはマーカーとしては、放射性および非放
射性化合物が含まれるが、後者の方が望ましい。
同時に増幅可能な含情報領域数は実用的な制限によって
以外は制限されないと考えられている。
以外は制限されないと考えられている。
例えば２０領域まで同時に増幅することができ、１０領
域、また、特に８．７，６，５，あるいは４領域が便利
である。望ましい局面では、６領域が同時に増幅される
。
域、また、特に８．７，６，５，あるいは４領域が便利
である。望ましい局面では、６領域が同時に増幅される
。
本発明の隣接するポリヌクレオチドは診断キッド内のも
のとして容易に与えることができる。本発明のさらに別
の局面はしたがつて、コントロール試料ＤＮＡとともに
含情報座位に隣接した試料ＤＮＡ領域にハイブリダイズ
可能な、二つの相補的な隣接ポリヌクレオチド、および
その使用のための指示を含むキットに関する。便利で望
ましいプロ′−ブとしては、本明細書の別の部分で示し
たものを含む。キットはまた、含情報座位にかかる隣接
ポリヌクレオチドの伸長のための試薬ヌクレオチド、お
よび／または酵素などの伸長開始因子も含むことができ
る。
のとして容易に与えることができる。本発明のさらに別
の局面はしたがつて、コントロール試料ＤＮＡとともに
含情報座位に隣接した試料ＤＮＡ領域にハイブリダイズ
可能な、二つの相補的な隣接ポリヌクレオチド、および
その使用のための指示を含むキットに関する。便利で望
ましいプロ′−ブとしては、本明細書の別の部分で示し
たものを含む。キットはまた、含情報座位にかかる隣接
ポリヌクレオチドの伸長のための試薬ヌクレオチド、お
よび／または酵素などの伸長開始因子も含むことができ
る。
本発明の方法で用いられる含情報遺伝子領域の隣接配列
の例を以下のページに示す。また、含情報遺伝子座位に
ハイブリダイズすることができる単一の座位のブローブ
の表を詳細に示した。
の例を以下のページに示す。また、含情報遺伝子座位に
ハイブリダイズすることができる単一の座位のブローブ
の表を詳細に示した。
このブローブのパネルは１９８８年５月にバージニア州
，クヴアンチコでの学会でレイ・ホワイト（Ｒａｙ Ｗ
ｈｉｔｅ）によって示された。このような含情報遺伝子
領域に隣接した領域にハイブリダイゼーションできるポ
リヌクレオチドプライマーを上述のように調製し、本発
明の方法に使用することができる。プライマーはこのよ
うな領域のどの一つに関しても、あるいは、領域の組合
せに関して調製され、どの望みの含情報領域のパネルの
伸長産物も与えることができる。
，クヴアンチコでの学会でレイ・ホワイト（Ｒａｙ Ｗ
ｈｉｔｅ）によって示された。このような含情報遺伝子
領域に隣接した領域にハイブリダイゼーションできるポ
リヌクレオチドプライマーを上述のように調製し、本発
明の方法に使用することができる。プライマーはこのよ
うな領域のどの一つに関しても、あるいは、領域の組合
せに関して調製され、どの望みの含情報領域のパネルの
伸長産物も与えることができる。
クローンλＭ Ｓ ２９中のミニサテライト反復配列。
ミニサテライトコア配列（ＧＧＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧ
ＡＲＧ，ジエフェリーズはか． １９８５）の３′末端
に相同な３９ｂｐコンセンサス反復配列領域を星印で示
す。コンセンサス配列からの変異は、λＭ Ｓ ２９か
らランダムにクローン化された４つの近接した反復ユニ
ット（ａ−ｄ，ｅ−ｈ）の二つのブロックに関して示す
。３９ｂｐの反復配列はＰ）ＦＡＧの１３の発散した反
復からなる。
ＡＲＧ，ジエフェリーズはか． １９８５）の３′末端
に相同な３９ｂｐコンセンサス反復配列領域を星印で示
す。コンセンサス配列からの変異は、λＭ Ｓ ２９か
らランダムにクローン化された４つの近接した反復ユニ
ット（ａ−ｄ，ｅ−ｈ）の二つのブロックに関して示す
。３９ｂｐの反復配列はＰ）ＦＡＧの１３の発散した反
復からなる。
ｐＭｓ３１−タンデム反復３１Ｂを大文字で示す。
ｇａｔＣＣａＣｔＣｇｇａａＣＣａＣＣｔｇｃａｇｔ
ｔａｇｇａｇｃａａｇｃｃｔａｇａａｔｇｔ ｔＣｔｇ
ｇａａｇｇａｔ ｉｇａａｇｃｃＩｌｇｃｃｔ ｔｇｔ
Ｃｇａｇｇｃｃｃｔｇｇｇａａａｇｔｇｇｃｃｔｇｇａ
ｃａｔｇｇｇｇａｔｇｔｇｇｃｔｇｇａｇｇａｃｃｃｇ
ａｇｇａａｇａｔｇｃｔｇａａｇｔｃｃｔｇｔｇｇａｇ
ｇｃｃｃｇｇｔｃｔｇｇｇａｇｃｃａｃｇｇｃｃｃｃｔ
ｃｃｃｃｃａｃｔｃａｇｔｃｃｇｇｃｃｔｇｃｔｇｇｇ
ｇｔ ｔ ｔｃｃｔｇｃｃｇｇｇｃｃｔｃｃｔｃａｇａ
ｇｃｃｃａｃｇｇｃｔｃｃｃｃａｇｇｔｇｇｃｔｃ ｔ
ｇｇｃｃｃｇｇｇｓｔｇｃｃａｃａｇｇｃａｃａａｃｃ
ｔａｇｇｃａｇｇｇｇａａｇｃｃｇｃａｇｃａｃａａ
ｔｇｔ ｔｇｇｃｔｃｔ ｔｃｃｃｔ ｔ ｔｇｃａｃ
ｇｃｔｇｇａｃｇｇｔｇｇｃｇｔ ｔ ｔ ｔｇｃｃｔ
ｔ ｔｃｇｃｃｔ ｔｇｇｇｃｔｃａｇｇａｇｇｇｇ
ｔｇｇｇｇｇｇｔＣ３１ｇｇａｇｇｇｇｃｃａｔｇａａ
ｇｇｇｇａｃｃｔｇｇｃｃｔｔｇｇＣＴＧＴＣＣＡＣＣ
ＴＣＣＣＡＣＡＧＡＣＡｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘＸＸｘ
ＴＣＴＡＣｃ’ｒｃＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＴＧＣＣｇｇ
ＣＣｇｇａｔｇｇｇＣＧＴＧＴＧＧＧＧＡＣＧＧＴＧＴ
ＧＣＣＧＧＴＧＴＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧ
ＴＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＴＧＣＡＧＧＴＧＴＧＧＧＧＡ
ＣＧＧＧＧＴＧＣＡＧＧＴＧＴＧＧＧＧＡＣＧＧＣＧＴ
ＧＣＡＧＧＴＧＴＧＧＧＧＡＣＧＧＧＴＧＣＡＧＧＴＧ
ＴＧＧＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＴＧＧＧＧＡＴＣ
６１０Ｍ Ｓ ８１座位の３′隣接配列 サ ア フ イ ト ミニサテラ イ ト ５’ ＣＣＧＧＣＣＧＧ ＡＴＧＧＧＣＧＴＧＴ
ＧＧＧＧＡＣＧＧＴＧ ＴＧＣＣＧＧＴＧＴＧ
ＧＧＧＡＣＧＧＧＧＴ３’ ＧＧＣＣＧＧＣＣ Ｔ
ＡＣＣＣＧＣＡＣＡ ＣＣＣＣＴＧＣＣＡＣ ＡＣ
ＧＧＣＣＡＣＡＣ ＣＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧ
ＴＧＴＧＧ ＣＧＴＣＣＡＣＡＣＣ ＧＧＡＣＧＧＧＧＴＧ ＣＣＴＧＣＣＣＣＡＣ ＣＡＧＧＴＧＴＧＧＧ ＧＴＣＣＡＣＡＣＣＣ ＧＡＣＧＧＧＧＴＧＣ ＣＴＧＣＣＣＣＡＣＧ ＡＧＧＴＧＴＧＧＧＧ ＴＣＣＡＣＡＣＣＣＣ ＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡ ＴＧＣＣＧＣＡＣＧＴ ＧＧＴＧＴＧＧＧＧＡ ＣＧＧＧＧＴＧＣＡＧ Ｇ
ＴＧＴＧＧＧＧＡＣ ＧＧＣＧＴＧＣＴＧＴ ＧＧ
ＧＧＡＴＣ ３’ＣＣＡＣＡＣＣＣＣＴ ＧＣＣＣ
ＣＡＣＧＴＣ ＣＡＣＡＣＣＣＣＴＧ ＣＣＧＣＡ
ＣＧＡＣＡ ＣＣＣＣＴＡＧ ５’ｐＭｓ４３−Ａ
ｌｕ配列は太字で、短いタンデム反復は下線で示す。ミ
ニサテライト配列は、Ｘで分断された二つの最も外側の
反復（大文字）で略記し、最後の反復ユニット中のＳ
ｍａ Ｉ部位で４３Ａの３′配列が再開され、それによ
りこれらの６塩基のみが大文字で示されている。
ｔａｇｇａｇｃａａｇｃｃｔａｇａａｔｇｔ ｔＣｔｇ
ｇａａｇｇａｔ ｉｇａａｇｃｃＩｌｇｃｃｔ ｔｇｔ
Ｃｇａｇｇｃｃｃｔｇｇｇａａａｇｔｇｇｃｃｔｇｇａ
ｃａｔｇｇｇｇａｔｇｔｇｇｃｔｇｇａｇｇａｃｃｃｇ
ａｇｇａａｇａｔｇｃｔｇａａｇｔｃｃｔｇｔｇｇａｇ
ｇｃｃｃｇｇｔｃｔｇｇｇａｇｃｃａｃｇｇｃｃｃｃｔ
ｃｃｃｃｃａｃｔｃａｇｔｃｃｇｇｃｃｔｇｃｔｇｇｇ
ｇｔ ｔ ｔｃｃｔｇｃｃｇｇｇｃｃｔｃｃｔｃａｇａ
ｇｃｃｃａｃｇｇｃｔｃｃｃｃａｇｇｔｇｇｃｔｃ ｔ
ｇｇｃｃｃｇｇｇｓｔｇｃｃａｃａｇｇｃａｃａａｃｃ
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ＧＣＡＧＧＴＧＴＧＧＧＧＡＣＧＧＧＴＧＣＡＧＧＴＧ
ＴＧＧＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＴＧＧＧＧＡＴＣ
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ＧＧＧＡＣＧＧＧＧＴ３’ ＧＧＣＣＧＧＣＣ Ｔ
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ＧＧＣＣＡＣＡＣ ＣＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧ
ＴＧＴＧＧ ＣＧＴＣＣＡＣＡＣＣ ＧＧＡＣＧＧＧＧＴＧ ＣＣＴＧＣＣＣＣＡＣ ＣＡＧＧＴＧＴＧＧＧ ＧＴＣＣＡＣＡＣＣＣ ＧＡＣＧＧＧＧＴＧＣ ＣＴＧＣＣＣＣＡＣＧ ＡＧＧＴＧＴＧＧＧＧ ＴＣＣＡＣＡＣＣＣＣ ＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡ ＴＧＣＣＧＣＡＣＧＴ ＧＧＴＧＴＧＧＧＧＡ ＣＧＧＧＧＴＧＣＡＧ Ｇ
ＴＧＴＧＧＧＧＡＣ ＧＧＣＧＴＧＣＴＧＴ ＧＧ
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ＣＡＣＧＴＣ ＣＡＣＡＣＣＣＣＴＧ ＣＣＧＣＡ
ＣＧＡＣＡ ＣＣＣＣＴＡＧ ５’ｐＭｓ４３−Ａ
ｌｕ配列は太字で、短いタンデム反復は下線で示す。ミ
ニサテライト配列は、Ｘで分断された二つの最も外側の
反復（大文字）で略記し、最後の反復ユニット中のＳ
ｍａ Ｉ部位で４３Ａの３′配列が再開され、それによ
りこれらの６塩基のみが大文字で示されている。
ｐＭＳ２２ｇ −２２８ Ｂ周辺のＤＮＡの２ｋｂサブ
クローン由来の配列。Ａｌｕ配列は太字で、短い端でＭ
ｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂ１ｏ１．反復は下線で示す。ミ
ニサテライト配列はＸで分離された二つの最も外側の反
復（大文字）で略記する。
クローン由来の配列。Ａｌｕ配列は太字で、短い端でＭ
ｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂ１ｏ１．反復は下線で示す。ミ
ニサテライト配列はＸで分離された二つの最も外側の反
復（大文字）で略記する。
ａｇｇｃｃａｃｃｃｃｃａｃｃａａｃａａｃａ ｔ ａ
ａｃｃａｇａｇｇｇｇａａｇｇａａｇｔ ｃａｇｇｃｃ
ｃｃ ｔ ｔ ｃ ｔ ｃａｃ ｔ ｃ ｔ ｇａｇａ
ａｇｃ ｔ ｇｇｔ ｇｃ ｔｇｇｇａ ｔ ｔ ｔ
ｔａｇｇｃ ｔｇｔ ｃａｃｇａｃｇａ ｔ ｔ ｃｃ
ａｃｃｃｇｇｃｃａｇｇｇｃａｇｇｃｃｃｇａａｃｃｇ
ｇｃｃｇｇａｇｇｃｃａｃａｇｇａｇａｃｃａａ ｔｇ
ａｇｃｃ ｔｇｇｃ ｔｇｇａｃ ｔ ｃｃ ｔｇｃａ
ａａｃｃ ｔ ｔｇａｇｇｇａｃｇｃｃｇａｇａｔ ｔ
ｃａｃａ ｔ ｔ ｃａｃ ｔｇａａ ｔ ｔ ｔ
ｔｃａ ｔｇｃａｃｇｔｇａｃａｃ ｔ ｃ ｔ ｔｃ
ｔ ｔ ｃ ｔ ｔ ｔ ｔ ｇｔ ｔｃｃｃ ｔｃ
ｃｃｇｃｃｃ ｔｇｃｃｃｃａｃｇｇａｇｃｃａ ｔ
ｔ ｔａｃａａａｃａ ｔａａａａｃｃａ ｔ ｔ ｔ
ｔ ａａａｃｃａ ｔ ｔ ｔ ｔ ｔａａａ ｔｇｇ
ｔ ｔ ｔ ａａａａｃｃ ｔｇｔ ｔ ｔｃ ｔｇｔ
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ｇｇｇｃｃｃａｃａ ｔ ｔ ｃ ｔｃ ｔ ｃｃｃａ
ｇｇｔ ｔａｃ ｔ ｃａｃａ ｔ ｃａｃ ｔ ｃａ
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ｃｔ ｔｃｃｃｔｃｃｃｔｃｃｃｔｃｃｃ ｔｃｃｔ
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ｔｃｃ ｔｃａｇｃｃ ｔ ｃａｇｃｃ ｔ ｃｃｃａ
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参考文献 １． Ｂｅｌｌ Ｇ Ｉ． Ｓｅｌｂｙ Ｊ Ｍ ａｎ
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０２８． ４． Ｊｅｆｆｒｅｙｓ Ａ Ｊ Ｃ１９８７） Ｂｉｏｃｈｅａ＋． Ｓｏｃ． Ｔｒａ
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ｆｒｅｙｓ Ａ Ｊ． Ｗｉｌｓｏｎ Ｖ ａｎｄ
Ｔｈｅｉｎ Ｓ Ｌ（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１
４． ６７−７３．６． Ｊｅｆｆｒｅｙｓ Ａ Ｊ
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１４， ４６０５−４６１８．９．Ｎａｋａｍｕｒ
ａ Ｙ，Ｌｅｐｐｅｒｔ Ｍ．Ｏ゜Ｃｏｎｎｃｌｌ
Ｐ．Ｗｏｌｆｆ Ｒ．Ｈｏｌｓ Ｔ．Ｃｕｌｖ
ｅｒ Ｍ，Ｍａｒｔｉｎ Ｃ，Ｆｕｊｉｓｏｔｏ
Ｅ． Ｈｏｆｆ Ｍ． Ｋｕｍｌｌｎ Ｅ ａｎｄ
Ｗｈｉｔｅ Ｒ（１９８７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５
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Ｗ１１ｓｏｎ Ｖ． Ｐａｔｅｌ Ｉ． Ｐｏ
ｖｅｙ Ｓ ａｎｄＪｅｆｆｒｅｙｓ Ａ Ｊ （１９８７） Ａｎｎ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．
５１． ２８９−２８８．１１．Ｒｅｅｄｅｒ Ｓ
Ｔ，Ｂｒｅｕｎ１ｎｇ Ｍ ＩＩ．Ｄａｖｉｅｓ Ｋ
Ｅ，Ｎｉｃｈｏｌｌｓ Ｒ Ｄ，Ｊａｒｍａｎ
Ａ Ｐ．Ｉｌｉｇｇｓ Ｄ Ｒ．Ｐｅａｒｓｏ
ｎ Ｐ Ｌ ａｎｄ Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ Ｄ Ｊ
（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１７． ５４２−５
４４．１２．Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ Ｈ，Ｇｒｅ
ｅｎ Ｐ．Ｉｌｅｌｍｓ Ｃ，Ｃａｒｔｉｎｈｏｕ
ｒ Ｓ． Ｗｅｉｆｆｅｎｂａｃｈ Ｂ． Ｓｔｅ
ｐｈｅｎｓ Ｋ．Ｋｅｉｔｈ Ｔ Ｐ．Ｂｏｖｄｅｎ
Ｄ Ｗ．Ｓｍｉｔｈ Ｄ Ｒ．ＬａｎｄｅｒＥ Ｓ．
Ｂｏｔｓｔｅｉｎ Ｄ．Ａｋｏｔｓ Ｇ，Ｒｅｄｉｋｅ
ｒ Ｋ Ｓ．Ｇｒａｖｉｕｓ Ｔ． Ｂｒｏｗｎ
Ｖ Ａ． Ｒ１ｓｉｎｇ Ｍ Ｂ． Ｐａｒｋｅｒ
Ｃ， Ｂｒｉｃｋｅｒ Ａ， Ｐｈｉｐｆ）ｓ Ｐ．
Ｍｕｌｌｅｒ−Ｋａｈｌｃ ＩＩ．１３． １４． １５． １Ｂ． Ｆｕｌｔｏｎ Ｔ Ｒ， Ｎｇ Ｓ． Ｓｃｈｕｍｍ
Ｊ Ｖ． Ｂａｒｋｅｒ Ｄ Ｆ．Ｃｒｏｏｋｓ Ｓ
Ｍ， Ｌ１ｎｃｌｏｎ Ｓ Ｅ． Ｄａ１ｙ Ｍ
Ｊ ａｎｄＡｂｒａｈａｍｓｏｎ Ｊ （１９８７） Ｃｅｌｌ ５１， ３１９−３３７．
Ｎａｋａｍｕｒａ Ｙ，Ｌａｔｈｒｏｐ Ｍ．０゜Ｃｏ
ｎｎｅｌｌ Ｐ，Ｌｅｐｐｅｒｔ Ｍ． Ｂａｒｋｅ
ｒ Ｄ， Ｗｒｉｇｈｔ Ｅ． ＳｋｏｌｎｉｃｋＭ，
Ｋｏｎｄｏｌｅｏｎ Ｓ． Ｌｉｔｔ Ｍ．
Ｌａｌｏｕｅｌ Ｊ −Ｍ ａｎｄＷｈＨｅ Ｒ （１９８８） Ｇｅｎｏｓｉｃｓ ２． ３０２−３
０９．Ｊｅｆｆｒｅｙｓ Ａ Ｊ．Ｂｒｏｏｋｆｉ
ｅｌｄ Ｊ Ｆ Ｙ ａｎｄＳｅｍｅｏｎｏｆ
ｆ Ｒ （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１７． ８１８−８１
９．Ｂａｉｒｄ Ｍ， Ｂａｌａｚｓ Ｉ， Ｇ
１ｕｓｔＩ Ａ． ＭｌｙａｚａｋｉＬ，Ｎｉｃｈｏ
ｌａｓ Ｌ．Ｗｅｘｌｅｒ Ｋ，Ｋａｎｔｅｒ
Ｅ．Ｇｌａｓｓｂｅｒｇ Ｊ． Ａｌｌｅｎ Ｆ，
Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ Ｐ ａｎｄＳｕｓｓｉａｎ
Ｌ （１９８Ｂ） Ａｍ． Ｊ． ｌＩｕａ＋． Ｇｅｎ
ｅｔ ３９． ４８９−５０１．Ｔｈｅｉｎ Ｓ Ｌ．
Ｊｅｆｆｒｅｙｓ Ａ Ｊ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｌｏ
ｃｋＨ Ａ （１９８６） Ｌａｎｃｅｔ １１． ３７．１７．
Ｋｎｏｖｌｔｏｎ Ｒ Ｇ，Ｂｒｏｗｎ Ｖ
Ａ，Ｂｒａｍａｎ Ｊ Ｃ．Ｂａｒｋｅｒ Ｃ．
Ｓｃｈｕｍｍ Ｊ Ｗ． Ｈｕｒｒａｙ Ｃ． Ｔａ
ｋｖｏｒｉａｎＴ．Ｒｌｔｚ Ｊ ａｎｄ Ｄｏｎｎ
ｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ Ｈ（１９８Ｂ） Ｂｌｏｏｄ ８
ｇ． ３７ｇ−３８５．１ｇ． Ｇｉｌｌ Ｐ．
Ｊｅｆｆｒｅｙｓ Ａ Ｊ ａｎｄ Ｗｅｒｒｅｔｔ
Ｄ Ｊ（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１８． ５
７７−５７９．１９． Ｇｉｌｌ Ｐ． Ｌｙｇ
ｏ Ｊ Ｅ． Ｆｏｗｌｅｒ Ｓ Ｊ ａｎｄ Ｗｅ
ｒｒｅｔｔＤＪ （１９８７） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ８．
３８−４４．２０．Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ，Ｆａｌｏ
ｏｎａ Ｆ．Ｓｃｈａｒｆ Ｓ．Ｓｉｋｉ Ｒ．１
１ｏｒｎ Ｇ ａｎｄ Ｅｒｌｌｃｈ ＩＩ（１９８Ｂ
） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍ
ｐ． Ｑｕａｎｔ．Ｂｌｏｌ．５１．２６３−２７３
． ２１．Ｓａｉｋｌ Ｒ Ｋ．Ｇｅｌｆａｎｄ Ｄ
ＩＩ．Ｓｔｏｆｆｅｌ Ｓ．Ｓｃｈａｒｆ Ｓ
Ｊ． Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｒ． Ｈｏｒｎ Ｇ Ｔ， Ｍ
ｕｌ．ｌｉｓＫ Ｂ ａｎｄ Ｅｒｌｉｃｈ Ｈ Ａ（
１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９． ４８７−５
４８．２２． Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｒ． Ｙｏｎ Ｂｅｒ
ｏｌｄｉｎｇｃｎ Ｃ ＩＩ． Ｓｅｎｓａｂａｕｔｈ
Ｇ Ｆ ａｎｄ Ｅｒｌｉｃｈ Ｈ Ａ（１９８ｇ）
Ｎａｔｕｒｅ ３３２． ５４３−５４６．２３．
ＬＩ Ｈ． Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎυ肌Ｃｕｔ Ｘ，
Ｓａ１ｋｉ Ｒ Ｋ．Ｅｒｌ１ｃｈ Ｈ ａｎｄ Ａｒ
ｎｈｃｉｍ Ｎ（１９８８） Ｎａｔｕｒｅ． ３
３５． ４１４−４１７．２４． Ｗｏｎｇ Ｃ． Ｄ
ｏｗｌｉｎｇ Ｃ Ｅ， Ｓａｉｋｉ Ｒ Ｋ． Ｈｉ
ｇｕｃｈｉＲ Ｇ． Ｅｒｌｉｃｈ Ｈ Ａ ａｎｄ
Ｋａｚａｚｉａｎ Ｈ Ｈ（１９８７） Ｎａｔｕｒ
ｅ ３３０． ３８４−３８８．２５． Ｓａｉｋｉ
Ｒ Ｄ． Ｓｃｈａｒｆ Ｓ Ｊ． Ｐａｌｏｏｎ
ａ Ｐ． ＭｕｌｌｉｓＫ Ｂ． Ｈｏｒｎ Ｇ
Ｔ． Ｅｒｌｉｃｈ Ｈ Ａ ａｎｄ Ａｒｎｈｅｉ
ｏ＋ Ｎ（１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０．
１３５０−１３５４．２Ｂ． Ｊｅｆｆｒｅｙｓ Ａ
Ｊ ａｎｄ Ｍｏｒｔｏｎ Ｄ Ｂ（１９８７） Ａ
ｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８． １−１５．
２７． Ｖｉｅｉｒａ Ｊ ａｎｄ Ｍｅｓｓ１ｎｇ
Ｊ（１９８２） Ｇｅｎｅ １９， ２５９−２６８
．２ｇ． Ｆｅｉｎｂｅｒｇ Ａ Ｐ ａｒｔｄ Ｖ
ｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ（１９８４） Ａｎａｌ． Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ． １３７． ２６６−２６７．２９
．Ｍａｎｉａｔ１ｓ Ｔ，Ｐｒｉｔｓｃｈ Ｅ Ｆ ａ
ｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ（１９８２） Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｎ．Ｙ．） ． ３０． Ａｒｍｏｕｒ Ｊ Ａ Ｌ． Ｐａｔｅｌ
Ｉ． Ｔｈｅｉｎ Ｓ Ｌ． Ｐｅｙ ＭＰ ａｎ
ｄ Ｊｅｆｆｒｅｙｓ Ａ Ｊ（１９８ｇ） Ｇｅｎｏ
ｍｉｃｓ． ４． ３２８−３３４．３１．Ｊｅｆ
ｆｒｅｙｓ Ａ Ｊ．Ｒｏｙｌｅ Ｎ Ｊ．Ｗｉｌｓ
ｏｎ Ｖ ａｎｄＷｏｎｇ Ｚ （１９８ｇ） Ｎａｔｕｒｅ ３３２． ２７８−２８
１．３２．Ｒｏｙｌｅ Ｎ Ｊ，Ｃｌａｒｋｓｏｎ
Ｒ． Ｗｏｎｇ Ｚ ａｎｄＪｅｆｆｒｅｙ
ｓ Ａ Ｊ （１９８８） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ３ ， ３５２
−３３４．３３．Ｒｏｙｌｅ Ｎ Ｊ．Ｃｌａｒｋ
ｓｏｎ Ｒ， Ｗｏｎｇ Ｚ ａｎｄＪｅｆｆ
ｒｅｙｓ Ａ Ｊ （１９８７）Ｉｌｕｍａｎ Ｇｅｎｅ ｍａｐｐｉ
ｎｇ ９： Ｎｉｎｔｈｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｇｅｎ
ｅｍａｐｐｉｎｇ． Ｃｙｔｏｇｅｎｃｔ． Ｃａｌｌ
Ｇｃｎｃｔ． ４６， ８８５．本発明を以下に
参考として例示するが、これに制限されるものではない
： 実施例 １ 材料と方法 ヒトＤＮＡ試料はＣＥＰＨ （パリ）から入手するか、
あるいは別掲のように（２６）静脈血から調製した。ク
ルアヘム社（Ｃｒｕａｃｈｅｍ）から供給された試薬を
用いてＡＢＩ３８０Ｂ ＤＮＡ合成機で合成したオリ
ゴヌクレオチドはエタオール沈澱によって精製し、水に
溶解した。ヒトミニサテライトクローンＭ Ｓ ３２
（１０）由来の５．６ｋｂ Ｓａｕ３Ａインサートをｐ
Ｕ Ｃ １３ （２７）のＢａｍＨＩ部位にサブクロ
ーニングした。同様に、組換えＭ１３ＲＦＤＮＡ３３．
ｌ， ３３．４，および３３．８（５）由来のミニサテ
ライトインサートを１．９ｋｂ Ｂａａ＋Ｈ Ｉ −
ＥｃｏＲ Ｉ断片、２．７ｋｂ Ｓ ａｕ３ Ａ −
Ｅ ｃｏＲ Ｉ断片、および０．７ｋｂ Ｂａａ＋Ｈ
Ｉ − ＥｃｏＲ Ｉ断片としてそれぞれ単離し、Ｂａ
ｍＨＩとＥｃｏＲＩの双方で消化したｐＵｃ１３にサブ
クローニングし、ブラスミドシリーズｐ３３．１， ｐ
３３．４． ｐ３３．６を作成した。適当なミニサテラ
イトを含むＤＮＡ断片を１％低融点アガロース（Ｓｅａ
ｐｌａｑｕｅ）で電気泳動を行なって制限酵素分解し
たブラスミドＤＮＡから単離した；ＤＮＡ断片を含むゲ
ルスライスを６５℃で水に溶解し、最終濃度を２μｇ
／ ｍｌ Ｄ Ｎ Ａとした。ＤＮＡの１０ｎｇアリコ
ートをラ．ンダムオリゴヌクレオチドプライミング（２
８）によって３２Ｐで標識した。
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参考文献 １． Ｂｅｌｌ Ｇ Ｉ． Ｓｅｌｂｙ Ｊ Ｍ ａｎ
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３７．３． Ｇｏｏｄｂｏｕｒｎ Ｓ Ｅ Ｙ， Ｈｉ
ｇｇｓ Ｄ Ｒ． Ｃｌｅｇｇ Ｊ Ｂａｎｄ Ｗｅａ
ｔｈｅｒａｌｌ Ｄ Ｊ（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
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ｎｓ． １５． ３０９−３１７．５． Ｊｅｆ
ｆｒｅｙｓ Ａ Ｊ． Ｗｉｌｓｏｎ Ｖ ａｎｄ
Ｔｈｅｉｎ Ｓ Ｌ（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１
４． ６７−７３．６． Ｊｅｆｆｒｅｙｓ Ａ Ｊ
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（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１Ｂ， ７６−７９．
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ｕａｒｒｅ Ａ Ｓ ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ
Ｄ（１９８７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５， ６８３−
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Ｊｃｆｆｒｅｙｓ Ａ Ｊ ａｎｄ Ｔｈ１ｅｎＳＬ （１９８Ｂ） Ｎｕｃｌｏｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
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ａ Ｙ，Ｌｅｐｐｅｒｔ Ｍ．Ｏ゜Ｃｏｎｎｃｌｌ
Ｐ．Ｗｏｌｆｆ Ｒ．Ｈｏｌｓ Ｔ．Ｃｕｌｖ
ｅｒ Ｍ，Ｍａｒｔｉｎ Ｃ，Ｆｕｊｉｓｏｔｏ
Ｅ． Ｈｏｆｆ Ｍ． Ｋｕｍｌｌｎ Ｅ ａｎｄ
Ｗｈｉｔｅ Ｒ（１９８７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５
， １６１８−１６２２．１０． Ｖｏｎｇ Ｚ，
Ｗ１１ｓｏｎ Ｖ． Ｐａｔｅｌ Ｉ． Ｐｏ
ｖｅｙ Ｓ ａｎｄＪｅｆｆｒｅｙｓ Ａ Ｊ （１９８７） Ａｎｎ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．
５１． ２８９−２８８．１１．Ｒｅｅｄｅｒ Ｓ
Ｔ，Ｂｒｅｕｎ１ｎｇ Ｍ ＩＩ．Ｄａｖｉｅｓ Ｋ
Ｅ，Ｎｉｃｈｏｌｌｓ Ｒ Ｄ，Ｊａｒｍａｎ
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ｎ Ｐ Ｌ ａｎｄ Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ Ｄ Ｊ
（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１７． ５４２−５
４４．１２．Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ Ｈ，Ｇｒｅ
ｅｎ Ｐ．Ｉｌｅｌｍｓ Ｃ，Ｃａｒｔｉｎｈｏｕ
ｒ Ｓ． Ｗｅｉｆｆｅｎｂａｃｈ Ｂ． Ｓｔｅ
ｐｈｅｎｓ Ｋ．Ｋｅｉｔｈ Ｔ Ｐ．Ｂｏｖｄｅｎ
Ｄ Ｗ．Ｓｍｉｔｈ Ｄ Ｒ．ＬａｎｄｅｒＥ Ｓ．
Ｂｏｔｓｔｅｉｎ Ｄ．Ａｋｏｔｓ Ｇ，Ｒｅｄｉｋｅ
ｒ Ｋ Ｓ．Ｇｒａｖｉｕｓ Ｔ． Ｂｒｏｗｎ
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Ｊ ａｎｄＡｂｒａｈａｍｓｏｎ Ｊ （１９８７） Ｃｅｌｌ ５１， ３１９−３３７．
Ｎａｋａｍｕｒａ Ｙ，Ｌａｔｈｒｏｐ Ｍ．０゜Ｃｏ
ｎｎｅｌｌ Ｐ，Ｌｅｐｐｅｒｔ Ｍ． Ｂａｒｋｅ
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Ｋｏｎｄｏｌｅｏｎ Ｓ． Ｌｉｔｔ Ｍ．
Ｌａｌｏｕｅｌ Ｊ −Ｍ ａｎｄＷｈＨｅ Ｒ （１９８８） Ｇｅｎｏｓｉｃｓ ２． ３０２−３
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ｅｌｄ Ｊ Ｆ Ｙ ａｎｄＳｅｍｅｏｎｏｆ
ｆ Ｒ （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１７． ８１８−８１
９．Ｂａｉｒｄ Ｍ， Ｂａｌａｚｓ Ｉ， Ｇ
１ｕｓｔＩ Ａ． ＭｌｙａｚａｋｉＬ，Ｎｉｃｈｏ
ｌａｓ Ｌ．Ｗｅｘｌｅｒ Ｋ，Ｋａｎｔｅｒ
Ｅ．Ｇｌａｓｓｂｅｒｇ Ｊ． Ａｌｌｅｎ Ｆ，
Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ Ｐ ａｎｄＳｕｓｓｉａｎ
Ｌ （１９８Ｂ） Ａｍ． Ｊ． ｌＩｕａ＋． Ｇｅｎ
ｅｔ ３９． ４８９−５０１．Ｔｈｅｉｎ Ｓ Ｌ．
Ｊｅｆｆｒｅｙｓ Ａ Ｊ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｌｏ
ｃｋＨ Ａ （１９８６） Ｌａｎｃｅｔ １１． ３７．１７．
Ｋｎｏｖｌｔｏｎ Ｒ Ｇ，Ｂｒｏｗｎ Ｖ
Ａ，Ｂｒａｍａｎ Ｊ Ｃ．Ｂａｒｋｅｒ Ｃ．
Ｓｃｈｕｍｍ Ｊ Ｗ． Ｈｕｒｒａｙ Ｃ． Ｔａ
ｋｖｏｒｉａｎＴ．Ｒｌｔｚ Ｊ ａｎｄ Ｄｏｎｎ
ｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ Ｈ（１９８Ｂ） Ｂｌｏｏｄ ８
ｇ． ３７ｇ−３８５．１ｇ． Ｇｉｌｌ Ｐ．
Ｊｅｆｆｒｅｙｓ Ａ Ｊ ａｎｄ Ｗｅｒｒｅｔｔ
Ｄ Ｊ（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１８． ５
７７−５７９．１９． Ｇｉｌｌ Ｐ． Ｌｙｇ
ｏ Ｊ Ｅ． Ｆｏｗｌｅｒ Ｓ Ｊ ａｎｄ Ｗｅ
ｒｒｅｔｔＤＪ （１９８７） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ８．
３８−４４．２０．Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ，Ｆａｌｏ
ｏｎａ Ｆ．Ｓｃｈａｒｆ Ｓ．Ｓｉｋｉ Ｒ．１
１ｏｒｎ Ｇ ａｎｄ Ｅｒｌｌｃｈ ＩＩ（１９８Ｂ
） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍ
ｐ． Ｑｕａｎｔ．Ｂｌｏｌ．５１．２６３−２７３
． ２１．Ｓａｉｋｌ Ｒ Ｋ．Ｇｅｌｆａｎｄ Ｄ
ＩＩ．Ｓｔｏｆｆｅｌ Ｓ．Ｓｃｈａｒｆ Ｓ
Ｊ． Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｒ． Ｈｏｒｎ Ｇ Ｔ， Ｍ
ｕｌ．ｌｉｓＫ Ｂ ａｎｄ Ｅｒｌｉｃｈ Ｈ Ａ（
１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９． ４８７−５
４８．２２． Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｒ． Ｙｏｎ Ｂｅｒ
ｏｌｄｉｎｇｃｎ Ｃ ＩＩ． Ｓｅｎｓａｂａｕｔｈ
Ｇ Ｆ ａｎｄ Ｅｒｌｉｃｈ Ｈ Ａ（１９８ｇ）
Ｎａｔｕｒｅ ３３２． ５４３−５４６．２３．
ＬＩ Ｈ． Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎυ肌Ｃｕｔ Ｘ，
Ｓａ１ｋｉ Ｒ Ｋ．Ｅｒｌ１ｃｈ Ｈ ａｎｄ Ａｒ
ｎｈｃｉｍ Ｎ（１９８８） Ｎａｔｕｒｅ． ３
３５． ４１４−４１７．２４． Ｗｏｎｇ Ｃ． Ｄ
ｏｗｌｉｎｇ Ｃ Ｅ， Ｓａｉｋｉ Ｒ Ｋ． Ｈｉ
ｇｕｃｈｉＲ Ｇ． Ｅｒｌｉｃｈ Ｈ Ａ ａｎｄ
Ｋａｚａｚｉａｎ Ｈ Ｈ（１９８７） Ｎａｔｕｒ
ｅ ３３０． ３８４−３８８．２５． Ｓａｉｋｉ
Ｒ Ｄ． Ｓｃｈａｒｆ Ｓ Ｊ． Ｐａｌｏｏｎ
ａ Ｐ． ＭｕｌｌｉｓＫ Ｂ． Ｈｏｒｎ Ｇ
Ｔ． Ｅｒｌｉｃｈ Ｈ Ａ ａｎｄ Ａｒｎｈｅｉ
ｏ＋ Ｎ（１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０．
１３５０−１３５４．２Ｂ． Ｊｅｆｆｒｅｙｓ Ａ
Ｊ ａｎｄ Ｍｏｒｔｏｎ Ｄ Ｂ（１９８７） Ａ
ｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８． １−１５．
２７． Ｖｉｅｉｒａ Ｊ ａｎｄ Ｍｅｓｓ１ｎｇ
Ｊ（１９８２） Ｇｅｎｅ １９， ２５９−２６８
．２ｇ． Ｆｅｉｎｂｅｒｇ Ａ Ｐ ａｒｔｄ Ｖ
ｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ（１９８４） Ａｎａｌ． Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ． １３７． ２６６−２６７．２９
．Ｍａｎｉａｔ１ｓ Ｔ，Ｐｒｉｔｓｃｈ Ｅ Ｆ ａ
ｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ（１９８２） Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｎ．Ｙ．） ． ３０． Ａｒｍｏｕｒ Ｊ Ａ Ｌ． Ｐａｔｅｌ
Ｉ． Ｔｈｅｉｎ Ｓ Ｌ． Ｐｅｙ ＭＰ ａｎ
ｄ Ｊｅｆｆｒｅｙｓ Ａ Ｊ（１９８ｇ） Ｇｅｎｏ
ｍｉｃｓ． ４． ３２８−３３４．３１．Ｊｅｆ
ｆｒｅｙｓ Ａ Ｊ．Ｒｏｙｌｅ Ｎ Ｊ．Ｗｉｌｓ
ｏｎ Ｖ ａｎｄＷｏｎｇ Ｚ （１９８ｇ） Ｎａｔｕｒｅ ３３２． ２７８−２８
１．３２．Ｒｏｙｌｅ Ｎ Ｊ，Ｃｌａｒｋｓｏｎ
Ｒ． Ｗｏｎｇ Ｚ ａｎｄＪｅｆｆｒｅｙ
ｓ Ａ Ｊ （１９８８） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ３ ， ３５２
−３３４．３３．Ｒｏｙｌｅ Ｎ Ｊ．Ｃｌａｒｋ
ｓｏｎ Ｒ， Ｗｏｎｇ Ｚ ａｎｄＪｅｆｆ
ｒｅｙｓ Ａ Ｊ （１９８７）Ｉｌｕｍａｎ Ｇｅｎｅ ｍａｐｐｉ
ｎｇ ９： Ｎｉｎｔｈｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｇｅｎ
ｅｍａｐｐｉｎｇ． Ｃｙｔｏｇｅｎｃｔ． Ｃａｌｌ
Ｇｃｎｃｔ． ４６， ８８５．本発明を以下に
参考として例示するが、これに制限されるものではない
： 実施例 １ 材料と方法 ヒトＤＮＡ試料はＣＥＰＨ （パリ）から入手するか、
あるいは別掲のように（２６）静脈血から調製した。ク
ルアヘム社（Ｃｒｕａｃｈｅｍ）から供給された試薬を
用いてＡＢＩ３８０Ｂ ＤＮＡ合成機で合成したオリ
ゴヌクレオチドはエタオール沈澱によって精製し、水に
溶解した。ヒトミニサテライトクローンＭ Ｓ ３２
（１０）由来の５．６ｋｂ Ｓａｕ３Ａインサートをｐ
Ｕ Ｃ １３ （２７）のＢａｍＨＩ部位にサブクロ
ーニングした。同様に、組換えＭ１３ＲＦＤＮＡ３３．
ｌ， ３３．４，および３３．８（５）由来のミニサテ
ライトインサートを１．９ｋｂ Ｂａａ＋Ｈ Ｉ −
ＥｃｏＲ Ｉ断片、２．７ｋｂ Ｓ ａｕ３ Ａ −
Ｅ ｃｏＲ Ｉ断片、および０．７ｋｂ Ｂａａ＋Ｈ
Ｉ − ＥｃｏＲ Ｉ断片としてそれぞれ単離し、Ｂａ
ｍＨＩとＥｃｏＲＩの双方で消化したｐＵｃ１３にサブ
クローニングし、ブラスミドシリーズｐ３３．１， ｐ
３３．４． ｐ３３．６を作成した。適当なミニサテラ
イトを含むＤＮＡ断片を１％低融点アガロース（Ｓｅａ
ｐｌａｑｕｅ）で電気泳動を行なって制限酵素分解し
たブラスミドＤＮＡから単離した；ＤＮＡ断片を含むゲ
ルスライスを６５℃で水に溶解し、最終濃度を２μｇ
／ ｍｌ Ｄ Ｎ Ａとした。ＤＮＡの１０ｎｇアリコ
ートをラ．ンダムオリゴヌクレオチドプライミング（２
８）によって３２Ｐで標識した。
（ｂ） ポリメラーゼ連鎖反応
ヒトＤＮＡのアリコートを、必要であればキャリアとし
て０．１μＭのオリゴヌクレオチドプライマ一存在下で
、５＋ａＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣΩ （ｐＨ７．５）で希
釈し、ｌＯμｆｆ ６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ７
（ｐＨ８．８），１８ｍＭ （ＮＨ４） ２ Ｓ
Ｏ４， ６．７ｍＭ Ｍｇ ＣΩ２，１０ａ＋Ｍ
２−メルカブトエタノール，６．７μＭＥＤＴＡ．１．
５ｍＭ ｄＡＴＰ，ｌ．５ｍＭ ｄＣＴＰ，１．５ｍＭ
ｄＴＴＰ， ｌ．５ｍＭ ｄＧＴＰ （ファルマシア
） ． １７０ ｘ／ｍｌウシ血清アルブミン（ Ｄ
Ｎ ａｓｅフリー，ファルマシア）に１μＭの各オリゴ
ヌクレオチドプライマーと１．５ユニットのＴａｑポリ
メラーゼ（アングリアン・バイオラブズ）を加えた中で
増幅させた。１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の
反応混合液の上に４０μｇのパラフィンオイルをのせ、
９５℃で１分間、６０℃で１分間、７０℃で１５分間の
サイクルをインテリジェント番ヒーティング・ブロック
（カムバイオ社、ケンブリッジ）上で行なった。最終の
増幅反応は一般に、８０”Ｃで１分間の最後の過程によ
ってチェイスし、残っている一本鎖ＤＮＡをプライマー
とア二一ルさせ、伸長過程を７０℃で１５分間行なった
。
て０．１μＭのオリゴヌクレオチドプライマ一存在下で
、５＋ａＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣΩ （ｐＨ７．５）で希
釈し、ｌＯμｆｆ ６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ７
（ｐＨ８．８），１８ｍＭ （ＮＨ４） ２ Ｓ
Ｏ４， ６．７ｍＭ Ｍｇ ＣΩ２，１０ａ＋Ｍ
２−メルカブトエタノール，６．７μＭＥＤＴＡ．１．
５ｍＭ ｄＡＴＰ，ｌ．５ｍＭ ｄＣＴＰ，１．５ｍＭ
ｄＴＴＰ， ｌ．５ｍＭ ｄＧＴＰ （ファルマシア
） ． １７０ ｘ／ｍｌウシ血清アルブミン（ Ｄ
Ｎ ａｓｅフリー，ファルマシア）に１μＭの各オリゴ
ヌクレオチドプライマーと１．５ユニットのＴａｑポリ
メラーゼ（アングリアン・バイオラブズ）を加えた中で
増幅させた。１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の
反応混合液の上に４０μｇのパラフィンオイルをのせ、
９５℃で１分間、６０℃で１分間、７０℃で１５分間の
サイクルをインテリジェント番ヒーティング・ブロック
（カムバイオ社、ケンブリッジ）上で行なった。最終の
増幅反応は一般に、８０”Ｃで１分間の最後の過程によ
ってチェイスし、残っている一本鎖ＤＮＡをプライマー
とア二一ルさせ、伸長過程を７０℃で１５分間行なった
。
（ｃ）ＰＣＲ産物のサザンプロット解析ジエチルエーテ
ル抽出によってパラフィンオイルをＰＣＲ反応液から除
いた。ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動、Ｈｙｂｏ
ｎｄ Ｎ （アマシャム社）上へのサザンブ口ッティン
グ、および３２Ｐで標識したミニサテライトプローブと
のハイブリダイゼーションは、全てのハイブリダイゼー
ションからコンペティターのヒドＤＮＡを省略すること
を除いては、以前に記されているように（１０）行なっ
た。ＰＣＲ産物の制限酵素消化およびｓ１ヌクレアーゼ
消化はゲル電気泳動の前に、５μｇのＰＣＲ反応液を２
５μｇの制限エンドヌクレアーゼあるいはＳ１ヌクレア
ーゼ緩衝液（２９）で希釈し、３ユニットの制限エンド
ヌクレアーゼあるいはＳ１ヌクレアーゼ（Ｂ Ｒ Ｌ）
で３７℃で３０分間消化することによって行なった。
ル抽出によってパラフィンオイルをＰＣＲ反応液から除
いた。ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動、Ｈｙｂｏ
ｎｄ Ｎ （アマシャム社）上へのサザンブ口ッティン
グ、および３２Ｐで標識したミニサテライトプローブと
のハイブリダイゼーションは、全てのハイブリダイゼー
ションからコンペティターのヒドＤＮＡを省略すること
を除いては、以前に記されているように（１０）行なっ
た。ＰＣＲ産物の制限酵素消化およびｓ１ヌクレアーゼ
消化はゲル電気泳動の前に、５μｇのＰＣＲ反応液を２
５μｇの制限エンドヌクレアーゼあるいはＳ１ヌクレア
ーゼ緩衝液（２９）で希釈し、３ユニットの制限エンド
ヌクレアーゼあるいはＳ１ヌクレアーゼ（Ｂ Ｒ Ｌ）
で３７℃で３０分間消化することによって行なった。
（ｄ） 単一のヒト細胞の単離およびＰＣＲ解折静脈
血を等体積のＩＸＳＳＣ （クエン酸ナトリウム生理食
塩水、０．１５Ｍ Ｎ ａ Ｃ Ｄ ， １５１１）
ＰＦ エン酸３ナトリウム、ｐＨ７．０）で希釈し、ヒ
ストパック（Ｈｉｓｔ ｏｐａｑｕｅ） − １１１９
（シグマ社）上に層状に載せ、２０００ ｇでＩＯ分
間遠心してリンパ球を単離した。
血を等体積のＩＸＳＳＣ （クエン酸ナトリウム生理食
塩水、０．１５Ｍ Ｎ ａ Ｃ Ｄ ， １５１１）
ＰＦ エン酸３ナトリウム、ｐＨ７．０）で希釈し、ヒ
ストパック（Ｈｉｓｔ ｏｐａｑｕｅ） − １１１９
（シグマ社）上に層状に載せ、２０００ ｇでＩＯ分
間遠心してリンパ球を単離した。
間層の細胞を３倍体積の１×ＳＳＣで希釈し、再度ヒス
トパック上でバンディングさせた。細胞を２０００ｇで
１０分間遠心してペレットにし、３回１×ＳＳＣで洗浄
して遠心し、１×Ｓｓｃで１０４細胞／ｍｌとなるよう
に再懸濁した。
トパック上でバンディングさせた。細胞を２０００ｇで
１０分間遠心してペレットにし、３回１×ＳＳＣで洗浄
して遠心し、１×Ｓｓｃで１０４細胞／ｍｌとなるよう
に再懸濁した。
０．５ｍｌの唾液を５ｍｌの１×Ｓｓｃで希釈し、２０
００ ｇで１０分間遠心して頬細胞を単離した。細胞ペ
レットを３回、１×ＳＳＣで洗浄し、１０’細胞／ｍｌ
に再懸濁した。
００ ｇで１０分間遠心して頬細胞を単離した。細胞ペ
レットを３回、１×ＳＳＣで洗浄し、１０’細胞／ｍｌ
に再懸濁した。
細胞懸濁液の約０．１μｇのアリコートをシリコナイズ
した顕微鏡スライドグラス上に滴下し、直ちにｌ００×
の倍率で、倒立顕微鏡で観察した。単一の核のある細胞
を含む水滴を直ちに０．４μｇのＩＸＳＳＣで希釈して
使い捨てチップピペットを用いてエツペンドルフチュー
ブに移した。顕微鏡スライドグラスを再度観察して細胞
が水滴から除かれたことを確認した。
した顕微鏡スライドグラス上に滴下し、直ちにｌ００×
の倍率で、倒立顕微鏡で観察した。単一の核のある細胞
を含む水滴を直ちに０．４μｇのＩＸＳＳＣで希釈して
使い捨てチップピペットを用いてエツペンドルフチュー
ブに移した。顕微鏡スライドグラスを再度観察して細胞
が水滴から除かれたことを確認した。
ＰＣＨに先立ち加熱あるいはドデシル硫酸ナトリウム（
ＳＤＳ）とプロテナーゼＫによる処理（２３）のいずれ
かによって細胞を溶解させた。前者の場合には、細胞を
含む水滴を４．５μｇの０．１μＭのオリゴヌクレオチ
ドプライマーを含む５ｍＭＴ ｒｉｓ − Ｈ Ｃｆｌ
（ｐＨ７．５）で希釈し、パラフィンオイルを重層
して９５℃で３分間加熱した後に、５μｇの２×濃度の
ＰＣＲ緩衝液／プライマー／Ｔａｑポリメラーゼを加え
、増幅した。後者の場合には、細胞を含む水滴を０．５
，ｃｄ２の５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ，Ｑ（ｐＨ７．５
）． ０．１μＭプライマーおよび１μｇの５ＩＩＩＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＮ （＋）Ｈ７．５）， ４０ｍＭジ
チオトレイトール，３．４μＭ ＳＤＳ，５０μｇ／
ｍｌプロテナーゼＫ（２３）と混合し、パラフィンオイ
ルで重層し、３７℃で４５分間消化した。３μｇの水を
消化溶液に加え、９５℃で３分間加熱してプロテナーゼ
Ｋを不活性化した後に５μｇの２ＸＰＣＲ反応混合液を
上述のように添加した。
ＳＤＳ）とプロテナーゼＫによる処理（２３）のいずれ
かによって細胞を溶解させた。前者の場合には、細胞を
含む水滴を４．５μｇの０．１μＭのオリゴヌクレオチ
ドプライマーを含む５ｍＭＴ ｒｉｓ − Ｈ Ｃｆｌ
（ｐＨ７．５）で希釈し、パラフィンオイルを重層
して９５℃で３分間加熱した後に、５μｇの２×濃度の
ＰＣＲ緩衝液／プライマー／Ｔａｑポリメラーゼを加え
、増幅した。後者の場合には、細胞を含む水滴を０．５
，ｃｄ２の５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ，Ｑ（ｐＨ７．５
）． ０．１μＭプライマーおよび１μｇの５ＩＩＩＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＮ （＋）Ｈ７．５）， ４０ｍＭジ
チオトレイトール，３．４μＭ ＳＤＳ，５０μｇ／
ｍｌプロテナーゼＫ（２３）と混合し、パラフィンオイ
ルで重層し、３７℃で４５分間消化した。３μｇの水を
消化溶液に加え、９５℃で３分間加熱してプロテナーゼ
Ｋを不活性化した後に５μｇの２ＸＰＣＲ反応混合液を
上述のように添加した。
（ａ）ＰＣＨによる増幅のためのヒトミニサテライトの
選択 ミニサテライトを増幅するための戦略を第１図に示す。
選択 ミニサテライトを増幅するための戦略を第１図に示す。
ミニサテライトに隣接した独特な配列に対応するオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いて、Ｔａｑボリメラーゼ
によってミニサテライトの全長の増幅を行なう。増幅さ
れたアリルはプライミング部位の内部に位置するミニサ
テライトプローブとサザンブ口ットハイプリダイゼーシ
ョンを行なうことによって検出される。６個のクローニ
ングされたミニサテライトが研究のために選択された（
表１）。そのうち二つ、ｐλｇ３およびＭ Ｓ ３２（
８． １０）は９７％のへテロ接合性をもち、４０以上
のアリルでその反復ユニット数に違いがあるような高度
に可変性のある座位を検出する。ＤＮＡフィンガープリ
ントからクローニングされたＳａｕ３Ａ− ＥｃｏＲＩ
ＤＮＡ断片として分離された（Ａ． Ｊ．ジエフ
ェリーズ（ｊｅｆｆｒｅｙｓ）未公開データ）他の４つ
のミニサテライト、３３．１， ３３．４，および３３
．６（５）そしてｐ Ｍ Ｓ ５１は、６６〜７７％の
へテロ接合性を有するような可変性がはるかに低い座位
を検出する；しかし、アリルはｐλｇ３およびＭＳ３２
（表１）のものよりも短く、ＰＣＨによる増幅にはより
従い易いはずである。ｐλｇ３，３３．１， ３３．４
，および３３．６の隣接配列は既に報告されている（８
）。全ての隣接ＤＮＡ配列はＥＭＢ ＬＤＮＡ配列デー
タベースに対してスクリーニングを行い、Ａｌｕのよう
な反復因子を同定し、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライ
マーＡおよびＢ（第１図）はこのような因子を避けるた
めに考案された。
ヌクレオチドプライマーを用いて、Ｔａｑボリメラーゼ
によってミニサテライトの全長の増幅を行なう。増幅さ
れたアリルはプライミング部位の内部に位置するミニサ
テライトプローブとサザンブ口ットハイプリダイゼーシ
ョンを行なうことによって検出される。６個のクローニ
ングされたミニサテライトが研究のために選択された（
表１）。そのうち二つ、ｐλｇ３およびＭ Ｓ ３２（
８． １０）は９７％のへテロ接合性をもち、４０以上
のアリルでその反復ユニット数に違いがあるような高度
に可変性のある座位を検出する。ＤＮＡフィンガープリ
ントからクローニングされたＳａｕ３Ａ− ＥｃｏＲＩ
ＤＮＡ断片として分離された（Ａ． Ｊ．ジエフ
ェリーズ（ｊｅｆｆｒｅｙｓ）未公開データ）他の４つ
のミニサテライト、３３．１， ３３．４，および３３
．６（５）そしてｐ Ｍ Ｓ ５１は、６６〜７７％の
へテロ接合性を有するような可変性がはるかに低い座位
を検出する；しかし、アリルはｐλｇ３およびＭＳ３２
（表１）のものよりも短く、ＰＣＨによる増幅にはより
従い易いはずである。ｐλｇ３，３３．１， ３３．４
，および３３．６の隣接配列は既に報告されている（８
）。全ての隣接ＤＮＡ配列はＥＭＢ ＬＤＮＡ配列デー
タベースに対してスクリーニングを行い、Ａｌｕのよう
な反復因子を同定し、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライ
マーＡおよびＢ（第１図）はこのような因子を避けるた
めに考案された。
全てのプライマーおよびハイブリダイゼーションプロー
ブの詳細は第１図の説明でふれる。
ブの詳細は第１図の説明でふれる。
（ｂ） ヒトミニサテライトアリルのＰＣＲ増幅の信
頼性と効率 特定の長いミニサテライトアリルを増幅するＴａｑポリ
メラーゼの能力を決定するために、１．１ｋｂから１７
．９ｋｂの範囲の長さの計８個の異なるλＭ Ｓ ３２
アリルを与える４個体由来の各０．１μｇのゲノムＤＮ
Ａ混合液をＭ Ｓ ３２隣接プライマーＡおよびＢを用
いてｌＯ〜２０サイクル増幅し、その後にミニサテライ
トブローブでサザンハイプリダイゼーション分析を行な
った（第２Ａ図）。６分間のＴａｑポリメラーゼ伸長時
間を用いて、４つの最も短いアリル（１．１〜２．９ｋ
ｂ）だけが効率よく増幅された。Ｔａｑボリメラーゼが
ミニサテライトを完全に伸長させる可能性を増すために
伸長時間を１５分間に伸ばすと、次に長い二つのアリル
（４．５ ．６．６ｋｂ）の収量が顕著に増大したが、
３０分の伸長ではさらなる改善は見られなかった。長い
アリルの相対的な収世はＴａｑポリメラーゼの濃度を増
すことによっても改善され（第２Ｂ図）、弱くではある
が１０．２ｋｂのアリルが検出されるようになった。
頼性と効率 特定の長いミニサテライトアリルを増幅するＴａｑポリ
メラーゼの能力を決定するために、１．１ｋｂから１７
．９ｋｂの範囲の長さの計８個の異なるλＭ Ｓ ３２
アリルを与える４個体由来の各０．１μｇのゲノムＤＮ
Ａ混合液をＭ Ｓ ３２隣接プライマーＡおよびＢを用
いてｌＯ〜２０サイクル増幅し、その後にミニサテライ
トブローブでサザンハイプリダイゼーション分析を行な
った（第２Ａ図）。６分間のＴａｑポリメラーゼ伸長時
間を用いて、４つの最も短いアリル（１．１〜２．９ｋ
ｂ）だけが効率よく増幅された。Ｔａｑボリメラーゼが
ミニサテライトを完全に伸長させる可能性を増すために
伸長時間を１５分間に伸ばすと、次に長い二つのアリル
（４．５ ．６．６ｋｂ）の収量が顕著に増大したが、
３０分の伸長ではさらなる改善は見られなかった。長い
アリルの相対的な収世はＴａｑポリメラーゼの濃度を増
すことによっても改善され（第２Ｂ図）、弱くではある
が１０．２ｋｂのアリルが検出されるようになった。
１３回目のサイクルに追加のＴａｑポリメラーゼを添加
することによっては、収量の増大はわずかじか認められ
ず、これらの延長した伸長時間中のポリメラーゼ活性の
顕著な低下については証拠はない。
することによっては、収量の増大はわずかじか認められ
ず、これらの延長した伸長時間中のポリメラーゼ活性の
顕著な低下については証拠はない。
アニーリング温度を変化させるさらなる実験では、伸長
温度と緩衝液濃度は大きなアリルの収量を増大させず（
データは示さない）、以下の全ての実験では１５分の伸
長時間と高濃度のＴａｑポリメラーゼ（１０μＵ Ｐ
ＣＲ反応液あたり１．５ユニット）・を用いた。
温度と緩衝液濃度は大きなアリルの収量を増大させず（
データは示さない）、以下の全ての実験では１５分の伸
長時間と高濃度のＴａｑポリメラーゼ（１０μＵ Ｐ
ＣＲ反応液あたり１．５ユニット）・を用いた。
少ないサイクル数（１０サイクル）では、増幅されたア
リルはその電気泳動の移動度から判断して、はじめのλ
Ｍ Ｓ ３２アリルの完全に正確なコピーであることが
示された（第２Ａ図）。サイクル数が増えると（１４．
１７サイクル）、バックグラウンドの標識の増加が見
られた；このほとんどはＳ１ヌクレアーゼでの消化によ
り除去できるので（データは示さない）、このバックグ
ラウンドの多くはプライミングされなかったそれまでの
サイクル由来の低レベルの一本鎖鋳型、および定義によ
りプライミングされ得ないそれまでのサイクル由来の不
完全な伸長産物から生じたものだと考えられる。サイク
ル数が多い場合には（２０サイクル）、ＰＣＲ産物の収
量が高くなりすぎ（ ＞ ４００ｎｇ／ ｍｌ） 、伸
長過程の際に一本鎖タンデム反復ミニサテライトＤＮＡ
の予定外のアニーリングが起こることから予想されたよ
うに、ハイブリダイゼーションパターンは分散したスメ
アを示す。これは再アニールした部位での不完全な伸長
終結、ミニサテライトの相補鎖に予定外にアニールした
不完全な鋳型の伸長から生じる疑似“アリル”および再
アニールしたミニサテライトＤＮＡ鎖の多分子間のネッ
トワーク形成にうながる。
リルはその電気泳動の移動度から判断して、はじめのλ
Ｍ Ｓ ３２アリルの完全に正確なコピーであることが
示された（第２Ａ図）。サイクル数が増えると（１４．
１７サイクル）、バックグラウンドの標識の増加が見
られた；このほとんどはＳ１ヌクレアーゼでの消化によ
り除去できるので（データは示さない）、このバックグ
ラウンドの多くはプライミングされなかったそれまでの
サイクル由来の低レベルの一本鎖鋳型、および定義によ
りプライミングされ得ないそれまでのサイクル由来の不
完全な伸長産物から生じたものだと考えられる。サイク
ル数が多い場合には（２０サイクル）、ＰＣＲ産物の収
量が高くなりすぎ（ ＞ ４００ｎｇ／ ｍｌ） 、伸
長過程の際に一本鎖タンデム反復ミニサテライトＤＮＡ
の予定外のアニーリングが起こることから予想されたよ
うに、ハイブリダイゼーションパターンは分散したスメ
アを示す。これは再アニールした部位での不完全な伸長
終結、ミニサテライトの相補鎖に予定外にアニールした
不完全な鋳型の伸長から生じる疑似“アリル”および再
アニールしたミニサテライトＤＮＡ鎖の多分子間のネッ
トワーク形成にうながる。
ＰＣＨによって増幅された各λＭ Ｓ ３２アリルの収
量はスキャニングデンシトメトリーで定量した（第３図
）。０．１μｇのゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲ産物は少な
くともサイクルｌ７までは指数関数的に蓄積した。
量はスキャニングデンシトメトリーで定量した（第３図
）。０．１μｇのゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲ産物は少な
くともサイクルｌ７までは指数関数的に蓄積した。
サイクルあたりの産物収量は、アリルの長さとともに単
調減少し、１５分の伸長時間と比較して６分間のほうが
より低い収量となる。アリル長に対する収ｎ曲線は、非
常に短いアリルに対しては約２．０のサイクルあたり収
量に外挿され、各サイクルでの変性およびプライミング
効率は１００％に近いことを示している。アリルの最終
収量はこれらの曲線から産出することができる；最初に
ｎ分子存在する、サイクルあたりｇＡの収量をもつアリ
ルＡに関しては、Ｃサイクル後の収量はおよそｎ ａ
ｇ Ａｃ分子である。より短いアリルがより効率よく増
幅されることから、異なる長さのアリルＡとＢの間のモ
ル不均衡は（ｇＡ／ｇＢ）”として与えられる。例えば
、１５分間の伸長時間での増幅を１０サイクル行なった
後、ｌｋｂのアリルは６ｋｂのアリルの１８倍高いモル
収量となる；ｚ５サイクル後には、不均衡は１３００倍
となる。この不均衡性は、ミニサテライトハイブリダイ
ゼーションブローブによってより長いアリルがより効率
よく検出されることにより、ある程度改善される。それ
にもかかわらず、ＰＣＨによって増幅される長いアリル
は、ヒトゲノムＤＮＡから開始するため量が少ないこと
、および、ＰＣＲサイクル数が多くなることによります
ます検出が困難になる。ミニサテライトｐλｇ３． ｐ
Ｍｓ５１， ３３．１， ３３．４．および３３．６も
ＰＣＨによって増幅される能力を調べるために試験した
（データは示さない）。全ての場合に、増幅されないこ
とが予測されたｐλｇ３の最長のアリル（ ＞ ８ ｋ
ｂ）を除いて全ての試したアリルの正確な増幅が観察さ
れた。またやはり、アリルが長くなるにつれてＰＣＲ産
物の収量は低下した。
調減少し、１５分の伸長時間と比較して６分間のほうが
より低い収量となる。アリル長に対する収ｎ曲線は、非
常に短いアリルに対しては約２．０のサイクルあたり収
量に外挿され、各サイクルでの変性およびプライミング
効率は１００％に近いことを示している。アリルの最終
収量はこれらの曲線から産出することができる；最初に
ｎ分子存在する、サイクルあたりｇＡの収量をもつアリ
ルＡに関しては、Ｃサイクル後の収量はおよそｎ ａ
ｇ Ａｃ分子である。より短いアリルがより効率よく増
幅されることから、異なる長さのアリルＡとＢの間のモ
ル不均衡は（ｇＡ／ｇＢ）”として与えられる。例えば
、１５分間の伸長時間での増幅を１０サイクル行なった
後、ｌｋｂのアリルは６ｋｂのアリルの１８倍高いモル
収量となる；ｚ５サイクル後には、不均衡は１３００倍
となる。この不均衡性は、ミニサテライトハイブリダイ
ゼーションブローブによってより長いアリルがより効率
よく検出されることにより、ある程度改善される。それ
にもかかわらず、ＰＣＨによって増幅される長いアリル
は、ヒトゲノムＤＮＡから開始するため量が少ないこと
、および、ＰＣＲサイクル数が多くなることによります
ます検出が困難になる。ミニサテライトｐλｇ３． ｐ
Ｍｓ５１， ３３．１， ３３．４．および３３．６も
ＰＣＨによって増幅される能力を調べるために試験した
（データは示さない）。全ての場合に、増幅されないこ
とが予測されたｐλｇ３の最長のアリル（ ＞ ８ ｋ
ｂ）を除いて全ての試したアリルの正確な増幅が観察さ
れた。またやはり、アリルが長くなるにつれてＰＣＲ産
物の収量は低下した。
（Ｃ） 単一ミニサテライト分子の増幅の信頼性単一
分子の信頼できる増幅が可能かどうかを試験するために
、ｌＯ細胞および１細胞に相当するヒ｝ＤＮＡの６０ｐ
ｇおよび６ｐｇをλＭ Ｓ ３２およびｐ Ｍ Ｓ ５
１の双方のプライマーを用いて２５サイクルの共増幅を
行なった（第４Ａ図）。６０ｐｇ試料中にはｐ Ｍ Ｓ
５１のいずれのアリル（１．６ｋｂおよび１．５ｋｂ
）も増幅され、６ｐｇ試料中にも一つあるいは双方のア
リルの増幅産物が検出された。同様に、λＭ Ｓ ３２
の２．８ｋｂおよび５．９ｋｂのアリルもヒトＤＮＡ試
料６ｐｇから増幅されたが、長い方のアリルの収量は予
想されたように低かった。予想されたように、６ｐｇ試
料中のλＭＳ３２およびｐＭｓ５１アリルの増幅が６３
％の反応あたり平均失敗率で、独立に行なわれることが
示された。６ｐｇのヒトＤＮＡが平均アリルを１分子含
んでいるため６ｐｇのＤＮＡ試料あたり１回の正しい増
幅反応が予想されるのに比較して、上記の結果はポヮソ
ン分布から、平均０．４８の正しい増幅反応が起きてい
ることを示している。したがって、単一の標的ミニサテ
ライト分子は、適度な効率でＰＣＨによって増幅され得
ることが示された。ｐＭｓ５１に関しては疑似増幅産物
は見られなかった。一方、λＭＳ３２は８０ｐｇおよび
６＋ｐｇの双方のＤＮＡ試料中に予想されなかった産物
がしばしば観察された（第４Ａ，４Ｂ図）。Ｓ１ヌクレ
アーゼ消化により、たまにしか現われない変性ＰＣＲ産
物とともに移動する一本のバンド（第４Ｂ図）は除去さ
れ、このバンドは最後のアニーリング／伸長過程によっ
てＰＣＲ産物のチェイスを行なうことにより大部分が除
去された（データは示さない、材料と方法参照）。この
８１ヌクレアーゼ感受性バンドは最後のＰＣＲサイクル
でプライミングされなかった一本鎖鋳型に対応するもの
と思われる。λＭＳ３２に検出される残りの疑似バンド
はＳ１ヌクレアーゼに耐性であるが、ミニサテライトに
隣接するＤＮＡを切断する制限エンドヌクレアーゼで消
化することにより、正しいＰＣＲ産物とともに短くなっ
た（第４Ｂ図）。これらの疑似バンドはおそらく正常な
隣接ＤＮＡ由来であるがミニサテライト反復ユニット数
が異なる異常なＰＣＲ産物を示していると考えられる。
分子の信頼できる増幅が可能かどうかを試験するために
、ｌＯ細胞および１細胞に相当するヒ｝ＤＮＡの６０ｐ
ｇおよび６ｐｇをλＭ Ｓ ３２およびｐ Ｍ Ｓ ５
１の双方のプライマーを用いて２５サイクルの共増幅を
行なった（第４Ａ図）。６０ｐｇ試料中にはｐ Ｍ Ｓ
５１のいずれのアリル（１．６ｋｂおよび１．５ｋｂ
）も増幅され、６ｐｇ試料中にも一つあるいは双方のア
リルの増幅産物が検出された。同様に、λＭ Ｓ ３２
の２．８ｋｂおよび５．９ｋｂのアリルもヒトＤＮＡ試
料６ｐｇから増幅されたが、長い方のアリルの収量は予
想されたように低かった。予想されたように、６ｐｇ試
料中のλＭＳ３２およびｐＭｓ５１アリルの増幅が６３
％の反応あたり平均失敗率で、独立に行なわれることが
示された。６ｐｇのヒトＤＮＡが平均アリルを１分子含
んでいるため６ｐｇのＤＮＡ試料あたり１回の正しい増
幅反応が予想されるのに比較して、上記の結果はポヮソ
ン分布から、平均０．４８の正しい増幅反応が起きてい
ることを示している。したがって、単一の標的ミニサテ
ライト分子は、適度な効率でＰＣＨによって増幅され得
ることが示された。ｐＭｓ５１に関しては疑似増幅産物
は見られなかった。一方、λＭＳ３２は８０ｐｇおよび
６＋ｐｇの双方のＤＮＡ試料中に予想されなかった産物
がしばしば観察された（第４Ａ，４Ｂ図）。Ｓ１ヌクレ
アーゼ消化により、たまにしか現われない変性ＰＣＲ産
物とともに移動する一本のバンド（第４Ｂ図）は除去さ
れ、このバンドは最後のアニーリング／伸長過程によっ
てＰＣＲ産物のチェイスを行なうことにより大部分が除
去された（データは示さない、材料と方法参照）。この
８１ヌクレアーゼ感受性バンドは最後のＰＣＲサイクル
でプライミングされなかった一本鎖鋳型に対応するもの
と思われる。λＭＳ３２に検出される残りの疑似バンド
はＳ１ヌクレアーゼに耐性であるが、ミニサテライトに
隣接するＤＮＡを切断する制限エンドヌクレアーゼで消
化することにより、正しいＰＣＲ産物とともに短くなっ
た（第４Ｂ図）。これらの疑似バンドはおそらく正常な
隣接ＤＮＡ由来であるがミニサテライト反復ユニット数
が異なる異常なＰＣＲ産物を示していると考えられる。
これらは特に増幅３０サイクル以降に顕著であり、一般
に本物のアリルと比較して少景存在し、親のアリルとは
異なり反応ごとに長さが変化する。これらは本物のアリ
ルの増幅が成功した反応液中にのみ見られ（第４Ａ図）
、試した全てのヒトＤＮＡで常に見られた（データは示
さない）ことから、これらはヒトＤＮＡあるいはそれま
でのＰＣＲ反応の産物がＰＣＲ反応に混入した結果では
ない。ほとんど全ての疑似産物が本物のアリルよりも短
いことから、これらはＰＣＲ反応液中にかなり早い時期
に生じ、その短さとそれに伴う高い増幅効率のために優
先的に蓄積するものであろう。どのようにこれらの“変
異体”アリルが生じるか、またこれらが生じるのを抑制
するようなＰＣＲ条件が見つけられるかどうかは現在の
ところ不明である。同様な異常な“アリル“の出現頻度
がｐλｇ３に関しても見られたが、試した他の４つのミ
ニサテライトに関してははるかに低い頻度で出現した。
に本物のアリルと比較して少景存在し、親のアリルとは
異なり反応ごとに長さが変化する。これらは本物のアリ
ルの増幅が成功した反応液中にのみ見られ（第４Ａ図）
、試した全てのヒトＤＮＡで常に見られた（データは示
さない）ことから、これらはヒトＤＮＡあるいはそれま
でのＰＣＲ反応の産物がＰＣＲ反応に混入した結果では
ない。ほとんど全ての疑似産物が本物のアリルよりも短
いことから、これらはＰＣＲ反応液中にかなり早い時期
に生じ、その短さとそれに伴う高い増幅効率のために優
先的に蓄積するものであろう。どのようにこれらの“変
異体”アリルが生じるか、またこれらが生じるのを抑制
するようなＰＣＲ条件が見つけられるかどうかは現在の
ところ不明である。同様な異常な“アリル“の出現頻度
がｐλｇ３に関しても見られたが、試した他の４つのミ
ニサテライトに関してははるかに低い頻度で出現した。
最初のヒトゲノムＤＮＡ中のミニサテライト座位の体細
胞変異も予想しないＰＣＲ産物のもとになる。クローン
化された腫瘍細胞群中に変異ミニサテライトアリルが現
われることによって示されたように（３０） 、このよ
うな変異は実際に、特にスＭ Ｓ ３２に関しで存在す
る。しかしながら、正常な親アリルが存在せずに変異ア
リルが現われるような６ｐｇヒトＤＮＡのＰＣＲ反応ば
これまでなかったため、体細胞変異が第４図に見られる
疑似バンドの主要な材料ではないようである。
胞変異も予想しないＰＣＲ産物のもとになる。クローン
化された腫瘍細胞群中に変異ミニサテライトアリルが現
われることによって示されたように（３０） 、このよ
うな変異は実際に、特にスＭ Ｓ ３２に関しで存在す
る。しかしながら、正常な親アリルが存在せずに変異ア
リルが現われるような６ｐｇヒトＤＮＡのＰＣＲ反応ば
これまでなかったため、体細胞変異が第４図に見られる
疑似バンドの主要な材料ではないようである。
（ｄ） 複数のミニサテライトの共増幅： ＰＣＲ第
４図は、同じＰＣＲ反応液中で二つのミニサテライトが
共増幅され得ることを示している。さらなる解析から、
座位間の顕著な阻害なしに少なくとも６個のミニサテラ
イトが共増幅され得ることが示された。さらに、ＰＣＲ
産物は６個全てのミニサテライトプローブ混合物とのサ
ザンブ口ットハイプリダイゼーションによって同時に分
類することも可能である。このような複数座位ＰＣＲ由
来のＤＮＡ“フィンガープリント”の例を第５図に示し
た。全ての場合に、第４図で見られたような疑似産物の
出現を最少に抑えるため、ＰＣＲ反応を１５〜１８サイ
クルに制限した。同一の個体の反復解析から、全てのハ
イブリダイズするＤＮＡ断片は本物のミニサテライト増
幅産物を示しており、パターンに再現性があることが示
された。
４図は、同じＰＣＲ反応液中で二つのミニサテライトが
共増幅され得ることを示している。さらなる解析から、
座位間の顕著な阻害なしに少なくとも６個のミニサテラ
イトが共増幅され得ることが示された。さらに、ＰＣＲ
産物は６個全てのミニサテライトプローブ混合物とのサ
ザンブ口ットハイプリダイゼーションによって同時に分
類することも可能である。このような複数座位ＰＣＲ由
来のＤＮＡ“フィンガープリント”の例を第５図に示し
た。全ての場合に、第４図で見られたような疑似産物の
出現を最少に抑えるため、ＰＣＲ反応を１５〜１８サイ
クルに制限した。同一の個体の反復解析から、全てのハ
イブリダイズするＤＮＡ断片は本物のミニサテライト増
幅産物を示しており、パターンに再現性があることが示
された。
ＤＮＡ “フィンガープリント”はｌｏｇのヒトＤＮＡ
から容易に得られる；ときに、一つあるいは二つの座位
は増幅されないこともある（第５Ａ，５０図、固体１．
１２） ；この増幅の失敗は通常３３．４、次にｐ
Ｍ Ｓ ５１に関してみられ、３３．１に関してはほ
とんど見られなかった（データは示さない）。増幅失敗
の可能性は、ミニサテライト反復ユニットのＧＣ含量と
相関があることがわかり（表１）、おそらくヒーティン
グブロックの局所的な温度差あるいはブロックと反応チ
ューブとの温度伝導性が悪いために９５℃でのＧＣに富
むミニサテライトの変性がうまくいかないため、増幅さ
れないと考えられる。
から容易に得られる；ときに、一つあるいは二つの座位
は増幅されないこともある（第５Ａ，５０図、固体１．
１２） ；この増幅の失敗は通常３３．４、次にｐ
Ｍ Ｓ ５１に関してみられ、３３．１に関してはほ
とんど見られなかった（データは示さない）。増幅失敗
の可能性は、ミニサテライト反復ユニットのＧＣ含量と
相関があることがわかり（表１）、おそらくヒーティン
グブロックの局所的な温度差あるいはブロックと反応チ
ューブとの温度伝導性が悪いために９５℃でのＧＣに富
むミニサテライトの変性がうまくいかないため、増幅さ
れないと考えられる。
これらのＰＣＲ ＤＮＡフィンガープ・リントは多様
性の程度が広く異なっている６つの座位に由来する（表
１）。全体の複雑さとこれらのパターンの多様性を決定
するために、関係のない個体を比較した（第５Ｂ図）。
性の程度が広く異なっている６つの座位に由来する（表
１）。全体の複雑さとこれらのパターンの多様性を決定
するために、関係のない個体を比較した（第５Ｂ図）。
平均して個体あたり８．９バンドが解析された（範囲６
〜１１，第６図）。
〜１１，第６図）。
最大可能バンド数は１２で（第５Ａ図）、これは全ての
座位に関してペテロ接合性であり、異なる座位由来のア
リルが電気泳動で同じ泳動度を示さず、どのアリルもＰ
ＣＲでの増幅に大きすぎない場合に対応する。無関係の
個体を一組ずつ比較して、個体組間で一致しないバンド
は平均ｌＯ．８であった（範囲５〜１８）。一致しない
バンドの寄与はほぼポワソン分布であるため、二つの関
連のない個体が同一のＤＮＡフィンガープリントを示す
（一致−１０．８ しないバンドがない）確率はｅ ＝ ２ Ｘ １
０’であると見積ることができる。したがって、６座位
のうち４つは多様性が比較的高くない（表１）という事
実にもかかわらず、これらのパターンはよい個体特異性
を示す。例えば第５Ｃ図に示した３世代家族で、親から
子孫まで正確なバンドの転移も見られるが、ＰＣＲ山来
ＤＮＡフィンガープリントにおける相違はこのように密
接に関連した個体間でも容易に検出可能である。
座位に関してペテロ接合性であり、異なる座位由来のア
リルが電気泳動で同じ泳動度を示さず、どのアリルもＰ
ＣＲでの増幅に大きすぎない場合に対応する。無関係の
個体を一組ずつ比較して、個体組間で一致しないバンド
は平均ｌＯ．８であった（範囲５〜１８）。一致しない
バンドの寄与はほぼポワソン分布であるため、二つの関
連のない個体が同一のＤＮＡフィンガープリントを示す
（一致−１０．８ しないバンドがない）確率はｅ ＝ ２ Ｘ １
０’であると見積ることができる。したがって、６座位
のうち４つは多様性が比較的高くない（表１）という事
実にもかかわらず、これらのパターンはよい個体特異性
を示す。例えば第５Ｃ図に示した３世代家族で、親から
子孫まで正確なバンドの転移も見られるが、ＰＣＲ山来
ＤＮＡフィンガープリントにおける相違はこのように密
接に関連した個体間でも容易に検出可能である。
（ｅ） 単一のヒト細胞中のミニサテライトの分類溶
解させた細胞はＤＮＡを精製する必要なしに直接ＰＣＨ
にかけることができ（２３） 、血液などの検体の解析
を非常に簡略化する。準備段階の実験では、最初に血液
の凍結と融解で赤血球を溶解させ、次に遠心で白血球と
核を集め、ＰＣＨの前に水中で加熱して細胞を溶解させ
ることにより、血液中のミニサテライトを分類すること
が可能であることが示された。この方法を用いて、３〜
３０の有核細胞に相当するｏ．ｏｏｔ〜０．Ｏｌμｇの
血液を再現性よく分類することができた（データは示し
ていない）。この分析を、単一のリンパ球にも拡張し（
第７Ａ図）、５つのミニサテライト座位を同時に共増幅
させ、連続的なハイブリダイゼーションによって分類し
た。ＰＣＨに先立ちプロテナーゼＫとＳＤＳで溶解させ
た細胞からも、水中で加熱して溶解させた細胞からも、
合理的に信頼し得る増幅が成功した。個々の有核頬細胞
もプロテナーゼＫ／Ｓ Ｄ Ｓ溶解に続いて分類するこ
とができたが（第７Ｂ図）、これらの細胞は水中では溶
解されなかった（データは示していない）。
解させた細胞はＤＮＡを精製する必要なしに直接ＰＣＨ
にかけることができ（２３） 、血液などの検体の解析
を非常に簡略化する。準備段階の実験では、最初に血液
の凍結と融解で赤血球を溶解させ、次に遠心で白血球と
核を集め、ＰＣＨの前に水中で加熱して細胞を溶解させ
ることにより、血液中のミニサテライトを分類すること
が可能であることが示された。この方法を用いて、３〜
３０の有核細胞に相当するｏ．ｏｏｔ〜０．Ｏｌμｇの
血液を再現性よく分類することができた（データは示し
ていない）。この分析を、単一のリンパ球にも拡張し（
第７Ａ図）、５つのミニサテライト座位を同時に共増幅
させ、連続的なハイブリダイゼーションによって分類し
た。ＰＣＨに先立ちプロテナーゼＫとＳＤＳで溶解させ
た細胞からも、水中で加熱して溶解させた細胞からも、
合理的に信頼し得る増幅が成功した。個々の有核頬細胞
もプロテナーゼＫ／Ｓ Ｄ Ｓ溶解に続いて分類するこ
とができたが（第７Ｂ図）、これらの細胞は水中では溶
解されなかった（データは示していない）。
個々の細胞を同定する信頼度を試験するために、盲検で
２個体由来の１４の頬細胞を独立に分類した（第７Ｂ図
）。４つの場合に増幅産物がいずれの座位に関しても見
られず、細胞がＰＣＲ反応に移行しなかったか、溶解が
起こらなかったか、あるいはＰＣＲ前に核ＤＮＡが分解
されたがの何れがであることが推測された。残りのｌＯ
の場合には、少なくとも２つのミニサテライト座位から
増幅されたアリルが検出され、いくつかの場合には、単
一の細胞から５つの座位全での増幅が成功した。
２個体由来の１４の頬細胞を独立に分類した（第７Ｂ図
）。４つの場合に増幅産物がいずれの座位に関しても見
られず、細胞がＰＣＲ反応に移行しなかったか、溶解が
起こらなかったか、あるいはＰＣＲ前に核ＤＮＡが分解
されたがの何れがであることが推測された。残りのｌＯ
の場合には、少なくとも２つのミニサテライト座位から
増幅されたアリルが検出され、いくつかの場合には、単
一の細胞から５つの座位全での増幅が成功した。
増幅程度が低く、単一の細胞レベルでは分類が困難なＭ
Ｓ３２の大きなアリルを除けば、少なくともいくつかの
座位が増幅されたこれらの単一細胞ＰＣＲ反応に関して
は、存在するアリルの約７５％がＰＣＲで検出可能であ
ったと見積られる。この見積りは、６ｐｇの，ヒトＤＮ
Ａ試料のＰＣＲ分析から決定された単一分子増幅効率の
結果とも一致する（第４図）。第４図から予測されるよ
うに、頬細胞とリンパ球の何れのＰＣＲ反応でもいくつ
かの場合に疑似バンドが見られた（第７Ａ，７Ｂ図）。
Ｓ３２の大きなアリルを除けば、少なくともいくつかの
座位が増幅されたこれらの単一細胞ＰＣＲ反応に関して
は、存在するアリルの約７５％がＰＣＲで検出可能であ
ったと見積られる。この見積りは、６ｐｇの，ヒトＤＮ
Ａ試料のＰＣＲ分析から決定された単一分子増幅効率の
結果とも一致する（第４図）。第４図から予測されるよ
うに、頬細胞とリンパ球の何れのＰＣＲ反応でもいくつ
かの場合に疑似バンドが見られた（第７Ａ，７Ｂ図）。
それにもかかわらず、１０個のうまく分類できた頬細胞
中に、試験した２個体のそれぞれからのアリルの相違を
検出することができ、核頬細胞の由来はこの盲検によっ
て正しく予測された。
中に、試験した２個体のそれぞれからのアリルの相違を
検出することができ、核頬細胞の由来はこの盲検によっ
て正しく予測された。
最後に、第７Ａ，７Ｂ図のいくつかのＤＮＡを含まない
コントロールの中に３３．６の増幅産物が、および頬細
胞コントロールの一つの中に３３．４の増幅産物が存在
したことを報告する。実際には、ヒト細胞やゲノムＤＮ
Ａではなく組換えＤＮＡやそれ以前のＰＣＲ反応産物で
あろうと思われるこれらの混入は、以前に研究室内環境
にさらされていない溶液、ガラス器具、使い捨てピペッ
トチップ、およびエッペンドルフチューブを用いること
によってのみ避けることができることを我々は見いだし
た。我々の実験で最も頻繁に混入が見られたものは３３
．６に対してであり、これは我々の研究室で最近４年間
にわたって連続的に使われてきた複数座位ＤＮＡフィン
ガープリントプローブ（５．６）であることは注目に値
する。
コントロールの中に３３．６の増幅産物が、および頬細
胞コントロールの一つの中に３３．４の増幅産物が存在
したことを報告する。実際には、ヒト細胞やゲノムＤＮ
Ａではなく組換えＤＮＡやそれ以前のＰＣＲ反応産物で
あろうと思われるこれらの混入は、以前に研究室内環境
にさらされていない溶液、ガラス器具、使い捨てピペッ
トチップ、およびエッペンドルフチューブを用いること
によってのみ避けることができることを我々は見いだし
た。我々の実験で最も頻繁に混入が見られたものは３３
．６に対してであり、これは我々の研究室で最近４年間
にわたって連続的に使われてきた複数座位ＤＮＡフィン
ガープリントプローブ（５．６）であることは注目に値
する。
（ｆ）結 論
Ｔａｑポリメラーゼは非反復ＤＮＡの増幅に顕著な信頼
性を示す（２１）だけではなく、反復ユニット数のアリ
ル特異性も保持したまま完全なミニサテライトを正確に
増幅することも可能である。しかし、通常のＰＣＲ反応
とは異なり、ミニサテライトＰＣＲは通常、産物の収量
が高くなりすぎて（１０μｇのＰＣＲ反応あたり＞ ４
ｎｇ）プライマー伸長中、特に長いミニサテライトア
リルの効率よい増幅を得るために長い伸長時間が必要と
される場合に相補的なタンデム反復鋳型鎖間の予定外の
アニーリングが起こる前に終了させなければならない。
性を示す（２１）だけではなく、反復ユニット数のアリ
ル特異性も保持したまま完全なミニサテライトを正確に
増幅することも可能である。しかし、通常のＰＣＲ反応
とは異なり、ミニサテライトＰＣＲは通常、産物の収量
が高くなりすぎて（１０μｇのＰＣＲ反応あたり＞ ４
ｎｇ）プライマー伸長中、特に長いミニサテライトア
リルの効率よい増幅を得るために長い伸長時間が必要と
される場合に相補的なタンデム反復鋳型鎖間の予定外の
アニーリングが起こる前に終了させなければならない。
また、ＰＣＲ反応はハイブリダイゼーションによって検
出可能な程度の産物を生成するのに十分進まなければな
らない。ミニサテライトブローブは感度が高＜ 、０．
ｌｐｇのミニサテライトＰＣＲ産物も容易に検出するこ
とができる（ｌＯ）。分類に適した産物量（０．１〜４
０００ｐｇ産物）を生成するＰＣＲサイクルの“枠゜は
したがって非常に広く、うまく分類を行なうために必要
なＰＣＲサイクル数の予測には、最初のヒトゲノムＤＮ
Ａ量の非常におおまかな見積りしか必要とされない。指
標として、１００ｎｇのゲノムＤＮＡにはｌＯ〜ｌ５サ
イクルが適当であり、ｌｏｇにはｌ８サイクル、単一細
胞ＰＣＲ（６ｐｇ）には２５サイクルが適当である。効
率よく増幅されにくい長いアリルを検出するためには、
ＰＣＲサイクル数を増加させる必要がある。
出可能な程度の産物を生成するのに十分進まなければな
らない。ミニサテライトブローブは感度が高＜ 、０．
ｌｐｇのミニサテライトＰＣＲ産物も容易に検出するこ
とができる（ｌＯ）。分類に適した産物量（０．１〜４
０００ｐｇ産物）を生成するＰＣＲサイクルの“枠゜は
したがって非常に広く、うまく分類を行なうために必要
なＰＣＲサイクル数の予測には、最初のヒトゲノムＤＮ
Ａ量の非常におおまかな見積りしか必要とされない。指
標として、１００ｎｇのゲノムＤＮＡにはｌＯ〜ｌ５サ
イクルが適当であり、ｌｏｇにはｌ８サイクル、単一細
胞ＰＣＲ（６ｐｇ）には２５サイクルが適当である。効
率よく増幅されにくい長いアリルを検出するためには、
ＰＣＲサイクル数を増加させる必要がある。
ミニサテライト増幅はしばしばＰＣＲ産物増幅の対数期
に制限する必要があるため（２１） 、ハイブリダイゼ
ーションシグナルは０．１ｎｇヒトゲノムＤＮＡまでは
加えたＤＮＡｆｆｉにほぼ比例する（データは示さない
）。この水準以下になると、標的ミニサテライト分子数
の確率論的な多様性によって比例関係が曖昧になる。し
たがって、ミニサテライトＰＣＲは低濃度のヒトＤＮＡ
の見積りに定量的に用いることができる。また、プライ
マーとＴａｑポリメラーゼ量はこのＰＣＲ初期過程には
制限を与えるものではなく、理論的には増幅される異な
る座位間の阻害はほとんどあるいは全く存在しないはず
である。実際には、少なくとも６個の異なるミニサテラ
イトが同時に共増幅され、この数がさらに増やせないと
いう理論的理由はないと思われる。
に制限する必要があるため（２１） 、ハイブリダイゼ
ーションシグナルは０．１ｎｇヒトゲノムＤＮＡまでは
加えたＤＮＡｆｆｉにほぼ比例する（データは示さない
）。この水準以下になると、標的ミニサテライト分子数
の確率論的な多様性によって比例関係が曖昧になる。し
たがって、ミニサテライトＰＣＲは低濃度のヒトＤＮＡ
の見積りに定量的に用いることができる。また、プライ
マーとＴａｑポリメラーゼ量はこのＰＣＲ初期過程には
制限を与えるものではなく、理論的には増幅される異な
る座位間の阻害はほとんどあるいは全く存在しないはず
である。実際には、少なくとも６個の異なるミニサテラ
イトが同時に共増幅され、この数がさらに増やせないと
いう理論的理由はないと思われる。
ミニサテライトの共増幅とそれにつづくミニサテライト
ブローブでの同時あるいは連続的ハイブリダイゼーショ
ンによって、非常に少量のＤＮＡ試料から個体の同定や
血縁関係に関する非常に多くの情報を集めることが可能
になる。これらのＰＣＲ由来ＤＮＡフィンガープリント
はｌｏｇのヒトＤＮＡまで信頼性がみられる。それより
はるかに少量のＤＮＡおよび単一の細胞からも情報が得
られるが、その場合、単一細胞の分類に必要とされる比
較的多いＰＣＲサイクル数を行なう間に、いくつかの座
位に疑似ＤＮＡ断片が生じ、１〜数細胞のレベルでの個
体の同定の場合に重要な問題となる。幸運なことに、こ
れらの疑似ＰＣＲ産物は反応ごとに変化することが示さ
れ、したがって非常に少量のＤＮＡ試料のＰＣＲ分析を
二重に行なうことにより、疑似ＰＣＲ産物を本物の増幅
産物と区別できるはずである。
ブローブでの同時あるいは連続的ハイブリダイゼーショ
ンによって、非常に少量のＤＮＡ試料から個体の同定や
血縁関係に関する非常に多くの情報を集めることが可能
になる。これらのＰＣＲ由来ＤＮＡフィンガープリント
はｌｏｇのヒトＤＮＡまで信頼性がみられる。それより
はるかに少量のＤＮＡおよび単一の細胞からも情報が得
られるが、その場合、単一細胞の分類に必要とされる比
較的多いＰＣＲサイクル数を行なう間に、いくつかの座
位に疑似ＤＮＡ断片が生じ、１〜数細胞のレベルでの個
体の同定の場合に重要な問題となる。幸運なことに、こ
れらの疑似ＰＣＲ産物は反応ごとに変化することが示さ
れ、したがって非常に少量のＤＮＡ試料のＰＣＲ分析を
二重に行なうことにより、疑似ＰＣＲ産物を本物の増幅
産物と区別できるはずである。
すでに、ＰＣＲ由来ＤＮＡフィンガープリントは、約２
Ｘ １０−５の確率で２個体の誤った相関を示し、高
水準の個体特異性を示す。それに対して、複数座位ポリ
コアブローブ（６）を用いた、あるいは座位特異的ヒト
ミニサテライトブローブの混合物（ｌＯ）を用いたサザ
ンブ口ットハイプリダイゼーションで得られる通常のＤ
ＮＡフィンガープリントははるかに高水準の個体特異性
を示す（それぞれ＜１０ ， ＜１０’） Ｏ
ＬカＬ、ＰＣＲ由ｆｆｉＤＮＡフィンガープリントの多
様性は実質的に改善し得る。第一に、特にｐλｇ３とλ
ＭＳ３２の高度な含情報座位は約８ｋｂ（ｌｏｇヒトＤ
ＮＡ）あるいは約５ｋｂ（単一細胞）以上は検出されな
かった。
Ｘ １０−５の確率で２個体の誤った相関を示し、高
水準の個体特異性を示す。それに対して、複数座位ポリ
コアブローブ（６）を用いた、あるいは座位特異的ヒト
ミニサテライトブローブの混合物（ｌＯ）を用いたサザ
ンブ口ットハイプリダイゼーションで得られる通常のＤ
ＮＡフィンガープリントははるかに高水準の個体特異性
を示す（それぞれ＜１０ ， ＜１０’） Ｏ
ＬカＬ、ＰＣＲ由ｆｆｉＤＮＡフィンガープリントの多
様性は実質的に改善し得る。第一に、特にｐλｇ３とλ
ＭＳ３２の高度な含情報座位は約８ｋｂ（ｌｏｇヒトＤ
ＮＡ）あるいは約５ｋｂ（単一細胞）以上は検出されな
かった。
この問題は、より限定された範囲のアリル長の高度に多
様性のあるミニサテライトを用いることにより克服でき
る。高水準の多様性は通常ミニサテライトの反復ユニッ
ト数が多いことと長いアリルを伴っているので、このよ
うな座位は稀だと思われる（５， ８． １０）。しか
しながら、いくつかの適切である可能性のある座位が同
定された（９． Ｊ． Ａ． Ｌ．アー？−（Ａｒｍｏ
ｕｒ）とＡ． Ｊ．ジエフェリーズ（Ｊｅｆｆｒｅｙｓ
） ，未発表データ）。第二に、同時に増幅されるミニ
サテライト数を増加させることが可能である。第三に、
ｐλｇ３やλＭ Ｓ ３２のような疑似ＰＣＲ産物を特
に生成する傾向のある座位を同定し、避けることができ
る。不注意な混入が回避され、超可変座位での体細胞変
異の潜在的存在を考慮に入れるならば（３０） 、上記
の目標が達成されれば単一の細胞レベルでの信頼性のあ
る同定が不可能であるという理由はなくなる。
様性のあるミニサテライトを用いることにより克服でき
る。高水準の多様性は通常ミニサテライトの反復ユニッ
ト数が多いことと長いアリルを伴っているので、このよ
うな座位は稀だと思われる（５， ８． １０）。しか
しながら、いくつかの適切である可能性のある座位が同
定された（９． Ｊ． Ａ． Ｌ．アー？−（Ａｒｍｏ
ｕｒ）とＡ． Ｊ．ジエフェリーズ（Ｊｅｆｆｒｅｙｓ
） ，未発表データ）。第二に、同時に増幅されるミニ
サテライト数を増加させることが可能である。第三に、
ｐλｇ３やλＭ Ｓ ３２のような疑似ＰＣＲ産物を特
に生成する傾向のある座位を同定し、避けることができ
る。不注意な混入が回避され、超可変座位での体細胞変
異の潜在的存在を考慮に入れるならば（３０） 、上記
の目標が達成されれば単一の細胞レベルでの信頼性のあ
る同定が不可能であるという理由はなくなる。
例えば法医学での個体の同定、父権審査、および骨髄移
植の追跡などでの複数座位ＤＮＡフィンガープリントブ
ローブの使用は、分類のためには少なくとも０．１〜１
μｇのヒトＤＮＡを必要とするこれらのプローブの感度
によって制限される（６）。
植の追跡などでの複数座位ＤＮＡフィンガープリントブ
ローブの使用は、分類のためには少なくとも０．１〜１
μｇのヒトＤＮＡを必要とするこれらのプローブの感度
によって制限される（６）。
同様に、座位特異的ミニサテライトブローブは、最少約
５０ｎｇまでのヒトＤＮＡのみを分類することができる
（１０）。ＰＣＲ山来ＤＮＡフィンガープリントは感度
を桁の差で改善し、通常のサザンブ口ットハイプリダイ
ゼーションでは比較的扱い゛にくかった検体を分類する
のに用いることができる。
５０ｎｇまでのヒトＤＮＡのみを分類することができる
（１０）。ＰＣＲ山来ＤＮＡフィンガープリントは感度
を桁の差で改善し、通常のサザンブ口ットハイプリダイ
ゼーションでは比較的扱い゛にくかった検体を分類する
のに用いることができる。
例えば、ヒトの毛根は一般に１０〜５００ｎｇのＤＮＡ
を含んでおり（２２） 、約７０％の毛根が座位特異的
ミニサテライトプローブを用いて分類される（Ｚ．ウォ
ン（Ｗｏｎｇ） ． Ｊ． Ａ． Ｌ．アー？ − （
Ａｒｍｏｕｒ） ．およびＡ． Ｊ．ジエフェリーズ（
Ｊｅｆｆｒｅｙｓ） ．未発表データ）のに対して、試
験した全ての毛根がＰＣＲ由来ＤＮＡフィンガープリン
トで分類された（データは示していない）。同様に、０
．００１〜０．０１μｇの血液は最初にＤＮＡを精製す
る必要なしに分類することができる。また同様に、唾液
は一般に１μｇあたり１００〜１０００の有核頬細胞を
含んでおり、したがってマイクロリットル以下の唾液試
料のＰＣＲ由来ＤＮＡフィンガープリントが可能である
。′部分的に分解された試料を含む、法医学上の微量の
髪、血液、精液、唾液および尿試料を分類するための可
能性は明白である。例えば微量・の唾などの、検体の不
注意な混入の可能性も同様に明らかである。
を含んでおり（２２） 、約７０％の毛根が座位特異的
ミニサテライトプローブを用いて分類される（Ｚ．ウォ
ン（Ｗｏｎｇ） ． Ｊ． Ａ． Ｌ．アー？ − （
Ａｒｍｏｕｒ） ．およびＡ． Ｊ．ジエフェリーズ（
Ｊｅｆｆｒｅｙｓ） ．未発表データ）のに対して、試
験した全ての毛根がＰＣＲ由来ＤＮＡフィンガープリン
トで分類された（データは示していない）。同様に、０
．００１〜０．０１μｇの血液は最初にＤＮＡを精製す
る必要なしに分類することができる。また同様に、唾液
は一般に１μｇあたり１００〜１０００の有核頬細胞を
含んでおり、したがってマイクロリットル以下の唾液試
料のＰＣＲ由来ＤＮＡフィンガープリントが可能である
。′部分的に分解された試料を含む、法医学上の微量の
髪、血液、精液、唾液および尿試料を分類するための可
能性は明白である。例えば微量・の唾などの、検体の不
注意な混入の可能性も同様に明らかである。
最終的には、ＰＣＲ山来ＤＮＡフィンガープリントは、
父権争議などにおける血縁を示すための高度に分極する
試験を供給するのに十分に個体特異的となるべきである
。ＤＮＡを単離する必要性を除くだけでなく、静脈穿刺
でなく指を刺すことによって得られる血液のようなはる
かに少量の試料を用いることができる。あるいは、血縁
の決定は唾液の分析をもとにしても行なうことができる
。これにより、信仰上などの理由から血液試料を与える
ことを拒否する個体の問題を回避することができ、また
、幼児から血液をとる場合の精神的外傷を取り除くこと
ができる。
父権争議などにおける血縁を示すための高度に分極する
試験を供給するのに十分に個体特異的となるべきである
。ＤＮＡを単離する必要性を除くだけでなく、静脈穿刺
でなく指を刺すことによって得られる血液のようなはる
かに少量の試料を用いることができる。あるいは、血縁
の決定は唾液の分析をもとにしても行なうことができる
。これにより、信仰上などの理由から血液試料を与える
ことを拒否する個体の問題を回避することができ、また
、幼児から血液をとる場合の精神的外傷を取り除くこと
ができる。
実施例 ２
材料と方法
ＰＣＨによるミニサテライトアリルの増幅オリゴヌクレ
オチドプライマーは既に記述されているように調製した
（ジエフェリーズ（ Ｊｅｆｆｒｅｙｓ）ほか， Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ． １８．１０９５３
−１０９７１）。λＭ Ｓ ３２ミニサテライトアリル
を、く４μｇＨ２０中の０．４μｇヒトゲノムＤＮＡを
５０μｌ２の４５ａＭ Ｔｒｉｓ − Ｈ ＣΩ（ｐ
ｌＩ８．８） ， １１ａ＋Ｍ（ＮＨ ） Ｓ０
， ４．５ｍＭ ＭｇＣＮ２． ４．５μＭ
ＥＤＴＡ．７ｄ ２−メルカプトエタノーノレ、 １
ｍＭ ｄＡＴＰ， １ 瓢Ｍ ｄＣＴＰ，
１ｍＭｄＧＴＰ，１ａ＋Ｍ ｄＴＴＰ （ファ
ルマシア社），１１０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（
ＤＮａｓ＋ｅフリーファルマシア社），１μＭオリゴヌ
クレオチドプライマーＡおよび１μＭオリゴヌクレオチ
ドＢと混合することによって増幅した。７．５ユニット
のＴａｑポリメラーゼ（カムバイオ タイプ■、あるい
はベルキンエルマーＡｍｐｌｉ Ｔａｑ）を添加し、反
応溶液を４０μｇのパラフィンオイルで重層し、９５℃
で１．５分、６７℃で１６５分、７０℃で９．９分のサ
イクルをテクネ・プログラマブル（Ｔｅｅｈｎｅ Ｐｒ
ｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）Ｄｒ１−Ｂｌｏｃｋ ＰＨＣ−
１上で３０回行ない、最後のチェイスを６７℃で１．５
分間、７０℃で９．９分間行なった。
オチドプライマーは既に記述されているように調製した
（ジエフェリーズ（ Ｊｅｆｆｒｅｙｓ）ほか， Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ． １８．１０９５３
−１０９７１）。λＭ Ｓ ３２ミニサテライトアリル
を、く４μｇＨ２０中の０．４μｇヒトゲノムＤＮＡを
５０μｌ２の４５ａＭ Ｔｒｉｓ − Ｈ ＣΩ（ｐ
ｌＩ８．８） ， １１ａ＋Ｍ（ＮＨ ） Ｓ０
， ４．５ｍＭ ＭｇＣＮ２． ４．５μＭ
ＥＤＴＡ．７ｄ ２−メルカプトエタノーノレ、 １
ｍＭ ｄＡＴＰ， １ 瓢Ｍ ｄＣＴＰ，
１ｍＭｄＧＴＰ，１ａ＋Ｍ ｄＴＴＰ （ファ
ルマシア社），１１０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（
ＤＮａｓ＋ｅフリーファルマシア社），１μＭオリゴヌ
クレオチドプライマーＡおよび１μＭオリゴヌクレオチ
ドＢと混合することによって増幅した。７．５ユニット
のＴａｑポリメラーゼ（カムバイオ タイプ■、あるい
はベルキンエルマーＡｍｐｌｉ Ｔａｑ）を添加し、反
応溶液を４０μｇのパラフィンオイルで重層し、９５℃
で１．５分、６７℃で１６５分、７０℃で９．９分のサ
イクルをテクネ・プログラマブル（Ｔｅｅｈｎｅ Ｐｒ
ｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）Ｄｒ１−Ｂｌｏｃｋ ＰＨＣ−
１上で３０回行ない、最後のチェイスを６７℃で１．５
分間、７０℃で９．９分間行なった。
ベルキンエルマーφシータスＤＮＡサーマルサイクラ−
（Ｐｅｒｋｉｎ ＥＩａ＋ｅｒ Ｃｅｔｕｓ ＤＮＡ
Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）上で、９５℃で１分、
６７℃で１分、７０℃で１０分のサイクルで行なっても
同様の結果が得られた。
（Ｐｅｒｋｉｎ ＥＩａ＋ｅｒ Ｃｅｔｕｓ ＤＮＡ
Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）上で、９５℃で１分、
６７℃で１分、７０℃で１０分のサイクルで行なっても
同様の結果が得られた。
増幅されたアリルの単離
５０μｇのＰＣＲ反応液を、５μ９の泳動混合液（１２
．５％ フイコール４００， ０．２％ プロモフェノ
ールブルー， ０．２Ｍ 酢酸トリス（ｐｌｌ８．
３），０．１Ｍ 酢酸ナトリウム，１ｍＭ ＥＤＴＡ
）と混合し、１％アガロースゲル（シグマ タイプＩ）
上でエチジウムブロマイド存在下で電気泳動を行なった
。増幅産物は長波長ｕ ／ ｖ灯（あるいは必要であれ
ば短波長ｕ ／ ｖ トランスイルミネーター）を用い
て可視化し、アリルを含むゲル断片を切り出した。ＤＮ
Ａを透析膜上で電気泳動によって回収し、エタノール沈
澱を行ない１０μｇのＨ２ｏに溶解した。
．５％ フイコール４００， ０．２％ プロモフェノ
ールブルー， ０．２Ｍ 酢酸トリス（ｐｌｌ８．
３），０．１Ｍ 酢酸ナトリウム，１ｍＭ ＥＤＴＡ
）と混合し、１％アガロースゲル（シグマ タイプＩ）
上でエチジウムブロマイド存在下で電気泳動を行なった
。増幅産物は長波長ｕ ／ ｖ灯（あるいは必要であれ
ば短波長ｕ ／ ｖ トランスイルミネーター）を用い
て可視化し、アリルを含むゲル断片を切り出した。ＤＮ
Ａを透析膜上で電気泳動によって回収し、エタノール沈
澱を行ない１０μｇのＨ２ｏに溶解した。
増 幅
ミニサテライトに隣接するＤＮＡに対応するオリゴヌク
レオチドプライマーを用いてどのようにミニサテライト
アリルが増幅されて完全なタンデム反復配列の増幅にい
たるかをこれまで記述してきた。ＰＣＲサイクル数を制
限し、ミニサテライトブローブでサザンブ口ットハイプ
リダイゼーションによって増幅されたアリルを検出する
ことにより、信頼し得る増幅が可能であるが、高いサイ
クル数では産物が一本鎖タンデム反復ミニサテライトＤ
ＮＡ断片間のア二二リングによる拡散した増幅産物のス
メアとなってしまうことを示した。
レオチドプライマーを用いてどのようにミニサテライト
アリルが増幅されて完全なタンデム反復配列の増幅にい
たるかをこれまで記述してきた。ＰＣＲサイクル数を制
限し、ミニサテライトブローブでサザンブ口ットハイプ
リダイゼーションによって増幅されたアリルを検出する
ことにより、信頼し得る増幅が可能であるが、高いサイ
クル数では産物が一本鎖タンデム反復ミニサテライトＤ
ＮＡ断片間のア二二リングによる拡散した増幅産物のス
メアとなってしまうことを示した。
また、高サイクル数で、エチジウムブロマイドで染色し
たアガロースゲルで検出可能なＰＣＲ産物のほとんどは
ミニサテライトのＰＣＲ産物には対応せず、他のゲノム
部位での誤ブライミングによって生じたものであった（
Ａ． Ｊ．ジエフェリーズ（Ｊａｆｆｒｅｙｓ）とＶ．
ウィルソン（Ｗ１１ｓｏｎ） 、未公表データ）。
たアガロースゲルで検出可能なＰＣＲ産物のほとんどは
ミニサテライトのＰＣＲ産物には対応せず、他のゲノム
部位での誤ブライミングによって生じたものであった（
Ａ． Ｊ．ジエフェリーズ（Ｊａｆｆｒｅｙｓ）とＶ．
ウィルソン（Ｗ１１ｓｏｎ） 、未公表データ）。
ＰＣＲ緩衝液のイオン強度を減少させ、ＰＣＲアニーリ
ング温度を上げることによって誤ブライミングを減じさ
せ、Ｔａｑポリメラーゼの由来を変えることにより、Ｐ
ＣＲで増幅された本物のアリルがエチジウムで染色した
ゲル上で直接可視化できるまでにミニサテライトに増幅
可能なことが示された（第９図）。ヘテロに拡散したミ
ニサテライト産物がアニーリングによって形成されるよ
うな産物量を生成するのに必要なほどの高いＰＣＲサイ
クル数の結果、分解して別々の低分子量ＤＮＡ断片とな
るバックグラウンドのスメアが生じる。それにもかかわ
らず、本物のアリルは明確に同定可能であり、ヒトゲノ
ムＤＮＡの通常のサザンブ口ットハイプリダイゼーショ
ンによって検出されたミニサテライトアリルの大きさと
対応する。
ング温度を上げることによって誤ブライミングを減じさ
せ、Ｔａｑポリメラーゼの由来を変えることにより、Ｐ
ＣＲで増幅された本物のアリルがエチジウムで染色した
ゲル上で直接可視化できるまでにミニサテライトに増幅
可能なことが示された（第９図）。ヘテロに拡散したミ
ニサテライト産物がアニーリングによって形成されるよ
うな産物量を生成するのに必要なほどの高いＰＣＲサイ
クル数の結果、分解して別々の低分子量ＤＮＡ断片とな
るバックグラウンドのスメアが生じる。それにもかかわ
らず、本物のアリルは明確に同定可能であり、ヒトゲノ
ムＤＮＡの通常のサザンブ口ットハイプリダイゼーショ
ンによって検出されたミニサテライトアリルの大きさと
対応する。
以前に示されたように（ジエフェリーズ他，１９８８）
、ミニサテライトアリルの収全はアリルが長くなるに
つれて減少し、エチジウムで染色したゲル上で同定可能
な程度まで６ｋｂより長いミニサテライトが増幅可能か
どうかはまだ示されていない。０．４μｇのヒトゲノム
ＤＮＡを含み、３０サイクル行なわれる５０μｇのＰＣ
Ｒ反応液の場合には、１μｇまでの小さな（ １ ｋｂ
）アリルが産生される；この収量は６ｋｂのアリルの場
合には＝１ｎｇまで低下する。アリルの長さが広く異な
るペテロ接合体の場合には、より小さなアリルの過剰増
幅は、大きなアリルの未成熟産物と、エチジウムで染色
したゲルからの消滅が常に起こる。
、ミニサテライトアリルの収全はアリルが長くなるに
つれて減少し、エチジウムで染色したゲル上で同定可能
な程度まで６ｋｂより長いミニサテライトが増幅可能か
どうかはまだ示されていない。０．４μｇのヒトゲノム
ＤＮＡを含み、３０サイクル行なわれる５０μｇのＰＣ
Ｒ反応液の場合には、１μｇまでの小さな（ １ ｋｂ
）アリルが産生される；この収量は６ｋｂのアリルの場
合には＝１ｎｇまで低下する。アリルの長さが広く異な
るペテロ接合体の場合には、より小さなアリルの過剰増
幅は、大きなアリルの未成熟産物と、エチジウムで染色
したゲルからの消滅が常に起こる。
ミニサテライト中のミニサテライト可変性反復配列（Ｍ
ＶＲ）マップするために、調製用ゲル電気泳動によって
増幅したアリルを回収し、増幅されたアリルの末端の一
方に近い場所で切断する制限エンドヌクレアーゼで切断
し、切断した末端をフィルーイン標識によって末端を標
識した。適当な制限酵素で末端を標識した断片を部分消
化し、アガロースゲルに流し、オートラジオグラフィー
によって内在するＭＶＲの位置をマッピングする。
ＶＲ）マップするために、調製用ゲル電気泳動によって
増幅したアリルを回収し、増幅されたアリルの末端の一
方に近い場所で切断する制限エンドヌクレアーゼで切断
し、切断した末端をフィルーイン標識によって末端を標
識した。適当な制限酵素で末端を標識した断片を部分消
化し、アガロースゲルに流し、オートラジオグラフィー
によって内在するＭＶＲの位置をマッピングする。
末端の切断は増幅される領域中の隣接ＤＮＡ中にある適
当な制限部位を用いて行ない得るが、あるいは、プライ
マーの一つが適当な制限部位を含む場合がある。λＭ
Ｓ ３２の５′ブライマ− ５′−ＴＣＡＣＣＧＧＴＧ
ＡＡＴＴＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＴ−３′は、プライマー
の中の９〜１４ｎｔに、ゲノムＤＮＡのＥｅｏＲＩ部位
に対応するＥｃｏＲＩ部位ヲ含む。λＭＳ３２の３′領
域の場合のように、ミニサテライトに隣接するＤＮＡ中
に適当な部位がない場合には、５′を伸長させたオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いて末端部位を生成させる
ことができる。このように、λＭＳ３２を増幅するのに
用いられる第二のプライマーは５’−ＣＴＧＡＴＣＡＴ
ＣＧＡＴＣＧＡＣＴＣＧＣＡＧＡＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧ
ＧＣＣ−３’に修飾され、ここで下線部はゲノムＤＮＡ
配列に対応する；５′の伸長領域はλＭ Ｓ ３２の近
傍を切断しないＣＩａＩ（ＡＴＣＧＡＴ）部位を含む。
当な制限部位を用いて行ない得るが、あるいは、プライ
マーの一つが適当な制限部位を含む場合がある。λＭ
Ｓ ３２の５′ブライマ− ５′−ＴＣＡＣＣＧＧＴＧ
ＡＡＴＴＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＴ−３′は、プライマー
の中の９〜１４ｎｔに、ゲノムＤＮＡのＥｅｏＲＩ部位
に対応するＥｃｏＲＩ部位ヲ含む。λＭＳ３２の３′領
域の場合のように、ミニサテライトに隣接するＤＮＡ中
に適当な部位がない場合には、５′を伸長させたオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いて末端部位を生成させる
ことができる。このように、λＭＳ３２を増幅するのに
用いられる第二のプライマーは５’−ＣＴＧＡＴＣＡＴ
ＣＧＡＴＣＧＡＣＴＣＧＣＡＧＡＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧ
ＧＣＣ−３’に修飾され、ここで下線部はゲノムＤＮＡ
配列に対応する；５′の伸長領域はλＭ Ｓ ３２の近
傍を切断しないＣＩａＩ（ＡＴＣＧＡＴ）部位を含む。
５′伸長部位の存在は、このプライマーがλＭ Ｓ ３
２を増幅する能力には影響を与えない（データは示さな
い）。これらの二つのプライマーで増幅されたアリルは
ＥｃｏＲＩあるいはＣＩａＩでの切断の後にいずれ下の
末端で標識することができ、タンデム反復配列のどちら
の末端からもＭＶＲのマッピングを行なうことを可能に
する。
２を増幅する能力には影響を与えない（データは示さな
い）。これらの二つのプライマーで増幅されたアリルは
ＥｃｏＲＩあるいはＣＩａＩでの切断の後にいずれ下の
末端で標識することができ、タンデム反復配列のどちら
の末端からもＭＶＲのマッピングを行なうことを可能に
する。
増幅されたＭ Ｓ ３２アリル中のＭＶＲのマッピング
モルモン教徒、フランス人、アーミッシュ、およびベネ
ズエラ人由来の家族のＣＥＰＨパネルのスクリーニング
から、λＭ Ｓ ３２のＡｌｕＩアリルが１．２ｋｂか
ら２０ｋｂにわたっていることが明らかになった，Ａｌ
ｕＩアリルは、上記のプライマーで対応するＰＣＲ産物
よりも−０．２ｋｂだけしが長くないため、６．２ｋｂ
より艮いＡｌｕＩアリルは増幅効率が低いため、内部に
容易にマッピングすることはできない。
ズエラ人由来の家族のＣＥＰＨパネルのスクリーニング
から、λＭ Ｓ ３２のＡｌｕＩアリルが１．２ｋｂか
ら２０ｋｂにわたっていることが明らかになった，Ａｌ
ｕＩアリルは、上記のプライマーで対応するＰＣＲ産物
よりも−０．２ｋｂだけしが長くないため、６．２ｋｂ
より艮いＡｌｕＩアリルは増幅効率が低いため、内部に
容易にマッピングすることはできない。
ＣＥＰＨパネル中で最も短いアリルに関するＥｃｏＲＩ
とＣｌａＩに対しての内部マッピングの結果を第１０図
に示す。いずれも連続的なＨｉｎｆ Ｉのラダーと不連
続的なＨ ａｅＩ［［のラダーを産生じ、後者はＥｃｏ
ＲＩとＣＩａＩに対して相補的である。
とＣｌａＩに対しての内部マッピングの結果を第１０図
に示す。いずれも連続的なＨｉｎｆ Ｉのラダーと不連
続的なＨ ａｅＩ［［のラダーを産生じ、後者はＥｃｏ
ＲＩとＣＩａＩに対して相補的である。
Ｈ ａｅＩ［Ｉによって切断可能な全てのＭＶＲの位置
の完全なマップが推定ざれた。独立の場合に増幅された
このアリルの解析を繰り返した結果、同一のマップが形
成され（データは示さない）、増幅とマッピングの信頼
性が示唆された。
の完全なマップが推定ざれた。独立の場合に増幅された
このアリルの解析を繰り返した結果、同一のマップが形
成され（データは示さない）、増幅とマッピングの信頼
性が示唆された。
実施例 ３
単一分子ＭＶＲマッピング
我々は、単一のミニサテライト分子を、正確でない長さ
の疑似ＰＣＲ産物が生じることがときたまあるが、理性
的な効率と信頼度で増幅しうろことを示した（ジエフェ
リーズほか， １９８８）。
の疑似ＰＣＲ産物が生じることがときたまあるが、理性
的な効率と信頼度で増幅しうろことを示した（ジエフェ
リーズほか， １９８８）。
ここに述べる改良したＰＣＲ条件を用いることにより、
長いアリル由来の疑似ＰＣＲ産物さえもその出現がほと
んど完全に抑制された（第１２Ａ図）。
長いアリル由来の疑似ＰＣＲ産物さえもその出現がほと
んど完全に抑制された（第１２Ａ図）。
単一分子ＭＶＲマッピングの信頼度を決定するために、
アリルｑおよび４に関してペテロ接合性のＣＥＰＨ個体
１０２０８から６ｐｇのＤＮＡの１６のアリコート（第
１２Ａ図）を、持込みの混入の危険が最少となるように
単一分子解析のために別に保存しておいた外来のプライ
マーＡおよびＢで２５サイクル増幅した（第１１Ａ図）
。Ｍ Ｓ ３２ ミニサテライトプローブとのサザンブ
口ットハイプリダイゼーションにより、５試料中にアリ
ル１の長さに対応するアリルが、６試料中にアリル４の
長さに対応するアリルが増幅されていることが認められ
た。
アリルｑおよび４に関してペテロ接合性のＣＥＰＨ個体
１０２０８から６ｐｇのＤＮＡの１６のアリコート（第
１２Ａ図）を、持込みの混入の危険が最少となるように
単一分子解析のために別に保存しておいた外来のプライ
マーＡおよびＢで２５サイクル増幅した（第１１Ａ図）
。Ｍ Ｓ ３２ ミニサテライトプローブとのサザンブ
口ットハイプリダイゼーションにより、５試料中にアリ
ル１の長さに対応するアリルが、６試料中にアリル４の
長さに対応するアリルが増幅されていることが認められ
た。
それ以外の増幅産物は検出されず、ＤＮＡを含まないコ
ントロールもネガティブだった（データは示さない）。
ントロールもネガティブだった（データは示さない）。
これらのデータから、単一ミニサテライト分子の４２％
はＰＣＲ産物を生じ、それと同様の効率が以前に報告さ
れており（ジエフェリーズほか， １９８８） 、より
大きなアリルの増幅効率も同様であった（第１２Ａ図説
明）。単一分子ＰＣＲ反応の連続的な混入を最少にする
ため、およびゲノム中の他の場所にプライマーＡおよび
／またはＢの誤プライミングからつくる疑似産物を除く
ために、単一分子から増幅された１１のアリルを雷なり
あったプライマ−０１とＤで再増幅し、内部マッピング
を行なった。得られた全てのマップはゲノムＤＮＡ全体
からの増幅によって得られるアリル１および４のマップ
と区別できなかった（データは示さない）。
はＰＣＲ産物を生じ、それと同様の効率が以前に報告さ
れており（ジエフェリーズほか， １９８８） 、より
大きなアリルの増幅効率も同様であった（第１２Ａ図説
明）。単一分子ＰＣＲ反応の連続的な混入を最少にする
ため、およびゲノム中の他の場所にプライマーＡおよび
／またはＢの誤プライミングからつくる疑似産物を除く
ために、単一分子から増幅された１１のアリルを雷なり
あったプライマ−０１とＤで再増幅し、内部マッピング
を行なった。得られた全てのマップはゲノムＤＮＡ全体
からの増幅によって得られるアリル１および４のマップ
と区別できなかった（データは示さない）。
Ｍ Ｓ ３２の単一分子を正確に増幅できることから、
ヒトゲノムＤＮＡ全体の中に存在するこの座位の最初か
らの変異を増幅し、解析することが可能となった。同一
の長さを持つが内部構造が異なるア・リル（アリル３ｌ
および３２，第１２図）に関してヘテロ接合性である個
体を選択した。この個体からの３０９ｇ精子ＤＮＡの重
複アリコートのＰＣＲ解析により、単一ミニサテライト
分子の増幅が効率よく行なわれることが示され、どの反
応においてもさらに異常な長さのアリルが生じた証拠は
示されなかった（第１３Ａ図）。
ヒトゲノムＤＮＡ全体の中に存在するこの座位の最初か
らの変異を増幅し、解析することが可能となった。同一
の長さを持つが内部構造が異なるア・リル（アリル３ｌ
および３２，第１２図）に関してヘテロ接合性である個
体を選択した。この個体からの３０９ｇ精子ＤＮＡの重
複アリコートのＰＣＲ解析により、単一ミニサテライト
分子の増幅が効率よく行なわれることが示され、どの反
応においてもさらに異常な長さのアリルが生じた証拠は
示されなかった（第１３Ａ図）。
この個体由来の精子ＤＮＡをＳａｕ３Ａとそのイソシゾ
マ−ＭｂｏＩで消化して、プライマーＡとＢの末端で切
断し（第１１Ａ図）、アガロースゲル電気泳動でサイズ
分画を行なった。元のアリル３１と３２よりも短１，”
Ｎ Ｄ Ｎ Ａ断片を含む両分群を集め、各画分のアリ
コートをプライマーＡおよびＢで増幅した。サザンブ口
ットハイプリダイゼーションから、調べたＤＮＡ画分の
サイズ範囲内にそのサイズが落ちる別々のＰＱＲ産物を
与える、これらの画分中で単一分子増幅が起こっている
ことが明らかになった（第１３Ｂ図，表２）。ＤＮＡを
含んでいない、あるいは精子ＤＮＡを欠くコントロール
Ｓ ａｕ３ Ａ ／ Ｍｂｏ Ｉ消化物由来の同等の大
きさのアリコートを含む多数の同時に行なったコントロ
ールＰＣＲ反応は、Ｍ３３２ ＰＣＲ産物に関して一
貫してネガティブであった。精子ＤＮＡ由来の最も短い
サイズ画分Ｓ３〜Ｓ５は全く増幅可能な前駆体アリルが
なく、９９．９９９９％以上の前駆体アリル分子はこれ
らの画分からは除去されていることが示唆された。これ
らのアリルは画分Ｓ１およびＳ２にもまだこれらのアリ
ルがわずかに存在しており、ゲル電気泳動分画を繰り返
したにもかかわらず、精製が不完全であったことが示唆
された。
マ−ＭｂｏＩで消化して、プライマーＡとＢの末端で切
断し（第１１Ａ図）、アガロースゲル電気泳動でサイズ
分画を行なった。元のアリル３１と３２よりも短１，”
Ｎ Ｄ Ｎ Ａ断片を含む両分群を集め、各画分のアリ
コートをプライマーＡおよびＢで増幅した。サザンブ口
ットハイプリダイゼーションから、調べたＤＮＡ画分の
サイズ範囲内にそのサイズが落ちる別々のＰＱＲ産物を
与える、これらの画分中で単一分子増幅が起こっている
ことが明らかになった（第１３Ｂ図，表２）。ＤＮＡを
含んでいない、あるいは精子ＤＮＡを欠くコントロール
Ｓ ａｕ３ Ａ ／ Ｍｂｏ Ｉ消化物由来の同等の大
きさのアリコートを含む多数の同時に行なったコントロ
ールＰＣＲ反応は、Ｍ３３２ ＰＣＲ産物に関して一
貫してネガティブであった。精子ＤＮＡ由来の最も短い
サイズ画分Ｓ３〜Ｓ５は全く増幅可能な前駆体アリルが
なく、９９．９９９９％以上の前駆体アリル分子はこれ
らの画分からは除去されていることが示唆された。これ
らのアリルは画分Ｓ１およびＳ２にもまだこれらのアリ
ルがわずかに存在しており、ゲル電気泳動分画を繰り返
したにもかかわらず、精製が不完全であったことが示唆
された。
元のアリルに近い長さのＤＮＡのゲル精製では、新しい
変異体アリルの検出が元のアリル由来のＰＣＲ産物に隠
されている、よりひどく混入した両分が得られる（デー
タは示していない）。
変異体アリルの検出が元のアリル由来のＰＣＲ産物に隠
されている、よりひどく混入した両分が得られる（デー
タは示していない）。
単一分子ミニサテライト欠失変異体は同一の個体から採
られた血液から調製されたサイズ分画ＤＮＡから、同様
に増幅された。また、単一分子増幅現象は血液ＤＮＡ中
では容易に検出されたが、血液ＤＮＡを欠くコントロー
ル消化産物では検出されなかった。検出された新しい変
異体精液および血液の数とサイズの詳細を表３に要約し
た。計８４の精液と４２の血液変異体が観察され、変異
体は最も大きなサイズ画分中に最も頻繁に生じた。
られた血液から調製されたサイズ分画ＤＮＡから、同様
に増幅された。また、単一分子増幅現象は血液ＤＮＡ中
では容易に検出されたが、血液ＤＮＡを欠くコントロー
ル消化産物では検出されなかった。検出された新しい変
異体精液および血液の数とサイズの詳細を表３に要約し
た。計８４の精液と４２の血液変異体が観察され、変異
体は最も大きなサイズ画分中に最も頻繁に生じた。
全ての精液および血液変異体を一つ以上の元のアリルと
並べ合わせられることから、これらの短いアリルは、精
液や血液ＤＮＡの単離の際に混入したものではなく、ゲ
ノムＤＮＡに存在する本物の変異分子を表していること
を強く指示する証拠が与えられる。さらに、同一のモザ
イク変異アリルが繰り返し検出されたことからさらに単
一分子ＭＶＲマッピングの信頼性が確認された。
並べ合わせられることから、これらの短いアリルは、精
液や血液ＤＮＡの単離の際に混入したものではなく、ゲ
ノムＤＮＡに存在する本物の変異分子を表していること
を強く指示する証拠が与えられる。さらに、同一のモザ
イク変異アリルが繰り返し検出されたことからさらに単
一分子ＭＶＲマッピングの信頼性が確認された。
実験手順
ＤＮＡの調製
ヒトＤＮＡはＣ Ｅ Ｐ Ｈ，パリから入手するか、あ
るいは他で記述されているように（ジエフェリーズ（Ｊ
ｅｆｆｒｅｙｓ）とモートン（Ｍｏｒｔｏｎ）， １９
８７）、８０の無関係なイギリス人から集めた静脈血か
ら調製した。単一分子ＰＣＲ解析のための血液ＤＮＡは
２０ｍｌのｌｘｓｓｃ（クエン酸ナトリウム生理食塩水
． ０．１５Ｍ Ｎａ （，Ｑ ， １５ｄ クエ
ン酸３ナトリウムｐＨ７．０）中に集めた２０ｍｌの血
液から調製した。
るいは他で記述されているように（ジエフェリーズ（Ｊ
ｅｆｆｒｅｙｓ）とモートン（Ｍｏｒｔｏｎ）， １９
８７）、８０の無関係なイギリス人から集めた静脈血か
ら調製した。単一分子ＰＣＲ解析のための血液ＤＮＡは
２０ｍｌのｌｘｓｓｃ（クエン酸ナトリウム生理食塩水
． ０．１５Ｍ Ｎａ （，Ｑ ， １５ｄ クエ
ン酸３ナトリウムｐＨ７．０）中に集めた２０ｍｌの血
液から調製した。
血液を凍結および溶解させて赤血球を溶解させ、１０．
０００ｇでｌＯ分間遠心して白血球を集めた。細胞ペレ
ットをＩＸＳＳＣで洗浄し、０．２Ｍ 酢酸ナトリウム
（ｐｌ１７．０）に再懸濁し、ＳＤＳを１％まで加えて
溶解させた。フェノール抽出し、エタノール沈澱を３回
行なってＤＮＡを集めた。全ての操作はピペット、使い
捨てプラスチック器具、および研究室環境にまださらさ
れていない試薬を用いて薄相流動フード中で混入の危険
が最少になるように行なった。試料を採取する前に性交
を避けていた個体（彼の相手のＤＮＡの混入を避けるた
め）から単一の射精から同様に、精子ＤＮＡを調製した
。精液を等量の１ｘＳＳＣで希釈し、精子を１０．００
０ｇでｌＯ分間遠心して集めた。細胞ベレットを２０ｍ
ｌのｌｘｓｓｃで３回洗浄し、遠心して、２０ｍｌのＩ
ＸＳＳＣ，１％ ＳＤＳで６回洗浄して全ての精液中の
白血球および表皮細胞を崩壊させた。
０００ｇでｌＯ分間遠心して白血球を集めた。細胞ペレ
ットをＩＸＳＳＣで洗浄し、０．２Ｍ 酢酸ナトリウム
（ｐｌ１７．０）に再懸濁し、ＳＤＳを１％まで加えて
溶解させた。フェノール抽出し、エタノール沈澱を３回
行なってＤＮＡを集めた。全ての操作はピペット、使い
捨てプラスチック器具、および研究室環境にまださらさ
れていない試薬を用いて薄相流動フード中で混入の危険
が最少になるように行なった。試料を採取する前に性交
を避けていた個体（彼の相手のＤＮＡの混入を避けるた
め）から単一の射精から同様に、精子ＤＮＡを調製した
。精液を等量の１ｘＳＳＣで希釈し、精子を１０．００
０ｇでｌＯ分間遠心して集めた。細胞ベレットを２０ｍ
ｌのｌｘｓｓｃで３回洗浄し、遠心して、２０ｍｌのＩ
ＸＳＳＣ，１％ ＳＤＳで６回洗浄して全ての精液中の
白血球および表皮細胞を崩壊させた。
残りの精子ペレットをＩＸＳＳＣ，ＩＭ ２−メルカ
ブトエタノール中で室温で５分間インキユベートし、Ｓ
ＤＳを１％まで加えることによって還元した精子を溶解
させた。フェノール抽出後、精子ＤＮＡをエタノール沈
澱によって集めた。
ブトエタノール中で室温で５分間インキユベートし、Ｓ
ＤＳを１％まで加えることによって還元した精子を溶解
させた。フェノール抽出後、精子ＤＮＡをエタノール沈
澱によって集めた。
ヒトＤＮＡのサイズ分画
４０μｇの血液精液ＤＮＡを、４ｍＭ スペルミジン
トリクロライドの存在下で販売元の指示する条件を用い
てＳａｕ３ＡとＭｂｏＩで完全に消化した。
トリクロライドの存在下で販売元の指示する条件を用い
てＳａｕ３ＡとＭｂｏＩで完全に消化した。
ＤＮＡを含まないコントロール消化物ととも一に、ＤＮ
Ａ消化産物をＴＨＥ （２０ｍＭ 酢酸トリス、ｌ０
ＩＩＩＭ 酢酸ナトリウム、０．１ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ
Ａ ， ｐｌｆ８．３）中の水平２０ｃｍ ０．６ア
ガロースゲル（シグマ・タイブ１）上に、スロットが試
料で半分も満たされないように載せた。Ｈｉｎｄｍ
ＤＮＡマーカーを横に流して試料の電気泳動を２０Ｖで
１８時間行なった。
Ａ消化産物をＴＨＥ （２０ｍＭ 酢酸トリス、ｌ０
ＩＩＩＭ 酢酸ナトリウム、０．１ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ
Ａ ， ｐｌｆ８．３）中の水平２０ｃｍ ０．６ア
ガロースゲル（シグマ・タイブ１）上に、スロットが試
料で半分も満たされないように載せた。Ｈｉｎｄｍ
ＤＮＡマーカーを横に流して試料の電気泳動を２０Ｖで
１８時間行なった。
マーカーのレーンを採り除き、エチジウムブロマイドで
染色した。０．６〜４．２ｋｂの範囲のヒトＤＮＡ断片
を含むゲル領域を、コントロール消化産物から対応する
領域とともに切り出し、ＤＮＡを透析膜上で電気的溶出
によってＤＮＡを集めた。
染色した。０．６〜４．２ｋｂの範囲のヒトＤＮＡ断片
を含むゲル領域を、コントロール消化産物から対応する
領域とともに切り出し、ＤＮＡを透析膜上で電気的溶出
によってＤＮＡを集めた。
回収したＤＮＡおよび、そのコントロール抽出物を新し
いゲル上で上記のように再分画した。回収したＤＮＡを
次に第３のゲルに泳動し、０８６〜３．８ｋｂのゲルス
ライスのシリーズを採った。各スライスからゲルの上下
ｌｏｗを削ってゲル表面を異常に移動したＤＮＡ断片の
混入を最少とし、ＤＮＡを電気的溶出およびエタノール
沈澱で集めた。ＤＮＡを５ａ＋Ｍ Ｔｒ１ｓ− ＨＣ
Ｎ （ｐＨ７．５）に溶解した。全ての操作は薄相流動
キャビネット中で行ない、電気泳動装置は使用前に家庭
用漂白剤に１ＭのＨＣＩを加えたものに蒸気フード中で
１６時間浸して混入を防いだ。
いゲル上で上記のように再分画した。回収したＤＮＡを
次に第３のゲルに泳動し、０８６〜３．８ｋｂのゲルス
ライスのシリーズを採った。各スライスからゲルの上下
ｌｏｗを削ってゲル表面を異常に移動したＤＮＡ断片の
混入を最少とし、ＤＮＡを電気的溶出およびエタノール
沈澱で集めた。ＤＮＡを５ａ＋Ｍ Ｔｒ１ｓ− ＨＣ
Ｎ （ｐＨ７．５）に溶解した。全ての操作は薄相流動
キャビネット中で行ない、電気泳動装置は使用前に家庭
用漂白剤に１ＭのＨＣＩを加えたものに蒸気フード中で
１６時間浸して混入を防いだ。
ＭＳ３２アリルの増幅
アリルは以前に記述された方法（ジエフェリーズ他，
１９８ｇ）の修飾法によって増幅した。０．４■のヒト
ゲノムＤＮＡを、５０ｐＱの４５ｍＭ Ｔ ｒｉｓ
−ＨＣＮ （ｐｌ１８．８） ， ｌｌｍＭ （ＮＨ４
’） ２Ｓ Ｏ４， ４．５１１Ｍ ＭｇＣＮ ．
１３．７ｍκ２−メルカプトエタノール， ４．５
μＭ ＥＤＴＡ．１ｍＭ ｄＡＴＰ，１ｍＭｄＣＴ
Ｐ，１ｍＭ ｄＧＴＰ，１ｍＭ ｄＴＴＰ（ファル
マシア），１１０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ Ｄ
Ｎ ａｓｅフリー，ファルマシア）に各１μＭのオリ
ゴヌクレオチドＣ１とＤあるいはＣとＤ１および５ユニ
ットのＴａｑポリメラーゼ（アマシャム社）を加えたも
のの中で増幅した。反応は、９６℃で１．３分、６７℃
で１分、７０℃で４分のサイクルをＤＮＡサーマルサイ
クラ−（ベルキンエルマー・シータス）上で２５〜３０
サイクル行なった。
１９８ｇ）の修飾法によって増幅した。０．４■のヒト
ゲノムＤＮＡを、５０ｐＱの４５ｍＭ Ｔ ｒｉｓ
−ＨＣＮ （ｐｌ１８．８） ， ｌｌｍＭ （ＮＨ４
’） ２Ｓ Ｏ４， ４．５１１Ｍ ＭｇＣＮ ．
１３．７ｍκ２−メルカプトエタノール， ４．５
μＭ ＥＤＴＡ．１ｍＭ ｄＡＴＰ，１ｍＭｄＣＴ
Ｐ，１ｍＭ ｄＧＴＰ，１ｍＭ ｄＴＴＰ（ファル
マシア），１１０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ Ｄ
Ｎ ａｓｅフリー，ファルマシア）に各１μＭのオリ
ゴヌクレオチドＣ１とＤあるいはＣとＤ１および５ユニ
ットのＴａｑポリメラーゼ（アマシャム社）を加えたも
のの中で増幅した。反応は、９６℃で１．３分、６７℃
で１分、７０℃で４分のサイクルをＤＮＡサーマルサイ
クラ−（ベルキンエルマー・シータス）上で２５〜３０
サイクル行なった。
ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルで電気泳動し、エ
チジウムブロマイドで染色して増幅されたアリルを可視
化した。アリルを電気的溶出およびエタノール沈澱によ
って回収し、５１１１ＨのＴ ｒｉｓ −Ｈ ＣＲ （
ｐＨ７．０）に溶解した。他から入手したＴａｑポリメ
ラーゼも同様に有効であった（Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（ベ
ルキンエルマー・シータス）およびタイプ■Ｔａｑポリ
メラーゼ（カムバイオ））。
チジウムブロマイドで染色して増幅されたアリルを可視
化した。アリルを電気的溶出およびエタノール沈澱によ
って回収し、５１１１ＨのＴ ｒｉｓ −Ｈ ＣＲ （
ｐＨ７．０）に溶解した。他から入手したＴａｑポリメ
ラーゼも同様に有効であった（Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（ベ
ルキンエルマー・シータス）およびタイプ■Ｔａｑポリ
メラーゼ（カムバイオ））。
単一分子解析のためのヒトＤＮＡ試料を遠心して粒子状
の物質を除き、５ｍＭ Ｔｒｉｓ − Ｈ Ｃ，Ｑ（
ｐＨ７．０）に０．１μＭのＰＣＲプライマーをキャリ
アとして加えたもので希釈し、プライマーＡとＢを用い
た７μｇのＰＣＲ反応を９６℃で１．３分、６４°Ｃで
１分および７０℃で４分のサイクルを２５〜２８サイク
ル行なった。以前に記述されたように（ジエフェリーズ
他． １９８８） ３２Ｐで標識したＭＳ３２ミニサテ
ライトブローブでサザンブ口ットハイプリダイゼーショ
ンによって検出した。ＰＣＲ産物を、１μＭの重なりあ
ったプライマ−Ｃ１とＤ、あるいはＣとＤ１を含むＰＣ
Ｒ反応液を０．４μｇの開始ＰＣＲ反応液をもとにして
９６℃で１．３分、６５℃で１分、７０℃で４分間のサ
イクルを２５〜３０サイクル行なった。再増幅されたア
リルを上述のようにアガロースゲル電気泳動によって精
製した。
の物質を除き、５ｍＭ Ｔｒｉｓ − Ｈ Ｃ，Ｑ（
ｐＨ７．０）に０．１μＭのＰＣＲプライマーをキャリ
アとして加えたもので希釈し、プライマーＡとＢを用い
た７μｇのＰＣＲ反応を９６℃で１．３分、６４°Ｃで
１分および７０℃で４分のサイクルを２５〜２８サイク
ル行なった。以前に記述されたように（ジエフェリーズ
他． １９８８） ３２Ｐで標識したＭＳ３２ミニサテ
ライトブローブでサザンブ口ットハイプリダイゼーショ
ンによって検出した。ＰＣＲ産物を、１μＭの重なりあ
ったプライマ−Ｃ１とＤ、あるいはＣとＤ１を含むＰＣ
Ｒ反応液を０．４μｇの開始ＰＣＲ反応液をもとにして
９６℃で１．３分、６５℃で１分、７０℃で４分間のサ
イクルを２５〜３０サイクル行なった。再増幅されたア
リルを上述のようにアガロースゲル電気泳動によって精
製した。
表
ＰＣＲ増幅のために選択されたヒトミニサテライトの性
質 クローン ｐｇａ Ｍ Ｓ ３２ ｐ Ｍ Ｓ ５１ ｐ ３３．１ ｐ ３３．４ ｐ ３３．８ 座 位 染色体上の位置 ”ｆ ｏ 接合性 アリ
ル数 ７ ＋Ｊ ′Ｌ４範囲（％’）
（ｋｂ）Ｄ７５２２ ７ｑ３Ｂ
−ｑｔｅｒ ９７ ＞４０
０．Ｅｆ 〜２ＯＤＩＳ８ １ｑ４２−
ｑ４３ ９７ ＞４０
１．１〜２０ＤｌＩＳ９７ １１ｑ１３
７７ ９ １
．３〜４．３８８ １０ １
．１〜２．５７０ ７ ０
．８〜１．３− ８７
８ ０．５〜１．０％ＧＣ２ 参考文献 ６８ （８， ｔｏ， ８２ （１０．３２） ３２〕 ；アリルの長さは、ＰＣＲプライマーによって決定され
たミニサテライトと隣接ＤＮＡの双方を含む（第１図参
照）。
質 クローン ｐｇａ Ｍ Ｓ ３２ ｐ Ｍ Ｓ ５１ ｐ ３３．１ ｐ ３３．４ ｐ ３３．８ 座 位 染色体上の位置 ”ｆ ｏ 接合性 アリ
ル数 ７ ＋Ｊ ′Ｌ４範囲（％’）
（ｋｂ）Ｄ７５２２ ７ｑ３Ｂ
−ｑｔｅｒ ９７ ＞４０
０．Ｅｆ 〜２ＯＤＩＳ８ １ｑ４２−
ｑ４３ ９７ ＞４０
１．１〜２０ＤｌＩＳ９７ １１ｑ１３
７７ ９ １
．３〜４．３８８ １０ １
．１〜２．５７０ ７ ０
．８〜１．３− ８７
８ ０．５〜１．０％ＧＣ２ 参考文献 ６８ （８， ｔｏ， ８２ （１０．３２） ３２〕 ；アリルの長さは、ＰＣＲプライマーによって決定され
たミニサテライトと隣接ＤＮＡの双方を含む（第１図参
照）。
；ミニサテライト反復ユニットのＧＣ含量。ｐＭ Ｓ
５１ ミニサテライト反復ユニットは５’−ＡＣＡＴＧ
ＧＣＡＧＧＣＡＧＧＧＣＡＧＧ） ＴＧＧＡＧＧＧ−
３’であり、ここでｎは反復ユニッｎ トによって１あるいは２である。
５１ ミニサテライト反復ユニットは５’−ＡＣＡＴＧ
ＧＣＡＧＧＣＡＧＧＧＣＡＧＧ） ＴＧＧＡＧＧＧ−
３’であり、ここでｎは反復ユニッｎ トによって１あるいは２である。
表
Ｓａｕ３ＡとＭｂｏｌで消化した輌液および血液ＤＮＡ
をサイズ分画したものの中に検出されたＭ Ｓ ３２の
欠失変異体の概要サイズ範囲， 解析された一倍体 ２．４〜３．０ １．１〜２．４ １．１〜１．７ ０．６〜１．１ ３．１〜３．８ ２．３〜３．１ １．６〜２．３ １．１−１．６ ０．８〜１．１ ０．１２ ０．７２ １．０ １．５ １．５ ６２〜８３ ３７〜６２ １７〜３７ ０〜ｌ７ ８６〜１１０ ５９〜８８ ３４〜５９ １７〜３４ ０〜■７ ５９〜７６ ４８〜６０ ２５〜３４ ９１〜１１３ ６１〜８６ ３８〜６２ ２０〜２９ 表３ 説明 ＭＳ３２ Ｓａｕ３Ａアリル４．９および５．ｌｋｂ
長（アリル３１および３２，第１２図）に関してペテロ
接合性の個体由来の精子ＤＮＡおよび血液ＤＮＡをＳａ
ｕ３ＡとＭｂｏＩで消化し、実験方法の項で述べたよう
にアガロースゲル電気泳動でサイズ分画を行なった。各
両分のＤＮＡの収量は、分画していない消化ＤＮＡの様
々な希釈に対して各両分のアリコートを電気泳動し、エ
チジウムブロマイド染色後のゲルの写真上の適当な分子
量の位置のデンシトメトリーをスキャンすることによっ
て見積った。各両分から複数のアリコートをＰＣＲプラ
イマーＡとＢを用いて増幅し、第１３図に示したような
新しい変異体アリルについて調べた。ハブ口イドゲノム
あたり３９ｇＤＮＡと仮定して、あるサイズクラスの変
異体についてハブ口イドゲノムの数を解析し、増幅が成
功する単一Ｍ Ｓ ３２分子の見積られた比率（４０％
）を訂正した。各変異体分子で観察された反復数はプラ
イマ−ＡとＢで増幅し開始産物のサイズから見積り、最
初のマツピンを行なった変異体中の反復数の直接決定に
よって確証した。
をサイズ分画したものの中に検出されたＭ Ｓ ３２の
欠失変異体の概要サイズ範囲， 解析された一倍体 ２．４〜３．０ １．１〜２．４ １．１〜１．７ ０．６〜１．１ ３．１〜３．８ ２．３〜３．１ １．６〜２．３ １．１−１．６ ０．８〜１．１ ０．１２ ０．７２ １．０ １．５ １．５ ６２〜８３ ３７〜６２ １７〜３７ ０〜ｌ７ ８６〜１１０ ５９〜８８ ３４〜５９ １７〜３４ ０〜■７ ５９〜７６ ４８〜６０ ２５〜３４ ９１〜１１３ ６１〜８６ ３８〜６２ ２０〜２９ 表３ 説明 ＭＳ３２ Ｓａｕ３Ａアリル４．９および５．ｌｋｂ
長（アリル３１および３２，第１２図）に関してペテロ
接合性の個体由来の精子ＤＮＡおよび血液ＤＮＡをＳａ
ｕ３ＡとＭｂｏＩで消化し、実験方法の項で述べたよう
にアガロースゲル電気泳動でサイズ分画を行なった。各
両分のＤＮＡの収量は、分画していない消化ＤＮＡの様
々な希釈に対して各両分のアリコートを電気泳動し、エ
チジウムブロマイド染色後のゲルの写真上の適当な分子
量の位置のデンシトメトリーをスキャンすることによっ
て見積った。各両分から複数のアリコートをＰＣＲプラ
イマーＡとＢを用いて増幅し、第１３図に示したような
新しい変異体アリルについて調べた。ハブ口イドゲノム
あたり３９ｇＤＮＡと仮定して、あるサイズクラスの変
異体についてハブ口イドゲノムの数を解析し、増幅が成
功する単一Ｍ Ｓ ３２分子の見積られた比率（４０％
）を訂正した。各変異体分子で観察された反復数はプラ
イマ−ＡとＢで増幅し開始産物のサイズから見積り、最
初のマツピンを行なった変異体中の反復数の直接決定に
よって確証した。
以下に、第１図〜第１３図の説明を一括して掲げる。
第１図
ＰＣＨによるミニサテライト増幅に用いられるプライマ
ーとハイブリダイゼーションプローブ。
ーとハイブリダイゼーションプローブ。
各ミニサテライト座位は、ミニサテライトからそれぞれ
ａおよびｂ ｂｐの距離に隣接するＤＮＡの独特な配
列中に位置する２０マーあるいは２４マーのプライマー
ＡおよびＢを用いて増幅された。
ａおよびｂ ｂｐの距離に隣接するＤＮＡの独特な配
列中に位置する２０マーあるいは２４マーのプライマー
ＡおよびＢを用いて増幅された。
ＰＣＲ産物は、ミニサテライトからＣおよびｄｂｐで切
断する制限エンドヌクレアーゼＸおよびＹで切断して単
離したミニサテライト内部のプローブとのハイブリダイ
ゼーションによって検出された。６種のミニサテライト
の詳細は以下のようである。ここでＲ＝反復ユニットの
長さ（ｂｐ）である： 第２図 ＰＣＨによるＭＳ３２ミニサテライトアリルの増幅。Ａ
．１．１〜１７．９ｋｂの範囲の８つの異なるＭＳ３２
アリルを含んでいるＣＥＰＨ個体２３０８． １０２０
Ｂ，１３３１０１および１３３３０４由来のＤＮＡの０
．１μｇアリコートを保存し、１ユニットのＴａｑボリ
メラーゼと隣接プライマーＡおよびＢを含む１０μｇの
反応液中で１０〜２０サイクル増幅した。ＰＣＲ産物は
１％のアガロースゲル上で電気泳動を行ない分離し、ミ
ニサテライトブローブとのサザンブ口ットハイプリダイ
ゼーションによって検出した。Ｔａｑポリメラーゼの７
０℃での伸長時間は６， １５，あるいは８０分で、１
０サイクルめに追加のポリメラーゼ（１ユニット）を加
えて０、あるいは加えずに０行なった。Ｈ，ＡｌｕＩで
消化した各２μｇのＣＥＰＨＤＮＡ；ＭＳ３２に隣接し
たＡ１ｕＩ部位は、各ＡｌｕＩアリルが対応するＰＣＲ
産物よりも０．２ｋｂ長くなるように位置している。オ
ートラジオグラフィーは５時間（サイクル１０． １４
）あるいは１時間（１７． ２０）で増感スクリーンを
用いずに行なった。Ｂ， Ｔａｑポリメラーゼの濃度を
増加させた場合の（ ａ − ｃ ，それぞれ０．５．
１． ２ユニット）長いアリルの増幅効率への影
響。伸長時間は７０℃で１５分であった。
断する制限エンドヌクレアーゼＸおよびＹで切断して単
離したミニサテライト内部のプローブとのハイブリダイ
ゼーションによって検出された。６種のミニサテライト
の詳細は以下のようである。ここでＲ＝反復ユニットの
長さ（ｂｐ）である： 第２図 ＰＣＨによるＭＳ３２ミニサテライトアリルの増幅。Ａ
．１．１〜１７．９ｋｂの範囲の８つの異なるＭＳ３２
アリルを含んでいるＣＥＰＨ個体２３０８． １０２０
Ｂ，１３３１０１および１３３３０４由来のＤＮＡの０
．１μｇアリコートを保存し、１ユニットのＴａｑボリ
メラーゼと隣接プライマーＡおよびＢを含む１０μｇの
反応液中で１０〜２０サイクル増幅した。ＰＣＲ産物は
１％のアガロースゲル上で電気泳動を行ない分離し、ミ
ニサテライトブローブとのサザンブ口ットハイプリダイ
ゼーションによって検出した。Ｔａｑポリメラーゼの７
０℃での伸長時間は６， １５，あるいは８０分で、１
０サイクルめに追加のポリメラーゼ（１ユニット）を加
えて０、あるいは加えずに０行なった。Ｈ，ＡｌｕＩで
消化した各２μｇのＣＥＰＨＤＮＡ；ＭＳ３２に隣接し
たＡ１ｕＩ部位は、各ＡｌｕＩアリルが対応するＰＣＲ
産物よりも０．２ｋｂ長くなるように位置している。オ
ートラジオグラフィーは５時間（サイクル１０． １４
）あるいは１時間（１７． ２０）で増感スクリーンを
用いずに行なった。Ｂ， Ｔａｑポリメラーゼの濃度を
増加させた場合の（ ａ − ｃ ，それぞれ０．５．
１． ２ユニット）長いアリルの増幅効率への影
響。伸長時間は７０℃で１５分であった。
第３図
ＰＣＲ伸長時間が６分（○）あるいは１５分（●）の場
合の、アリル長の関数としてのＭ Ｓ ３２ ミニサテ
ライトアリルの増幅効率。増幅サイクルあたりの産物収
量は、増感スクリーンなしでプレフラッシュしたＸ線フ
ィルムに感光させた第２図のトラックＨ， ６＋， １
５＋のレーザーデンシトメトリーをスキャンすることに
よって決定した。サイクルｌＯまで、サイクル１０から
１４まで、サイクル１４から１７までで決定されたサイ
クルあたり収世の平均評価はほぼ一致したものであり、
ＰＣＲ産物の収量は少なくともサイクル１７までは対数
的に増加することが示唆された；図は各アリルに対する
収量の３つの評価の平均値を示している。
合の、アリル長の関数としてのＭ Ｓ ３２ ミニサテ
ライトアリルの増幅効率。増幅サイクルあたりの産物収
量は、増感スクリーンなしでプレフラッシュしたＸ線フ
ィルムに感光させた第２図のトラックＨ， ６＋， １
５＋のレーザーデンシトメトリーをスキャンすることに
よって決定した。サイクルｌＯまで、サイクル１０から
１４まで、サイクル１４から１７までで決定されたサイ
クルあたり収世の平均評価はほぼ一致したものであり、
ＰＣＲ産物の収量は少なくともサイクル１７までは対数
的に増加することが示唆された；図は各アリルに対する
収量の３つの評価の平均値を示している。
第４図
単一細胞相当のヒトＤＮＡからの二つのミニサテライト
の共増幅。Ａ．λＭ Ｓ ３２のアリルａ，ｂ，および
ｐ Ｍ Ｓ ５１のｃ，ｄに関して、ペテロ接合性の個
体から採取した血液由来のＤＮＡの８０ｐｇあるいは６
ｐｇアリコートを、双方の座位に対するプライマーＡお
よびＢの存在下で１５分の伸長時間で２５サイクル増幅
させ、増幅産物のサザンプロット解析を行なった。オー
トラジオグラフィーの感光時間を長くした場合に３つの
６ｐｇ試料で低レベルのアリルａが検出された（矢印）
。Ｂ．ＭＳ３２の疑似増幅産物の解析。２つの６０ｐｇ
Ｄ Ｎ Ａアリコートを３０サイクル増幅させ、Ｓ
１ヌクレアーゼ（Ｓｌ） 、ＢｇｌＩ（Ｂ）、あるいは
ＨｐａＩ （Ｈ）で消化した。ＢｇｌＩは隣接配列中、
ＭＳ３２ミニサテライトとブライマ−Ｂの間で１カ所切
断し、ａｔｉｂｐの隣接ＤＮＡを除去する。ＨｐａＩ部
位はプライマーＡとミニサテライトの間で切断し、１９
５ｂｐの隣接ＤＮＡを除去する（第１図説明参照）。
の共増幅。Ａ．λＭ Ｓ ３２のアリルａ，ｂ，および
ｐ Ｍ Ｓ ５１のｃ，ｄに関して、ペテロ接合性の個
体から採取した血液由来のＤＮＡの８０ｐｇあるいは６
ｐｇアリコートを、双方の座位に対するプライマーＡお
よびＢの存在下で１５分の伸長時間で２５サイクル増幅
させ、増幅産物のサザンプロット解析を行なった。オー
トラジオグラフィーの感光時間を長くした場合に３つの
６ｐｇ試料で低レベルのアリルａが検出された（矢印）
。Ｂ．ＭＳ３２の疑似増幅産物の解析。２つの６０ｐｇ
Ｄ Ｎ Ａアリコートを３０サイクル増幅させ、Ｓ
１ヌクレアーゼ（Ｓｌ） 、ＢｇｌＩ（Ｂ）、あるいは
ＨｐａＩ （Ｈ）で消化した。ＢｇｌＩは隣接配列中、
ＭＳ３２ミニサテライトとブライマ−Ｂの間で１カ所切
断し、ａｔｉｂｐの隣接ＤＮＡを除去する。ＨｐａＩ部
位はプライマーＡとミニサテライトの間で切断し、１９
５ｂｐの隣接ＤＮＡを除去する（第１図説明参照）。
第５図
ＰＣＨによる６つの異なるヒトミニサテライトの共増幅
。Ａ． ミニサテライトｐλｇ３，ＭＳ３２．ｐＭｓ
５１， ３３．１． ３３．４．および３３．６に対す
るプライマーＡおよびＢの混合物を用いた。個体１由来
のＤＮＡ１０１ｇ（最初の４レーン）、あるいはｌｏｇ
（最後の２レーン）のそれぞれ１５あるいは１８サイク
ルの増幅。ＰＣＲ産物は３２Ｐで標識した６種全てのブ
ローブの混合物とのサザンブ口ットハイプリダイゼーシ
ョンによって検出した。調べた個体はあらかじめ６つの
座位について独立に解析されており、それにより全ての
ハイブリダイズしたＤＮＡ断片を図に示したように帰属
させることができた；この個体は６座位全てに関してペ
テロ接合性であった。これらのＤＮＡフィンガープリン
トは３回の独立した実験由来のものである。最後の部分
で３３．４が増幅されていないことに注意。
。Ａ． ミニサテライトｐλｇ３，ＭＳ３２．ｐＭｓ
５１， ３３．１． ３３．４．および３３．６に対す
るプライマーＡおよびＢの混合物を用いた。個体１由来
のＤＮＡ１０１ｇ（最初の４レーン）、あるいはｌｏｇ
（最後の２レーン）のそれぞれ１５あるいは１８サイク
ルの増幅。ＰＣＲ産物は３２Ｐで標識した６種全てのブ
ローブの混合物とのサザンブ口ットハイプリダイゼーシ
ョンによって検出した。調べた個体はあらかじめ６つの
座位について独立に解析されており、それにより全ての
ハイブリダイズしたＤＮＡ断片を図に示したように帰属
させることができた；この個体は６座位全てに関してペ
テロ接合性であった。これらのＤＮＡフィンガープリン
トは３回の独立した実験由来のものである。最後の部分
で３３．４が増幅されていないことに注意。
Ｂ．関連のない８個体（２〜９）の、ｌｏｇのＤＮＡ試
料を１８サイクル増幅させた後のＤＮＡフィンガープリ
ント。Ｃ． １０ｎｇ ＤＮＡを１５サイクル増幅さ
せた後の３世代家族（ＣＥＰＨ血族１４３５）のＤＮＡ
フィンガープリント。この家族の２番目の解析で示され
るように、個体１２ではアリル３３．４とｐ Ｍ Ｓ
５１に対応する３つのバンドが増幅されていない（最初
の列でバンドを星印で示してある）。全ての実験で、バ
ックグラウンドのレベルを下げるためにゲル電気泳動前
にＰＣＲ産物をＳ１ヌクレアーゼで消化した（材料と方
法参照）。
料を１８サイクル増幅させた後のＤＮＡフィンガープリ
ント。Ｃ． １０ｎｇ ＤＮＡを１５サイクル増幅さ
せた後の３世代家族（ＣＥＰＨ血族１４３５）のＤＮＡ
フィンガープリント。この家族の２番目の解析で示され
るように、個体１２ではアリル３３．４とｐ Ｍ Ｓ
５１に対応する３つのバンドが増幅されていない（最初
の列でバンドを星印で示してある）。全ての実験で、バ
ックグラウンドのレベルを下げるためにゲル電気泳動前
にＰＣＲ産物をＳ１ヌクレアーゼで消化した（材料と方
法参照）。
全ての実験でＤＮＡを含まないコントロール試料は一貫
してブランクだった（示していない）。
してブランクだった（示していない）。
第６図
ＰＣＲで同時に６種のミニサテライトを共増幅すること
によって作成したＤＮＡフィンガープリントの多様性。
によって作成したＤＮＡフィンガープリントの多様性。
第５図で述べたように、関連のない２１個体由来のｌｏ
ｇのＤＮＡ試料を解析した。
ｇのＤＮＡ試料を解析した。
個体あたりの解析可能なＤＮＡ断片数中の多様性。
２９の独立な組ごとの比較を元にして、関連のない個体
の組のＤＮＡフィンガープリントの間に見られる相違あ
たりの平均バンド数を解析した。一致しないバンドの数
は、比較した２個体が共有していないバンドの総数であ
る。６座位の場合一致しないバンドの理論的な最大数は
２４であり、観測された平均値は１０．８±２．８（Ｓ
． Ｄ．）であった。不一致性の分布は、ほぼこの平均
値を持つポヮソン分布を示した（点線）。
の組のＤＮＡフィンガープリントの間に見られる相違あ
たりの平均バンド数を解析した。一致しないバンドの数
は、比較した２個体が共有していないバンドの総数であ
る。６座位の場合一致しないバンドの理論的な最大数は
２４であり、観測された平均値は１０．８±２．８（Ｓ
． Ｄ．）であった。不一致性の分布は、ほぼこの平均
値を持つポヮソン分布を示した（点線）。
第７図
単一のヒト細胞由来のミニサテライトの増幅。
Ａ． ０． １． ３個の小リンパ球（第５Ａ図
で解析した個体由来）を含む試料を、プロテナーゼＫと
ＳＤＳ処理、あるいは水中での加熱により溶解し、ＭＳ
３２， ｐＭＳ５１， ３３．１，・３３．４，およ
び３３．６に対するプライマーを用いて２７サイクル共
増幅を行なった。５種のそれぞれのミニサテライトプロ
ーブで連続的に、ＰＣＲ産物のサザンブ口ットハイプリ
ダイゼーションを行なった。Ｂ．上述のようにプロテナ
ーゼＫとＳＤＳで溶解させてＰＣＲを行なった後に解析
した、単一頬細胞の増幅産物。
で解析した個体由来）を含む試料を、プロテナーゼＫと
ＳＤＳ処理、あるいは水中での加熱により溶解し、ＭＳ
３２， ｐＭＳ５１， ３３．１，・３３．４，およ
び３３．６に対するプライマーを用いて２７サイクル共
増幅を行なった。５種のそれぞれのミニサテライトプロ
ーブで連続的に、ＰＣＲ産物のサザンブ口ットハイプリ
ダイゼーションを行なった。Ｂ．上述のようにプロテナ
ーゼＫとＳＤＳで溶解させてＰＣＲを行なった後に解析
した、単一頬細胞の増幅産物。
２個体、ａおよびｂ由来の細胞を調べた；ｂはｐＭｓ５
１． ３３．１，および３３．６でホモ接合性である。
１． ３３．１，および３３．６でホモ接合性である。
０，細胞を含まないコントロール。疑似ＰＣＲ産物を矢
印で示してある。
印で示してある。
第８図
ブラスミドクローンｐ Ｍ ３ ２２８の構造。箱で示
した領域はミニサテライト配列を表す。２つの区別可能
な異なるミニサテライト領域が存在する；ヒトＤＮＡの
厳しい存在下のハイブリダイゼーションで、２２８Ａは
より強くハイブリダイズするバンドを検出し、２２８Ｂ
はより弱いバンドを検出する。
した領域はミニサテライト配列を表す。２つの区別可能
な異なるミニサテライト領域が存在する；ヒトＤＮＡの
厳しい存在下のハイブリダイゼーションで、２２８Ａは
より強くハイブリダイズするバンドを検出し、２２８Ｂ
はより弱いバンドを検出する。
第９図
０．４μｇヒトゲノムＤＮＡを用いて３０サイクルのＰ
ＣＲを行なった後、エチジウムで染色したアガロースゲ
ルでの電気泳動による増幅されたＭ Ｓ ３２ミニサテ
ライトアリルの直接検出。Ｍ＝マーカーＤＮＡ（０．５
μｇ ＤＮＡｘＨｉｎｄＩ［Ｉ＋０．２μｇ ＯＸ
１７４ ＤＮＡＸＨａｅｍ）．個体１はゲルで検出さ
れた４．５ｋｂのアリル、および、はるかに低効率でし
か増幅されずしたがって検出できない、より大きな（７
ｋｂ）に関してはへテロ接合性であった。
ＣＲを行なった後、エチジウムで染色したアガロースゲ
ルでの電気泳動による増幅されたＭ Ｓ ３２ミニサテ
ライトアリルの直接検出。Ｍ＝マーカーＤＮＡ（０．５
μｇ ＤＮＡｘＨｉｎｄＩ［Ｉ＋０．２μｇ ＯＸ
１７４ ＤＮＡＸＨａｅｍ）．個体１はゲルで検出さ
れた４．５ｋｂのアリル、および、はるかに低効率でし
か増幅されずしたがって検出できない、より大きな（７
ｋｂ）に関してはへテロ接合性であった。
個体２は３．７ｋｂおよび４．６ｋｂのアリルに関して
はへテロ接合性であった。どちらも検出可能である。
はへテロ接合性であった。どちらも検出可能である。
増幅されたアリルのサイズは、これらの個体由来のゲノ
ムＤＮＡの通常のサザンプロット解析によって決定され
た予想されたサイズに対応した。
ムＤＮＡの通常のサザンプロット解析によって決定され
た予想されたサイズに対応した。
分解されたミニサテライトアリルの対応する、低分子量
ＰＣＲ産物の複合群がさらに存在することに注意。０＝
ＤＮＡを含ま・ないコントロール。
ＰＣＲ産物の複合群がさらに存在することに注意。０＝
ＤＮＡを含ま・ないコントロール。
第ｌθ図
ＣＥＰＨ個体１０２０２の小さいＭ Ｓ ３２アリルの
ＭｖＲマップ。Ａ．ＥｃｏＲＩで消化してＥｃｏＲＩ部
位で末端標識した後の、ＰＣＲ増幅アリルのＨｉｎｆ
Ｉ （Ｆ）およびＨａｅｍ （Ｈ）部分分解産物。
ＭｖＲマップ。Ａ．ＥｃｏＲＩで消化してＥｃｏＲＩ部
位で末端標識した後の、ＰＣＲ増幅アリルのＨｉｎｆ
Ｉ （Ｆ）およびＨａｅｍ （Ｈ）部分分解産物。
Ｂ，ＣＩａＩ部位で末端標識した同じアリル山来の相補
的パターン。Ｃ．このアリルのＨｉｎｆ ＩおよびＨ
ａｅｍ切断部位のマップ。ＰＣＲプライマーＡおよびＢ
の位置を示す。
的パターン。Ｃ．このアリルのＨｉｎｆ ＩおよびＨ
ａｅｍ切断部位のマップ。ＰＣＲプライマーＡおよびＢ
の位置を示す。
第１１図
ＭＳ３２ミニサテライトアリル中の多様な反復ユニット
の位置をマッピングするための戦略。Ａ．ミニサテライ
ト反復配列（白抜き）およびそれを挟むレトロウイルス
ＬＴＲ相同配列（黒）に対する、ＰＣＲプライマーの相
対的な位置。Ｈｉｎｆ Ｉ（Ｆ） ． Ｈａｅｍ （Ｈ
） ，およびＳａｕ３Ａ（Ｓ）の制限部位も示す。プラ
イマー配列は、Ａ，５’−ＴＣＡＣＣＧＧＴＧＡＡＴＴ
ＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＴ−３’ ；ｆ３．５’−ＡＡ
ＧＣＴＣＴＣＣＡＴＴＴＣＣＡＧＴＴＴＣＴＧＧ−３’
；ｃ．５’−ＣＴＴＣＣＴＣＧＴＴＣＴＣＣＴＣＡ
ＧＣＣＣＴＡＧ−３’ ；Ｄ．５’−ＣＧＡＣＴＣＧ
ＣＡＧＡＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＧＣＣ−３’である。５
′側に伸長したＴＣＡＣＣＧＧＴＧＡＡＴＴＣを持つ誘
導体Ｃ１およびＤ１は、効果的に切断されるＥｃｏＲＩ
部位（下線）を含み、末端標識とマッピングに適した唯
一のＥｃｏＲＩ部位を有するＰＣＲ産物の精製に使用し
た。Ｂ．ＣＥＰＨ個体１０２０８由来の小さなＭ Ｓ
３２アリル上の内部マツピングデータ。このアリルは、
プライマーＣ１とＤ（左）、あるいはＣとＤＩ（右）を
用いてゲノムＤＮＡから増幅し、ＥｃｏＲＩ部位で末端
標識し、Ｈｉｎｆ Ｉ （Ｆ）あるいはＨａｅＩ［［
（Ｈ）で部分消化し、アガロースゲル電気泳動およびオ
ートラジオグラフィーを行なった。このアリル中の、Ｈ
ａｅｍによって切断されたあるいはされなかった内部
ミニサテライト反復配列ユニットの部分は（Ａ）に示す
。
の位置をマッピングするための戦略。Ａ．ミニサテライ
ト反復配列（白抜き）およびそれを挟むレトロウイルス
ＬＴＲ相同配列（黒）に対する、ＰＣＲプライマーの相
対的な位置。Ｈｉｎｆ Ｉ（Ｆ） ． Ｈａｅｍ （Ｈ
） ，およびＳａｕ３Ａ（Ｓ）の制限部位も示す。プラ
イマー配列は、Ａ，５’−ＴＣＡＣＣＧＧＴＧＡＡＴＴ
ＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＴ−３’ ；ｆ３．５’−ＡＡ
ＧＣＴＣＴＣＣＡＴＴＴＣＣＡＧＴＴＴＣＴＧＧ−３’
；ｃ．５’−ＣＴＴＣＣＴＣＧＴＴＣＴＣＣＴＣＡ
ＧＣＣＣＴＡＧ−３’ ；Ｄ．５’−ＣＧＡＣＴＣＧ
ＣＡＧＡＴＧＧＡＧＣＡＡＴＧＧＣＣ−３’である。５
′側に伸長したＴＣＡＣＣＧＧＴＧＡＡＴＴＣを持つ誘
導体Ｃ１およびＤ１は、効果的に切断されるＥｃｏＲＩ
部位（下線）を含み、末端標識とマッピングに適した唯
一のＥｃｏＲＩ部位を有するＰＣＲ産物の精製に使用し
た。Ｂ．ＣＥＰＨ個体１０２０８由来の小さなＭ Ｓ
３２アリル上の内部マツピングデータ。このアリルは、
プライマーＣ１とＤ（左）、あるいはＣとＤＩ（右）を
用いてゲノムＤＮＡから増幅し、ＥｃｏＲＩ部位で末端
標識し、Ｈｉｎｆ Ｉ （Ｆ）あるいはＨａｅＩ［［
（Ｈ）で部分消化し、アガロースゲル電気泳動およびオ
ートラジオグラフィーを行なった。このアリル中の、Ｈ
ａｅｍによって切断されたあるいはされなかった内部
ミニサテライト反復配列ユニットの部分は（Ａ）に示す
。
第１２図
多様な集団から採取し、マップの相同性を示すために並
べたＭ Ｓ ３２アリルのＭＶＲマップ。各アリルは、
各反復ユニットがＨ ａｅｍによって切断されるかＣａ
ｎ Ａ）％あるいは切断されないか（１，Ｔ）によって
記号がつけられている。各アリルは、集団の由来（Ａ．
アーミッシュ；Ｅ．イギリス人；Ｆ．フランス人；Ｍ．
モルモン教徒；Ｖ．ベネズエラ人）および反復ユニット
数とともに、アリルの長さの順に番号（１〜３２）がつ
けられている。
べたＭ Ｓ ３２アリルのＭＶＲマップ。各アリルは、
各反復ユニットがＨ ａｅｍによって切断されるかＣａ
ｎ Ａ）％あるいは切断されないか（１，Ｔ）によって
記号がつけられている。各アリルは、集団の由来（Ａ．
アーミッシュ；Ｅ．イギリス人；Ｆ．フランス人；Ｍ．
モルモン教徒；Ｖ．ベネズエラ人）および反復ユニット
数とともに、アリルの長さの順に番号（１〜３２）がつ
けられている。
ＭＶＲマップ中の高順位タンデム反復は、アリルの下に
一一一一ウで示してある。一つ以上のアリルで共通なＭ
ＶＲマップ領域はアリルの全ての組の組合せのドットマ
トリックス比較によって同定された。ギャップＯは並べ
方を最適化するために導入した。このようにして４つの
共通な５′ハブ口タイプ（１．２Ａ，２Ｂ．３）が同定
された。ハプ口タイプ１（大文字）は２０〜２１反復ユ
ニットにわたる。ハブ口タイプ２Ａ（大文字）は長さに
より可変性がある。ハブ口タイプ２ｂはハブ口タイブ２
Ａの最初の１５反復とそれに続く多様な数のさらなる反
復ユニット（下線を引いた小文字）からなる。短く、暫
定的に同定されたハブ口タイプ３（大文字）は、おもに
ａタイプの反復ユニットを含むアリルと優先的に関連し
ているようである。
一一一一ウで示してある。一つ以上のアリルで共通なＭ
ＶＲマップ領域はアリルの全ての組の組合せのドットマ
トリックス比較によって同定された。ギャップＯは並べ
方を最適化するために導入した。このようにして４つの
共通な５′ハブ口タイプ（１．２Ａ，２Ｂ．３）が同定
された。ハプ口タイプ１（大文字）は２０〜２１反復ユ
ニットにわたる。ハブ口タイプ２Ａ（大文字）は長さに
より可変性がある。ハブ口タイプ２ｂはハブ口タイブ２
Ａの最初の１５反復とそれに続く多様な数のさらなる反
復ユニット（下線を引いた小文字）からなる。短く、暫
定的に同定されたハブ口タイプ３（大文字）は、おもに
ａタイプの反復ユニットを含むアリルと優先的に関連し
ているようである。
３つの残りのアリル“その他”は４つの主要な５′ハブ
口タイプ群に分類可能なアリルと顕著な相同性を示さな
い。同一（３．４）および非常に相同な（２４， ２５
． ２８）アリルは垂直な線で示してある。
口タイプ群に分類可能なアリルと顕著な相同性を示さな
い。同一（３．４）および非常に相同な（２４， ２５
． ２８）アリルは垂直な線で示してある。
第１３図
サイズ分画した精子ＤＮＡ由来の単一分子の変異体Ｍ
Ｓ ３２アリルの増幅。Ａ．単一分子ＰＣＨの信頼性お
よび効率。アリル３１および３２に関してヘテロ接合性
の個体由来の精子ＤＮＡのＳａｕ３ＡとＭｂｏＩ消化産
物の３０ｐｇアリコート（第３図）をＰＣＲプライマー
ＡとＢを用いて２８サイクルの増幅を行なった（第ＩＡ
図）。ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルで電気泳動
を行い、３２Ｐで標識したＭ Ｓ ３２ミニサテライト
プローブを用いてサザンブ口ットハイプリダイゼーショ
ンを行なった。４０の重複ＰＣＲ反応のうち２８が双方
のアリルからのＰＣＲ産物を示した。ポワソン分布から
、各アリルにつき平均５分子加えたものと比較して、平
均１．８回の成功した増幅現象毎アリル毎反応であるこ
とを示唆するものである。従って、加えたＭ Ｓ ３２
分子の３６％がＰＣＲシグナルを与えた。
Ｓ ３２アリルの増幅。Ａ．単一分子ＰＣＨの信頼性お
よび効率。アリル３１および３２に関してヘテロ接合性
の個体由来の精子ＤＮＡのＳａｕ３ＡとＭｂｏＩ消化産
物の３０ｐｇアリコート（第３図）をＰＣＲプライマー
ＡとＢを用いて２８サイクルの増幅を行なった（第ＩＡ
図）。ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルで電気泳動
を行い、３２Ｐで標識したＭ Ｓ ３２ミニサテライト
プローブを用いてサザンブ口ットハイプリダイゼーショ
ンを行なった。４０の重複ＰＣＲ反応のうち２８が双方
のアリルからのＰＣＲ産物を示した。ポワソン分布から
、各アリルにつき平均５分子加えたものと比較して、平
均１．８回の成功した増幅現象毎アリル毎反応であるこ
とを示唆するものである。従って、加えたＭ Ｓ ３２
分子の３６％がＰＣＲシグナルを与えた。
Ｂ．Ｓａｕ３ＡとＭｂｏＩで消化し、ゲル電気泳動によ
ってサイズ分画した精子ＤＮＡからの単一分子増幅。そ
れぞれ０．０３， ０．１５， ０．６． １．２．お
よび１．０μｇ相当の全精子ＤＮＡを含むＳ１〜８５両
分由来の複数のＤＮＡアリコートをＰＣＲプライマーＡ
およびＢを用いて２５サイクル増幅した。
ってサイズ分画した精子ＤＮＡからの単一分子増幅。そ
れぞれ０．０３， ０．１５， ０．６． １．２．お
よび１．０μｇ相当の全精子ＤＮＡを含むＳ１〜８５両
分由来の複数のＤＮＡアリコートをＰＣＲプライマーＡ
およびＢを用いて２５サイクル増幅した。
ＰＣＲ産物はＭ Ｓ ３２ ミニサテライトプローブを
用いてサザンブ口ットハイプリダイゼーションで検出し
た。Ｈ． ａｏｐｇの分画していない精子ＤＮＡ０各両
分のサイズ範囲が示されている。Ｃ．重なりあったＰＣ
Ｒブライマ−０１とＤ（第１１図説明）を用いて２５〜
２８サイクル再増幅し、アガロースゲル電気泳動を行な
ってエチジウムブロマイドで染色した（Ｂ）の変異体ミ
ニサテライト。
用いてサザンブ口ットハイプリダイゼーションで検出し
た。Ｈ． ａｏｐｇの分画していない精子ＤＮＡ０各両
分のサイズ範囲が示されている。Ｃ．重なりあったＰＣ
Ｒブライマ−０１とＤ（第１１図説明）を用いて２５〜
２８サイクル再増幅し、アガロースゲル電気泳動を行な
ってエチジウムブロマイドで染色した（Ｂ）の変異体ミ
ニサテライト。
第１図はＰＣＨによるミニサテライト増幅において使用
されるブ゜ライマーとハイブリダイゼーションプローブ
との位置関係を示す図である。 第２図はＰＣＨによるＭ Ｓ ３２ミニサテライトアリ
ルの増幅を示すオートラジオダラムである。 第３図はアリル長とサイクル当りの収量との関係を示す
グラフである。 第４図は単一細胞相当のヒトＤＮＡからの二つのミニサ
テライトの共増幅を示すオートラジオダラムである。 第５図はＰＣＨによる６つの異なるヒトミニサテライト
の共増幅を示すオートラジオダラムである。 第６図はＰＣＲで同時に６種のミニサテライトを共増幅
することによって作成したＤＮＡフィンガープリントの
多様性を示すグラフである。 第７図は単一のヒト細胞由来のミニサテライトの増幅を
示す図である。 第８図はプラスミドクローンｐ Ｍ ８ ２２ｇの構造
を示す図である。 第９図はアガロースゲルでの電気泳動により増幅された
ＭＳ３２ミニサテライトアリルの直接検出図である。 第ｌθ図はＣＥＰＨ個体１０−２ ０ ２の小さいＭ
Ｓ ３２アリルのＭＶＲマップである。 第１１図はＭＳ３２ミニサテライトアリル中の多様な反
復ユニットの位置をマッピングするための基礎となるデ
ータを示す図である。 第１２図はマップの相同性を示すために並べたＭ Ｓ
＄２アリルのＭＶＲマップを示す図である。 第１３図はサイズ分画した精子ＤＮＡ由来の単一分子の
変異体ＭＳ３２アリルの増幅を示す図である。 ８５９ ｌ＋一 冥入Ｍ８３２ わ−− ４ ＋ Ｊｐ ｈ ４ｈ−＋１本一一〜市千づ
Ｗ中本＋＋＋÷Ｍ品４Ｉ＾４一 Ａ Ｂ ！ 何 ，ｌ． ２２８Ａ ２２８Ｂ ｉｋｂ Ｌ一一一一」 Ｍ Ｑ Ｍ 手 続 補 正 書 １．事件の表示 平成１年特許願第３０７３７８号 ２．発明の名称 伸長されたヌクレオチド配列 ３．補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 名 称 インペリアル・ケミカル・インダストリーズ
・ビーエルシー ４．代理人 住 所 東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手
町ビル ２０６区 ５．補正の対象 タイプ印書により浄書した明細書 適正な図面
されるブ゜ライマーとハイブリダイゼーションプローブ
との位置関係を示す図である。 第２図はＰＣＨによるＭ Ｓ ３２ミニサテライトアリ
ルの増幅を示すオートラジオダラムである。 第３図はアリル長とサイクル当りの収量との関係を示す
グラフである。 第４図は単一細胞相当のヒトＤＮＡからの二つのミニサ
テライトの共増幅を示すオートラジオダラムである。 第５図はＰＣＨによる６つの異なるヒトミニサテライト
の共増幅を示すオートラジオダラムである。 第６図はＰＣＲで同時に６種のミニサテライトを共増幅
することによって作成したＤＮＡフィンガープリントの
多様性を示すグラフである。 第７図は単一のヒト細胞由来のミニサテライトの増幅を
示す図である。 第８図はプラスミドクローンｐ Ｍ ８ ２２ｇの構造
を示す図である。 第９図はアガロースゲルでの電気泳動により増幅された
ＭＳ３２ミニサテライトアリルの直接検出図である。 第ｌθ図はＣＥＰＨ個体１０−２ ０ ２の小さいＭ
Ｓ ３２アリルのＭＶＲマップである。 第１１図はＭＳ３２ミニサテライトアリル中の多様な反
復ユニットの位置をマッピングするための基礎となるデ
ータを示す図である。 第１２図はマップの相同性を示すために並べたＭ Ｓ
＄２アリルのＭＶＲマップを示す図である。 第１３図はサイズ分画した精子ＤＮＡ由来の単一分子の
変異体ＭＳ３２アリルの増幅を示す図である。 ８５９ ｌ＋一 冥入Ｍ８３２ わ−− ４ ＋ Ｊｐ ｈ ４ｈ−＋１本一一〜市千づ
Ｗ中本＋＋＋÷Ｍ品４Ｉ＾４一 Ａ Ｂ ！ 何 ，ｌ． ２２８Ａ ２２８Ｂ ｉｋｂ Ｌ一一一一」 Ｍ Ｑ Ｍ 手 続 補 正 書 １．事件の表示 平成１年特許願第３０７３７８号 ２．発明の名称 伸長されたヌクレオチド配列 ３．補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 名 称 インペリアル・ケミカル・インダストリーズ
・ビーエルシー ４．代理人 住 所 東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手
町ビル ２０６区 ５．補正の対象 タイプ印書により浄書した明細書 適正な図面
Claims (14)
- （１）一つ以上のコントロールに関してゲノムＤＮＡの
テスト試料を解析する方法であって、該方法は少なくと
も一つの含情報座位のミニサテライト配列を、 （ｉ）増幅される各含情報座位に関するプライマーと該
テスト試料をハイブリダイズさせることであって、該プ
ライマーは、該テスト試料の一方の鎖のミニサテライト
配列に相補的で該ミニサテライト配列を補完する該プラ
イマーの伸長産物が合成されるような条件下で増幅され
る含情報座位の該ミニサテライト配列に隣接した領域に
おいて該テスト試料の該一方の鎖とハイブリダイズ可能
であること； （ｉｉ）上記のように形成された伸長産物をそれが合成
された鋳型から分離して一本鎖分子を得ること； （ｉｉｉ）必要であれば、ステップ（ｉｉ）によって得
られた一本鎖分子の少なくとも一つの鋳型からプライマ
ー伸長産物が合成されるような条件下で、ステップ（ｉ
）のプライマーをステップ（ｉｉ）で得られた一本鎖分
子とハイブリダイズさせること；および、 （ｉｖ）増幅産物の検出、およびそれを一つ以上のコン
トロールと比較すること； のステップによって増幅することからなり、目的とする
伸長産物は検出されるのには十分な量生成されるが、相
補的なミニサテライト鋳型鎖間での実質的に予定外のハ
イブリダイゼーションが行なわれるには伸長産物の収量
が不十分であるように行なわれる方法。 - （２）ゲノムＤＮＡのテスト試料が増幅前に制限酵素処
理され、増幅される各含情報座位に関してただ一つのプ
ライマーが用いられる特許請求の範囲第１項記載の方法
。 - （３）（ｉ）増幅される各含情報座位に関して二つのプ
ライマーと該テスト試料をハイブリダイズさせることで
あって、各プライマーは、該テスト試料の各鎖の該ミニ
サテライト配列に相補的で該ミニサテライト配列を補完
する各プライマーの伸長産物が合成されるような条件下
で増幅される含情報座位の該ミニサテライト配列に隣接
する領域において該テスト試料の一本鎖とハイブリダイ
ズすることが可能であり、それによって一つのプライマ
ーから合成された伸長産物がその相補鎖から分離される
ともう一方のプライマーの伸長産物合成のための鋳型と
なることができるものであること；（ｉｉ）上記のよう
に形成された伸長産物をそれが合成された鋳型から分離
し、一本鎖分子を得ること； （ｉｉｉ）必要ならば、ステップ（ｉｉ）によって得ら
れた一本鎖分子の各々の鋳型からプライマー伸長産物が
合成されるような条件下で、ステップ（ｉ）のプライマ
ーとステップ（ｉｉ）によって得られた一本鎖分子をハ
イブリダイズさせること；および、（ｉｖ）増幅産物の
検出および一つ以上のコントロールと比較すること； のステップからなり、 目的の伸長産物は検出されるのには十分な量生成される
が、相補的なミニサテライト鋳型鎖間の実質的に予定外
のハイブリダイゼーションが起こるには伸長産物の収量
が不十分であるように行なわれる特許請求の範囲第１項
記載の方法。 - （４）テスト試料中の含情報座位アリルが１５キロ塩基
対までである特許請求の範囲第１項から第３項までのい
ずれか１項に記載の方法。 - （５）二本鎖ＤＮＡはそのまま残すが一本鎖ＤＮＡを特
異的に消化あるいは分解する少なくとも一つの酵素を使
用し、それによって非特異的な増幅産物の形成を緩和す
ることを含む特許請求の範囲第１項から第４項までのい
ずれか１項に記載の方法。 - （６）増幅をイオン強度の低い緩衝液中でアニーリング
温度を高くして行なってミスプライミングを緩和させる
特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれか１項に
記載の方法。 - （７）二つ以上の含情報座位を同時に増幅させる特許請
求の範囲第１項から第６項までのいずれか１項に記載の
方法。 - （８）ゲノムＤＮＡテスト試料中の一分子の含情報座位
の解析のための特許請求の範囲第１項から第７項までの
いずれか１項に記載の方法。 - （９）ゲノムＤＮＡのテスト試料のミニサテライト配列
に相補的で該ミニサテライト配列を補完する伸長産物の
形成を行なわせるために、含情報座位のミニサテライト
配列に隣接する領域において該ゲノムＤＮＡのテスト試
料の一本鎖とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドで
あって、この場合該含情報座位がＭＳ１、ＭＳ２９、Ｍ
Ｓ３１ＡおよびＭＳ３１Ｂ、ＭＳ３２、ＭＳ４３Ａおよ
びＭＳ４３Ｂ、ＭＳ５１、ＭＳ２２８およびＭＳ２２８
Ｂの中から選択されることを特徴とするポリヌクレオチ
ド。 - （１０）含情報座位のミニサテライト配列に隣接する領
域においてゲノムＤＮＡテスト試料の一本鎖とハイブリ
ダイズ可能なポリヌクレオチドプライマーから調製され
たポリヌクレオチド伸長産物であって、該ポリヌクレオ
チド伸長産物がテスト試料の一本鎖の該ミニサテライト
配列に相補的で該ミニサテライト配列を補完するポリヌ
クレオチド伸長産物。 - （１１）特許請求の範囲第１０項に記載されたポリヌク
レオチド伸長産物の多数の正確なコピーを含む混合物。 - （１２）特許請求の範囲第１項〜第７項のうち一つに記
載された増幅法を少なくとも３サイクル行なった産物を
含む特許請求の範囲第１１項記載の混合物。 - （１３）ゲノムＤＮＡのテスト試料中の少なくとも一つ
の含情報座位のミニサテライト配列を増幅するためのポ
リヌクレオチドプライマーを含むキットであって、該プ
ライマーがテスト試料の一方の鎖のミニサテライト配列
に相補的で該ミニサテライト配列を補完するプライマー
の伸長産物が合成される条件下で増幅される含情報座位
の該ミニサテライト配列に隣接する領域においてテスト
試料の一本鎖とハイブリダイズ可能であり；さらにＤＮ
Ａコントロール試料と使用説明書を含んでいるキット。 - （１４）各含情報座位に関して二つの相補的な隣接ポリ
ヌクレオチドプライマーを含んでいる特許請求の範囲第
１３項記載のキット。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8827544.1 | 1988-11-25 | ||
| GB888827544A GB8827544D0 (en) | 1988-11-25 | 1988-11-25 | Extended nucleotide sequences |
| GB8907653.3 | 1989-04-05 | ||
| GB898907653A GB8907653D0 (en) | 1989-04-05 | 1989-04-05 | Polynucleotides |
| GB898907655A GB8907655D0 (en) | 1989-04-05 | 1989-04-05 | Polynucleotides |
| GB8907655.8 | 1989-04-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02231100A true JPH02231100A (ja) | 1990-09-13 |
Family
ID=27264197
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1307378A Pending JPH02231100A (ja) | 1988-11-25 | 1989-11-27 | 伸長されたヌクレオチド配列 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0370719A3 (ja) |
| JP (1) | JPH02231100A (ja) |
| AU (1) | AU4556589A (ja) |
| CA (1) | CA2003776A1 (ja) |
| DK (1) | DK594089A (ja) |
| FI (1) | FI895627A0 (ja) |
| FR (1) | FR2639651A1 (ja) |
| GB (1) | GB2228086A (ja) |
| NO (1) | NO894687L (ja) |
| PT (1) | PT92404A (ja) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991014003A2 (en) * | 1990-03-09 | 1991-09-19 | Ig Laboratories, Inc. | Characterization and analysis of polymorphic vntr loci |
| US5364759B2 (en) * | 1991-01-31 | 1999-07-20 | Baylor College Medicine | Dna typing with short tandem repeat polymorphisms and identification of polymorphic short tandem repeats |
| GB9108354D0 (en) * | 1991-04-18 | 1991-06-05 | Solicitor For The Affairs Of H | Nucleotide probes |
| US5378602A (en) * | 1991-05-29 | 1995-01-03 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Highly informative microsatellite repeat polymorphic DNA markers twenty-[seven]six |
| US5853989A (en) * | 1991-08-27 | 1998-12-29 | Zeneca Limited | Method of characterisation of genomic DNA |
| GB2259138B (en) * | 1991-08-27 | 1995-08-23 | Ici Plc | Minisatellite variant repeat (MVR-PRC) mapping |
| US6207373B1 (en) | 1998-02-25 | 2001-03-27 | Nanogen, Inc. | Methods for determining nature of repeat units in DNA |
| WO1995012607A1 (en) * | 1993-11-03 | 1995-05-11 | Molecular Tool, Inc. | Single nucleotide polymorphisms and their use in genetic analysis |
| JP3175110B2 (ja) * | 1994-02-07 | 2001-06-11 | オーキッド・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド | リガーゼ／ポリメラーゼ媒体された単一ヌクレオチド多型のジェネティックビットアナリシスおよび遺伝子解析におけるその使用 |
| GB9406534D0 (en) * | 1994-03-31 | 1994-05-25 | Univ Leicester | Y chromosome polymorphic sequences and probes thereto |
| US7138511B1 (en) | 1997-01-28 | 2006-11-21 | The Regents Of The University Of California | Nucleic acids, kits and methods for the diagnosis, prognosis and treatment of glaucoma and related disorders |
| US6171788B1 (en) | 1997-01-28 | 2001-01-09 | The Regents Of The University Of California | Methods for the diagnosis, prognosis and treatment of glaucoma and related disorders |
| US6475724B1 (en) | 1997-01-28 | 2002-11-05 | The Regents Of The University Of California | Nucleic acids, kits, and methods for the diagnosis, prognosis and treatment of glaucoma and related disorders |
| US6143496A (en) | 1997-04-17 | 2000-11-07 | Cytonix Corporation | Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly |
| US20030031675A1 (en) | 2000-06-06 | 2003-02-13 | Mikesell Glen E. | B7-related nucleic acids and polypeptides useful for immunomodulation |
| EP1950305A1 (en) | 2001-05-09 | 2008-07-30 | Monsanto Technology, LLC | Tyr a genes and uses thereof |
| US7329490B2 (en) | 2003-09-15 | 2008-02-12 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for diagnosing schizophrenia by detecting a polymorphism in the KalphaM1 gene |
| AU2008282780B2 (en) | 2007-08-01 | 2014-04-17 | Dana- Farber Cancer Institute | Enrichment of a target sequence |
| DE102009033368B4 (de) * | 2009-07-16 | 2023-01-26 | Bruker Daltonics GmbH & Co. KG | Massenspektrometrische Sepsisdiagnose |
| US8623603B2 (en) | 2010-03-08 | 2014-01-07 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Full cold-PCR enrichment with reference blocking sequence |
| US20130316358A1 (en) | 2011-01-31 | 2013-11-28 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods of diagnosing disease using overlap extension pcr |
| EP3333269B1 (en) | 2011-03-31 | 2021-05-05 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods to enable multiplex cold-pcr |
| US9133490B2 (en) | 2012-05-16 | 2015-09-15 | Transgenomic, Inc. | Step-up method for COLD-PCR enrichment |
| WO2018111835A1 (en) | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for molecular barcoding of dna molecules prior to mutation enrichment and/or mutation detection |
| WO2019023243A1 (en) | 2017-07-24 | 2019-01-31 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING AND AMPLIFYING DNA TARGETS IN A SINGLE REACTION MIXTURE |
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|---|---|---|---|---|
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| CA1284931C (en) * | 1986-03-13 | 1991-06-18 | Henry A. Erlich | Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids |
| GB8606719D0 (en) * | 1986-03-19 | 1986-04-23 | Lister Preventive Med | Genetic probes |
| GB8716367D0 (en) * | 1987-07-10 | 1987-08-19 | Reeders S T | Genetic identification |
| WO1989010414A1 (en) * | 1988-04-28 | 1989-11-02 | Robert Bruce Wallace | AMPLIFIED SEQUENCE POLYMORPHISMS (ASPs) |
-
1989
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- 1989-11-20 EP EP19890311982 patent/EP0370719A3/en not_active Withdrawn
- 1989-11-24 FI FI895627A patent/FI895627A0/fi not_active Application Discontinuation
- 1989-11-24 CA CA002003776A patent/CA2003776A1/en not_active Abandoned
- 1989-11-24 PT PT92404A patent/PT92404A/pt not_active Application Discontinuation
- 1989-11-24 NO NO89894687A patent/NO894687L/no unknown
- 1989-11-24 DK DK594089A patent/DK594089A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-11-24 AU AU45565/89A patent/AU4556589A/en not_active Abandoned
- 1989-11-24 FR FR8915504A patent/FR2639651A1/fr active Pending
- 1989-11-27 JP JP1307378A patent/JPH02231100A/ja active Pending
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| EP0370719A3 (en) | 1991-10-09 |
| CA2003776A1 (en) | 1990-05-25 |
| PT92404A (pt) | 1990-05-31 |
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