PT92404A - Processo para a caracterizacao de adn genomico e para a preparacao de polinucleotidos uteis para essa caracterizacao - Google Patents

Description

Descrição referente à patente de invenção de IMPERIAL CHEMICAL IN DUSTRIES PLC, britânica, industrial e comercial, com sede em Imperial Chemical House, Mill-bank, London SW1P 3JF, Inglaterra, (inventor: Alec John Jeffreys, residente na Inglaterra), para "PROCESSO PARA A CARACTERIZAÇÃO DE ADN GENÕMICO E PARA A PREPARAÇÃO DE POLINUCLEÕTIDOS PTEIS PARA ESSA CARACTERIZAÇÃO".

DESCRIÇÃO A presente invenção refere-se em geral a um processo para a caracterização de uma amostra de ADN genõmico e a sequências nucleotídicas utilizadas nesse processo. Em parti cular a presente invenção inclui a utilização de sequências nucleotídicas que compreendem oligonucleótidos capazes de hibrida-ção com regiões adjacentes a locais genéticos informativos. O processo da presente invenção pode por exemplo ser usado em disputas de paternidade, em medicina forense ou na prevenção, no diagnóstico ou no tratamento de afecções ou de predisposições ge néticas. O processo é especialmente útil quando está presente na amostra de ADN uma quantidade muito reduzida do local informativo, até uma única molécula. São conhecidos na técnica da especialida de métodos de caracterização genética. Na Patente do Reino Unido ηδ. 2166445 (Lister Institute) são descritas várias sequências 1

de ADN que podem ser usadas como sondas para se hibridarem simul^ taneamente com vários sítios polimórficos num genoma animal, por exemplo humano, ou vegetal possibilitando a produção de uma "impressão digital de ADN" composta por bandas de ADN marcado de di ferentes pesos moleculares. A impressão digital de ADN no seu conjunto é característica do indivíduo em questão e a origem das diferentes bandas pode ser seguida através dos antepassados do indivíduo e pode em certos casos ser considerada como associada a certas perturbações genéticas. No pedido de Patente Europeia com o número de publicação 238329 descrevem-se várias sequências de ADN que podem ser utilizadas como sondas para hibridar indivi dualmente em sítios individuais polimórficos no genoma animal, por exemplo humano. Descrevem-se também métodos de caracterização genética que usam uma ou várias destas sondas.

As regiões mini-satélites repetitivas em série em ADN de vertebrados apresentam frequentemente altos níveis de variabilidade alélica no número de unidades repetidas [1 a 4]. Foram desenvolvidas sondas de hibridação capazes de de-tectar mini-satélites múltiplos e de produzir impressões digitais de ADN específicas em relação a um indivíduo [5 a 7] e foram clonadas mini-satélites humanos que proporcionam sondas espe cíficas em relação a um local para locais hipervariãveis individuais [5 e 8 a lo]. Estes marcadores genéticos altamente informa tivos encontraram uma ampla aplicação em muitas áreas da genética, incluindo a análise de ligações [9 e 11 a 13], a determinação de parentesco por exemplo em disputas de paternidade e de imigração [6, 10 14 e 15], a determinação de compatibilidade em transplantações de medula óssea [16 e 17] e para identificação individual em medicina forense [10, 18 e 19] . As aplicações a ti^ pificação de amostras forenses como sejam de manchas de sangue e de sémen ou de raízes de cabelo são no entanto limitadas pela sensibilidade das sondas de hibridação, as quais necessitam de pelo menos 50 ng de ADN humano relativamente não degradado para tipificação com sondas mini-satélites específicas em relação a um local [10] e de 0,01 g de ADN para a análise com sondas de im pressão digital de ADN multilocal [6]. , Quando se pode dispor de uma quantidade suficiente de ADN na amostra a analisar os processos descritos 2

proporcionam formas valiosas e seguras de caracterização genética. No entanto a eficiência das técnicas anteriores é limitada, por exemplo em aplicações forenses onde frequentemente apenas se dispõe de um pequeno número de cópias da molécula de ADN a anali sar.

Por conseguinte é desejável dispor de ou tro método de caracterização genética que seja especialmente ade quado a pequenas amostras de ADN genõmico. K. Kleppe et al., em J. Mo. Biol. (1971), 56, 341-361, descrevem um método para a amplificação da sequência de ADN pretendida. 0 método envolve a desnaturação de um ADN duplex para formar cadeias simples. A fase de desnaturação é levada a efeito na presença de um excesso suficientemente grande de dois iniciadores de ácido nucleico que hibridam com regiões adjacentes da sequência de ADN pretendida. Por arrefecimento ob-têm-se duas estruturas, cada uma das quais contendo o comprimento integral da cadeia de molde complexada de modo apropriado com o iniciador. Adicionam-se polimerase de ADN e uma quantidade suficiente de cada um dos trifosfatos de nucleósido, obtendo-se deste modo duas moléculas do duplex original. Repete-se o ciclo anterior de desnaturação, adição de iniciador e extensão até se obter o número de cópias apropriado da sequência de ADN pretendi da. Indica-se que pode ser necessário um ajustamento da concentração dos iniciadores. 0 método anterior será na presente memória descritiva designado seguidamente como reacção de cadeia de polimrase (RCP), conforme reivindicado nas Patentes dos Estados Unidos nQs. 4683195 e 4683202, nas quais a amplificação de uma dada sequência de ácidos nucleicos num molde é efectuada por extensão de um iniciador de ácido nucleico na presença de polímera se Taq. ou do fragmento de Klenow de polimerase de ADN I de E. coli.. O procedimento de amplificação é geralmente repetido até cerca de 50 ciclos. Os exemplos apresentados apenas se referem a sequências de ADN curtas, geralmente de poucas centenas de pares de bases. A amplificação enzimática de ADN pela re . acção de cadeia de polimerase (RCP, [20]) permite analisar quan-m_ tidades de ADN humano muito menores. A notável especificidade da 3

polimerase Taq termoestãvel simplificou muito a RCP [21] e possi bilitou que a tipificação de algumas classes de polimorfismo de ADN humano fosse estendida â raiz de um único cabelo [22] e mesmo a uma única célula somática ou de esperma [23]. Na maioria dos trabalhos até à data a RCP tem sido utilizada para amplificar regiões curtas de ADN humano, normalmente com o comprimento de poucas centenas de pares de bases [21 a 23]. É possível detec tar polimorfismos de substituição de bases por hibridação dos produtos da RCP com oligonucleétidos específicos para um alelo [22 e 23], por análise de sequência de ADN dos produtos de RCP [24], ou, se a substituição de bases afecta um sítio de restrição, por cisão dos produtos da RCP com uma endonuclease de restrição [25]. É possível do mesmo modo analisar polimorfismos de supressão/inserção por dimensionamento dos produtos da RCP por electoforese em gel [22]. Na sua maioria estes sistemas de marca ção são, no entanto, dimõrficos e a sua utilidade por exemplo em medicina forense é limitada pela sua relativamente baixa variabi lidade em populações humanas.

Conforme explicado acima, a RCP tem sido restrita â amplificação de sequências de ADN relativamente curtas e há sérias dúvidas sobre se a RCP pode ser usada com êxito em relação a sequências longas de ADN especialmente se é necessã ria a reprodução fiel destas sequências. De facto foi estabeleci do que o limite absoluto para a RCP é de 2 kb [21]. Outras dificuldades resultam, no entanto, quando a amostra de ADN contém se quências repetitivas, por exemplo repetições em série de um núcleo particular ou uma sequência de consenso como as que se encontram em locais hipervariãveis altamente informativos.

Deste modo é possível prever que ocorrerá hibridação entre os produtos da amplificação resultando deste modo a formação duma rede e a terminação prematura da reacção de RCP num sítio temperado. Estes produtos de RCP incompleta podem então actuar, por meio de têmpera sem correspondência com a cadeia de mini-satélites complementar, como substrato para .o prolongamento no ciclo seguinte de amplificação. Deste modo resulta a geração de produtos espúrios de amplificação múltiplos. A apli [ cação de RCP à amplificação de mini-satélites, particularmente ^ de alelos longos de mini-satélites que contêm muitas unidades re 4

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petidas, deve portanto envolver com toda a probabilidade uma per da da fidelidade da sequência e dar como resultado um grande número de produtos de amplificação, com a consequência de que este processo não é significativo nem reflete de modo preciso os ale-los mini-satélites no ADN genõmico de partida. E. Boerwinkle e L.Chan (1988), por sua vez, num resumo de uma comunicação apresentada no 398 encontro anual da American Society of Human Genetics em Nova Orleães (Outubro de 1988) [Resumo (0548) 12.5], referem-se à utilização de RCP em locais hipervariãveis repetidos em série, mas a dimensão da região visada que estes autores empregam era relativamente pe quena, sendo sempre menor do que 1 kilobase de comprimento. Para além disso estes autores não descrevem o modo como a técnica de RCP foi aplicada para conseguir a reprodução fiel de sequências e a produção de um resultado significativo e preciso. S. Odel-berg et al. numa apresentação â American Academy of Forensic Sei ence (Fevereiro de 1988) descreveram, por outro lado, a aplicação sem êxito de RCP a mini-satélites maiores e os seus resultados confirmam as dificuldades previstas anteriormente discutidas uma vez que estes autores não conseguiram usar RCP para obter qualquer resultado significativo ou útil tendo em vista a multiplicidade de produtos de amplificação detectados. A presente invenção baseia-se na verificação de que é possível amplificar fielmente muitas vezes uma quantidade tão pequena como uma única molécula de um local genético informativo numa amostra de ADN genómico de modo a obter produtos de amplificação que são úteis para fins de caracterização genética efectuando a amplificação dentro de uma janela def^ nida de tal modo que se gera uma quantidade do produto de extensão pretendido suficiente para ser detectável mas que o rendimen to do produto de extensão não é adequado para permitir uma hibri. dação sem correspondência substancial entre cadeias de molde repetidas em série complementares.

De acordo com um aspecto da presente invenção proporciona-se um processo de caracterização de uma amostra a analisar de ADN genómico com referência a uma ou a várias [ amostras de comparação caracterizado por compreender as fases de ^ amplificar a sequência mini-satélite em pelo menos um local in- 5

formativo na amostra a analisar por (i) hibridação da amostra a analisar com um iniciador com respeito a cada local informativo a ser amplificado, sendo o iniciador hibridável com uma cadeia simples da amostra a analisar numa região que ladeia a sequência mini-satélite do local informativo a ser amplificado sob condições tais que é sintetizado um produto de prolongamento do iniciador que é complementar da referida sequência mini-satélite da cadeia da amostra a analisar e transpõe esta sequência; (ii) separação do produto, do prolongamento formado do modo indi cado a partir do molde no qual foi sintetizado a fim de dar origem a moléculas de cadeia simples; (iii) se necessário, hibridação do iniciador da fase (i) com moléculas de cadeia simples obtidas de acordo com a fase (ii) sob condições tais que é sintetizado um produto de prolongamento do iniciador a partir do molde de pelo menos uma das moléculas de cadeia simples obtidas de acordo com a fase (ii), e (iv) detecção dos produtos de amplificação e comparação destes produtos com uma ou com várias amostras de comparação; sendo este processo efectuado de tal modo que se gera uma quanti dade do produto de prolongamento pretendido suficiente para ser detectado mas tal que o rendimento do produto de prolongamento não é adequado para permitir hibridação sem correspondência entre as cadeias complementares do molde mini-satélite.

Deverá notar-se que o ciclo de hibridação do iniciador com pelo menos uma das moléculas de cadeia simples obtidas pela separação do produto do prolongamento formado a partir do molde no qual foi sintetizado seguida de síntese adi cional do produto de prolongamento pode ser repetido tão poucas ou tantas vezes quanto se queira a fim de gerar, por um lado, su ficiente produto de prolongamento para ser detectável e, por outro lado, a fim de gerar uma quantidade do produto de prolongamento inadequada para permitir uma hibridação sem correspondência substancial entre as cadeias complementares do molde do mini -satélite. ] Quando o método da presente invenção é • levado a efeito usando um iniciador relativo a cada local infor- 6 6

mativo pode ser vantajoso submeter a amostra a analisar de ADN genómico a restrição antes da amplificação. A este respeito, quando se usa apenas um iniciador relativo a um local informativo, é provável a formação de produtos de prolongamento de compri mentos variados. Por exemplo é possível formar uma série de produtos com a mesma extremidade terminal 51 mas com extremidades terminais 3' diferentes. Pode ser obtido um perfil mais limpo se a amostra a analisar de ADN genómico for submetida a restrição antes da amplificação. Quando se efectua a restrição, pode ser utilizada qualquer endonuclease de restrição apropriada. Uma vez que a sequência de flanco do local informativo relevante será co nhecida e que a sequência de reconhecimento de enzimas de restri ção conhecidas é também conhecida, o especialista na matéria nãc encontrará dificuldade em seleccionar uma enzima de restrição apropriada para utilização. Quando se usa apenas um iniciador re lativo a cada local informativo será obtida uma amplificação arit mética, mas quando se empregam dois destes iniciadores pode ser obtida uma amplificação exponencial. 0 processo da presente invenção é portanto efectuado de preferência usando dois iniciadores relativos a cada um dos locais informativos a ser amplificados.

Deste modo, de acordo com um outro aspec to da presente invenção, proporciona-se um processo para a carac terização de uma amostra a analisar de ADN genómico com referência a uma ou várias amostras de comparação caracterizado por con preender uma fase de amplificação de uma sequência mini-satélite em pelo menos um local informativo na amostra a analisar por (i) hibridação da amostra a analisar com dois iniciadores com respeito a cada local informativo a ser amplificado, sendo cada iniciador hibridãvel com cadeias simples da amostra a analisar numa região que ladeia a sequência mini-satéli-te do local informativo a ser amplificado sob condições tais que é sintetizado um produto de prolongamento de cada iniciador que é complementar da referida sequência mini-sa télite de cada cadeia da amostra a analisar e transpõe esta sequência, podendo o produto de prolongamento sintetiza do a partir dum iniciador servir de molde para a síntese do produto de prolongamento do outro iniciador; 7

(ii) separação do produto do prolongamento formado do modo indi cado a partir do molde no qual foi sintetizado a fim de dar origem a moléculas de cadeia simples; (iii) se necessário, hibridação do iniciador da fase (i) com moléculas de cadeia simples obtidas de acordo com a fase (ii sob condições tais que é sintetizado um produto de prolongamento do iniciador a partir do molde de cada uma das moléculas de cadeia simples obtidas de acordo com a fase (ii); e (iv) detecção dos produtos de amplificação e comparação destes produtos com uma ou várias amostras de comparação; sendo este processo efectuado de tal modo que se gera uma quanti dade do produto de prolongamento pretendido suficiente para ser detectado mas tal que o rendimento do produto de prolongamento não é adequado para permitir hibridação sem correspondência entre as cadeias complementares do molde mini-satélite.

Conforme especificado anteriormente, deverá notar-se que o ciclo de hibridação do iniciador com cada uma das moléculas de cadeia simples obtidas por separação do pro duto de prolongamento formado a partir do molde em que foi sinte tizado seguida da síntese adicional do produto de prolongamento pode ser repetido tantas vezes ou tão poucas quanto se queira a fim de gerar, por um lado, suficiente produto de prolongamento para ser detectável e, por outro lado, a fim de gerar uma quanti dade do produto de prolongamento inadequada para permitir uma hi bridação substancial sem correspondência entre as cadeias comple mentares do molde do mini-satélite.

Um local informativo inclui regiões de ADN genõmico por referência às quais ê possível distinguir uns indivíduos dos outros. Os locais hipervariáveis, de que pode haver mais de 1000 no genoma humano, podem ser úteis como locais informativos. O poder de distinção dum local genético informativo é frequentemente referido em termos de variação alêlica ou de polimorfismo. Geralmente, quanto maior for o grau de variação alélica ou de polimorfismo entre indivíduos, maior será o poder de distinção do local em questão. Como guia conveniente, os Ιοί cais genéticos incluem os em que é possível distinguir pelo me-• nos 3 alelos diferentes em qualquer amostra de 100 indivíduos 8 não relacionados entre si escolhidos ao acaso. Deverá notar-se que o temo indivíduo foi usado acima para fererir não apenas se res humanos mas também outros animais bem como plantas e as linhas de células derivadas desses seres humanos, animais ou plantas. Em cada caso, no entanto, a amostra de indivíduos não relacionados entre si escolhidos ao acaso será constituída por indivíduos todos da mesma espécie.

Com respeito às aplicações humanas da presente invenção, a expressão "local genético informativo" usado na presente memória descritiva pode ser definido em alternati_ va como um local em que é possível distinguir pelo menos 3 ale-los diferentes em ADN extraído que uma linha de células qualquer seleccionada de entre as seguintes que foram depositadas na American Type Culture Collection (ATCC):-

Linha de células Depósito ATCC NQ He la CCL2 RPMI 2650 CCL 30 Detrit 532 CCL 54 Detroit 525 CCL 65 Detroit 529 CCL 66 Detroit 510 CCL 72 WI - 38 CCL 75 Citrullinemia CCL 76 EB - 3 CCL 85 RAJI CCL 83 JIYOYE (P-2003) CCL 87 WI - 26 CCL 95 Detroit 551 CCL 110 RPMI 6666 CCL 113 RPMI 7666 CCL 114 CCRF-CEM CCL 119 CCRF-SB CCL 120 HT-1080 CCL 121 HG 261 CCL 122 CHP3 (M.W.) CCL 132 LL47 (MaDo) CCL 135 - 9 - >

Linha de células HEL 299 LL 24 HFLI WI-1003 MRC-5 IMR-90 LS 174T LL 86(LeSa) LL 97A (AIMy) HLF-a

CCD-13LU

CCD-8LU CCD-llLu CCD-14Br

CCD-16LU

CCD-18LU

CCD-19LU

Hs888Lu MRC-9

Daudi

CCD-25LU SW403

NAMALWA

Depósito ATCC NQ. CCL 137 CCL 151 CCL 153 CCL 154 CCL 171 CCL 186 CCL 188 CCL 190 CCL 191 CCL 199 CCL 200 CCL 201 CCL 202 CCL 203 CCL 204 CCL 205 CCL 210 CCL 21 CCL 212 CCL 213 CCL 215 CCL 230 CRL 1432

Todas as linhas de células acima mencionadas estão livremente disponíveis na ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-1776, EUA, e estão incluídas no catálo go da ATCC de linhas de células e de hibridomas. Todas as linhas de células acima mencionadas estavam depositadas na ATCC antes de 1985.

Os locais informativos convenientes para utilização na presente invenção incluem os locais com os quais as sequências nucleotídicas e as sondas descritas no pedido de Patente Europeia nQ. 238329 são capazes de hibridação, bem como os locais informativos cujas sequências de flanco são descritas neste pedido. Outros locais informativos incluem as regiões de 10

ADN genõmico identificadas por sondas de mini-satélites descritas por S. J. Gendler et ai. em PNAS, £4, (1987), páginas 6060--6064. Um local informativo de interesse especial é a HVR alfa globina 5' descrita pelo American Journal of Human Genetics, 1988, 43, páginas 249-256.

Os locais informativos convenientes para utilização na presente invenção incluem os locais que têm um máximo de 15 quilobases. Outros locais informativos convenientes incluem os que proporcionam alelos curtos, sendo o limite superior por exemplo menos de 10 quilobases, especialmente os de menos de 8 e de modo muito especial os de menos de 6 quilobases.

De modo conveniente os alelos são pelo menos de 1 quilobase, especialmente pelo menos de 1,5 e de modo muito especial de pelo menos 2 quilobases. Deste modo constituem gamas adequadas 1; 1,5; 2; 2,5 ou 3 a 6; 7; 8; 9 ou 10 quilobases. Com respeito aos resultados obtidos com o processo da presente invenção quando se começa apenas com uma única molécula de ADN na amostra, é preferível que o comprimento dos alelos não exceda 6 quilobases. São também preferidos os locais informativos com uma gama restrita de comprimentos dos alelos. Observou-se que estas preferências nem sempre são compatíveis com locais altamente informativos uma vez que estes estão habitualmente associados com numerosas unida des repetidas de mini-satélites e de alelos longos. O especialijs ta na matéria não terá, no entanto, dificuldade em seleccionar locais convenientes para os seus fins. São necessários iniciadores capazes de hibridação com regiões de ADN da amostra de flanco de locais informativos a fim de proporcionar pontos para o início da síntese de produtos de prolongamento ao longo de locais genéticos informativos. Estes iniciadores são geralmente oligonucleótidos e são de preferência de cadeia simples para uma máxima eficiência da amplificação, mas em alternativa podem ser de cadeia dupla. Se for de cadeia dupla, o iniciador é em primeiro lugar tratado a fim de separar as duas cadeias antes de ser usado para preparar os polinucleõtidos de prolongamento. Os iniciadores devem ser su ficientemente compridos para promover o início da síntese de po-) linucleótidos de prolongamento. O comprimento exacto destes ini-• ciadores dependerá de muitos factores incluindo a temperatura e 11

a natureza do iniciador. Geralmente um iniciador compreenderá pe lo menos sete nucleõtidos, como por exemplo 15 a 25 nucleótidos como seja por exemplo 20 a 25 nucleótidos. Deverá notar-se que não é necessário que a sequência de flanco reflita a sequência exacta da região de flanco do local informativo. Ê apenas necessário que a respectiva sequência seja homóloga num grau que permita a hibridação. O produto de prolongamento obtido deste modo deve também ser capaz de actuar como um molde para hibridação adicional com um iniciador. Não se pensa que o comprimento máximo de qualquer iniciador seja crítico e é apenas limitado por considerações práticas.

Normalmente o ADN da amostra a analisar será de dupla cadeia e é por conseguinte conveniente seleccionar iniciadores que hibridam com diferentes cadeias do ADN da amostra e em posições relativas ao longo da sequência tais que um produto de prolongamento sintetizado a partir de um iniciador po de actuar como um molde para a extensão do outro iniciador para dar um ácido nucleico de um comprimento definido.

As regiões de flanco de certas regiões genéticas informativas identificadas pelas sondas descritas na Patente UK Nõ. 2166445 e no pedido de Patente europeia nQ. 238329 acima referidas e as sequências nucleõtídicas que hibridam com estas não tinham sido anteriormente descritas e tanto individuaJL mente como em qualquer combinação representam aspectos adicionais da presente invenção. As sequências são apresentadas nas pá ginas que precedem os exemplos. As regiões genéticas informativas encontram-se indicadas em algumas sequências pela palavra MINISATÉLITE. Conforme explicado acima, pode ser usada como iniciador qualquer sequência conveniente. Sublinharam-se exemplos de algumas sequências de iniciadores convenientes. Com o objecti vo de clareza e de brevidade, apenas se representou em algumas sequências a unidade de repetição mais exterior de cada lado de cada conjunto sequencial em série de mini-satélites (em letras maiusculas), separada por uma série de xx para indicar a omissão da maior parte das repetições. Uma vez que raramente existe um número inteiro de unidades de repetição em cada conjunto sequen-\ ciai, estas repetições mais exteriores podem estar fora de con-• cordância umas em relação às outras, mas conservam a relação cor 12

Encontrou-se uma região de repetição em série antes insuspeitada ao sequenciar o vector pMS31 (EP--238329); este conjunto sequencial está separado do mini-sateli-te maior por 10 bases e é constituído por mais de 7 repetições de uma sequência de 19 pb rica em G/C que se prolonga até ao sítio Sau3AI definindo a extremidade do clone. Esta região, designada 31B, é rica em G na cadeia oposta à cadeia rica em G do mini-satélite maior. Por mapeamento genómico verifica-se que a região 31B tem uma contribuição mínima, se é que tem alguma, para a variação de comprimento neste local (dados não apresentados).

Detectaram-se dois locais por pMS228 (Ar mour et al., 1989, NAR, Γ7, 13, 4925-4935) em condições muito críticas. Por análise de famílias verificou-se que estes locais estão intimamente ligados. Por mapeamento de restrição do ADN clonado, subsequentemente confirmado por análise de sequência, demonstrou-se a presença de duas regiões de repetição em série distintas, designadas por 228A e 228B (Figura 8). Sondando novamente o ADN humano com subclones de pMS228 verificou-se que a re gião 228A detectava o local de hibridação mais intensa e maior e que a região 228B detectava os alelos mais pequenos e de hibrida ção mais fraca. Estes mini-satélites foram localizados usando cé lulas somáticas e hibridação in situ para 17pl3-pter. As proprie dades dos locais detectados por pMS51 e pMS228 e por outros minjL -satélites encontram-se resumidas no Quadro 2.

Os dados das sequências confirmaram a nossa verificação anterior da disposição de um par de mini-satélites em pMS43 descrita no nosso pedido de Patente UK 8813781.5 e elucidaram-se dois novos exemplos (pMS31 e pMS228) de clones de mini-satélites que contêm dois conjuntos sequenciais adjacentes. Ao contrário de pMS43, em que o local 'menor' 43B possui uma baixa heterozigocidade (30%), os dois mini-satélites em pMS228 possuem heterozigocidades superiores a 80%. O mini-satéli te 228B (figura 8, Quadro 2) combina uma alta heterozigocidade (85%) com uma gama de dimensões de alelos limitada (0,6 a 5,5 kb); esta combinação torna este local muito útil para a análise ’ de mini-satélites pela reacção de cadeia de polimerase [23]. Em geral os locais mais variáveis possuem uma ampla gama de dimen- 13

sões de alelos de tal modo que muitos alelos ultrapassam a dimen são máxima normalmente amplificãvel por este método, dando assim um perfil incompleto. No local detectado por 228B, pelo contrário, um estudo de 48 indivíduos não relacionados mostrou que 95% dos alelos eram inferiores a 2 kb e que o maior (5,5 kb) estava bem dentro da gama amplificável (J. Armour e A. Jeffreys, resultados não publicados) . Nós mostrámos que mesmo o alelo maior nes^ te local pode ser amplificado, proporcionando um perfil da amplificação num único local completo e mesmo assim informativo de mo do útil.

Foi isolado um novo mini-satélite clona-do denominado MS29 que habitualmente detecta dois locais variáveis no ADN humano. Um local, localizado na região terminal do ramo mais curto do cromossoma humano número 6, encontra-se também presente nos grandes símios. 0 segundo local de mini-satélite está localizado intersticialmente no cromossoma 16pll e está ausente tanto nos primatas não humanos como em alguns seres huma nos. 0 mini-satélite MS29 foi isolado a partir de um banco genó-mico L47 obtido a partir de ADN enriquecido de sequências de mini-satélites conforme já descrito na literatura (Wong et al.,

Ann. Hum. Genet. (1987) 51, 260-288. O mini-satélite MS29 contém uma sequência repetida de 39 pb. Esta sequência ê constituída por 13 repetições divergidas do trinucleõtido YAG em que Y repre senta um nucleótido qualquer A, G, C ou T. As sequências de flan co deste mini-satélite podem ser elucidadas usando técnicas de sequenciação conhecidas em si.

Em resumo, as novas sequências de flanco são as de MSI, MS29, MS31A e MS31B, MS32, MS43A e MS43B, MS51, MS228A e MS228B, Para além disso proporcionamos agora também mais informação sobre novas sequências de flanco para a sonda de mini-satélite p g3 (Wong et al., Nucleic Acids Research, 1£, 11, (1986), 4605-4616), bem como para as sondas 33.1, 33.4 e 33.6 (Patente UK 2166445/The Lister Institute of Preventive Medicine).

Um grupo de especial interesse de sequên cias de flanco é o das sondas de mini-satélites MSI, MS29, MS31A, e MS31B, MS32, MS43A e MS43B, MS51, MS228A e MS228B.

Outros grupos de especial interesse de • sequências de flanco são constituídos pelas sequências de qual- 14 ΡΜΚ·**Κΰ

quer das sondas de mini-satélites anteriores.

Conforme especificado anteriormente, os mini-satélites MS29 e MS31B são novos e as sequências de repetição e/ou as sequências de flanco de qualquer destes mini-satélites representam outros aspectos particulares da presente invenção. 0 processo da presente invenção pode ser usado com respeito a qualquer local informativo conveniente. De£ te modo, por exemplo, é possível preparar iniciadores para hibri dação para as sequências de flanco da região 51 hipervariável do gene da insulina humana (Am. J. Hum. Genet., 1986, ^39, 291-229), da HVR da globina alfa 5' (Am. J. Hum. Genet., 1988 43, 249-256), da HVR da globina alfa 3' (EMBOJ, 1986, _5, 1957-1863), da região hipervariável no local da globina zeta (PNAS, 1983, 80^, 5022--5026), ou do local Ha Ras (Nature, 1983, 302, 33-37). Também se considera incorporado por referência na presente especificação um painel de sondas proposto por Ray White. As sequências de flanco destas podem ser elucidadas usando técnicas conhecidas.

Os polinucleótidos de flanco prolongados preparados de acordo com o processo da presente invenção representam um aspecto adicional da invenção. Estes polinucleótidos podem estar presentes em cópias únicas ou múltiplas. Quando estão presentes cópias múltiplas estas são cópias fiéis e de prefe rência isentas de reticulação ou de ligações cruzadas entre cadeias individuais. Pelo termo fiel pretendemos significar que a informação de caracterização genética a ser obtida a partir da dimensão e da composição da cópia é essencialmente a mesma para todas as cópias. De modo conveniente os iniciadores de prolongamento contêm uma sequência idêntica ou complementar de um local genético informativo de mais de 1 quilobase. Outros valores convenientes incluem 1,5 e 2 quilobases. De modo conveniente o núme ro de cópias representa o produto de pelo menos 3, 5, 7, 9, 13 ou 15 ciclos do método de amplificação da presente invenção.

De acordo com ainda outro aspecto da pre sente invenção proporciona-se uma mistura que contém múltiplas cópias fiéis de iniciadores prolongados (como definidos anterior . mente). Como anteriormente a mistura é substancialmente isenta de reticulação ou de ligações cruzadas entre cadeias individuais, 15

Os iniciadores para utilização na presen te invenção devem ser preparados por métodos análogos aos conhecidos na especialidade. Por exemplo quando é conhecida uma sequência de flanco dada, é possível preparar um iniciador nucleótí-dico conveniente por síntese directa. Também podem ser usadas técnicas de clonagem a fim de reproduzir fragmentos de ADN que contêm sequências de flanco de locais genéticos informativos.

Em alternativa, é possível identificar fragmentos de ADN que contêm locais genéticos informativos e, usando um procedimento análogo ao dos métodos descritos acima, é possível prolongar uma sequência nucleótidica hibridável com o local genético informativo. 0 produto obtido deste modo pode em seguida ser modificado directamente, por exemplo por cisão, a fim de preparar um iniciador conveniente ou a sua sequência pode ser determinada e é possível em seguida preparar iniciadores con venientes por síntese directa.

Conforme explicado acima, o ADN da amostra é geralmente de dupla cadeia. Por conseguinte é desejável se parar as cadeias do ácido nucleico antes de que possa actuar como um molde para prolongamento de um iniciador. A separação das cadeias pode ser levada a efeito por qualquer método adequado in cluindo meios físicos, químicos ou enzimáticos. Usa-se de modo conveniente desnaturação pelo calor a fim de conseguir até 99% de desnaturação. As temperaturas normais incluem de 85 a 105QC durante períodos desde cerca de 1 a cerca de 10 minutos.

De preferência usa-se um iniciador para cada uma das cadeias do ADN da amostra. Em relação ao ADN de dupla cadeia usam-se portanto normalmente dois iniciadores. Geralmente os iniciadores são usados a fim de permitir que o prolonga mento prossiga ao longo do local informativo na mesma direcção ao longo das duas cadeias, isto é de 51 para 3" ou vice-versa.

De preferência a extensão prossegue de 5' para 3'.

Os iniciadores são de forma conveniente hibridados com a amostra de ADN genõmico sob condições conhecidas. Geralmente esta reacção tem lugar numa solução aquosa tampo nizada, de preferência a um pH de 7 a 9. De preferência está pre | sente um grande excesso de iniciador na mistura reaccional. Deve rá notar-se que em certas aplicações de diagnóstico a quantidade 16

de ADN da amostra pode não ser conhecida mas é desejável um excesso dos iniciadores. A amplificação é efectuada de modo conve niente por adição dos trifosfatos dos desoxirribonucleósidos dATP, dCTP, dGTP e dTTP â mistura de síntese em quantidades adequadas e a solução resultante pode ser em seguida por exemplo aquecida a uma temperatura de 90 a 1005C durante um período de por exemplo desde cerca de 1 a 10 minutos. Após este período de aquecimento a solução pode ser deixada arrefecer até 30 a 70QC, o que é preferível para a hibridação do iniciador. Quando se usa polimerase Taq como agente indutor a fim de facilitar a reacção de prolongamento é preferível efectuar a hibridação de iniciador a uma temperatura de desde 50 a 70QC, por exemplo de 50 a 65QC, como seja a 60QC.

Verificou-se que a hibridação do iniciador é efectuada de modo vantajoso num tampão de força iónica reduzida a uma temperatura de têmpera elevada. Deste modo reduz-se a possibilidade de falsa iniciação. As expressões "força iónica reduzida" e "temperatura de têmpera elevada" devem ser compreendidas como referentes a condições nos extremos das gamas que geralmente seriam consideradas apropriadas por um biologista molecular com experiência normal para uma dada reacção de amplificação de ácidos nucleicos, ou fora destas gamas. A fim de proporcionar uma ilustração mas sem que possa ser considerado uma limi tação, um tampão conveniente será de força iónica suficiente para permitir manter um pH estável de 7 a 9. São temperaturas de têmpera convenientes geralmente de 50 a 60QC. Deverá notar-se que as condições de reacção em cada caso dependem do iniciador ou dos iniciadores usados.

Pode adicionar-se à mistura de têmpera um agente apropriado para a indução ou para a catálise da reacção de prolongamento e a reacção pode então ser deixada prosseguir sob condições conhecidas da especialidade. 0 agente indutor é de modo conveniente uma enzima. São enzimas adequadas o fragmento de Klenow da polim: rase I de E. coli. a polimerase de ADN T4, mas de preferência a [ polimerase Taq. Podem também ser usadas outras polimerases dispo níveis de ADN/ transcritases inversas e outras enzimas, incluin- 17

* do enzimas termoestáveis que facilitem a reacção de prolongamento . A nova cadeia sintetizada e a cadeia de ácido nucleico sua complementar formam uma molécula de dupla cadeia que é usada nas fases seguintes do processo. As fases de se paração das cadeias e de prolongamento da sequência podem ser re petidas tantas vezes quantas se queira usando os procedimentos referidos acima. As condições adequadas para estes procedimentos são descritas nas Patentes US 4683202 e 4683195 que aqui se dão como reproduzidas. Conforme explicado nas especificações das patentes referidas os ciclos de separação e de prolongamento podem ser efectuados passo a passo ou de modo vantajoso operam-se vários ciclos por exemplo de modo semi-automãtico ou completamente automático.

Na técnica convencional de RCP a reacção de amplificação é geralmente deixada prosseguir até cerca de 50 ciclos. Pelo contrário, crê-se que de acordo com o processo da presente invenção o limite superior para a amplificação é de cer ca de 25 ciclos quando se parte de uma única cópia do ADN da amostra. Quando se dispõe de maiores quantidades de partida da amostra de ADN genõmico, são necessários menos ciclos de amplifj. cação. A gama conveniente de ciclos de amplificação em função da quantidade de ADN na amostra e a natureza da sequência serão em seguida ilustradas sem qualquer carácter limitativo no procedimento de análise seguinte:

As análises que se seguem referem-se a reacções de amplificação usando volumes de 10 jal e com períodos de prolongamento de 15 minutos: Considerando uma heterozigocida-de individual para os alelos A e B, em que A é mais comprido que B, é possível prever que A se amplificará por conseguinte menos eficientemente do que B. O limite inferior de número de ciclos é ditado pela sensibilidade das sondas, que podem detectar cerca de 1 pg de produto. A fim de detectar o alelo A, é necessá rio um número de ciclos suficiente para gerar >0,1 pg do produto de alelo.A. De modo semelhante, a fim de detectar os dois ale los deve produzir-se >0,1 pg do alelo B. O limite superior do \ número de ciclos é limitado pelo rendimento dos dois alelos A ’ e B. 18

·» J. C1 e CU Podem ser estimados como se segue:

Seja M = massa inicial de ADN genómico humano (em pico-gramas) a = comprimento do alelo A (kb) b = comprimento do alelo B (kb)

ga = ganho por ciclo de RCP do alelo A

gb = ganho por ciclo de RCP do alelo B

Uma vez que a dimensão do genoma diplói-de humano é de 6x10 kb então a quantidade inicial do alelo A é M. a Pg 6 x 106

De modo semelhante, a quantidade inicial do alelo B é M. a Pg 6 x 106 0 rendimento do alelo A após C ciclos é dado por: M. a gac Pg c a 6 x 10° e de modo semelhante para o alelo B, A partir da Fig. 3 o ganho por ciclo g encontra-se relacionado com o comprimento do alelo L por gL ξ 2 - 0,093 L (L = 0-6 kb) O limite inferior de ciclos é portanto o menor valor de C quando M.a (2 - 0,093.L)C > 0,1 6 x 106 M.b (2 - 0,093.L)C > 0,1 6 x 106 O limite superior Cu é do mesmo modo o maior valor de C quando o rendimento total dos dois alelos é 19 1000 pg, isto é, M.a (2 - 0,093.L) + M.b (2 - 0,093.Lr <1000 ,6 6 x 10' 6 x 10 e podem ser determinados por reite ração por computador. Alguns exemplos típicos são: M a b i—1 ol C pg kb kb —u 10.000 5 1 7 20 1.000 3 2 10 24 100 6 0,5 19 27 6 6 1 27+ 32 + notar que o intervalo torna-se muito estreito e pode desaparecer para quantidades muito pequenas de ADN com dimensões de alelos amplamente diferentes. * N.B. Este modelo não toma em consideração o facto de que exi£ te uma variação estocástica significativa no número de moléculas visadas em quantidades de ADN genómico humano <100 pg (equivalente a 17 células). A análise de 6 pg de ADN corresponde â amplificação de uma única molécula visada em cada alelo.

Os homozigotos podem ser facilmente acomodados no modelo. Cu conserva-se sem alteração, enquanto que é definido pelo número de ciclos necessário para dar 5*0,05 pg de cada alelo (isto é, >0,1 pg combinados) .

Também podem ser acomodadas reacções com diferentes volumes. é definido pelo número de ciclos necessário para dar >0,1 pg de cada alelo na reacção total. Cu é definido pelo número de ciclos necessário para dar < 1000 pg de produto total por 10 μΐ de reacção. Para reacções de RCP de grande volume, não se modifica, mas Cu será um pouco maior do que com uma reacção de 10 jil. A gama de ciclos de amplificação que gera uma quantidade apropriada de produto de amplificação para caracterização (0,1 a 4000 pg de produto) é por exemplo de 10 a 15 20

ciclos por 100 ng de ADN genómico, 18 ciclos para 1 ng e 25 ciclos para amplificação de uma única célula (6 ng). O número de ciclos de RCP pode ter de ser aumentado a fim de detectar alelos maiores que são amplificados com uma eficiência inferior. Em fun ção do comprimento do alelo é possível obter 1000 a 10 pg de produto de amplificação fiel.

Uma vantagem particular do processo reivindicado é que é possível identificar diferenças de apenas uma unidade repetida numa região informativa. O processo da presente invenção também deve oferecer reprodução fiel de grandes locais genéticos informativos, por exemplo com um máximo de 15 kb, como sejam com um máximo de cerca de 10 kb.

Também se verificou que os problemas associados com a reticulação de cópias amplificadas do ADN da amojs tra bem como com a geração de produtos de prolongamento incomple to pode levar ao aparecimento de quantidades significativas de ADN mini-satélite de cadeia simples de dimensões heterogéneas. Este ADN de simples cadeia pode produzir níveis significativos de produtos não específicos na reacção de RCP. Este problema pode ser ultrapassado ou pelo menos aliviado por meio do uso de en zimas que digerem ou que degradam especificamente o ADN de cadeia simples e que deixam o ADN de cadeia dupla intacto. A enzima pre ferida é a nuclease Sl. A digestão dos produtos finais da RCP com esta enzima dá como resultado um perfil mais limpo de produtos de RCP revelados no final da fase de detecção. Por conseguin te num aspecto preferido da presente invenção o processo da presente invenção inclui a utilização de pelo menos uma enzima que digere ou degrada especificamente o ADN de cadeia simples enquan to que deixa o ADN de dupla cadeia intacto, evitando deste modo os problemas dos produtos não específicos da reacção de RCP. A detecção dos produtos da amplificação pode ser efectuada por qualquer meio conveniente. Os produtos am plifiçados podem ser identificados e caracterizados, por exemplo usando electroforese em gel seguida, se assim se pretender, de hibridação com sondas hibridãveis com os locais informativos con tidos nesses produtos, por sua vez seguida por exemplo por auto-[ -radiografia quando se usam sondas marcadas por radioisótopos.

No pedido de Patente Europeia com o n°. de publicações 238329 21

descrevem-se procedimentos convenientes. Em alternativa podem ser usados métodos mais directos. A separação dos produtos da am plificação num gel pode ser seguida por visualização directa des^ tes. É possível efectuar uma coloração directa por exemplo com brometo de etídio quando se dispõe de uma quantidade suficiente de produto. As sequências nucleotídicas de flanco podem, em alternativa, conter um componente marcador ou uma etiqueta e este marcador ou esta etiqueta podem então ser detectados usando quaJL quer método conveniente. Estas marcas ou etiquetas podem incluir tanto componentes radioactivos como não radioactivos mas são pre feridos estes últimos. Não se crê que o número de regiões infor mativas que podem ser amplificadas simultaneamente seja limitado a não ser por limitações práticas. É possível, por exemplo, amplificar até um máximo de vinte regiões simultaneamente, de modo conveniente dez regiões e em especial um máximo de oito, sete, seis, cinco ou quatro regiões. Num aspecto preferido da presente invenção são amplificadas simultaneamente seis regiões.

Os polinucleótidos de flanco da presente invenção podem de modo conveniente ser proporcionados num conjun to ("kit") de diagnóstico. Um outro aspecto da presente invenção refere-se por conseguinte a um conjunto ("kit") de diagnóstico que contém dois polinucleótidos de flanco complementares capazes de hibridação com regiões do ADN da amostra e instruções para o seu uso. Exemplos de sondas convenientes e preferidas incluem os já referidos na presente memória descritiva. 0 conjunto pode tam bém incluir nucleótidos reagentes para o prolongamento dos polinucleótidos de flanco através do local genético informativo e/ou um promotor de prolongamento como seja uma enzima.

Nas páginas que se seguem apresentam-se exemplos de sequências de flanco de regiões genéticas informativas que podem ser usadas no processo da presente invenção. Também são descritos pormenores de um painel de sondas de locais singulares que são capazes de hibridação com regiões genéticas informativas. Este painel de sondas foi descrito por Ray White num encontro em Quântico, Virginia, em Maio de 1988. É possível , preparar como anteriormente descrito e usar no processo da pre-^ sente invenção iniciadores polinucleotídicos capazes de hibrida- 22

Podem ser preparados iniciadores com respeito a qualquer destas regiões ou combinação de regiões a fim de proporcionar produtos de prolongamento de qualquer painel pretendido de uma região ou de regiões informativas. pMSl.lb Sequência de flanco 5' que se prolonga no mini-satélite

5' GCCATTTCCATAAACACGTATCGAGTACCTAATACTACAAAGTACCATACCAGGTACTAC -“-1-1-1-1-1

3' CGGTAAAGGTATTTGTGCATAGCTCATGGATTATGATGTTTCATGGTATGGTCCATGATG -1-1-1-1-1-1

ATCCATTAAGAATGTTAATAATTAATCACGCTCATTTGCCATTGATTTTAAGTTTCCATT -1-1-1-1-1-1

TAGGTAATTCTTACAATTATTAATTAGTGCGAGTAAACGGTAACTAAAATTCAAAGGTAA

TTATTAGTGTCAGGTGGTTTTACCAATGGCCTCCCTTTCCTTCATGCTTACACTAAAAAA -1-1-1-1--1-1

AATAATCACAGTCCACCAAAATGGTTACCGGAGGGAAAGGAAGTACGAATGTGATTTTTT

AGAACAACAGTAATGATTGTATGTCATGCTTTTCTGTGATGAGCCTTGATGTTTTTAACA -1-1-1-1-1-1

TCTTGTTGTCATTACTAACATACAGTACGAAAAGACACTACTCGGAACTACAAAAATTGT

GAATTTGATAGTTTGAGACATAAAAATTTTTGAAAAACCAACTCACGTTTCCAAACAAAA -1-1-1-1-1-1

CTTAAACTATCAAACTCTGTATTTTTAAAAACTTTTTGGTTGAGTGCAAAGGTTTGTTTT

GTGAAAAGGAGAGCTGGATTCCAGCCCCGCCACCCCAGCAAATTGAGAAATCACCCCTTG -1-1-1-1-1-1

CACTTTTCCTCTCGACCTAAGGTCGGGGCGGTGGGGTCGTTTAACTCTTTAGTGGGGAAC CTGTGAGTCAGTGGGT 3'

-|- MINI-SATÊLITE GACACTCAGTCACCCA 5' - 23 -

cd ti CQ cd p co Ή M 'CU g CU O u o I—I X! o cd o‘ •u p co P u tnP U tn cd u u cd P X tn u u u P tn υ o cn u tn cd U Cn u tn cd cd P tn cd cd u X P u p tn u tn cdl • tn cn o co u υ U tn u P P u tn P p tn tn < u u tnP cd tn μ tn cd u O cd P P tn u u tn cd cd P p cd cd u u u tn tn U P p p tn co tn tn Cn O P cd P u u tnP u u tn u P tn cdP tnu tí u P u P P P co tn tn P P tn u co tn to co Eh tnP o cd P .u 0 u u co u cd p u tn υ P co tnP u p cd tn < tn tn υ u tnP υ tn Cn u o u cn tn cd CnP cd P co P cd P tn&H P P tn u tn cd p| o co cd co P u tn cd cd cd P P P u U P cd u tn u P. cd P u cu o tnP tn cd P cn tn u u cd u tn tnP -ti cd u tn u tn u tn 0 υ Cn cd cn u u P tn u u tn tn u u P P co o tn cd p. tn cd tn 0 • o Cn.tnP p cn tn cd tn u tn P cd rd u P cd P P tn u tn tn tn icd υ O P tn tnP tn tn tnP tn tn o u u tn tn tnP cd tn. u. tn cd θ' co cnP P u o cd tn tf u cd cd co P P P P tn cd u cd · u cd ' cd H cd P u tn tn u P tn CP (0 co P co cd P co tn tn tn cd Ucd u u P cd tnu P cd p cd cd tf u P co cd cd P tn cd P cd cd cd' U U P CU P 17>P cd tntn o tn υ u co u P P U P co tn u tn cd' u tn.P a cn cd. Cn tn p. o tn tnP u cd tn cd P U P cd cd u cd cd '· tn tn tn cu -P co cn co cn υ cd cn u u co co u cd u u <d υ u cd cd - .tn (d ' cd μ P cn cn tn Cn tn P Cn u u cd P u co p υ u P tnP co:p· u:tn P p cd cd P u u rd tn cd P u P P u tn cd tn co u tnp.p-tri cd • cd cn cn tn p co P u cd P tn P P (0 u cd cd cd tn tn o> uco' <d > tn cd Cn Cn cn tn tn tn tn CJ P o P co tn tn co tn tnP cd- cj cd o 0 P P P cd co p u P co u o P co P tnP u P tn cd U -P p 0. ti υ u· co u u tn tn u u u P tn u P p cd u tnP u tn. u ovtn cd o U.P Cn .u.cn tn cd u u tn tn u tn cd tnP P cd u cd-. tn tntn υ PU u co 'cd P tn u (0 P co tn P co P P u u co u '.co cd' .tn j3 u 0 P o PP tn co P P P co P cd u tn P tn tn cd Cri cd cd P ti cd p: U Cn tn cnP U tn u u P P cd O P cnP P tn 'ctí'U'tn'P σ' cn .cn tn P P cn tn tn P o tn P tn co u u P co cd· .'co; u p .u ·*» P cd Cn Cn p;. u P u P u P P u cd P P cd u u cd tnP cd tn CQ « cd u.· co cd u tn u Cn cd cd P cd u cd P P u u P P .tnP cd P υ P.U co co: co tn cd co co cd tn P P P P P u u tn P.· tn co P X o p;tn tn 0:P P tn cd u tn P P P p p u u P P tn cd cd cd o Cn cnP tn tn u tn U P P cd tn co tn u cd cd cd u P tnP tn H Λ u cri cn tn U .(0 tn co co u u cd P u tn tn cd u P tn tn cd tn tn O Λ cd O: cn id co cn P cn u P P P P u P P u P cd P tn cd p cd Qa Cr> o cd υ p. cn υ P cd u o cd cd P cn cd u cd tn tn tn co u tn CQ P u cd u U\C0 tn u tn u u cd tn co tn o cd cd tn P p tnP tn υ a cri u tn cd P P tn tn tn tn tn u cd P cd cd P u tn tn cd cd CD P P Cn cd co .tn u tnP P <d tn cd cd u tn <d tn cd u p tnP P ip • cd P;. Cn cd υ cd cn tn u P tn u P P P P cd cd P tn u cd u tn CD t , cd u‘ co co u -co P P cd P P co P u tn cd cd tn cd P tn u u tn H cd u u cd cd cn u tn u u υ tn tn cd P P tn P u u cd.· tn u cd CD O. υ cn cn tn u tn tn tn co tn P co P P tn tn P P u tn tn tnP tn Kl dl u p cd tn O P P u cd P u P P tn to P P cd cd P tn tnP P vU rn o cnP cd u tn u u P u P u co tnP p P co P P tn cnP. u UJ cn p cn u u co u tn cd cd u co P cd p cd P co cd P cd cd tn. tn <d cd U P P tn co cd P u cd u tn u u cd tnP u co u o u cd tn cd CQ cd cn u cd p tn u u P <d (0 tn cd u P P co tn cd P o o u id cd cd cn P co o co cd u u tn u co tn u cd p cd cd cd U P tn cd P u cd p_| • P u.co co u o tn co tn cd P tnP P p cd to u U u p cd tn tn cd d cd cn <0 cn u cn P u P cd P tn tn cd P P to u < tn tn tnP tn cd n·* o u cd cn cd p tn u P P P u tn co u co tn cd u Eh P P· (0 UP· cd CQ o o . cn u tn'cd Cn P tn P cd P u u u co P u U cd cd tn tnP cd 'd cd u· cn tn P u tn tn u tn u u co cd o u to cd Eh P u cd tnP. u •rj cd u cn cd u u co P tn cd co tn cd P p cd u u <! cd tn u u u cd cd υ uP cd p cd u u tn tn cd P U tn p co <d u EH u P cd u cd P g u cnP P u u cd tnP tn cd u P co P o tn tnu tn tn tn u u u • P cd: tn P tn cn u tn u tn cd tn cd co cn co cd u X P cd .tn u cd P g cd υ UVP u tn cd P cd P P u tn cd cd cd cd tn u X P u tnP cd u (D d • u u-.u u cn o o u u u tn tn u o co tn P u X tn tn <o u cd P w cd υ p · cd •cn u u υ P tn u cd cd P rd p cd P u X tn co id u U tn xí cd cn u cd u tn u cd cd tn tn tn P P P cd P tn X tn u tnP u P CQ ti cd Cri tn cd p tn tn u P tn P cd co U P cd tn (0 X P p tn u p tn d) μ P co tn u u co tn tn co tn P P cd cd P cd cd u X cd u tn u cd cd M tH υ u co u u tn u P tn P u u cd P co co P u X u p tn tn <d P 0 X u cd' cd υ cd p u u cd u 0 P P to tn cd co P X P u cd tnP cd •H ti P p; cn u u tn u P P cd cd u cd to P cd. tn P X u tn tnP tn u M 01 cd tn'P o tn co tn tn <d P tn u P P P P P cd X u tn tn cd p cd <D cn P: cd cd P u tn cn <d P P P cd u co u P tn X u tn tn u u cd *P CU ' XI ω CD 1 cn p co in r*» cn r-cro in r— cn LD r- cn p ΓΟ in Γ' cn 1-i ro un Γ- o co ir> CN cn VO V H CO Ul CN ro nt 1—1 co co ro o r* n· CN cn CO ΓΟ o o P <N CN ΓΟ N* tn tn ό r~~ t—[ Γ" P (M cN ro «θ' cn uo Ό r-» r- co cn P P P P P P i—1 i—1 i—1 '—i r-C •Η cd e

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te no cloneAMS29. A região na sequência de repetição de consenso de 39 pb semelhante â extremidade 3' da sequência núcleo do mini—satelite (GGAGGTGGGCAGGARGj Jeffreys et al., 1985) esta mar cada com asteriscos. Os desvios da sequência de consenso são apresentados para dois blocos de 4 unidades de repetição contíguas (a-d e-h) clonados aleatoriamente a partir de AmS29. A sequência de repetição de 39 pb é constituída por 13 repetições di vergentes de PyAG. consenso TTGCAGTAGCTGTGGCAGGAGGAGTAGCAGCATCAGCAG = (YAG)13

e f g h

C G --- G --- G G C C --- G 26 pMS31 Sequência de flanco 5' que se prolonga no mini-satélite

5' GATCCACTCGGAACCACCTGCAGTTAGGAGCAAGCCTAGAATGTTCTGGAAGGATTGAAG -1-1-1-1-1-1

3' CTAGGTGAGCCTTGGTGGACGTCAATCCTCGTTCGGATCTTACAAGACCTTCCTAACTTC

CCAGCCTTGTCTGAGGCCCTGGGAAAGTGGCCTGGACATGGGGATGTGGCTGGAGGACCC -1-1-1-1-1-1

GGTCGGAACAGACTCCGGGACCCTTTCACCGGACCTGTACCCCTACACCGACCTCCTGGG

GAGGAAGATGCTGAAGTCCTGTGTGAGGCCCGGTCTGGGAGCCACGGCCCCTCCCCCACT -1-1-1-1-1-1

CTCCTTCTACGACTTCAGGACACACTCCGGGCCAGACCCTCGGTGCCGGGGAGGGGGTGA

CAGTCCGGCCTGCTGGGGTTTCCTGCCGGGCCTCCCTCAGAGCCCACGGCTCCCCAGGTG -1-1-1-1-1-1

GTCAGGCCGGACGACCCCAAAGGACGGCCCGGAGGGAGTCTCGGGTGCCGAGGGGTCCAC

GCTCTGGCCCGGGAGCCACAGGCACAACCTAGGCAGGGGAAGCCGCATGCACAATGTTGG -1-1--1-1-1-1

CGAGACCGGGCCCTCGGTGTCCGTGTTGGATCCGTCCCCTTCGGCGTACGTGTTACAACC

CTCTTCCCTTTGCACGCTGGACGGTGGCGTTTTGCCTTTCGCCTTGGGCTCAGGAGGGGC

GAGAAGGGAAACGTGCGACCTGCCACCGCAAAACGGAAAGCGGAACCCGAGTCCTCCCCG TGGGGGGTCAGGAGGGGCCATGAAGGGGACCTGGCCTTGG 3' MINI_SATÉLITE ACCCCCCAGTCCTCCCCGGTACTTCCCCTGGACCGGAACC 5' 27

pMS3 - A repetigão em série 31B é apresentada em maiusculas. u Cn u tO Cn X E-c CD P 44 υ u tn X O U tn CnP tn cn X o < P -P u u Cn X o CD P υ U υ tO X o U υ υ cn Cn Cn X u U υ 4J cn (0 Cn X < CD cn cn cn to (0 X o Eh to tO u cn o X o CD υ to ϋ CnP X o Eh υ cn cn tn υ X CD CD tnP P cn tn < H CD (0 υ U íO cnu U < tO cn u υ tn < E-t U cn 4J P Cn P CD O O p to P CnP < CD Eh P cn P <0 o O U CD tO ta cn P o < CJ U Cn to Cn υ cn CJ o O cn Cn cn o u U Eh CD (0 Cn Cn í0 P U CD U (0 <0 P to P EH Eh < Cn Cn u u P U CD O Cn U Cn tO o CJ CD O P υ P u υ < CJ CD U υ U cn cn CJ < U P to u tnP CJ O Eh P Cn cn tO P Eh CD O cn d' cn u P CD CD Eh P to cj (0 P Eh CD 0 tO Cn u u cn O Eh 0 tO Cn P o o CnCD < Cn P cn cn cn Cn Eh U o tO u to tO tn P CD 0 rH P Cn cj tn P P CJ Eh CO U cn P cn cn cj tncD υ P o tn cn u tn 0 cn cn tO υ υ tn tn 0 u (0 P o u to tnP 0 Eh (0 f0 u υ tn P (0 U < υ cn u cn cn υ tn < 0 cn cn u cn P o tn 0 0 <0 Cn υ P υ <0 o 0 0 Cn Cn P υ cn tn o 0 0 Cn -P υ P u tn tn 0 EH tO to υ u tO cn cn Eh 0 P u υ cn υ cnu 0 Eh P to υ tn cn t0 CJ Eh U tn Cn cn P P t0 CD 0 0 tO cn cn CnP cnEn 0 Eh υ P υ tnP P CJ < 0 cn u tO (0 υ tO ·< U U · 4-1 u υ υ u CJ CJ 0 0 u cn υ υ o υ <í Eh 0 u Cn tn ο P tntD 0 U (0 P tO υ P tn< 0 < u cn cn | J u cnu 0 0 u (0 cn υ P tn< 0 0 <o tO cn cn u t0 CJ U 0 to (0 P cn cn cnu < 0 cn i cn o u tn mu 0 EH cn i cn P (0 P tO Eh 0 0 u cn cn υ P u u 0 EH 4-> P Cn ο tn P u 0 0 υ u υ ο P m< Eh 0 «2 u u tn i tO tn Eh 0 < U o u ί0 tO mu Eh U cj cn , tn cn ι υ m Eh 0 0 P cn i cn t0 t0 tn x 0 Eh to tO tO ο u m x < 0 cr > cn cn ip tn ip X U 0 rH m ιn Γ- cn r-t m cn Γ- r- t—1 00 vo cn o rH CN CN cn ν’ tn tn 28

Jl

ίϊκα aeiHt' \ÍLZ*Ãxssa texsat

SEQUÊNCIA DE FLANCO 3' DO LOCAL MS31 MINI-SATÉLITE

MINI- 5' CCGGCCGG ATGGGCGTGT GGGGACGGTG TGCCGGTGTG GGGACGGGGT

-SATÉLITE 3' GGCCGGCC TACCCGCACA CCCCTGCCAC ACGGCCACAC CCCTGCCCCA

3CAGGTGTGG GGACGGGGTG CAGGTGTGGG GACGGGGTGC AGGTGTGGGG ACGGCGTGCA 3GTCCACACC CCTGCCCCAC GTCCACACCC CTGCCCCACG TCCACACCCC TGCCGCACGT 3GTGTGGGGA CGGGGTGCAG GTGTGGGGAC GGCGTGCTGT GGGGATC 3' 2CACACCCCT GCCCCACGTC CACACCCCTG CCGCACGACA CCCCTAG 5'

Sequência de flanco 5' de pMS32.6 que se prolonga no mini-satélite

5' GATCACCGGTGAATTCCACAGACACTTAAAAGCAAAAATAATAATTTGTTGAATACAGTG 3.-1-1-1-1-1-1

CTAGTGGCCACTTAAGGTGTCTGTGAATTTTCGTTTTTATTATTAAACAACTTATGTCAC

AGTTCTAAATTTCTCTTCAAAGAATCAGTATGTCAGTATGTTCAGTTCTTTGTTCTCCAT -1-1-1-1-1-1

TCAAGATTTAAAGAGAAGTTTCTTAGTCATACAGTCATAGGAGTCAAGAAAGCCGAGGTA TTTAAAGTTGAACTTCCTCGTTCTCCTCAGCCCTAGTTTCACTAAACAACCTTTTCCAAC 3' -1-1-1-1-1-1 AAATTTCAACTTGAAGGAGCAAGAGGAGTCGGGATCAAAGTGATTTGTTGGAAAAGGTTG 5 1

MINI-SATÉLITE

I

pMS32.6 Sequência de flanco 3' que se prolonga apartir do mini--satélite

5' AACCACCCTTCCCAC -1-1

3' TTGGTGGGAAGGGTG

CAAACTACTCACCCCGCCACTCTGGCTCATACCCCTGCTCTCTTTAAAGTAGCCAATCGG -1-1-1-1-1-1

GTTTGATGAGTGGGGCGGTGAGACCGAGTATGGGGACGAGAGAAATTTCATCGGTTAGCC

AATTAGCTTAGACTGTGCAGTCCAACCCTAGCCGATACGGGAACGACGCATCAGTAGGGG -1-1-1-1-1-1

TTAATCGAATCTGACACGTCAGGTTGGGATCGGCTATGCCCTTGCTGCGTAGTCATCCCC

CTACCTGTGTCAGGAATCAGAACCCCTTCCCCTCCCTTGTTCAGGTGTGCTCTGGCCATT -1-1-1-1-1-1

GATGGACACAGTCCTTAGTCTTGGGGAAGGGGAGGGAACAAGTCCACACGAGACCGGTAA

GCTCCATCTGCGAGTCGCACCCTTCTAGAGAAGTAAAATTGCCTTGCTGAGAAAATTAAA -1-1-1-1-1-1 CGAGGTAGACGCTCAGCGTGGGAAGATCTCTTCATTTTAACGGAACGACTCTTTTAATTT CTTATGTTTGAGTGGTATTTCTTTTGCAGCACCAAAAATTTATTTACACCAAATTCTACA 3' GAATACAAACTCACCATAAAGAAAACGTCGTGGTTTTTAAATAAATGTTGTTTAAGATGT 5' ο Ρ •Η Ρσ> Φ £ Η Α β •Η Ο β <0) β σ φ m β ’ϋ β

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Sequências de flanco de 33.1

5' TGTACACTCC CAGTGCCCGA GAGGATGGGG TTGAGAGCTA AGCTGAGAAA 3’ ACATGTGACC GTCACGGGCT CTCCTACCCC AACTCTCGAT TCGACTCTTT

GTCTATCTCT GAATTTCANT GCTGATAAAA ACAACCGAGC CTGCCGGGGC CAGATAGAGA CTTAAAGTNA CGACTATTTT TGTTGGCTCG GACGGCCCCG

AGGGGCTTGC TTTCTCCACG GATGGGATGC CACAACTGC TCCCCGAACG AAAGAGGTGC CTACCCTACG GTGTTGACG

MINI-SATÉLITE

TTTCCTGAA

AAAGGACTT

CATCGTACCC CCCACCCCCC AGAAGCTTGT GGGTGACACG GCACGGTGGC GTAGCATGGG GGGTGGGGGG TCTTCGAACA CCCACTGTGC CGTGCCACCG

TTAGGGACAC AGATGATAGA AGCTGGCTGC ATAAAAGACA AGTCTTTACA AATCCCTGTG TCTACTATCT TCGACCGACG TATTTTCTGT TCAGAAATGT

GAGTCTTGTC AAGCCCTCAG GTCTGCGCAC GCTTGATCTA ACCAAAGTTT CTCAGAACAG TTCGGGAGTC CAGACGCGTG CAGACTAGAT TGGTTTCAAA TTCCTGTGGA 3' AAGGACACCT 5'

Sequências de flanco de 33.4

5' ATCAAGGAGG CAGTGAGAGA TGAACTGGAA GTGACCAGGG GCTGCCAGCA

3’ TAGTTCCTCC GTCACTCTCT ACTTGACCTT CACTGGTCCC CGACGGTCGT

AACCCCCTCC ACCGAGAAGA TGACTTTCAC CTACTATACA GCAGAAAACC

TTGGGGGAGG TGGCTCTTCT ACTGAAAGTG GATGATATGT CGTCTTTTGG

AAAAGCCAAG ATAAAAATCG CTGGGGAGGG GCAGGGATGG GGGACCGGGC

TTTTCGGTTC TATTTTTAGC GACCCCTCCC CGTCCCTACC CCCTGGCCCG

CAGACCCCAG CTGCTGAGCA CGCGCCACCT

GTCTGGGGTC GACGACTCGT CGGCGGTGGA

MINI-SATÉLITE

CCTAAGCAGG TTCTGGTGGC GGATTCGTTC AAGACCACCG CTCCTGGCTG GGTGTAGGCA GAGGCTGGCT CCCGGAGGCC GCAGGGGGGC GAGGACCGAC CCACATCCGT CTCCGACCGA GGGCCTCCGG CGTCCCCCCG TCTGAGAAGG GGGCGGCCTG AGGGGGAGCC CAGGACAGCC CCTATGCTGC AGACTCTTCC CCCGCCGGAC TCCCCCTCGG GCTCTGTCGG GGATACGACG CCCCGTCCAG CCCGGCCCCT CAGGCTGTGT TTCCTGAGAC CTCGCTAGTC GGGGCAGGTC GGGCCGGGGA GTCCGACACA AAGGACTCTG GAGCGATCAG TAACCCAAAC CTCCCAGCTC TGTCATTCAA AGGGATGGAT TAGGTCCCCG ATTGGGTTTG GAGGGTCGAG ACAGTAAGTT TCCCTACCTA ATCCAGGGGC TGGGTCCATT TCCCT 3' ACCCAGGTAA AGGGA 5' 33

Sequências de flanco de 33.6

5' TGTGAGTAGA GGAGACCTCA CATTTGACCT TGGAAAGT

3' ACACTCATCT CCTCTGGAGT GTAAACTGGA ACCTTTCA

MINI-SATÉLITE

GGTTG CTCCTCACTC TGTGGTCTTT GTCTGTCCAG CCAAC GAGGAGTGAG ACACCAGAAA CAGACAGGTC ACCTTCCCTT CTTGGATTGA GTAATGTCTC ACCTGCTTGC 3' TGGAAGGGAA GAACCTAACT CATTACAGAG TGGACGAACG 5’ 34 (ti r) g Cti 0 cn •H g trti 0 +> P tti H g • 0) tO d 'P CD (D •H 0 > cu rti tn CD (D Ό rti •H d tn tti d rd d O (ti '(D (ti tti d +> cn rti P d O d d (D g uti (ti CD tn • Φ P CU tti (D tn (D d to (D cn H ft rd rti P tn ,—, (ti d (D cn g 0 P +J rti ω trti 0 Ή H cn r—1 P 0 cn 'CD O •H tn « (D +> cn P (D tO Cti 'P W cn o> cn H tn Cti H 1 (ti Λ P •H g g CD d P Ρ •d g d ω g (D tn d — rti rti (D P P cn tti tn d tn rd CD H CD cn d +» CD H 0 d tn Cti •rH 0 cti 0 H d 0 d +> O CD CD •H d P C a, d (D X cn rti cn P (D (D tn O * d CD cn (D tti cn •rH ts O g rti g (D cn g - 0 cn CD 0 P cn P trd d (D g tn P P tO CD (D cn n o tti CD d H 0 • 0 P tcti (D P O (D o> rH ft tti tti < ω (D H tti o d O H cn d P rd * tn CD Φ Ή tn cti P CU O Cti P tn (D d tti tti CD d » <(D cti tn P -d cn (D cn d cti cti 'tí CD ‘d (ti cn r—1 cti ·* Xi • rQ d cn H tn cn P cti m d rti (=d cn CU X! P r—1 u o u ϋ x cr oro p x cr tr> tr> o X cn ro <a o cn ο υ o οΊρ o o cnp p cn cn υ cnim u nj o cnj-) ρ p u υ υ OOP Π3 p o Cn Cn o

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SEQUÊNCIAS DE FLANCO DO LOCAL MS51

5' GATCAGCGAA CTTCCTCTCG GCTCCCGATA TCCTCCTCGA TACGCACTCT 3' CTAGTCGCTT GAAGGAGAGC CGAGGGCTAT AGGAGGAGCT ATGCGTGAGA

GCCACAACGG GCAGGGTCCC TTTCAGCGTC TCATCCACAG TGAACGGGAG CGGTGTTGCC CGTCCCAGGG AAAGTCGCAG AGTAGGTGTC ACTTGCCCTC

TTGAGGCTTT CTTAGCGGAG GGGCTGGAGG GAC AACTCCGAAA GAATCGCCTC CCCGACCTCC CTG

MINI-SATÉLITE

CCTC CCTGCGGTTT GGAG GGACGCCAAA

CCGGATGCTA CGGGGTGGAT CGGAGTGTGG TGTTAAGCAC ATCTGGACAC GGCCTACGAT GCCCCACCTA GCCTCACACC ACAATTCGTG TAGACCTGTG

GCTCTGTCCG AGACACATAG TCCCCAGGCG ACCTACAGCC ACAGCCTGAC CGAGACAGGC TCTGTGTATC AGGGGTCCGC TGGATGTCGG TGTCGGACTG

CTCCTGAAAA TTTCCCAGCT TCCCACAGTC CTCAATGTGG AAACCAGTGC GAGGACTTTT AAAGGGTCGA AGGGTGTCAG GAGTTACACC TTTGGTCACG CCAAAGGCCA CCTGCCCACA CTGGCACCGA ATTC 3' GGTTTCCGGT GGACGGGTGT GACCGTGGCT TAAG 5' MS51 - Sequência ao longo do sítio Hinf I adjacente

1 AGTGGATTTT CCCACTTCCC TCTGTTGTCT ATAATGAATG ACCACTACAT 51 TTTTAACCCC AAAAGCTTCT CATATGAAGA GGAGACTTCT TTCAGCAGCA 101 GGCAGGGCAC CTTCTCTGAA GCTCGCCAGC AAGCACCAAC CGACTCCCTG 151 GCCACGGCAG CTGACGCCCA GGCAGTGACC CCACACGGGA GGGCTCTCGA 201 AAAGRCTGGA GCTCCCATGA C 36 pMS228 - Sequência de um subclone de 2 kb de ADN ao redor de 228B. As sequências Alu estão G| 03 ω 03 b M D1 0 φ H 03 u 03 03 4-1 0 X! 4-1 03 G b 03 •r~l H G (ti 0 S 0 03 03 03 O 10 cx • rl 03 4-> (ti 03 d A (ti 03 Λ 54 G rl 03 H (ti XI b b d 03 03 0 (ti Uti 4-1 (ti 03 54 03 (ti A Q) rl 03 54 O '03 d 03 (ti rl a !> 03 03 54 • 03 Λ 03 (ti (ti - .p X! 54 O b l(ti 54 o 4-1 O 03 A 03 03 03 03 10 03 (ti o> 03 d •r4 44 (ti 4-1 Ή 54 03 H (ti A '03 A 03 44 03 M (ti 03 03 03 1 (ti •rl 03 G (ti 03 rl r4 a b O O 4-> 03 03 •H O 'b 54 d rl tir> (ti 03 03 a G •rl (ti a a H 03 0) O —

•'ΓΉίΝοίΓΟ’σιηαηοΜ'-σίσΐΗΓ-ΐΗΗ^ι^τΗ 37

Sequências de flanco da região hipervariável 51 do gene da insu· lina humana (AM. J. HUM. GENET., 1986, 39, 291-229.)

5' CTGGGGCTGC TGTCCTAAGG CAGGGTGGGA ACTAGGCAGC CAGCAGGGAG

3' GACCCCGACG ACAGGATTCC GTCCCACCCT TGATCCGTCG GTCGTCCCTC

GGGACCCCTC CCTCACTCCC ACTCTCCCAC CCCCACCACC TTGGCCCATC

CCCTGGGGAG GGAGTGAGGG TGAGAGGGTG GGGGTGGTGG AACCGGGTAG

MINI-SATÉLITE

CATGGCGGCA TCTTGGGCCA TCCGGGACTG GGG GTACCGCCGT AGAACCCGGT AGGCCCTGAC CCC

ACAG CAGCGCAAAG AGCCCCGCCC TGCAGCCTCC TGTC GTCGCGTTTC TCGGGGCGGG ACGTCGGAGG

AGCTCTCCTG GTCTAATGTG GAAAGTGGCC CAGGTGAGGG CTTTGCTCTC TCGAGAGGAC CAGATTACAC CTTTCACCGG GTCCACTCCC GAAACGAGAG CTGGAGACAT TTGCCCCCAG 3' GACCTCTGTA AACGGGGGTC 5' - 38 -

SEQUÊNCIAS DE FLANCO DA HVR 5' DA GLOBINA ALFA (AM. J. HUM. GENET., 1988, 43. 249-256) 5' TTAGATGCTC GCCG MINI- CTGTGCGGG AAGCCCGAAA TCCTTA 3' 3' AATCTACGAG CGGC -SATÉLITE GACACGCCC TTCGGGCTTT AGGAAT 5' SEQUÊNCIAS DE FLANCO DA HVR 3' DA GLOBINA ALFA (EMBO, 1986, 5, 1957-1863)

5' AGTCCCACCT GCAGGAAAAG GTGCAGGTAA GG 3' TCAGGGTGGA CGTCCTTTTC CACGTCCATT CC

MINI-SATÉLITE

AGGAACAGCA ACACGCAGGG AATATCGACA TCCTTGTCGT TGTGCGTCCC TTATAGCTGT TGGGTGATGC CTGCAAAGCA CAGCATCAAT CCCAAGTGAC TGA 3' ACCCACTACG GACGTTTCGT GTCGTAGTTA GGGTTCACTG ACT 3' 39 -

Sequências de flanco da região hipervariável no local da globina

Zeta (PNAS, 1983, 80, 5022-5026) ACACCCATCA ATGGGAGCAC CAGGACAGACAT GGAGGCTAAT GTCATGTTGT TGTGGGTAGT TACCCTCGTG GTCCTGTCTGTA CCTCCGATTA CAGTACAACA AGACAGGAT GGTGCTGAGC TGACCACACC CACATTATTA GAAAATAACA TCTGTCCTA CCACGACTCG ACTGGTGTGG GTGTAATAAT CTTTTATTGT GCACAGGCTT GGGGTGGAGG CGGGACACAA GACTAGCCAG AAGGAGAAAG CGTGTCCGAA CCCCACCTCC GCCCTGTGTT CTGATCGGTC TTCCTCTTTC AAAGGTGAAA AGCTGTTGGT GCAAGGAAGC TCTTGGTATT TTCAACGGCT TTTCCACTTT TCGACAACCA CGTTCCTTCG AGAACCATAA AAGTTGCCGA MINI-SATÉLITE AGC TACAGGGAGA AAAGACTTGG TCG ATGTCCCTCT TTTCTGAACC TGCTGTGGGC CTGCCTTGGG GCTGGTGGTA CAGCCCTTAT CTGCTGCCCT ACGACACCCG GACGGAACCC CGACCACCAT GTCGGGAATA GACGACGGGA CAGGATCTCC CGGCCCCTCT CGTCCAGGCC CCTGCAACCC CATGCCCCAG GTCCTAGAGG GCCGGGGAGA GCAGGTCCGG GGACGTTGGG GTACGGGGTC CCTCTGAGGA CCAAAGGCGC CCCTGCTTGG GAAGAGGGGG CTCAGGGGAG GGAGACTCCT GGTTTCCGCG GGGACGAACC GTTCTCCCCC GAGTCCCCTC TCGCCTGACC CGGTTCCAAG CCAGGCTGAT TTACCGTTGT TAACATCCTA AGCGGACTGG GCCAAGGTTC GGTCCGACTA AATGGCAACA ATTGTAGGAT GTGCACGCAT CCCTCTGCCT CATGCACCCA ACTCCAAGGC CTGGTACAC 3' CACGTGCGTA GGGAGACGGA GTACGTGGGT TGAGGTTCCG GACCATGTG 5' 40 SEQUÊNCIAS DE FLANCO DO LOCAL HA RAS (NATURE, 302, 33-37)

5' TGCTCCAAGG GGCTTGCCCT GCCTTGGGCC AAGTTCTAGG TCTGGCCACA ACGAGGTTCC CCGAACGGGA CGGAACCCGG TTCAAGATCC AGACCGGTGT GCCACAGACA GCTCAGTCCC CTGTGTGGTC ATCCTGGCTT CTGCTGGGGG CGGTGTCTGT CGAGTCAGGG GACACACCAG TAGGACCGAA GACGACCCCC CCCACAGCGC CCCTGGTGCC CCTCCCCTCC CAGGGCCCGG GTTGAGGCTG GGGTGTCGCG GGGACCACGG GGAGGGGAGG GTCCCGGGCC CAACTCCGAC GGCCAGGCCT CTGGGACGGG GACTTGTGCC CTGTCAGGGT TCCCTATCCC CCGGTCCGGA GACCCTGCCC CTGAACACGG GACAGTCCCA AGGGATAGGG TGAGGTTGGG GGAGAGCTAG CAGGGCATGC CGCTGGCTGG CCAGGGCTGC ACTCCAACCC CCTCTCGATC GTCCCGTACG GCGACCGACC GGTCCCGACG

AGGGAC MINI-SATÉLITE

TCCCTG

GAGTGACCAG

CTCACTGGTC

CTTCCCCATC GATAGACTTC CCGAGGCCAG GAGCCCTCTA GGGCTGCCGG GAAGGGGTAG CTATCTGAAG GGCTCCGGTC CTCGGGAGAT CCCGACGGCC

GTGCCACCCT GGCTCCTTCC ACACCGTGCT GGTCACTGCC TGCTGGGGGC CACGGTGGGA CCGAGGAAGG TGTGGCACGA CCAGTGACGG ACGACCCCCG GTCAGATGCA GGTGACCCTG TGC 3' CAGTCTACGT CCACTGGGAC ACG 5' 41 CM (D d 3'*o cjiiti to co lo x o o x o lo ή Pí " pí ** a h § h

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Painel de Sondas de Local Singular Propostas por Ray White tí|CM 1 „·*» -H S 3 a« Md (D P I (d Λ S fn r fi -ri -ri o 0) w&i υωυ n I m I•H ,8 3 = Λ 0 S 3 § (d t fi C β Λ (ti CD .U υο Ό S d cn P ·Η ·Η β -η ¢1) H P H cá

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Probabilidade a priori de que um pai presumível falsamente acusado seja excluído pela sonda - 42 - Q) -μ -H >1 (ti Pí

Sondas de Local Singular Adicionais Clonadas por

43

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33. Royle N J, Clarkson R, Wong Z and Jeffreys A J (1987) Human Gene mapping 9: Ninth International workshop on human gene mapping, Cytogenet, Cell Genet. 46, 685. A invenção será de seguida ilustrada por meio dos exemplos não limitativos que se seguem. EXEMPLO 1

MATERIAIS E MÉTODOS (a) Preparação de ADN qenómico, de oligonucleótidos e de sondas de hibridação

As amostras de ADN humano forma fornecidas por CEPH, Paris, ou foram preparadas a partir de sangue veno so conforme descrito na literatura [26]. Os oligonucleótidos sin tetizados num sintetizador de ADN ABI 380B usando reagentes fornecidos por Cruachem foram purificados por precipitação com eta-nol e foram dissolvidos em água. A inserção Sau3A de 5,6 kb do clone MS32 mini-satélite humano [10] foi subclonada no sítio BamHI de pUCl3 [27]. De modo semelhante, as inserções de mini-sa télites dos ADN"s recombinantes de M13 RF 33.1, 33.4 e 33.6 [5] foram isoladas sob a forma de um fragmento BamHI-EcoRI de 1,9 kb, um fragmento Sau3A-EcoRI de 2,7 kb e um fragmento BamHI-EcoRI de 0,7 kb, respectivamente, e foram subclonadas em pUC13 digerido com BamHI e EcoRI a fim de dar origem ãs séries plasmídicas * p33.1, p33.4 e p33.6. Isolaram-se fragmentos de ADN contendo mi- • ni-satélites apropriados a partir de ADN's plasmídicos de restri - 46 -

ção por electroforese através de agarose a 1% de baixa temperatu ra de gelificação (ver Placa); as tiras de gel que continham os fragmento de ADN foram dissolvidas em água a 65QC até uma concen tração final de 2 jug/ml de ADN. Marcaram-se alíquotas de 10 ng com p por iniciação aleatória com oligonucleõtidos [28]. (b) Reacgão de cadeia de polimerase

Amplificaram-se alíquotas de ADN humano, diluídas se necessário com Tris-HCl 5 mM (pH 7,5), na presença de iniciadores oligonucleotídicos 0,1 pM como suporte em 10 μΐ de Tris-HCl 67 mM (pH 8,8), (NH^^SO^ 16 mM, MgCl2 6,7 mM, 2-mer captoetanol 10 mM, EDTA 6,7 μΜ, dATP 1,5 mM, dCTP 1,5 mM, dTTP 1,5 mM, dGTP 1,5 mM (Pharmacia), 170 fig/ml de albumina de soro de bovino (isenta de DNase, Pharmacia) mais 1 μΜ de cada iniciador oligonucleotídico e 1,5 unidades de polimerase Taq (Anglian Biolabs). Cobriram-se as misturas reaccionais em tubos Eppendorf com uma camada de 40 μΐ de óleo de parafina e trataram-se durante 1 minuto a 95QC, 1 minuto a 60QC e 15 minutos a 70QC num Inte lligent Heating Block (Cambio, Cambridge). As reacções de amplificação final foram geralmente feitas terminar por uma fase final de 1 minuto a 60QC a fim de temperar qualquer ADN de cadeia simples restante com iniciador, seguida por uma fase de prolonga mento a 70QC durante 15 minutos.

(c) Análise de mancha de Southern dos produtos de RCP

Removeu-se o óleo de parafina das reacções de RCP por extracção com éter dietílico. Levaram-se a efeito electroforese em gel de agarose dos produtos de RCP, análise de mancha de Southern em Hybond N (Amersham) e hibridação com „ 32 sondas mmi-satelites marcadas com p conforme descrxto anten-ormente [10], excepto em que se omitiu o ADN humano competidor de todas as hibridações. Realizaram-se digestões de restrição e digestão com nuclease SI de produtos de RCP por diluição de 5 μΐ da mistura reaccional da TCP com 25 F1 de endonuclease de restri_ ção ou de tampão de nuclease SI [29] e digestão durante 30 minu- * tos a 37QC com 3 unidades de endonuclease de restrição de nuclea • se Sl (BRL) antes da electroforese em gel. 47

(d) Isolamento e análise por RCP de células humanas isoladas

Isolaram-se linfócitos por diluição de sangue venoso com um volume igual de lxSSC (salina de citrato de sódio, NaCl 0,15 M, citrato trissõdico 15 mM, pH 7,0), depósito numa camada sobre Histopaque-1119 (Sigma) e centrifugação a 2000 g durante 10 min. Diluiram-se as células da interface com 3 vol de lxSSC e depositadas novamente sobre Histopaque. As células fo ram agregadas por centrifugação a 2000 g durante 10 minutos, lavadas três vezes com lxSSC com centrifugação e ressuspensão em 4 lxSSC numa concentração de 10 celulas/ml.

Isolaram-se células bucais por diluição de 0,5 ml de saliva com 5 ml de lxSSC e centrifugação a 2000 g durante 10 minutos. O agregado celular foi enxaguado três vezes ~ 4 com lxSSC e ressuspendido numa concentração de 10 celulas/ml.

Pipetaram-se alíquotas de 0,1 μΐ das sus pensões celulares numa lâmina de microscópio tratada com silico-ne e examinou-se rapidamente com um aumento de lOOx num microscõ pio invertido. Diluiram-se gotículas que continham uma única célula nucleada imediatamente com 0,4 μΐ de lxSSC e transferiram--se para um tubo de Eppendorf usando uma pipeta de ponte descartável. A lâmina de microscópio foi re-examinada a fim de verificar que a célula fora retirada com a gotícula.

As células foram lisadas antes da RCP por aquecimento ou por tratamento com dodecil-sulfato de sódio (SDS) e proteinase K [23] . No primeiro caso, a gotícula da célula foi diluída com 4,5 μΐ de Tris-HCl 5 mM (pH 7,5) que continha iniciadores oligonucleotídicos 0,1 μΜ, coberta com uma camada de óleo de parafina e aquecida a 95QC durante 3 minutos antes da adição de 5 ul de tampão de RCP concentrado 2x/iniciadores/poli-merase Taq e de amplificação. No último caso, a gotícula da célu la foi misturada com 0,5 μΐ de Tris-HCl 5 mM (pH 7,5), iniciadores 0,1 μΜ mais 1 ul de Tris-HCl 5 mM (pH 7,5), ditiotreitol 40 mM, SDS 3,4 μΜ, proteinase K [23] a 59 μg/ml, coberta com uma ca mada de óleo de parafina e digerida a 37õC durante 45 minutos. Adicionaram-se 3 μΐ de água â mistura proveniente da digestão e aqueceu-se a 95QC durante 3 minutos a fim de inactivar a protei- • nase K antes da adição de 5 P1 de mistura de reacção de RCP corno] • . anteriormente. 48

(a) Selecgão de mini-satélites humanos para amplificação por RCP A estratégia de amplificação de mini-satélites é apresentada na Figura 1. Usam-se iniciadores oligonu-cleotídicos que correspondem a uma sequência de ADN singular de flanco de mini-satélites para dirigir a amplificação do mini-satélites completo pela polimerase Taq. Os alelos amplificadores são detectados por hibridação de mancha de Southern com uma sonda mini-satélite localizada internamente em relação aos sítios dos iniciadores. Escolheram-se para estudo seis mini-satélites clonados (Quadro 1). Dois deles, pflg3 e MS32 [8, 10], detectam locais altamente variáveis com uma heterozigocidade de 97% ou su perior a mais de 40 alalos com variação no número de unidades re petidas. Os outros quatro mini-satélites, 33.1, 33.4 e 33.6 [5] e pMS51, isolados sob a forma dum fragmento Sau3A-EcoRi de ADN clonado a partir duma impressão digital de ADN (A. J. Jeffreys, resultados não publicados), detectam locais muito menos variáveis com heterozigocidades de 66 a 77%; os alelos são no entanto mais curtos do que os de p^g3 e MS32 (Quadro 1) e devem ser mais susceptíveis de amplificação por RCP. As sequências de flanco de pAg3, 33.1, 33.4 e 33.6 foram descritas anteriormente [5, 8]; o ADN de flanco de ÂMS32 e pMSSl foi sequenciado conforme descrito anteriormente [8]. Todas as sequências de ADN de flanco foram passadas em busca contra um banco de dados de sequências de ADN EMBL a fim de identificar elementos de repetição tais como Alu, e projectaram-se iniciadores oligonucleotídicos de RCP A e B (Figura 1) a fim de evitar estes elementos. Na legenda da Figura 1 são dados pormenores de todos os iniciadores e sondas de hibri dação. (b) Fidelidade e eficiência da amplificação por RCP de alelos mini-satélites humanos A fim de determinar a capacidade da poli merase Taq para amplificar em particular alelos mini-satélites longos, amplificou-se uma mistura de 0,1 μg de ADN genómico de cada um de 4 indivíduos, dando um total de 8 alelos de MS32 dife • rentes com dimensões desde 1,1 a 17,9 kb durante 10 a 20 ciclos . usando iniciadores de flanco A e B de ÍMS32 e em seguida subme- - 49 -

teu-se a hibridação de mancha de Southern com uma sonda mini-satélite (Figura 2A). Usando períodos de prolongamento de 6 minutos para a polimerase Taqf apenas os quatro alelos mais curtos (1,1 a 2,9 kb) foram amplificados com eficácia. Aumentando o tem po de prolongamento para 15 minutos a fim de melhorar as possibi lidades de que a polimerase Taq progrida completamente ao longo do mini-satélite verificou-se um aumento nítido do rendimento dos dois alelos de dimensão a seguir (4,5 e 6,6 kb), embora não se tenha vefificado mais qualquer melhoria com prolongamentos de 30 minutos. Foi possível também melhorar o rendimento relativo de alelos grandes aumentando a concentração da polimerase Taq (Figura 2B), tornando possível a detecção de um alelo de 10,2 kb, embora fracamente. A adição de mais polimerase Taq no 13Q ciclo apenas deu uma melhoria marginal no rendimento e não há qualquer evidência de uma baixa significativa na actividade de polimerase durantes estes períodos de prolongamento aumentados. Outras expe riincias de variação de temperatura de têmpera, da temperatura de prolongamento e da concentração de tampão não melhoraram o rendimento dos alelos grandes (dados não apresentados) e todas as outras experiências foram efectuadas usando períodos de 15 mi nutos de prolongamento e polimerase Taq (1,5 unidades por jul de reacção de RCP).

Com poucos ciclos (10 ciclos), os alelos amplificados parecem ser cópias completamente fiéis dos alelos de partida de AMS32, de acordo com as respectivas mobilidades electroforéticas. (Figura 2A). Com ciclos mais numerosos (14 a 17 ciclos), há um aumento de marcações de fundo; uma vez que a maior parte destas podem ser eliminadas por digestão com nuclease SI (resultados não apresentados), uma grande parte deste fundo provavelmente deriva de níveis baixos de moldes de cadeia simples de um ciclo anterior que não reagiu bem como o iniciador e de produtos de prolongamento incompleto de ciclos anteriores que por definição não podem reagir com o iniciador. Com numerosos ci cios (20) o padrão de hibridação degenera para uma mancha hetero dispersa, como seria de esperar uma vez que o rendimento do produto de RCP torna-se tão elevado (>400 ng/ml) que a têmpera fo-. ra de correspondência de ADN de mini-satélite repetido em série ^ de cadeia simples ocorre durante a fase de prolongamento. Esta 50

circunstância provocará a terminação prematura da extensão num sítio retemperado, para "alelos" espúrios resultado do prolongamento de moldes incompletos temperados fora de correspondência com a cadeia complementar de um mini-satélite e a formação de ré des multimoleculares de cadeias de ADN de mini-satélite retemperadas .

Os rendimentos de cada alelo <3mS32 ampli ficado por RCP foram quantificados por densitometria de varrimen to (Figura 3) . Os produtos de RCP de 0,1 fig de ADN genómico acumulam-se exponencialmente pelo menos até ao ciclo 17. O ganho em produto por ciclo decresce monotonamente com o comprimento dos alelos, com ganhos inferiores para 6 minutos em comparação com períodos de prolongamento de 15 minutos. As curvas do ganho em função do comprimento do alelo podem ser extrapoladas retroactivamente para um ganho por ciclo de aproximadamente 2,0 para alelos muito curtos, indicando que a eficácia da desnaturação e da reacção com o iniciador em cada ciclo está próxima de 100%. Os rendimentos finais de um ale lo podem ser calculados a partir destas curvas; para um alelo A com um ganho gA por ciclo presente inicialmente em n moléculas, o rendimento apos c ciclos e aproximadamente de n.gA moléculas. A falta de balanço molar entre os alelos A e B de comprimentos diferentes, proveniente da amplificação mais eficiente dos ale-los mais curtos, e dada por (Çf^/ÇTg) · Por exemplo, apos 10 ciclos de amplificação com períodos de extensão de 15 minutos, o rendimento molar de um alelo de 1 kb será 18 vezes superior ao de um alelo de 6 kb? após 25 ciclos a proporção será de 1300 vezes. Esta falta de balanço é melhorada em certo grau pela detec-ção mais eficiente dos alelos mais compridos pela sonda de hibri dação de mini-satélite. Apesar disso, os alelos mais compridos amplificados pela RCP vão-se tornando cada vez mais difíceis de detectar com pequenas quantidades de ADN humano genómico e altos números de ciclos de RCP.

Experimentaram-se também os mini-satélites pAg3, pMS51, 33.1, 33.4 e 33.6 a fim de determinar a respec-tiva capacidade para serem amplificados por RCP (resultados não [ apresentados). Observou-se em todos os casos uma amplificação • fiel de todos os alelos experimentados, excepto para os alelos 51

mais compridos (>8kb) de pAg3 que, como era de esperar, não se conseguiram amplificar. Novamente, os rendimentos dos produtos da RCP baixaram com o crescimento do comprimento dos alelos. (c) Fidelidade da amplificagão de moléculas isoladas de mini--satélites A fim de ensaiar se era possível a ampli ficação fiel de moléculas isoladas, co-amplificaram-se alíquotas de 60 e de 6 pg de ADN humano, equivalentes a 10 e 1 células, du rante 25 ciclos usando iniciadores tanto para Ams32 como para pMS51 (Figura 4A). Os dois alelos de pMS51 (1,6 e 1,5 kb) foram amplificados na amostra de 60 pg e os produtos de amplificação de um ou dos dois alelos puderam ser também observados nas amostras de 6 pg, indicando que é possível amplificar fielmente molé cuias visadas isoladas. De modo semelhante, os alelos de 2,8 e de 5,9 kb de ^MS32 puderam ser amplificados com êxito a partir de amostras de 6 pg de ADN humano, se bem que o rendimento do alelo maior fosse, conforme esperado, muito baixo. Na aparência a amplificação com êxito de alelos de MS32 e de pMS51 em amostras de 6 pg ocorreu independentemente, conforme esperado, com uma taxa de insucesso por alelo por reacção de 63%. A partir da distribuição de Poisson, este facto indica em média acontecimentos de amplificação com um êxito de 0,46 por amostra de ADN de 6 pg, em comparação com a previsão de 1 acontecimento, uma vez que 6 pg de ADN humano conterão em média uma molécula de um alelo. Deste modo, é possível amplificar por RCP com eficácia razoável moléculas de mini-satélites visadas isoladas. Não se observaram produtos de amplificação espúria com pMS51. Em contraste, com MS32 observaram-se frequentemente produtos não esperados tanto nas amostras de 60 pg como de 6 pg de ADN (Figuras 4A e B). Por digestão com nuclease SI foi eliminada uma banda (Figura 4B) que aparece apenas ocasionalmente, que migra em conjunto com produtos de RCP desnaturados e que pode ser eliminada principalmente por eliminação dos produtos da RCP por uma fase final de têmpera/ prolongamento (resultados não apresentados, ver Materiais e Métodos). Esta banda sensível a nuclease SI corresponde presumi-. velmente a um molde de cadeia simples que não sofreu reacção com 1 o iniciador no ciclo de RCP final. As outras bandas espúrias de- 52

tectadas por ^MS32 eram resistentes a nuclease SI mas foram redu zidas em dimensão, simultaneamente com o produto correcto da RCP, por digestão com endonucleases de restrição que cindem o ADN de flanco do mini-satélite (Figura 4B). Estas bandas espúrias repre sentam presumivelmente produtos anormais de RCP com ADN de flanco normal mas com números alterados de unidades de repetição de mini-satélites. Estas bandas são especialmente notáveis após 30 ciclos de amplificação, estão geralmente presentes em pequenas quantidades em comparação com o alelo autêntico e variam em comprimento de reacção para reacção, em contraste com o alelo de origem. Não são o resultado de contaminação das reacções de RCP com ADN humano ou com produtos de reacções de RCP anteriores, uma vez que apenas aparecem em reacções em que ocorreu com êxito a amplificação de um alelo autêntico (Figura 4A) e que têm sido observadas de forma consistente em todos os ADNs ensaiados (resultados não apresentados). Uma vez que quase todos os produtos espúrios são mais curtos do que o alelo autêntico, é provável que estes produtos apareçam relativamente cedo durante a reacção de RCP e que se acumulem preferencialmente devido ao seu menor comprimento e a sua concomitante maior eficácia de amplificação. Não é muito claro ainda como aparecem estes alelos "mutantes" nem se é possível encontrar condições da RCP que suprimam o seu aparecimento. Verificou-se uma frequência semelhante de aparecimento de "alelos" anormais com pfcg3, mas apenas com muito menor frequência com os outros quatro mini-satélites ensaiados.

As mutações somáticas em locais de mini--satélites no ADN genômico humano de partida podiam ser também uma origem de produtos de RCP inesperados. Estas mutações existem de facto, especialmente para Ams32, como se verifica pelo aparecimento de alelos mini-satélites mutantes em populações cio nais de células de tumores [30] . É no entanto improvável que os mutantes somáticos sejam uma origem importante das bandas espúrias que se observam na Figura 4, uma vez que não foram ainda ob servadas reacções de RCP em 6 pg de ADN humano que apresentem um alelo mutante aparecendo na ausência do alelo de origem normal.

| (d) Co-amplificação de mini-satélites múltiplos: impressões di-gitais de ADN humano derivadas de RCP 53

A Figura 4 demonstra que dois mini-saté-lites podem ser co-amplificados com êxito na mesma reacção de RCP. Uma análise mais profunda mostrou que pelo menos 6 mini-sa-têlites puderam ser co-amplificados sem qualquer interferência aparente entre os locais. Para além disso, os produtos da RCP pu deram também ser tipificados simultaneamente por hibridação de mancha de Southern com um cocktail de todas as seis sondas mini--satélites. Na Figura 5 apresentam-se exemplos destas "impressões digitais" de ADN multilocal derivado por RCP. Em todos os casos a reacção de RCP foi limitada a 15 a 18 ciclos a fim de minimizar o aparecimento de produtos espúrios como se observa na Figura 4. Análises repetidas do mesmo indivíduo mostraram que o padrão era reproductível, com todos os fragmentos de ADN que hibri daram representando produtos autênticos de amplificação de mini--satélites. Foi possível obter facilmente "impressões digitais" de ADN a partir de 1 ng de ADN humano; em algumas ocasiões não foi possível amplificar um ou dois locais (indivíduos 1 e 12, Pi gura 5A e C); esta impossibilidade afectou normalmente o mini-sa télite 33.4, seguido pelo pMS51 e com menor probabilidade o 33.1 (resultados não apresentados). A probabilidade de não se dar a amplificação parece estar relacionada com o conteúdo em GC das unidades de repetição do mini-satélite (Quadro 1) e sugere que a ausência de amplificação é um resultado duma falha na desnaturação de mini-satélites ricos em GC a 95QC, provavelmente devido a variações localizadas de temperatura no bloco de aquecimento ou a uma condutividade térmica baixa entre o bloco e o tubo da reac ção.

Estas impressões digitais de ADN de RCP são derivadas de seis locais com níveis de variabilidade que variam amplamente (Quadro 1). A fim de determinar a complexidade geral e o nível de variabilidade destes padrões, compararam-se indivíduos não relacionados (Figura 5B). Em média foram resolvidas 8,9 bandas por indivíduo (gama 6 a 11, Figura 6). 0 número máximo de bandas é 12 (Figura 5A), que corresponde a heterozigo-ciade em todos os locais, sem comigração electroforética de ale-los de locais diferentes e sem alelos demasiado grandes para se-) rem amplificados por RCP. Em comparações aos pares de indivíduos ^ não relacionados há em média 10,8 bandas que são discordantes en 54

tre pares de indivíduo (gama 5 a 18). Uma vez que a distribuição de discordâncias se aproxima de uma distribuição de Poisson, então a probabilidade de que dois indivíduos não relacionados apre sentem impressões digitais de ADN idênticas (sem bandas discor-dantes) pode ser estimada em e ' = 2 x 10 . Estes padrões portanto mostram um bom grau de especificidade individual, apesar do facto de que quatro dos seis locais usados mostram níveis relativamente modestos de variabilidade (Quadro 1). São também facilmente detectáveis diferenças em impressões digitais de ADN derivadas de RCP entre indivíduos intimamente relacionados, por exemplo na família de 3 gerações apresentada na Figura 5C em que se pode também observar a transmissão fiel de bandas de pais para filhos. (e) Tipificação de mini-satélites em células humanas isoladas É possível submeter células lisadas di-rectamente a RCP sem necessidade de purificação do ADN [23], o que simplifica grandemente a análise de espêcimens como por exem pio sangue. Em experiências preliminares provou-se que é possível tipificar mini-satélites no sangue por congelação e desconge lação do sangue a fim de lisar os eritrõcitos, seguida de centri fugação para separar os glóbulos brancos e os núcleos, e aquecimento em água para lisar as células antes da RCP. Usando este mé todo é possível tipificar de modo reproductível 0,001 a 0,01 pl de sangue, o que corresponde a 3 a 30 células nucleadas (resulta dos não apresentados). Esta análise foi também aplicada a linfó-citos isolados (Figura 7A) dos quais se co-amplificarem simultaneamente cinco locais de mini-satélites e se tipificaram por hi-bridação sequencial. Verificou-se uma amplificação com êxito e fiel tanto a partir de células lisadas com proteinase K e SDS an tes da RCP como a partir de células lisadas por aquecimento em água. Também foi possível tipificar células bucais nucleadas individuais a seguir a lise com proteinase K/SDS (Figura 7B), embo ra não tivesse sido possível lisar estas células em água (resultados não apresentados). . A fim de experimentar a viabilidade da * identificação de células individuais, tipificaram-se separadamen • ““ 55

te 14 células bucais de dois indivíduos numa experiência cega (Figura 7B). Em quatro casos não foram observados produtos de am plificação de qualquer dos locais, sugerindo que a célula não ti nha sido transferida para a reacção de RCP ou que a lise não tinha tido lugar ou então que o ADN nuclear se tinha degradado antes da RCP. Nos restantes 10 casos foi possível detectar alelos amplificados a partir de pelo menos dois dos locais de mini-saté lites e em alguns casos todos os cinco locais se amplificaram com êxito a partir de uma única célula. Omitindo os alelos grandes de MS32, que se amplificaram em grau reduzido e que seriam difíceis de tipificar ao nível de uma única célula, estimamos que, para estas reacções de RCP de células isoladas em que pelo menos alguns locais foram amplificados, aproximadamente 75% dos alelos presentes puderam ser detectados a seguir à RCP. Esta estimativa está em concordância com a eficácia da amplificação de uma única molécula determinada por análise de RCP de amostras de 6 pg de ADN humano (Figura 4). Como é de esperar a partir de Figura 4, foram observados vários exemplos de bandas espúrias tanto em reacções de RCP de células bucais como de linfõcitos (Figu ras 7A e B). No entanto foi possível detectar alelos que permitem uma distinção de cada um dos dois indivíduos nas 10 células bucais que foram tipificadas com êxito, e a origem de cada célula bucal foi determinada com êxito nesta experiência cega.

Finalmente fazemos notar a presença de produtos amplificados do mini-satélite 33.6 em algumas amostras de comparação isentas de ADN nas Figuras 7A e B e do mini-satél_i te 33.4 numa das amostras de comparação de células bucais. Na prática, verificámos que esta contaminação, provavelmente com ADNs recombinantes ou com produtos de reacções de RCP anteriores e não com células humanas ou com ADN genõmico, apenas pode ser evitada mediante o uso de soluções, vidraria, pontas de pipetas descartáveis e tubos de Eppendorf que não tenham estado anterior mente expostos ao ambiente de laboratório. É de salientar que o problema de contaminação que encontrámos de forma mais consisten te tenha sido com o mini-satélite 33.6, uma das sondas de impreis são digital de ADN multilocal [5 e 6] que têm sido continuamente \ utilizados no nosso laboratório durante os últimos quatro anos. 56

X

(f) CONCLUSÕES A polimerase Tag não só apresenta uma fi delidade notável na amplificação de ADN não repetido [21], como também é capaz de amplificar fielmente mini-satélites inteiros e de conservar a especificidade alélica do número de unidades de repetição. Ao contrário das reacções de RCP habituais, no entanto, a RCP de mini-satélite normalmente tem de ser terminada antes de que o rendimento do produto se torne tão elevado (>4 ng por 10 μΐ de reacção de RCP) que ocorra a têmpera foram de correspondência entre cadeias de molde com repetições em série complementares durante o prolongamento por iniciador, especialmente durante os longos períodos de prolongamento necessários para obter uma amplificação eficaz de alelos de mini-satélites longos. Além disso, a reacção de RCP deve ser deixada prosseguir até um grau suficiente para gerar produto suficiente para que seja de-tectãvel por hibridação. As sondas de mini-satélites são sensíveis e podem facilmente detectar 0,1 pg de mini-satélite produto de RCP [lo]. A gama de ciclos de RCP que geram uma quantidade apropriada de produto para a tipificação (0,1 a 4000 pg de produ to) é por conseguinte muito ampla e apenas é necessária uma esti mativa muito aproximada da quantidade de ADN genõmico inicial a fim de prever o número de ciclos de RCP necessário para uma tip_i ficação bem sucedida. Como indicação geral é possível afirmar que 10 a 15 ciclos são adequados para 100 ng de ADN genómico, 18 ciclos para 1 ng e 25 ciclos para uma RCP com uma única célula (6 pg). Pode ser necessário aumentar o número de ciclos de RCP a fim de detectar alelos maiores que são amplificados com menos eficácia.

Uma vez que as amplificações de mini-sa-têlites necessitam frequentemente de ser restringidas â fase exponencial de acumulação de produtos de RCP [21], o sinal de hibridação é aproximadamente proporcional ã quantidade de ADN inicial até um limite inferior de 0,1 ng de ADN genómico humano (re sultados não apresentados). Abaixo deste limite, a variação esto cãstica no número de moléculas de mini-satélites visados pode obscurecer a proporcionalidade. A RCP de mini-satélites pode por . conseguinte ser usada quantitativamente a fim de estimar concen-trações baixas de ADN humano. Além disso, a quantidade de inicia 57

dores e de polimerase Taq não é limitante durante esta fase precoce da RCP e em princípio deve haver uma interferência pequena ou nula entre os diferentes locais a ser amplificados. Na prática, é possível co-amplificar simultaneamente pelo menos seis mini-satélites diferentes e parece não haver qualquer razão teórica para que este número não possa ser ainda aumentado. A co-amplificação de mini-satélites seguida por hibridação sequencial simultânea com sondas de mini-sa télites permite obter a partir de amostras muito pequenas de ADN uma quantidade considerável de informação relativa à identidade individual e às relações familiares. Estas impressões digitais de ADN derivadas de RCP parecem ser fiáveis até um limite inferior de 1 ng de ADN. Também é possível extrair informação a partir de quantidades muito mais pequenas de ADN e de células isola das, se bem que a criação de fragmentos espúrios de ADN nos mesmos locais, durante o número relativamente grande de ciclos de RCP necessários para a tipificação de uma única célula, possa apresentar problemas significativos para a identificação individual ao nível de uma célula ou de poucas células. Felizmente, pa rece que estes produtos espúrios de ADN variam de reacção para reacção e por conseguinte deverá ser possível distinguir entre alelos autênticos amplificados e produtos espúrios de RCP em amostras de ADN muito pequenas por meio de análises de RCP dupli cadas.

As impressões digitais de ADN derivadas de RCP já apresentam um bom nível de especificidade individual, com uma probabilidade de falsa associação entre dois indivíduos -5 de cerca de 2 x 10 .Em contraste, as impressões digitais obtidas por hibridação de mancha de Southern com uma sonda multilo-cal polinúcleo [6] ou com um cocktail de sondas de mini-satéli- tes humanos específicos em relação a um local [lo] apresentam ní -12 veis muito mais elevados de especificidade individual (<10 e —6 <1 respectivamente) . No entanto, a variabilidade de impressões digitais de ADN derivadas de RCP pode ser substancialmente melho rada. Em primeiro lugar, não é possível detectar alelos altamente informativos particularmente em pAg3 e AmS32 acima de aproxi-madamente 8 kb (1 ng de ADN humano) ou aproximadamente 5 kb (célula isolada). Foi possível ultrapassar este problema por meio 58

da utilização de mini-satélites altamente variáveis com uma gama mais restrita de comprimentos de alelos. Estes locais parecem ser mais raros uma vez que os altos níveis de variabilidade estão normalmente associados com grandes números de unidades de re petição de mini-satélites e com alelos longos [5, 8 e 10]. Alguns locais possivelmente apropriados foram no entanto isolados ([9], J.A.L. Armour e A.J. Jeffreys, resultados não publicados). Em se gundo lugar, foi possível aumentar o número de mini-satélites que são amplificados simultaneamente. Em terceiro lugar, foi pojs sível identificar e evitar os locais que são especialmente propensos a gerar produtos espúrios de RCP, como p^g3 e MS32. Se es tes objectivos poderem ser alcançados, então não vemos razão para que não seja possível uma identificação fiável ao nível de uma única célula, desde que se evite qualquer contaminação inadvertida e que a presença potencial de mutações somáticas nos locais hipervariãveis seja tomada em conta [30]. A utilização de sondas de impressões digitais de ADN de multilocal por exemplo na identificação de indi víduos em medicina forense, em provas de paternidade e na monito rização de transplantações de medula óssea é limitada pela sensi^ bilidade destas sondas que necessitam de pelo menos 0,1 a 1 jug de ADN humano para a tipificação [6]. De modo semelhante, as son das de mini-satélites específicas em relação a um local apenas podem tipificar até um limite inferior de 50 ng de ADN humano [10]. A obtenção de impressões digitais de ADN por meio de RCP melhora a sensibilidade em várias ordens de grandeza e pode ser usada para tipificar especímenes que são relativamente intratáveis por hibridação de mancha de Southern convencional. Por exem pio, as raízes de cabelos humanos contêm normalmente 10 a 500 ng de ADN [22] e enquanto que é possível tipificar aproximadamente 70% das raízes usando sondas de mini-satélites específicas para um local (Z. Wong, J.A.L. Armmour e A.J. Jeffreys, resultados não publicados), foi possível tipificar todas as raízes de cabelos até agora experimentadas por impressão digital de ADN deriva da de RCP (resultados não apresentados). De modo semelhante, é possível tipificar 0,001 a 0,01 μΐ de sangue sem necessidade de purificar previamente o ADN. Do mesmo modo, a saliva contém normalmente 100 a 1000 células bucais nucleadas por μΐ e a análise 59 i^ESSESano». de impressão digital de ADN derivada de RCP de amostras de menos do que um microlitro de saliva é portanto possível. 0 potencial para tipificar quantidades vestigiais de cabelo, sangue, sémen, saliva e urina em especímenes forenses, incluindo amostras; parcialmente degradadas, é óbvio. 0 potencial de contaminação inadvertida dos especímenes, por exemplo com traços de cuspo, é também evidente.

As impressões digitais de ADN derivadas de RCP podem adquirir eventualmente uma especificidade individual suficiente para proporcionar um ensaio altamente polarizado para o estabelecimento de parentesco por exemplo em disputas de paternidade. Não apenas se obviaria a necessidade de isolar o ADN como se poderiam usar amostras muito menores de sangue obtidas por picagem no dedo e não por colheita na veia. Em alternativa, a determinação do parentesco pode ser baseada na análise de saliva. Deste modo evitar-se-ia o problema dos indivíduos que se opõem à colheita de amostras de sangue por razões religiosas ou outras e ultrapassar-se-ia o truma da colheita de sangue em crianças . EXEMPLO 2

MATERIAIS E MÉTODOS

Amplificação de alelos de mini-satélites por RCP

Prepararam-se iniciadores oligonucleotí-dicos conforme descrito anteriormente (Jeffreys et al., Nucleic Acids Res. ljS, 10953-10971) . Os alelos do mini-satélite /|MS32 fo ram amplificados por mistura de 0,4 jug de ADN genõmico humano em («44 μg de H20 com 50 μΐ de Tris-HCl 45 mM (pH 8,8), (NH^^SO^ 11 mM, MgCl2 4,5 mM, EDTA 4,5 μΜ, 2-mercaptoetanol 7 mM, dATP 1 mM, dCTP 1 mM, dGTP 1 mM dTTP 1 mM, (Pharmacia), albumina de soro de bovino a 110 pg/ml (isenta de DNase, Pharmacia), iniciador oligonucleotídico A 1 μΜ e iniciador oligonucleotídico B 1 μΜ. . Adicionaram-se 7,5 unidades de polimerase Taq (Cambio tipo III | ou Perkin Elmer AmpliTaq), cobriu-se a mistura reaccional com 40 60

* μΐ de óleo de parafina, ciclizou-se a 95QC durante 1,5 minutos, 67QC a 1,5 minutos e 70QC durante 9,9 minutos durante 30 ciclos num Techne Programmable Dri-Block PHC-1 e em seguida tratou-se a 67QC durante 1,5 minutos e a 70QC durante 9,9 minutos. Obtiveram-se resultados equivalentes num Perkin Elmer Cetus DNA Ther-mal Cycler, ciclizando a 95QC durante 1 minuto, 67QC durante 1 minuto e 70°C durante 10 minutos.

Isolamento de alelos amplificados

Misturaram-se 50 μΐ de reacções de RCP com 5 μΐ de mistura de carga (ficol 400 a 12,5%, azul de bromoti mol a 0,2%, acetato de Tris 0,2 M (pH 8,3), acetato de Na 0,1 M, EDTA 1 mM), depositou-se sobre um gel de agarose a 1% (Sigma Tipo I) e submeteu-se a electroforese na presença de brometo de etídio. Os alelos amplificados foram visualizados usando luz UV de comprimento de onda longo (ou um transiluminador de UV de com primento de onda curto se necessário) e cortaram-se lâminas de gel contendo os alelos. Recuperou-se o ADN por electroforese numa membrana de diálise, precipitou-se por etanol e dissolveu-se em 10 jul de H20.

Amplificação

Descrevemos anteriormente como é possível amplificar os alelos de mini-satélites usando iniciadores oligonucleotídicos que correspondem a ADN de flanco dos mini-sa-télites a fim de provocar a amplificação de todo o conjunto sequencial de repetição em série. Limitando o número de ciclos de RCP e detectando os alelos amplificados por hibridação de mancha de Southern com uma sonda de mini-satélite, mostrámos que era possível uma amplificação fiel, mas que com altos números de ciclos os produtos degeneravam numa mancha heterodispersa de produtos amplificados devido a têmpera entre fragmentos de ADN de mini-satélites de repetição em série de cadeia simples. Além dis so, a maioria dos produtos detectãveis com altos números de ciclos num gel de agarose corado com brometo de etídio não corres-. pondia a produtos de RCP do local do mini-satélite, mas eram ori " ginãrios de reacção com o iniciador fora de correspondência em 61

outros sítios genómicos (A. J. Jeffreys e V. Wilson, resultados não publicados).

Por meio da diminuição da força iônica do tampão da RCP e do aumento da temperatura de têmpera a fim de reduzir a reacção com o iniciador fora de correspondência, bem como pela alteração da origem da polimerase Taq, provou-se ser possível amplificar mini-satélites até ao ponto em que os alelos autênticos amplificados por RCP podem ser visualizados directa-mente num gel corado por etídio (Figura 9). Ê certo que ocorre alguma interferência de manchas anómalas que se resolvem em fracj mentos de ADN de baixo peso molecular como resultado do grande número de ciclos necessário para gerar esta quantidade de produto que produz, por têmpera, produtos de mini-satélites heterodis persos. No entanto, os alelos autênticos são identificáveis niti damente e correspondem em dimensão aos alelos de mini-satélites detectados por hibridação de mancha de Southern convencional de ADN genómico humano. Tal como foi já feito notar (Jeffreys et al, 1988) , os rendimentos dos alelos dos mini-satélites diminuem com o comprimento dos alelos e ainda não foi provado ser possível am plificar mini-satélites mais compridos que 6 kb a ponto de que possam ser identificados num gel corado com etídio. Para reacções de RCP de 50 pl contendo 0,4 fig de ADN genómico humano e processadas durante 30 ciclos, ê possível produzir até 1 pg de alelos pequenos (1 kb); este rendimento desce para = 1 ng para alelos de 6 kb. Em heterozigotos que diferem amplamente nas dimensões dos alelos, a sobre-amplificação do alelo menor causa normalmente o colapso prematuro do alelo maior e o seu desaparecimento dos géis corados com etídio. A fim de mapear as repetições variantes dos mini-satélites (RVM) em mini-satélites, o alelo amplificado é recuperado por electroforese em gel preparativa, cindido com uma endonuclease de restrição, que corta próximo de uma ou da ou tra extremidade do alelo amplificado, e marcado na extremidade por marcação de preenchimento na extremidade cindida. Por digestão parcial do fragmento marcado na extremidade com enzimas de restrição apropriadas seguida de electroforese em gel de agarose . e de auto-radiografia obtém-se um mapa da localização das RVMs internas. A cisão terminal pode ser levada a efeito usando um sí 62

tio de restrição apropriado situado no ADN de flanco dentro da região que está sendo amplificada, ou em alternativa um dos iniciadores pode transpor um sítio de restrição adequado. 0 iniciador 5' para MS32, 5'-TCACCGGTGAATTCCACAGACACT-3', contém um sítio EcoRI nas bases 9 a 14 dentro do iniciador, correspondendo a um sítio EcoRI no ADN genõmico. Na ausência de um sítio apropria do no ADN de flanco do mini-satélites, como no caso da região 3' de AmS32, é possível gerar um sítio terminal usando um iniciador oligonucleotídico prolongado em 5'. Deste modo, o segundo inicia dor usado para amplificar ÂMS32 foi modificado para 5*--CTGATCATCGATCGACTCGCAGATGGAGCAATGGCC-3', em que a região sublinhada corresponde a sequências de ADN genõmico; o prolongamento 5' contém um sítio para Ciai (ATCGAT) que não é cindido perto de λΜ332. A presença do prolongamento 5' não tem qualquer efeito sobre a capacidade deste iniciador para amplificar MS32 (resultados não apresentados). Os alelos amplificados com estes dois iniciadores podem ser marcados em qualquer das extremidades a se guir a cisão com EcoRI ou Ciai, permitindo que seja realizado o mapeamento de RVM a partir de qualquer das extremidades do conjunto sequencial de repetições em série.

Mapeamento de RVMs no interior dos alelos de MS32 amplificados

Uma busca no painel de CEPH de famílias de origem Mormon, francesa, Amish e venezuelana revelou alelos Alui de MS32 com dimensões desde 1,2 kb até 20 kb; uma vez que os alelos Alui têm um comprimento apenas superior em = 0,2 kb do que os produtos de RCP correspondentes com os iniciadores referj. dos, então os alelos mais compridos que 6,2 kb não podem ser facilmente mapeados internamente devido ã baixa eficácia da amplificação.

Os resultados do mapeamento interno para o alelo mais curto no painel de CEPH são apresentados na Figura 10 para o alelo EcoRI e Ciai amplificado e marcado. Ambos produzem uma escala Hinfl contínua e uma escala Haelll descontínua, sendo a última complementar para EcoRI e Ciai. É possível deduzir um mapa completo da localização de todas as RVMs cindíveis por Haelll. Uma análise repetida deste alelo amplificado numa ou tra ocasião deu origem ao mesmo mapa (resultados não apresenta- - 63 - dos), indicando que a amplificação e o mapeamento tinham sido f_i éis. EXEMPLO 3

Mapeamento das RVM de uma única molécula

Mostrámos que é possível amplificar molé cuias de mini-satélites isoladas com uma eficácia e uma fidelida de razoáveis, se bem que com o aparecimento ocasional de produtos espúrios de RCP de comprimento incorrecto (Jeffreys et al., 1988). A utilização das condições de RCP modificadas descritas na presente memória descritiva suprimiu quase completamente o aparecimento dos produtos espúrios de RCP mesmo para alelos comprimidos (Figura 12A). A fim de determinar a fidelidade do mapea mento de RVM de uma única molécula, amplificaram-se 16 alíquotas de 6 pg de ADN de 10208 heterozigotos individuais de CEPH para os alelos q e 4 (Figura 12A) durante 25 ciclos com iniciadores exteriores A e B (Figura 11A) que estão reservados exclusivamente para análise de moléculas isoladas a fim de minimizar o risco de contaminação a partir do exterior. Por hibridação de mancha de Southern com uma sonda de mini-satélite MS32 revelaram-se ale los amplificados que correspondem em comprimento ao alelo 1 em 5 amostras e ao alelo 4 em 6 amostras. Não se detectaram outros am plificados e as amostras de comparação correspondentes a zero ADN analisadas em paralelo deram também resultados negativos (re sultados não apresentados). A partir destes resultados, 42% das moléculas de mini-satélites isoladas deram origem a produtos de RCP, uma eficácia semelhante à relatada anteriormente (Jeffreys et al., 1988) e semelhante â eficácia da amplificação de alelos maiores (Figura 12A legenda). Os 11 alelos amplificados a partir de moléculas isoladas foram re-amplificados com os iniciadores Cl e D associados, a fim de minimizar a subsequente contaminação de reacções de RCP de moléculas isoladas e de eliminar os produtos espúrios originários da reacção com iniciadores fora de correspondência com ou iniciadores A e/ou B em qualquer localização * do genoma, e em seguida foram submetidos a um mapeamento interno. - 64 -

Todos os mapas obtidos eram idênticos aos mapas dos alelos 1 e 4 obtidos por amplificação de ADN genómico em quantidade (resultados não apresentados).

Amplificação de novos mutantes de supressão de MS32 a partir de ADN genómico humano seleccionado por dimensão A possibilidade de amplificação fiel de moléculas isoladas de MS32 torna possível amplificar e caracteri zar mutações de novo neste local presentes no ADN genómico humano completo. Escolheu-se um indivíduo que era heterozigoto para os alelos de comprimento semelhante mas com estrutura interna muito diferente (alelos 31 e 32, Figura 12). Por análise de RCP de 40 alíquotas em duplicado de 30 pg de ADN espermático deste indivíduo verificou-se uma amplificação eficiente de moléculas de mini-satélites isoladas sem qualquer evidência de alelos de comprimento anormal adicionais em qualquer reacção (Figura 13A).

Digeriu-se o ADN espermático deste indivíduo com Sau3A mais o isoesquizómero Mbol, que cindem em posição distai em relação aos iniciadores A e B (Figura 11A), e frac cionou-se por dimensão por electroforese em gel de agarose. Reco lheu-se uma série de fracções que continham fragmentos de ADN me nores que os alelos progenitores 31 e 32 e amplificaram-se alí-quotas de cada fracção com os iniciadores A mais B. Por hibrida-ção de mancha de Southern verificou-se que se tinham dado aconte cimentos de amplificação de moléculas isoladas nestas fracções, dando produtos discretos de RCP cujas dimensões se situavam no domínio de dimensões das fracções de ADN ensaiadas (Figura 13B, Quadro 2). Várias reacções executadas paralelamente de RCP com amostras de comparação que não continham ADN ou que continham alíquotas de fracções de dimensão equivalente de uma amostra de comparação constituída por uma mistura proveniente de uma digestão Sau3A/MboI isenta de ADN espermático (ver Procedimentos Expe rimentais) deram resultados negativos de forma consistente em re lação a produtos de RCP de MS32. As fracções de menor dimensão S3 a S5 do ADN espermático estavam completamente isentas de ale-, los precursores amplificáveis, indicando que >99,9999% das molé * cuias dos alelos precursores tinham sido eliminadas destas frac- - 65 -

ções. Ainda estavam presentes quantidades vestigiais destes ale-los nas fracções SI e S2, indicando uma purificação incompleta apesar de várias passagens de fraccionamento por electroforese em gel. A purificação em gel de ADN de dimensão próxima da dos alelos progenitores deu origem a fracções mais contaminadas nas quais a detecção de novos alelos mutantes foi prejudicada por produtos de RCP dos alelos projenitores (resultados não apresentados) .

Amplificaram-se de modo semelhante mutan tes de supressão de moléculas isoladas de mini-satélites a partir de ADN fraccionado por dimensão preparado a partir de sangue colhido do mesmo indivíduo. Foi possível detectar facilmente tam bém neste caso acontecimentos de amplificação de moléculas isola das no ADN do sangue mas não nos produtos digeridos de comparação que não possuiam ADN do sangue. No Quadro 3 apresentam-se pormenores do número e das dimensões dos novos mutantes de alelos de esperma e de sangue. Observou-se um total de 64 mutantes de esperma e de 42 de sangue, ocorrendo os mutantes mais frequen temente nas fracções de maior dimensão. A possibilidade de alinhamento de todos os mutantes de esperma e de sangue com um ou outro alelo progeni^ tor fornece uma forte evidência a favor da hipótese de que estes alelos representam moléculas mutantes autênticas presentes no ADN genõmico e não contaminantes introduzidos durante o isolamen to do ADN do esperma e do sangue. Para além disso, a detecção re petida de alelos mutantes com um mosaico idêntico confirma também a fidelidade do mapeamento de RVM de moléculas isoladas.

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

Preparação de ADN

Os ADNs humanos foram fornecidos por CEPH, Paris, e foram também preparados a partir de sangue venoso recolhido a partir de 80 indivíduos não relacionados entre si de nacionalidade inglesa, conforme descrito na literatura (Jeffreys e Morton, 1987). Preparou-se ADN de sangue para análise por RCP . de moléculas isoladas a partir de 20 ml de sangue recolhido em 20 ml de 1 x SSC (salina de citrato de sódio, NaCl 0,15, citrato 66

trissódico 15 mM, a pH 7,0). Congelou-se e descongelou-se o sangue a fim de lisar os eritrõcitos e separaram-se os leucócitos por centrifugação a 10 000 g durante 10 minutos. Lavou-se o agre gado celular com 1 x SSC, ressuspendeu-se em acetato de Na 0,2 M (pH 7,0) e lisou-se por adição de SDS até 1%. Separou-se o ADN após extracção por fenol por três ciclos de precipitação por eta nol. Todas as operações foram executadas numa cabina de fluxo la minar usando pipetas, acessórios de plástico descartáveis e reagentes que não tinham estado anteriormente expostos ao ambiente do laboratório, a fim de minimizar o risco de contaminação. Preparou-se de modo semelhante ADN espermãtico a partir de uma única ejaculação de um indivíduo que tinha evitado relações sexuais antes da colheita da amostra (a fim de evitar a contaminação com ADN estranho). Diluiu-se o sémen com o mesmo volume de 1 x SSC e separou-se o esperma por centrifugação a 10 000 g durante 10 minutos. O agregado celular foi lavado três vezes com 20 ml de 1 x SSD, con centrifugação seguida por seis lavagens com 20 ml de 1 x SSC, SDS a 1% a fim de lisar quaisquer leucócitos seminais e células epiteliais. O agregado espermático residual foi incubado em 1 x SSC com 2-mercaptoetanol 1 M à temperatura ambiente duran te 5 minutos e o esperma reduzido foi lisado por adição de SDS até 1%. O ADN espermãtico foi recolhido após extracção com fenol por precipitação com etanol.

Fraccionamento por dimensão de ADN humano

Digeriram-se completamente 40 μg de ADN de esperma e de sangue com Sau3A mais Mbol na presença de triclo reto de espermidina 4 mM usando as condições recomendadas pelo fornecedor. Carregou-se o produto da digestão do ADN juntamente com um produto digerido de comparação sem ADN num gel de agarose

a 0,6% horizontal de 20 cm de comprimento (Sigma tipo 1) em TNE (acetato de Tris 20 mM, acetato de Na 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 8,3) de tal modo que a calha de carga ficasse menos de meio cheia com a amostra. Submeteram-se as amostras a electroforese juntamente com marcadores de ADN digerido com HindiII a 20 V durante 18 ho-. ras. Removeram-se as bandas do marcador e corou-se com brometo ' de etídio. Cortou-se e separou-se a região do gel que continha - 67 -

os fragmentos de ADN desde 0,6 a 4,2 kb juntamente com a região correspondente da amostra de comparação e isolou-se o ADN por electroeluição numa membrana de diãlise. Refraccionou-se o ADN separado bem como o extracto da amostra de comparação como ante-riormente num gel novo. Submeteu-se o ADN recuperado em seguida a electroforese através de um terceiro gel e retirou-se uma série de tiras de gel desde 0,6 a 3,8 kb. Cortou-se 1 mm de gel do topo e do fundo de cada tira a fim de minimizar a contaminação com fragmentos de ADN que migram de forma aberrante ao longo da superfície do gel e recolheu-se o ADN por electroeluição e preci^ pitação por etanol. Dissolveu-se o ADN em Tris-HCl 5 mM (pH 7,5). Todas as operações foram levadas a efeito numa cabine de fluxo laminar e o equipamento de electroforese foi descontaminado antes de ser usado por imersão em lexívia doméstica com HC1 1 M nu ma chaminé de laboratório durante 16 horas.

Amplificação de alelos MS32

Amplificaram-se alelos por uma modificação de métodos anteriormente descritos (Jeffrey et al., 1988). Amplificaram-se 0,4 jug de ADN genõmico humano em 50 μΐ de Tris--HC1 45 mM (pH 8,8), (NH^^SO^ 11 mM» MgC^ 4,5 mM, 2-mercapto-etanol 6,7 mM, EDTA 4,5 μΜ, clATP 1 mM» dCTP 1 mM, dGTP 1 mM, dTTP 1 mM, (Pharmacia), 110 jug/ml de albumina de soro de bovino (isenta de DNase, Pharmacia), oligonucleótidos Cl mais D ou C mais Dl cada um 1 joM, e 5 unidades de polimerase Taq (Amersham) . AS reacções foram realizadas em ciclos durante 1,3 minutos a 96° C, 1 minuto a 67QC e 4 minutos a 70QC para 25 a 30 ciclos num DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus). Os produtos de RCP foram submetidos a electoforese através de um gel de agarose a 0,8? e os alelos amplificados foram visualizados por coloração com brometo de etídio. Os alelos foram recuperados por electro-elui-ção e precipitação com etanol e foram dissolvidos em Tris-HCl 5 mM (pH 7,0). Outras origens de polimerase Taq foram igualmente eficazes (AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus) e polimerase Taq tipo III (Cambio).)

Centrifugaram-se amostras de ADN humano • para análise de moléculas isoladas a fim de remover quaisquer 68

69

Quadro 1 - Propriedades de mini-satélites humanos seleccionados

p*—» CM 0 cn Γ—1 d CM •H 0 o cn d d 0 • H i—1 H icd 4-1 κ o cn i—1 r—i t—“1 4-1 0 C> 0) 00 rH cn in in LO CU icd d P$ i—i L-—1 1—1 1-1 1_1 d d> d ar{ 44 o 4-> o cu E E d Dl cu CLTM cd cu u 40 CM σ 40 00 o rH μ CM o\P 0 40 40 40 LO 40 f» 4-1 cu d CU d 0 d cu rH a d II CQ Ω cd d 0 <3 d 0 >—1 rl cu d) ccd <u cn LO cn o 0 d d d ω H rQ o O >* ** d tf d <d Λ4 CM CM «tf CM i—1 .—1 0 íd cu — 1 | 1 1 1 | E E SÊ® 40 rH cn Γ—1 00 L0 0 cu (d ·Η 0 * * κ h 0 • 0 d d O iH i—1 i—1 o O cu h cu -P - -μ rl cn H i—1 1 i—1 'CU 0 '(U •P O (D cq 4-> cd 0 rd 0 O O cd CQ C i—I 'tf tf O CQ 1 0 • cu A A σι i—1 o 00 | H 0 Οι H Λ Λ rl d EH a »d d •r| d Γ-) E P4 E 0 U 0 0 P$ 0 d C u μ 1 0 • 0 0 0 H (D P ._. icd 0 d N d d rH o> 0 0 Cd cd r| 6 0 μ d <— -P cd 4-) id (D -H o\o r- f" 40 o Γ- d CU 0 o> +J U σι σ> 40 Γ" 40 E d (¾ 0 cti CU 0 cu tf CU c u W θ' d -H μ u •rl H 0 4h o cu 0 rl d d d EH H r| cu < D £ CQ O s 0 CQ cu < cd icd cd 0 d s μ Η P4 cd - • cd cd o (U CU O d LD 0 U n cq •P cn H tó r| ccd (d -η o cq tf -¾1 cd d 'CU d> D Η Ό 0 1 tf cn CU d H cd e 40 CM Ή CQ d rH -P 0 0 cn "tf tf 0 CQ m cu 0 μ tf tf r-1 d CQ cd cn D Ω o Γ" I—) 1—1 | 1 1 cu d S cu CQ μ D μ 0 0 u 4-> d 0 CU cu Γ" d rd -P d H CM σι cu •r-l E •H cd CM 00 co E d cu rH cu ϋ in M I—1 H H 'CU d 0 t" rH Η U d 0 4-) cd PI Q Q Q 1 1 1 & H d cd d E 'd CQ rl 0 CQ cu 1 d d 0 44 •μ d «tf rH d d (U CM ι—1 1—1 • 40 CQ CU 0 -r| cd d cn cn LD • cn • 0 Di d E d 0 tf co w cn cn cn r—1 S a cn • cn ·*> • fc* u D a D D D H CN

Quadro 2 - Propriedades dos locais de mini-satélites detectados por clones específicos em relação a um local

0 ooυ g o (d d rH Π3 MH -H 0 d) G

s Q G 1 D1 1 σ σ\ o 00 -tf uo (U 1 ο oo CM CN 00 Γ" σι o ω l oo •tf H co H H o -μ G <1 cu 00 g CN cd CNcuΛ cu td d goο υ G • cd iH h mh X! -CMcn 00 'tf 00 cn P·» o 00 00 o co CN CTl o l> rH o •tf rH 00 CN rH s—' Η 1 1 -tf cdμ d&> cu

OG H 1¾ μ cu > 1 cd i ο υ i iCd -H 1 θ’ g l μ μ μ cu •μ tf μ e 228B <d Ό i cu m cu oo 1 -μ 0 n ca i -μ oo -μ 'tf oo Pa O •H CQ 1 tf CM CM tf • G i—I o i 1 1 1 1 'tf 00 00 cd Cd g l co oo CN CN CN i—1 rH rH υ o i 00 oo CN «tf tf tf Λ m 0 Μ 1 tf a. Oa tf CN H r·' ω υ i 1 0" rH r" rH rH rH de O o 1¾ Ω < cu •d <u d d d H g O CU o

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cd d 1 1 1 1 00 rH H 00 CN 00 ro "tf H ir> 00 CN CN G 1 tf CO co co CO co CO 0 1 a g g g g g co 1 PM Pa CM CM CM CM CM g cu cu d foram 71 cn d «o o H -P d d cd d cd > p d d a λ d 'ρ

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Legenda do Quadro 3 - 0 ADN do esperma e do sangue de um indivíduo heterozigoto em relação aos alelos de MS32 Sau3A de 4,9 e 5,1 kb de comprimento (alelos 31 e 32, Figura 12) foi digerido com Sau3A mais Mbol e fraccionado por dimensões por electoforese em gel de agarose conforme descrito em Procedimentos Experimentais. 0 rendimento de ADN em cada fracção foi estimado por elec-troforese de alíquotas de cada fracção em comparação com uma série diluída de ADN não digerido e não fraccionado, seguida de densitometria de varrimento da região de peso molecular apropria do em fotografias de um gel corado com brometo de etídio. Amplificaram-se alíquotas múltiplas de cada fracção usando os iniciadores de RCP A e B e ensaiaram-se para verificação da ocorrência de novos alelos mutantes conforme se apresenta na Figura 13. Derivou-se o número de genomas haplõides analisando para a determi nação de mutantes de uma dada classe a partir do rendimento de cada fracção, partindo da hipótese de que cada genoma haplóide continha 3 pg de ADN e corrigindo para a proporção estimada (40%) de moléculas de MS32 isoladas que se amplificaram com êxito. O número observado de repetições em cada molécula mutante foi estimado a partir da dimensão do produto inicial amplificado com os iniciadores A e B e confirmado por determinação directa do número de repetições em mutantes submetidos a mapeamento interno .

Figura 1 - Iniciadores e sondas de hibridação usados na amplificação de mini-satélites por RCP. Cada local de mini-satélite foi amplificado usando iniciadores de 20 ou 24 bases A e B localizados em sequências singulares no ADN de flanco a 'a' e 1 b' pb rejs pectivamente do mini-satélite. Detectaram-se os produtos da RCP por hibridação com uma sonda interna de mini-satélite isolada por cisão com as endonucleases de restrição X e Y que cindem a 1 c' e 'd* pb do mini-satélite. Os pormenores dos seis mini-saté-lites são os seguintes, em que R = comprimento da unidade de repetição (pb) : p g3, A = 5'-ACCACAGGCAGAGTAAGAGG-31, B = 5'-CCACCCTGCTTACAGCAA-* TG-3', X = Pst I, Y = Ddel, a = 35, b = 58, c = 26, d = 45, 1 R = 37; MS32, A = 5'-TCACCGGTGAATTCCACAGACACT-3', B = 5'-AAGCTC- 73

« X

TCCATTTCCAGTTTCTGG-31, X = Hpalf Y = Bqll, a = 181, b = 324, c = 10, d = 37, R = 29; pMS51, A = 5'-GATCAGCGAACTTCCTCTCGGCTC--3', B = 5'-TCCACATTGAGGACTGTGGGAAGC-3', X = Ddel, Y = HaelI, a = 117, b = 131, c = 30, d = 0, R = 25 + 33: p33.1, A = 5'--CTTTCTCCACGGATGGGATGCCAC-3 ' , B = 5 ' -GCCGTGTCACCCACAAGCTTCTGG-3 ', X = Ddel, Y = Ddel, a = 11, b= 96, c= O, d = 2, R = 64: p33.6, A = 5'-TGTGAGTAGAGGAGACCTCACATT-31, B = 5'-AGGTGAGACATTACTCAATC-CAAG-3', X = Styl, Y = DralII, a = 14, b = 45, c = 10, d = 16, R = 37.

Figura 2 - Amplificação de alelos do mini-satélite MS32 por RCP. A, reuniram-se alíquotas de 0,1 jig de ADN dos indivíduos de CEPH 2306, 10208, 133101 e 133304, os quais no seu conjunto continham 8 alelos diferentes de MS32 desde 1,1 até 17,9 kb e amplificaram -se durante 10 a 20 ciclos em reacções de 10 ul que continham 1 unidade de polimerase Taq mais os iniciadores de flanco A e B. Separaram-se os produtos de RCP por electroforese num gel de aga rose a 1% e detectaram-se por hibridação de mancha de Southern com uma sonda de mini-satélite. Os períodos de prolongamento com a polimerase Taq a 70©C foram de 6, 15 ou 30 minutos com (+) ou sem (-) adição de mais polimerase (1 unidade) no loQ ciclo. H, 2 jag de cada um dos ADN de CEPH digeridos com Alui? Os sítios Alui de flanco de MS32 estão localizados de tal modo que cada alelo Alui é 0,2 kb mais comprido do que o seu produto de RCP correspondente. Efectuou-se a auto-radiografia durante 5 horas (ciclos 10 e 14) ou 1 hora (17 e 20) sem alvo intensificador. B, efeito do aumento da concentração de polimerase Taq (a-c, 0,5, 1, 2 uni dades, respectivamente) na eficiência da amplificação de alelos compridos. O período de prolongamento a 70QC foi de 15 minutos.

Figura 3 - Eficiência da amplificação de alelos do mini-satélite MS32 em função do comprimento do alelo, com períodos de prolonga mento de RCP de 6 minutos (0) e 15 minutos (0). O ganho em produ . to por ciclo de amplificaçao foi determinado por densitometria *_ de laser de varrimento das pistas H 6+ e 15+ da Figura 12, expojs 74

tas a uma película de raios X pré-exposta a um relâmpago sem alvo de intensificação. A estimativa média do ganho por ciclo determinada até ao ciclo 10, desde o ciclo 10 até ao 14 e desde o ciclo 14 até ao 17 estavam em concordância completa, indicando que o rendimento de produtos de RCP aumenta exponencialmente pelo menos até ao ciclo 17; a Figura apresenta o valor médio de três estimativas do ganho de cada alelo.

Figura 4 - Co-amplificação de dois mini-satélites a partir de ADN equivalente a uma única célula, A, amplificaram-se alíquotas de 60 ou 6 pg de ADN de sangue de um indivíduo heterozigoto em relação aos alelos 'a' e 'b' em AmS32 e 'c' e 'd' em pMS51 duran te 25 ciclos com 15 minutos de período de prolongamento na presença dos iniciadores A e B de ambos os locais e em seguida submeteu-se a análise de hibridação de mancha de Southern dos produ tos da amplificação. Foi possível detectar um baixo nível do ale lo 'a' em três das amostras de 6 pg por exposição prolongada a auto-radiografia (flechas). B, análise de produtos espúrios de amplificação de MS32. Amplificaram-se duas alíquotas de 60 pg du rante 30 ciclos e em seguida digeriu-se com nuclease SI (Sl), Bgll (B) ou Hpal (H). A enzima de restrição Bgll cinde uma vez no ADN de flanco entre o mini-satélite de MS32 e o iniciador B e remove 311 pb de ADN de flanco. A enzima Hpal cinde entre o iniciador A e o mini-satélite, removendo 195 pb de ADN de flanco (ver a legenda da Figura 1).

Figura 5 - Co-amplificação de seis mini-satélites humanos diferentes por RCP. A, amplificação de 10 ng (primeiras quatro pistas) ou de 1 ng de ADN (últimas duas pistas) do indivíduo 1 durante 15 ou 18 ciclos respectivamente, usando um coktail de iniciadores A e B para os mini-satélites p/|g3, MS32, pMS51, 33.1, 33.4 e 33.6. Os produtos de RCP foram detectados por hibridação de mancha de Southern com um cocktail de todos as seis diferen- 32 ^ tes sondas de mini-satélites marcadas por p. O indivíduo do en 75

saio tinha antes sido caracterizado em todos os seis locais sepa radamente, o que permitiu que todos os fragmentos de ADN da hi-bridação fossem atribuídos conforme é apresentado; este indivíduo é heterozigoto em todos os seis locais. Estas impressões digitais de ADN são de três experiências separadas. Note-se que não se conseguiu amplificar 33.4 na última pista. B, impressões digitais de ADN de 8 indivíduos não relacionados entre si (2a 9) a seguir a amplificação de amostras de 1 ng de ADN durante 18 ciclos. C, impressões digitais de ADN de uma família durante 3 gerações (Família 1435 CEPH) a seguir a amplificação de 10 ng de ADN durante 15 ciclos. A amplificação não resultou em três bandas, correspondentes aos alelos de 33.4 e pMS51 no indivíduo 12, como se verificou por uma segunda análise desta família (primeira pista, bandas marcadas com um asterisco). Em todas as experiências digeriram-se os produtos de RCP com nuclease SI (ver Mate riais e Métodos) antes da electroforese em gel, a fim de reduzir a marcação de fundo. As amostras de comparação isentas de ADN em todas as experiências deram de modo consistente resultados nulos (não apresentados).

Figura 6 - Variabilidade das impressões digitais de ADN produzidas por co-amplificação de seis mini-satélites simultaneamente por RCP. Analisaram-se amostras de 1 ng de ADN de 21 indivíduos não relacionados entre si conforme descrito na Figura 5. A, variação no número de fragmentos de ADN que é possível resolver por indivíduo. O número médio de bandas resolvidas por diferenças verificadas entre as impressões digitais de ADN de pares de indivíduos não relacionados, com base em 29 comparações aos pares independentes. O número de bandas discordantes é o número to tal de bandas não partilhadas pelos dois indivíduos em comparação. O número teórico máximo de discordâncias com 6 locais é 24 e a média observada é 10,8 + 2,8 (D.P.).A distribuição de discordâncias aproxima-se de uma distribuição de Poisson com esta média (círculos a cheio). 76

Figura 7 - Amplificação de mini-satélites de células humanas iso ladas. A, lisaram-se amostras contendo 0, 1 ou 3 linfôcitos pequenos (do indivíduo analisado na Figura 5A) com proteinase K mais SDS ou por aquecimento em água, seguindo por co-amplifica-ção com iniciadores para MS32, pMS51, 33.1, 33.4 e 33.6 durante 27 ciclos. Hibridaram-se os produtos de RCP por mancha de Southern sequencialmente com cada uma das cinco sondas de mini-saté lites. B, produtos de amplificação de células bucais isoladas, analisadas a seguir a lise com proteinase K mais SDS e RCP como anteriormente. Ensaiaram-se células de dois indivíduos, 'a' e ' b'; 'b' é homozigótico em pMS51, 33.1 e 33.6. O, amostra de com paração sem células. Os produtos espúrios de RCP estão indicados por flechas.

Figura 8 - Estrutura do clone plasmídico pMS228. As regiões representadas por rectângulos representam conjuntos seriados de mini-satélite. Existem duas regiões distintas de mini-satélites discerníveis; a 228A detecta as bandas que hibridam mais fortemente e a 228B as bandas mais fracas em hibridação em condições críticas de ADN humano.

Figura 9 - Detecção directa de alelos de mini-satélite MS32 amplificados por electoforese em geis de agarose corados por etí-dio, a seguir a 30 ciclos de RCP de 0,4 jug ADN genómico humano. M = ADN de marcação (0,5 pg de ADN x Hind III + 0,2 pg de ADN 0x174 x HealII). 0 indivíduo 1 é heterozigõtico em relação ao alelo de 4,5 kb detectado no gel e a um alelo maior (7 kb) que é amplificado com muito menor eficácia e não pode por conseguinte ser detectado. O indivíduo 2 é heterozigõtico em relação aos ale los de 3,7 e de 4,6 kb, ambos detectáveis. As dimensões dos alelos amplificados correspondem âs dimensões previstas determinadas por análise convencional de mancha de Southern de ADN genómi . co a partir destes indivíduos. Note-se a presença de um conjunto adicional complexo de produtos de RCP de baixo peso molecular 77 que correspondem aos alelos de mini-satélites colapsados. 0 = amostra de comparação sem ADN.

Figura 10 - Mapa de RVM do alelo menor MS32 no indivíduo CEPH 10202. A, produtos da digestão parcial por Hinfl (F) e HaelII (H) do alelo amplificado por RCP seguida de cisão com EcoRI e de marcação na extremidade no sítio EcoRI. B, o padrão complementar do mesmo alelo marcado na extremidade no sítio Ciai. C, mapa dos sítios de cisão Hinfl e HaelII no alelo. As localizações dos ini ciadores de RCP A e B não estão representadas.

Figura 11 - Estratégia para o mapeamento da localização de unida des de repetição variantes no interior de um alelo do mini-saté-lite MS32. A, localização dos iniciadores de RCP em relação âs repetições do mini-satélite (rectângulos vazios) e da LTR homólo ga retroviral (rectângulo a cheio) que as rodeia. Também se apre sentam os sítios de restrição para HinFI (F), HaelII (H) e Sau3A (S). As sequências de iniciadores são A, 51-TCACCGGTGAATTCCACAG-ACACT-3'; B, 51-AAGCTCTCCATTTCCAGTTTCTGG-3'; C, 5'-CTTCCTCGTTCT-CCTCAGCCCTAG-3'; D, 5'-CGACTCGCAGATGGAGCAATGGCC-3'. Utilizaram--se derivados Cl e Dl com um prolongamento 51-TCACCGGTGAATTC-contendo um sítio EcoRI cindido eficazmente (sublinhado) a fim de gerar produtos de RCP com um único sítio EcoRI adequado para a marcação na extremidade e o mapeamento. Bf mapeamento interno num alelo de MS32 pequeno do indivíduo CEPH 10208. Este alelo foi amplificado a partir de ADN genõmico usando os iniciadores Cl mais D (esquerda) ou C mais Dl (direita), marcado na extremidade no sítio EcoRI e parcialmente digerido com Hinfl (F) e Hael (H) e em seguida submetido a electoforese em gel de agarose e au to-radiografia. A distribuição das unidades de repetição internas do mini-satélite neste alelo cindido ou não cindido por Hae-III é apresentada em (A). 78

Figura 12 - Mapas de RVM de alelos de MS32 colhidos a partir de várias populações e alinhados para mostrar as semelhanças. Cada alelo está codificado de acordo com a circunstância de cada unidade de repetição ser cindida (a, A) ou não cindida (t, T) por HealII. Cada alelo recebe um número de série (1 a 32) na ordem do comprimento respectivo juntamente com a população de origem (A, Amish; E, inglÊS; F, francês? M, Mormon; Vf venezuelano) e o número de unidades repetidas. As repetições em série de ordem su perior nos mapas de RVM encontram-se indicadas por debaixo dos alelos por —As regiões dos mapas de RVM comuns a mais do que um alelo foram identificadas por comparações de matrizes de pontos de todas as possíveis combinações aos pares de alelos. Os in tervalos (-) foram introduzidos a fim de optimizar os alinhamentos . Deste modo foram identificados quatro haplõtipos 5' comuns (1, 2A, 2B e 3). 0 haplótipo 1 (maiúsculas) prolonga-se por 20 a 21 unidades de repetição. O haplótipo 2A (maiúsculas) é de comprimento mais variável. O haplótipo 2b é constituído pelas primeiras 15 repetições do haplótipo 2A (maiúsculas) seguidas por um número variável de unidades de repetição adicionais (minúsculas sublinhadas). O haplótipo 3 mais curto e identificado provisoriamente (maiúsculas) parece estar preferencialmente associado com alelos que contêm principalmente unidades de repetição do ti^ po 'a'. Os três alelos restantes "outros" não mostram qualquer semelhança significativa com os alelos classificáveis nos 4 grupos haplotípicos 5' principais. As coincidências entre alelos idênticos (3 e 4) e muito parecidos (2A, 25 e 26) encontram-se indicadas por linhas verticais.

Figura 13 - Amplificação de moléculas isoladas de alelos de Ms32 mutantes a partir de ADN espermãtico fraccionado por dimensão. A, fidelidade e eficácia de RCP de moléculas isoladas. Amplifica ram-se alíquotas de 30 pg de misturas resultantes da digestão por Sau3A mais Mbol de ADN espermático de um indivíduo heterozi-gõtico em relação aos alelos 31 e 32 (Figura 3) durante 28 ci-. cios usando os iniciadores de RCP A mais B (Figura IA). Submete-1 ram-se os produtos da RCP a electroforese através de um gel de 79

ι

agarose a 0,8% e a hibridação de mancha de Southern com uma son- 32 da de mmi-satelite MS32 marcada por P. De 40 reacçoes de RCP em duplicado, 28 apresentaram produtos de RCP de ambos os alelos A partir da distribuição de Poisson, este resultado indica uma média de 1,8 acontecimentos de amplificação bem sucedidos por alelo por reacção, em comparação com uma média de entrada de 5 moléculas de cada alelo. Deste modo, 36% das moléculas de MS32 de entrada deram um sinal de PCR. B, acontecimentos de amplifica ção de moléculas isoladas a partir de ADN espermático digerido com Sau3A mais Mbol e fraccionado por dimensão por electoforese em gel. Amplificaram-se alíquotas múltiplas de ADN das fracções SI a S5 cada uma contendo respectivamente ADN a partir do equiva lente a 0,03; 0,15; 0,6; 1,2 e 1,0 pg de ADN espermático total durante 25 ciclos usando os iniciadores de RCP A mais B. Detecta ram-se os produtos de RCP por hibridação de mancha de Southern com uma sonda de mini-satélite de MS32. H, 30 pg de ADN espermático não fraccionado. Apresenta-se a gama de dimensões de cada fracção. C, mini-satélites mutantes em (B) re-amplifiçados usando os iniciadores de RCP associados Cl mais D (legenda da Figura 11) durante 25 a 28 ciclos seguidos de electoforese em gel de agarose e coloração com brometo de etídio. 80

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES - la - Processo para a caracterização de uma amostra de ADN genómico com a referência a uma ou a várias amostras de comparação caracterizado por compreender as fases de amplificar a sequência mini-satélite em pelo menos um local informativo na amostra a analisar por: (i) hibridação da amostra a analisar com um iniciador com respeito a cada local informativo a ser amplificado, sendo o iniciador hibridável com uma cadeia simples da amostra a analisar numa região que ladeia a sequência mini-satélite do local informativo a ser amplificado sob condições tais que é sintetizado um produto de prolongamento do iniciador que ê complementar da referida sequência mini-satélite da cadeia da amostra a analisar e transpõe esta sequência; (ii) separação do produto do prolongamento formado do modo indi cado do molde no qual foi sintetizado a fim de dar origem a moléculas de cadeia simples; (iii) se necessário, hibridação do iniciador da fase (i) com moléculas de cadeia simples obtidas de acordo com a fase (ii) sob condições tais que é sintetizado um produto de prolongamento do iniciador a partir do molde de pelo menos uma das moléculas de cadeia simples obtidas de acordo com a fase (ii) , e (iv) detecção dos produtos de amplificação e comparação destes produtos com uma ou com várias amostras de comparação; sendo este processo efectuado de tal modo que se gera uma quanti dade do produto de prolongamento pretendido suficiente para ser detectável mas tal que o rendimento do produto de prolongamento não é adequado para permitir hibridação sem correspondência entre as cadeias complementares do molde mini-satélite. 81

   2ã Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a amostra a analisar de ADN genômico ser submetida a restrição antes da amplificação e se usar apenas um iniciador com respeito a cada local informativo a ser amplificado. - 33 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender as fases de: (i) hibridar a amostra a analisar com dois iniciadores com res peito a cada local informativo a ser amplificado, sendo ca da iniciador hibridável com cadeias simples da amostra a analisar numa região que ladeia a sequência mini-satélite do local informativo a ser amplificado sob condições tais que é sintetizado um produto de prolongamento de cada iniciador que é complementar da referida sequência mini-satélite de cada cadeia da amostra a analisar e transpõe esta sequência, podendo o produto de prolongamento sintetizado a partir dum iniciador servir de molde para a síntese do produto de prolongamento do outro iniciador; (ii) separar o produto do prolongamento formado do modo indicado do molde no qual foi sintetizado a fim de dar origem a moléculas de cadeia simples; (iii) se necessário, hibridar o iniciador da fase (i) com molécu las de cadeia simples obtidas de acordo com a fase (ii) sob condições tais que é sintetizado um produto de prolongamento do iniciador a partir do molde de cada uma das moléculas de cadeia simples obtidas de acordo com a fase (ii), e (iv) detectar os produtos de amplificação e comparar estes produtos com uma ou com várias amostras de comparação; sendo este processo efectuado de tal modo que se gera uma quanti^ 82

   dade do produto de prolongamento pretendido suficiente para ser detectãvel mas tal que o rendimento do produto de prolongamento não é adequado para permitir hibridação sem correspondência entre as cadeias complementares do molde mini-satélite. - 43 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por os alelos de um local infor mativo na amostra a analisar terem um máximo de 15 quilobases. - 5§ - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado por incluir a fase de utilização de pelo menos uma enzima que digere ou degrada de modo específico o ADN da cadeia simples deixando intacto o ADN de cadeia dupla, de modo a minimizar a formação de produtos de amplificação não específica. - 6ã - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a amplificação ser efectua-da num tampão de força iõnica reduzida e a uma temperatura de têmpera elevada de modo a minimizar os erros de iniciação. - 7a - Processo de acordo com qualquer das rei- 83 I

   vindicações 1 a 6, caracterizado por se amplificarem simultânea mente mais do que um local informativo. - 8§ - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado por ser efectuada a caracteriza ção de uma molécula dum local informativo numa amostra de ADN ge nõmico. - 9§ - Processo para a preparação de um polinu-cleõtido hibridável com uma cadeia simples de uma amostra de ADN genõmico numa região que ladeia a sequência mini-satélite dum lo cal informativo de modo a permitir a formação dum produto de pro longamento que é complementar da referida sequência mini-satélite de cadeia da amostra a analisar e transpõe esta sequência caracterizado por o local informativo ser seleccionado de entre um dos seguintes: MSI, MS29, MS31A e MS31B, MS32, MS43A e MS43B, MS51, MS228A e MS228B. - 10â - Processo para a preparação de um produto de prolongamento polinucleótidico a partir de um iniciador poli-nucleotídico hibridável com uma cadeia simples de uma amostra de ADN genõmico numa região que ladeia a sequência mini-satélite dum local informativo caracterizado por o produto de prolongamen to polinucletídico ser complementar da referida sequência mini-. -satélite e transpor esta sequência da cadeia da amostra a anali sar. 84

   - lia - Processo para a preparação de uma mistura caracterizado por se incorporarem múltiplas cópias fiéis de um produto de prolongamento polinucleotídico obtido de acordo com a reivindicação 10. - 12» - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por se incorporarem os produtos de pelo menos 3 ciclos do processo de amplificação de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7. - 13a - Processo para a preparação de um conjunto de análise (kit) caracterizado por se incluir um iniciador po linucleotídico para a amplificação da sequência mini-satélite em pelo menos um local informativo numa amostra a analisar de ADN genómico, sendo o iniciador hibridável com uma cadeia simples da amostra a analisar numa região que ladeia a sequência mini-saté-lite do local informativo a ser amplificado sob condições tais que é sintetizado um produto de prolongamento do iniciador que ê complementar da sequência mini-satélite da cadeia da amostra a analisar e transpõe esta sequência; e por se incluir adicionalmente uma amostra de ADN de comparação e instruções para utiliza ção. 85 143 - 14a Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por se incluírem no conjunto de análise dois iniciadores polinucleotídicos de flanco complementares com respeito a cada local informativo. A requerente reivindica as prioridades dos pedidos britânicos apresentados em 25 de Novembro de 1988, sob o nQ. 8827544.1 e em 5 de Abril de 1989, sob os nQs. 8907655.8 e 8907653.3. Lisboa, 24 de Novembro de 1989 © ASSaa 0J?IS£lL BL KÍJo.SZSLJ»

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