JP2012516678A - 低分子rna種の定量化のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
マイクロRNAは、約22個のヌクレオチド非翻訳領域RNAの豊富なクラスであり、動物、植物及びウイルスの発生において重要な制御的役割を果たす。マイクロRNAは約15年前にlin−4の発見によって、線形動物C.エレガンスの生活環及び幼生の発生におけるタイミング及び進行に関与する低分子RNAをコードすることが認識されたが(Lee et al. 1993 Cell 75:843-854, Wightman et al.1993 Cell 75:855362)、最近になってやっと、マイクロRNAが動物において広範の制御機能を有する主要クラスのリボレギュレーターを形成することが認められた(Lagos-Quintana et al. 2001 Science 294:853858, Lau et al. 2001 Science 294:858-862, Lee and Ambros. 2001 Science 294:862-86)。それ以降、マイクロRNAの研究における革命が生じ、今日miRBase データベースバージョン12.0(http://microrna.sanqer.ac.uk/)には866人のヒトマイクロRNAが含まれ、PubMedデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.αov/pubmed/)には3900個のマイクロRNA関連論文が含まれ、これらはマイクロRNAの関心及び重要性を反映している。
「低分子RNA分子」は、生細胞中の小さなRNA分子、例えば低分子の「非翻訳領域RNA分子」、すなわちタンパク質に翻訳されない分子を意味する。非翻訳領域RNA分子は、RNA、例えばマイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、低分子核内RNA(snRNA)、低分子核小体RNA(snoRNA)、小分子RNA(stRNA)、アンチジーンRNA(agRNA)及びPiwi結合RNA(piRNA)を含む。
「ポリAテールの添加」、「ポリ−Aテール化」及び「ポリアデニル化」は、RNA分子の3’終末におけるポリ(A)テールの合成、全塩基がアデニンであるRNAの伸展を意味する。ポリアデニル化は、生物における自然の生物プロセスであるが、様々なポリメラーゼ、例えば市販の大腸菌ポリ(A)ポリメラーゼI(E-PAP)を使用して、インビボ(in vitro)で実施することもまた可能である。
好適には、順方向プライマーは、miR配列の5’末端の12〜18個の塩基と同一であるようにデザインされる。好適には、順方向プライマーのTmは、55℃〜65℃の範囲内とすべきであるが、しかしながら、55℃以下及び65℃以上のTmもまた容認可能である。プライマーのTmは好適には55℃〜65℃の範囲内であることを確実にするために、1又は複数のLNA単量体を天然のヌクレオチドを置換している配列に挿入してよい。人工のヌクレオチド配列もまた、Tmが55℃〜65℃の範囲内であることを確かめるために、順方向プライマーの5’末端に添加してよい。
逆方向プライマーは、式II:
R3−(T)x−R4(II)
(式中、
R3は、5’末端ヌクレオチド配列であり、
(T)xは、量xで連続したチミン残基である中央部分であり、ここでxは1〜100の整数であり、
そしてR4が、マイクロRNA分子の一部と特異的にハイブリッド形成する3’末端のヌクレオチド配列である)のものである。
R4は、好適には、特異的miRNAの3’末端からデザインされた1〜10個のヌクレオチドのヌクレオチド配列である。R4は、対応するmiRNA特異的順方向プライマーの伸展によって生成されるDNA鎖(すなわち、上鎖)と特異的にハイブリッド形成することができる。miRNA特異性を確実にし、且つプライマーのTmが好適には55℃〜65℃の範囲内であることを確かめるために、1又は複数のLNA単量体は対応する天然のヌクレオチドを置換しているR4配列に挿入してよい。
1)miRヌクレオチド配列の3’末端から全アデニン残基を除去する。これらはポリAテールの一部を形成するであろう。
2)アデニン残基の除去後、miRの3’末端塩基に逆相補的な配列から始まり、1塩基が順方向プライマーと重なるまで続ける。
3)逆方向プライマーの3’末端配列がシトシン残基であり、順方向プライマーの3’末端がグアニン残基の場合、逆方向プライマーの3’末端から1塩基を除去する。
4)配列がグアニン残基であり、順方向プライマーの3’末端がシトシン残基である場合、プライマーの3’末端から1塩基を除去する。
5)最後の2つの塩基が、順方向プライマーの(3’末端から)最後の2つの塩基と重複している場合、プライマーの3’末端から1塩基を除去する。
6)条件が満たされるまで、このプロセスを繰り返す。
7)条件を満たすプライマーが存在しない場合、ルール#2及び3に構わず、AA、AT、TA又はTTをコードする配列に関して2つの塩基を重ねる(しかし、それ以上は重ねない)。
8)条件を満たすプライマーが存在しない場合、他の順方向プライマーデザインを試す。
を満たす多数のプライマーをデザインする。
1)少なくとも4塩基長。
2)プライマーの3’末端における最後6塩基中、5個以下のシトシン残基及びグアニン残基。
3)最後又は最後から2番目の塩基がアデニン残基又はチミン残基の場合を除き、プライマーの3’末端における最後の5塩基中、4以下のシトシン残基及びグアニン残基。
4)可能であれば、3’末端において2以下のアデニン残基又はチミン残基。
5)当該条件を満たすプライマーが存在しない場合、他の順方向プライマーデザインを試す。
1)逆方向プライマーのR4部分の5’末端から第一のシトシン残基又はグアニン残基において、LNAを挿入する。
2)3つ又はそれ以上連続したシトシン残基又はグアニン残基を有する配列中にLNAが存在しない。
3)LNAは、プライマーの3’末端から4位又はそれ以上の位置に存在すべきである。
4)当該条件を満たすことができない場合、逆方向プライマーのR4部分の5’末端から第一のアデニン残基又はチミン残基においてLNAを挿入する。
5)LNAは、プライマーの3’末端から4位又はそれ以上の位置に存在すべきである。
6)当該条件を満たすことができない場合、プライマーのR4部分の3’末端においてLNAチミン(LNA-T)を挿入する。
式、
R3−(T)x、
の配列を逆方向プライマーの5’末端に添加する。本発明の一定の実施形態におけるヌクレオチド配列:
5’−TGACACGGAGGTACTAGTTTTTTTTTTTTTT−3’(配列番号4)を逆方向プライマーの5’末端に添加する。
αRT−PCR反応及び関連のプライマーの詳細な概略:
本発明は、試料中のマイクロRNA分子の増幅のための方法を供し、当該方法は、図1に模式的に記載される工程を含んでなり:
(a)試料中のRNA分子の集合にポリAテールを添加する工程;
(b)逆転写反応において伸展プライマーを使用して、ポリAテール化されたRNA分子のcDNA分子を生成する工程;及び
(c)当該RNA分子に特異的な順方向プライマー及び逆方向プライマーをいずれも使用して、PCRによってcDNA分子を増幅する工程、
を含んでなる。
R1−(T)y−R2(III)
(式中、
R1が、5’末端ヌクレオチド配列であり、
(T)yが、量yで連続したチミン残基の中央部分であり、ここでyが1〜100の整数であり、
R2が3’末端ヌクレオチド配列である。)のプライマーである。
R3−(T)x−R4(II)
(式中、
R3が、5’末端ヌクレオチド配列であり、
(T)xが、量xで連続したチミンヌクレオチドの中央部分であり、ここでxが、1〜100の整数であり、
R4が、標的RNA分子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成する3’末端ヌクレオチド配列である。)
のプライマーである。
本発明はまた、本発明において使用される順方向プライマー及び逆方向プライマーのヌクレオチド配列をデザインするための方法を供する。プライマーの体系的アプローチ及び実験評価を実施例3のセクションに示す。
本発明は、実施例5及び9において記載されるように、ヒト又は他の生物から生じる様々な細胞又は組織における、低分子RNA分子、例えば、マイクロRNA又はsiRNAの増幅及び定量化に有用である。実施例10において説明されるように、本願の方法は、多少類似する市販の1つのチューブ内cDNA合成アプローチと比較した場合に、感度及び特異性に関して優れている。
a)請求項1〜28のいずれか1項に記載の方法に従って、標的マイクロRNAを増幅する工程、
b)増幅されたDNA分子の量を測定する工程、
を含んでなる。
a)式I:R1−(T)y−R2(III)
(式中、
R1は、5’末端ヌクレオチド配列であり、
(T)yは、量yで連続したチミン残基である中央部分であり、ここでyが1〜100の整数であり、
R2が、3’末端ヌクレオチド配列である)
の伸展プライマー、
b)式II:R3−(T)x−R4(II)
(式中、
R3は、5’末端ヌクレオチド配列であり、
(T)xは、量xで連続したチミン残基である中央部分であり、ここでxが1〜100の整数であり、
R4が、標的RNA分子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成する、3’末端ヌクレオチド配列である)
の逆方向プライマー、並びに
c)順方向プライマー、
を含んでなる。
一実施形態において、キットは、標的マイクロRNAの検出に特異的な少なくとも1つのプライマーセットを含んでなる、少なくとも1つの哺乳類標的マイクロRNAを検出するためにデザインされる。
a)試料における低分子RNA分子の集合へポリAテールを添加し、逆転写反応において伸展プライマーを使用してポリAテール化された低分子RNA分子のcDNA分子を生成する工程、
b)結合されたポリAテール化及び逆転写反応物の一定分量を、マイクロタイタープレートの個々のウェル中にピペットする工程、
c)マイクロRNA特異的プライマーセットを含むマイクロタイタープレートの個々のウェル中で、特異的標的マイクロRNAを増幅する工程、並びに
d)個々のウェル中で特異的マイクロRNA分子の量を測定する工程、
を含んでなり、高処理量の実験装置に適合する様式で実施されることを特徴とする方法である。
例えば、装置は、典型的には1又は複数のピペットロボットを含んでなる。
この実施例において、本発明のmiR特異的定量的逆転写PCR(qRT-PCR)を使用して、hsa−miR−197をヒトRNA試料から増幅した。
・1μl 10x ポリ(A)ポリメラーゼバッファー(New England Biolabs)
・1μl 1mM ATP
・1μl 10μM RTプライマー(=伸展プライマー)(L2TA:5’−ggtactagtttttttttttttttvn(配列番号5), vはシトシン, グアニン及びアデニン残基を指定し, nはシトシン, グアニン, アデニン及びチミン残基を指定する)。
・1mM dATP、1mM dCTP、1mM dGTP、1mM dTTPの1μl混合
・0,5μl(200U/μl)MuLV逆転写酵素(New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, US)
・0.2μl(5U/μl)ポリ(A)ポリメラーゼ(New England Biolabs)
・1μl RNA試料(全てAmbion, Austin, TX, US由来の、総ヒトRNA試料=25ngヒト心臓RNA, 25ngヒト脳RNA, 25ngヒト肝臓RNA及び25ngヒト肺RNAの100ngの混合物。TE中の10ng/μlファージMS2 RNAにおいて, 合成テンプレートを調製し,約107コピーを反応に添加した。Integrated DNA technology Inc., Coralville, IA, US.から合成テンプレートを得た。)
・10μlまでの水
・10μl 2x PCRmastermix(Roche cat#04 673 484 001, Roche Diagnostics A/S, Hvidovre, Denmark)
・1μl以下のRT反応物
・2.5μM miR特異的順方向プライマー及び2.5μM miR特異的逆方向プライマーを有する1μl TEバッファー(TEバッファー: 10mM Tris/HCI (pH 8.0), 1mM EDTA)
・20μlまでの水
を含んだ。
工程2のmiR特異的PCRプライマーの異なるデザインの効果は、逆転写反応の生成物として同一の配列を有する人工のDNAテンプレート上でテストすることができる。PCRに人工のDNAテンプレートを使用する重要な利点は、逆転写工程の効率における実験変動が排除されることである。
miR特異的順方向プライマー:
F7a:5’−tGaGgtagtaggttg(配列番号7)(小文字は自然発生のヌクレオチドを指定し、大文字はLNAを指定す)。
miR特異的逆方向プライマー:
・550μl 2x PCR mastermix(Roche cat#04 673 484 001)
・440μlの水、及び表1に記載する通り。
定義セクションの「プライマーデザイン」部分に示されるデザインルールに従って、プライマーを手作業でデザインした。
プライマーデザインルールを使用することによって、リアルタイムPCR実験において次の検証基準に従って>70%成功率を有するPCRプライマーを達成することが可能である:
4つの逆転写(RT)試料のためのRtmixの調製:
1.水
2.100ngの総ヒトRNAmix*(デフォルトとして、我々はAmbion由来の各心臓, 脳, 肝臓及び肺の総RNAの25ngの混合を使用する)。
*RNA混合物:1μl 1μg/μl心臓RNA、1μl 1μg/μl脳RNA、1μl 1μg/μl肝臓RNA、1μl 1μg/μl肺RNA、36μlTE。−80℃で1μl一定分量で保存。
3.ポリAテール化なしの100ng総ヒトRNA混合物。
4.TEにおける10ngファージMS2 RNA中の合成miRの107コピー(合成miRをIntegrated DNA technologies Inc., Coralville, IA, US. から得た)。miRを、少なくとも20個のmiRまで含んでなるプールとして添加することができる。
試料1:#2及び4の指数関数エリアと比較して40以上上回るサイクル閾値(Ct)。5000下回る融解ピークの導関数。
試料2:35下回るCt
釣鐘状の融解曲線上の1ピーク、言い換えればピークは69℃〜80℃の間に位置すべきことが最もである。試料4と同一温度(+/- 0.5℃)においてピークとなる。
指数関数的エリアにおいて、10倍のデルタRnにおけるクロッシングポイント(crossing point)からデルタRnにおけるクロッシングポイントを引いたものが、3.2〜4.4の間に存在すべきである:3.2<(C10T-CT)<4.4
試料3:#2及び4の指数関数的エリアと比較して40以上上回るCt。
5000下回る融解ピークの導関数。
試料4:釣鐘状の融解曲線上の1ピーク、言い換えればピークは69℃〜80℃の間に位置すべきことが最もである。試料2と同一温度(+/- 0.5℃)においてピークとなる。
hsa−let−7aの配列から1つのヌクレオチドのみ異なる3つのmiRが存在する(下記の表)。
氷上で混合した:
RT mix:
・1μl 10xPAPバッファー(Epicentre Biotechnologies,Madison, WI, US.)
・1μl 1mM ATP
・1μl 10μM RTプライマー(L2TA:5’-ggtactagtttttttttttttttvn(配列番号5),vはc, g及びaを指定し、nはc, g, a及びtを指定する。))
・1mM dATP、1mM dCTP、1mM dGTP、1mM dTTPの1μlの混合
・0,5μl 2ユニット/μl Transcriptor(Roche Diagnostics A/S, Hvidovre, Denmark, cat# 03 531 295 001)。
・0,2μl(5U/μl)ポリ(A)ポリメラーゼ(Epicentre)
・4.5μlの水
・10μl 2x PCR mastermix(Roche cat#04 673 484 001)
・1μl以下のRT反応物
・2.5μM miR特異的順方向プライマー及び2.5μM miR特異的逆方向プライマーを有する1μlTE
・20μlまでの水
を含む。
この実施例において、総ヒト脳RNA(Ambion)におけるmiR/hsa−let−7a、hsa−miR−21、hsa−miR−27b及びhsa−miR−195のコピー数を測定した。
氷上で混合した:
RT mix:
・1μl 10x PAPバッファー(New England Biolabs)
・1μl 1mM ATP
・1μl 10μM RT−プライマー(L2TA: 5'-ggtactagtttttttttttttttvn (配列番号5), vはシトシン, グアニン及びアデニン残基を指定し,nはシトシン, グアニン, アデニン及びチミン残基を指定する)。
・1mM dATP、1mM dCTP、1mM dGTP、1mM dTTPの1μlの混合
・0.5μl 2ユニット/μl Transcriptor(Roche cat# 03 531 295 001, Roche Diagnostics A/S,Hvidovre, Denmark)。
・0.5μl(5U/μl)ポリ(A)ポリメラーゼ(New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, US)
・3μlの水
TE:10mM Tris/HCl(pH 8.0)、1mM EDTA。
・10μl 2x PCR mastermix(Roche cat#04 673 484 001)
・1μl以下のRT反応物
・2.5μM miR特異的順方向プライマー、及び2.5μM miR特異的逆方向プライマーを有する1μlTE
・20μlまでの水
を含んだ。
この実施例は、hsa−miR−10aアッセイが対応するプレmiR、hsa−プレmiR−10aを検出しないことを示す。同様に、hsa−miR−10aではなく、hsa−プレmiR−10aを検出するアッセイを行うためのプライマーデザインを使用することが可能である。
氷上で混合した:
RT mix:
・1μl 10x PAPバッファー(New England Biolabs)
・1μl 1mM ATP
・1μl 10μM RT−プライマー(L2TA: 5'-ggtactagtttttttttttttttvn (配列番号5), vはシトシン, グアニン及びアデニン残基を指定し,nはシトシン, グアニン, アデニン及びチミン残基を指定する)。
・1mM dATP、1mM dCTP、1mM dGTP、1mM dTTPの1μlの混合
・0.5μl 2ユニット/μl Transcriptor(Roche cat# 03 531 295 001)。
・0.5μl(5U/μl)ポリ(A)ポリメラーゼ(New England Biolabs)
・3μlの水
・10μl 2x PCR mastermix(Roche cat#04 673 484 001)
・1μl以下のRT反応物
・2.5μM miR特異的順方向プライマー及び2.5μM miR特異的逆方向プライマーを有する1μlTE
・20μlまでの水
を含んだ。
この実施例において、総ヒトRNA中のhsa−miR−10a及び対応するプレmiR、hsa−プレmiR−10aを検出した。
氷上で混合した:
RT mix:
・1μl 10x PAPバッファー(New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, US)
・1μl 1mM ATP
・1μl 10μM RT−プライマー(L2TA: 5'-ggtactagtttttttttttttttvn (配列番号5), vはシトシン, グアニン及びアデニン残基を指定し,nはシトシン, グアニン, アデニン及びチミン残基を指定する)。
・1mM dATP、1mM dCTP、1mM dGTP、1mM dTTPの1μlの混合
・0.5μl 2ユニット/μl Transcriptor(Roche cat# 03 531 295 001)。
・0.5μl(5U/μl)ポリ(A)ポリメラーゼ(New England Biolabs)
・3μlの水
TEバッファー:10mM Tris/HCl(pH 8.0)、1mM EDTA。
・10μl 2x PCR mastermix(Roche cat#04 673 484 001)
・1μl以下のRT反応物
・2.5μM miR特異的順方向プライマー及び2.5μM miR特異的逆方向プライマーを有する1μlTE
・20μlまでの水
を含んだ。
実験の目的:この出願において記載されるユニバーサル逆転写酵素定量的PCR方法論(UniRT qPCR)が、対応する成熟miRの共検出なしに特異的にプレmiRを検出するために使用することができるかを決定すること。
・合成RNA 1*106分子
・5x UniRT反応バッファー 2μl
・10x 酵素混合物 1μl
・10μlまでの水
42℃で60分間インキュベートし、85℃で5分間熱変性する。水中で10x希釈する。
SYBR Green Master Mix,UniRT(Exiqon AS, Cat.No. 203400)でのqPCR
Mix:
・プライマーmix(それぞれ3uM) 1μl
・SYBR green master mix 5μl
・cDNAテンプレート 1μl
・水 3μl
2つのプライマーの混合を使用した:1)miR−203(miR-203. Fwd及びmiR-203.Revプライマー)及び2)プレmiR−203(プレmiR-203. Fwd及びmiR-203. Revプライマー)。使用したテンプレートは、mir−203及びプレmir−203であった。テンプレート対照(NTC)qPCRはまた、各PCRアッセイのために行わなかった。全てのqPCRを、2通り行った。
1.95℃で10分間
2.95℃で10秒間
3.60℃で分間
SYBR green(HRM dye)でのシグナル検出を開始した。工程2〜3を45回繰り返し、続いて融解曲線分析を行った。
標準miR−203プライマーは、Cp値28,86でmiR−203テンプレートを良好に検出する。また、miR−203アッセイは、miRはプレmir−203の3’末端に位置するので、特にプレmiR−203を検出する(30,125のCp)。プレmiR−203アッセイデザインは、Cp値25,7でプレmiRを検出するが、成熟miR−203はプレmiR−203特異的アッセイで検出されない(Cp=40)。このデータは、プレmir特異的アッセイをプレmiR分子を特異的に標的にするようデザインすることができることを明確に示す。
実験の目的は、心臓及び肝臓組織間で異なって発現される、良好に発現されたmiRNAを、本発明のSYBR green ユニバーサル逆転写酵素定量的PCR(UniRT qPCR)方法に基づいたqPCRアレイを使用して識別することができるかを決定することである。
肝臓及び全心臓由来の総RNAはAmbion Inc.から購入し、ヌクレアーゼ非含有の水中で濃度10ng/μlまで希釈し、−80℃で貯蔵した。我々は、文献(例えば: Liang, Y., et al. (2007) BMC Genomics. 8: ppl66 and Landgraf P., et al.(2007) Nature Biotechnol. (9): pp 996-7) を参照されたい)から、心臓及び肝臓組織試料において異なって発現されることが知られる数個のmiRNAを選択した。選択したmiRは、hsa−miR−1、hsa−miR−126及びhsa−miR−133b(心臓)並びにhsa−miR−192、hsa−miR−122*、hsa−miR−194及びhsa−miR−122(肝臓)であった。
・総RNA20ng
・5x UniRT反応バッファー 4μl
・酵素混合物 2μl
・20μlまでの水
42℃で60分間インキュベートし、85℃で5分間熱変性する。ヌクレアーゼ非含有水中でcDNA1/100を希釈する。
5μlの希釈したcDNAを、下記の7つのmiRアッセイの乾燥したプライマーセットで384ウェルプレート中で、5μlのSYBR Green Master Mix、UniRT(Exiqon AS, Cat.No. 203400)と混合した。プレートを密閉し、増幅及び分析のために直接LightCyclerの上に置いた。
1.95℃で10分間
2.95℃で10秒間
3.60℃で1分間
我々は、心臓及び肝臓組織間で異なって発現するように、文献により以前から周知の計7個のmiRNAを選択した。表15及び図7に結果を示す。得られたデータは、3つの遺伝子miR−1、miR−133b及び126が全て、肝臓試料よりも心臓試料において多量の発現を示していることを示した。同様に、miR−192、miR−194及びmiR−122並びに122*は、心臓よりも肝臓において多量の発現を示している。違いは、2.6〜12.9Cpの範囲に渡っており、これは発現における5倍〜1000倍以上の違いの範囲に相当する。一般的に、文献から記載される異なって発現されたmiRは、本明細書に記載されるアッセイを使用して、容易にUniRT発現プラットフォームによって識別される。
本発明において記載されるLNAベースのデザインを、市販のDNAベースの生成物、miScript逆転写キット(Qiagen, Cat. no. 218060, QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)と比較した。このDNAベースの生成物はまた、miRNA3’末端ポリアデニル化工程、続くDNAベースのポリdTプライマーの逆転写に依存しており、ここでいずれの反応も1つのチューブ内反応中で生じる。これらの方法はいずれも同一の酵素工程を使用するため、miScriptはプライマー中にLNAを含まないので比較は非常に良好に本発明のLNAベースの方法の驚くべき利点を説明する。他の違いは、miScriptはRTプライマーと共に添加されるユニバーサルなタグに特異的な逆方向プライマーを使用し、一方本願の方法のLNAベースの逆方向プライマーは検出されているmiRNAに特異的なことである。
製造者の使用説明書に従ってユニバーサルcDNA合成キット(Exiqon A/S, Vedbaek, Denmark., Prod. No. 203300)又はmiScript逆転写キット(Qiagen, Cat. no. 218060, QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)を使用して、(Integrated DNA technology Inc., Coralville, IA, US. から得た)合成miRNA標的の希釈系列上で、10ng/μl MS2バクテリオファージRNA(Roche Applied Science, Catalog Number 10165948001)のバックグラウンドで逆転写を実施した。
ユニバーサルcDNA合成キット(Exiqon, Prod. No. 203300)を使用して得られたcDNA上で、SYBR Green master mix、ユニバーサルRT(Exiqon, Prod. No. 203400)及び表17に記載されたプライマーセットを使用してqPCRを実施した。miScript逆転写キット(Qiagen, Cat. no. 218060)を使用して得られたcDNA上で、miScript SYBR Green PCRキット(Qiagen, Cat. no. 218073)を使用してqPCRを実施した。いずれの場合においても、製造者によって説示されるサイクル条件を使用して、Roche LC480 LightCycler(Roche Diagnostics A/S, Hvidovre, Denmark)上で増幅及び検出を実施した。各cDNA/アッセイの組合せを3通り行った。
図8は、4つのテストした各miRNAに関して、実験において得られたテンプレート濃度に対する3通りのCp値を示す。比較したアッセイの4つ全てにおいて、本発明の方法(ひし形に結合している黒線)は、本発明のアッセイで一貫して得られた低Cp値によって示される通り、miScriptアッセイ(球に結合している灰色線)より感度が高かった。hsa−let−7aの場合、定量的に検出された最低コピー数として測定された、本発明のアッセイは10倍の改良された感度を有した。hsa−miR−143及びhsa−miR−155に関しては、感度における違いは、本発明のアッセイの使用によって100倍となった。非常に低いgc量(表16を参照されたい)且つそれ故低融解温度であるhsa−miR−1に関して、RNAの最高濃度においてさえ代替のアッセイを、テンプレートを検出するために使用することができなかった。本発明においてデザインされたアッセイは、PCR反応においてわずか10miRNAコピーを定量的に検出した。このデータは、本発明のアッセイが驚くことに感度が高いことを明確に示す。この感度における改善が、5’「タグ配列」(R1)及び3’「アンカー配列」(R2)いずれも含んでなる伸展プライマーのデザインに部分的に、並びにLNAを含むqPCR反応のテンプレート特異的(例えば、miR特異的)順及び逆方向プライマーのテンプレート特異的(例えば、miR特異的)順及び逆方向プライマーデザインに部分的に基づくと、我々は考えている。我々の結果は、順及び逆方向プライマーの遺伝子特異的デザインによって、ユニバーサル逆方向プライマーを使用した純粋なDNAプライマーによるものよりも、より高い感度検出が可能であることを示す。
Claims (45)
- 試料における特定のRNA分子の増幅のための方法であって:
a)試料におけるRNA分子の集合にポリAテールを添加する工程;
b)逆転写反応においてプライマーを使用して、ポリAテール化したRNA分子のcDNA分子を生成する工程;及び
c)上記特定RNA分子に特異的である、順方向プライマー及び逆方向プライマーをいずれも使用して、PCRによってcDNA分子を増幅する工程、
を含んでなる方法。 - 前記特定RNA分子が低分子の、非翻訳領域RNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記特定低分子RNA分子がマイクロRNAである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記伸展プライマーが、10〜100ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記伸展プライマーが、15〜45ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項4に記載の方法。
- 前記伸展プライマーが、式III:
R1−(T)y−R2(III)
(式中、
R1が、5’末端ヌクレオチド配列であり、
(T)yは、y個連続したチミン残基の中央部分であり、ここでyが1〜100の整数であり、そして
R2が、3’末端ヌクレオチド配列である)
のヌクレオチド配列である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。 - 前記R1が、1〜30ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列である、請求項6に記載の方法。
- 前記R1が、6〜10ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列である、請求項7に記載の方法。
- 前記R1が、8ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列である、請求項8に記載の方法。
- 前記yが、5〜50の整数である、請求項6〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記yが、5〜21の整数である、請求項10に記載の方法。
- 前記yが、12、13、14、15、16、17又は18である、請求項11に記載の方法。
- 前記yが15である、請求項12に記載の方法。
- 前記R2が、2つの3’末端ヌクレオチド残基から成る配列モチーフVNであり、ここでVはアデニン残基、グアニン残基、又はシトシン残基であり、Nはアデニン残基、グアニン残基、シトシン残基又はチミン残基である、請求項6〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記R2が、3つの3’末端ヌクレオチドから成る配列モチーフVNNであり、ここでVは、アデニン残基、グアニン残基、又はシトシン残基であり、Nは、アデニン残基、グアニン残基、シトシン残基又はチミン残基である、請求項6〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記伸展プライマーが、少なくとも1つのLNAを含んでなる、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記順方向プライマーが、10〜100ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記順方向プライマーが、少なくとも1つのLNAを含んでなる、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記順方向プライマーが、標的RNA分子の相補的DNA分子と特異的にハイブリッド形成するようにデザインされる、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記逆方向プライマーが、式II:
R3−(T)x−R4(II)
(式中、
R3は、5’末端ヌクレオチド配列であり、
(T)xは、x個連続したチミン残基の中央部分であり、ここでxが1〜100の整数であり、
R4が、標的RNA分子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成する3’末端ヌクレオチド配列である)
のヌクレオチド配列である、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。 - 前記R3が、1〜30ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列である、請求項20に記載の方法。
- 前記xが、5〜50である、請求項20又は21に記載の方法。
- 前記xが、5〜21である、請求項22に記載の方法。
- 前記xが、15である、請求項23に記載の方法。
- 前記式(II)のxが、式(III)のyと同等である、請求項20〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記R4が、1〜10ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項20〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記R4が、少なくとも1つのLNAを含んでなる、請求項20〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記R4が、1つのLNAのみ含む、請求項27に記載の方法。
- 前記R4が、標的RNAの3’末端と特異的にハイブリッド形成するようにデザインされる、請求項20〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記LNAが、逆方向プライマーのR4部分の5’位又は5’位に隣接した位置に位置する、請求項27〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 生物由来の試料における標的マイクロRNAの量を測定するための方法であって:
a)請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法に従って、標的マイクロRNAを増幅する工程、
b)増幅されたDNA分子の量を測定する工程、
を含んでなる方法。 - 前記増幅されたDNA分子の量を、蛍光ベースの定量的リアルタイムPCR方法を使用して測定する、請求項31に記載の方法。
- 前記増幅されたDNA分子の量を、SYBR(登録商標)green色素を使用して測定する、請求項31又は32に記載の方法。
- 標的RNAの検出に特異的な少なくとも1つのプライマーセットを含んでなる、少なくとも1つの標的RNAを検出するためのキットであって、
上記プライマーセットが:
a)式III:
R1−(T)y−R2(III)
(式中、
R1は、5’末端ヌクレオチド配列であり、
(T)yは、y個連続したチミン残基の中央部分であり、ここでyが1〜100の整数であり、
R2が、3’末端ヌクレオチド配列である)
の伸展プライマー
b)式II:
R3−(T)x−R4(II)
(式中、
R3は、5’末端ヌクレオチド配列であり、
(T)xは、x個連続したチミン残基の中央部分であり、ここでxが1〜100の整数であり、
R4が、標的RNA分子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成する、3’末端ヌクレオチド配列である)
の逆方向プライマー、並びに
c)順方向プライマー、
を含んでなるキット。 - 標的マイクロRNAの検出に特異的な少なくとも1つのプライマーセットを含んでなる、少なくとも1つの哺乳類標的マイクロRNAを検出するための、請求項34に記載のキット。
- 前記順方向プライマーが、10〜100ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項34又は35に記載のキット。
- 前記順方向プライマーが、少なくとも1つのLNAを含んでなる、請求項34〜36のいずれか1項に記載のキット。
- 前記逆方向プライマーが、少なくとも1つのLNAを含んでなる、請求項34〜37のいずれか1項に記載のキット。
- 前記順方向プライマーが、標的マイクロRNA分子の相補的DNA分子に特異的にハイブリッド形成するようにデザインされる、請求項34〜38のいずれか1項に記載のキット。
- 前記逆方向プライマーが、請求項27〜30のいずれか1項に記載の逆方向プライマーである、請求項34〜39のいずれか1項に記載のキット。
- 前記少なくとも1つの哺乳類標的マイクロRNAが、ヒトマイクロRNAである、請求項34〜40のいずれか1項に記載のキット。
- 前記少なくとも1つの哺乳類標的マイクロRNAが、miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/)から入手できる全ての周知のヒトマイクロRNAから成る群から選択される、請求項34〜41のいずれか1項に記載のキット。
- 前記少なくとも1つの哺乳類標的マイクロRNAが、マウスのマイクロRNAである、請求項34〜41のいずれか1項に記載のキット。
- 請求項1〜33のいずれか1項に記載の、生物由来の試料における特定の標的マイクロRNAを検出する又は特定の標的マイクロRNAの量を測定するための高処理量方法であって、結合されたポリAテール化及び逆転写反応物を、順及び逆方向プライマーのマイクロRNA特異的プライマーセットを含んでなるマイクロタイタープレートの個々のウェル中に分注する分配工程をさらに含んでなり、結果として:
c)試料における低分子RNA分子の集合へポリAテールを添加し、逆転写反応において伸展プライマーを使用してポリAテール化された低分子RNA分子のcDNA分子を生成する工程;
d)上記結合されたポリAテール化及び逆転写反応の一定分量を、マイクロタイタープレートの個々のウェル中にピペットする工程、
e)マイクロRNA特異的プライマーセットを含むマイクロタイタープレートの個々のウェル中で、特定の標的マイクロRNAを増幅する工程、並びに
f)個々のウェル中で特定のマイクロRNA分子の量を測定する工程、
を含んでなり、高処理量の実験装置に適合する様式で実施されることを特徴とする方法。 - 表18に開示されるオリゴヌクレオチドの群から選択されるオリゴヌクレオチド。
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