WO2013111800A1 - Ｈｉｖ検出用オリゴヌクレオチド、ｈｉｖ検出キット、及びｈｉｖ検出方法 - Google Patents

Ｈｉｖ検出用オリゴヌクレオチド、ｈｉｖ検出キット、及びｈｉｖ検出方法 Download PDF

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hiv detection
detection
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壮利 水谷
彩 石坂
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to an oligonucleotide for detecting a human immunodeficiency virus (hereinafter referred to as HIV), an HIV detection kit, and an HIV detection method.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2012-013087 filed in Japan on January 25, 2012, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • HIV infection that is the cause of acquired immunodeficiency syndrome (hereinafter referred to as AIDS)
  • AIDS acquired immunodeficiency syndrome
  • the detection sensitivity of the virus in the diagnostic technique is low, HIV has disappeared from the body even though HIV is latent in the body. There is a risk of being misdiagnosed as a thing, leaving the roots of AIDS recurrence.
  • HAART therapy High Active Anti-Retroviral Therapy: hereinafter referred to as HAART therapy
  • HAART therapy is a method in which a plurality of inhibitors that inhibit reverse transcription of viral RNA, insertion of viral DNA into genomic DNA, and the like in the acute infection period described above are administered.
  • HAART therapy anti-HIV therapy has undergone significant development.
  • some infected cells acquire resistance to the HAART therapy (hereinafter, this infected cell is referred to as a latently infected cell).
  • this infected cell is referred to as a latently infected cell.
  • the viral life cycle observed in the acute infection phase is halted and no viral RNA is produced.
  • HAART therapy inhibits each step of virus growth as described above, it is difficult to remove virus from latently infected cells by HAART therapy.
  • discontinuing HAART therapy restarts the viral life cycle in latently infected cells. Therefore, the inability to remove viruses from latently infected cells has an adverse effect on QOL (Quality of Life) of HIV patients.
  • QOL Quality of Life
  • the latently infected cell contained a short RNA of about 60 bases. It was found out (see Non-Patent Document 1).
  • the HIV RNA quantification method using the real-time PCR method as the principle of amplification and detection of the target nucleic acid is known as one of the rapid diagnosis methods for HIV infection.
  • Examples of the HIV RNA quantification method using the real-time PCR method include the method described in Patent Document 1.
  • the method described in Patent Document 1 is a method for amplifying and quantifying HIV-1 provirus inserted into the genome using degenerate primers designed to recognize various subtypes of HIV-1. . This method is excellent in that it can be applied not only to subtype B, which is the main infection source of Japanese infected persons, but also to various other subtypes.
  • HIV since HIV has a reverse transcriptase with low fidelity (accuracy), it is a virus that is very susceptible to mutation.
  • the sequence of the oligonucleotide recognizing HIV described in Patent Document 1 is derived from the gag gene region encoding the structural protein GAG located about 500 bases downstream from the transcription start point. It is not enough to detect all the viruses with high accuracy.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides an oligonucleotide for HIV detection, an HIV detection kit, and an HIV detection method capable of early detection of HIV with high accuracy and high sensitivity. Let it be an issue.
  • the present invention shows that specific RNA is transcribed in HIV-infected cells during the latent infection period, and that HIV viral RNA is less susceptible to mutation during reverse transcription. And the present invention was completed.
  • the present invention provides an oligonucleotide for HIV detection, an HIV detection kit, and an HIV detection method having the following characteristics.
  • An oligonucleotide for HIV detection characterized by having 80% or more identity with a base sequence consisting of 10 or more consecutive bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 6.
  • Second for HIV detection according to (1) characterized by having 90% or more identity with a base sequence comprising 10 or more consecutive bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 6 Oligonucleotide.
  • the HIV detection product according to (1) which has 95% or more identity with a base sequence composed of 10 or more consecutive bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 6 Oligonucleotide.
  • HIV even if a mutation occurs in HIV in an HIV-infected cell, such a virus can be detected with high accuracy. Moreover, according to the present invention, HIV can be detected early and with high sensitivity even during the latent infection period.
  • FIG. 1 It is a detection result of HIV-1 short-chain RNA using Real Time PCR in Example 1, Example 2, and Comparative Example 1. It is a base sequence analysis result of about 60 bases short chain RNA in Experimental example 2.
  • FIG. It is a result of quantitative PCR in Experimental Example 3. It is a calibration curve in Experimental Example 3. It is explanatory drawing of the detection system of the short chain RNA produced in the HIV infection cell of this invention.
  • the oligonucleotide for HIV detection of the present invention has 80% or more identity with a base sequence composed of 10 or more consecutive bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 6.
  • a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 6 In the oligonucleotide for HIV detection of the present invention, one to a plurality of bases may be deleted, inserted or substituted with respect to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 6 within the range of identity.
  • the oligonucleotide for HIV detection of the present invention preferably has 90% or more identity with a base sequence consisting of 10 or more consecutive bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 6.
  • SEQ ID NO: 1 5'-GTCTCTCTGGTTAGACCCAGATCTGAGCTCTGGGAGCTCTCTGGCTAGCTAGGGGAACCCCACTGCTG-3 CTIGC CTIGCT It is a part of a TAR (Trans Activation Response region) sequence that exists in a Long Terminal Repeat (Long Terminal Repeat).
  • HIV-1 There are two types of HIV: HIV-1 and HIV-2.
  • HIV detection oligonucleotide of the present invention can specifically detect only HIV-1 without depending on the subtype.
  • HIV TAR sequences are involved in the transcriptional control of viral genes and are present in the LTRs located at the 5 'and 3' ends of the viral genome.
  • the TAR sequence is highly conserved among HIV-1 subtypes, and the transcriptional activation factor tat (Trans AcTivator) binds to the TAR sequence to promote transcription of the viral gene.
  • the TAR sequence is a site to which a transcriptional activator binds, and from the viewpoint that transcription of a viral gene is strictly controlled through such binding, the present inventor is unlikely to be mutated. I found out that it was a place. Therefore, since the oligonucleotide for HIV detection of the present invention includes a sequence that recognizes the TAR sequence and can also recognize mutated HIV, it can detect HIV with high accuracy.
  • the oligonucleotide for HIV detection of the present invention is preferably DNA, and is not limited to natural and non-natural, as long as it has the same function as DNA.
  • Artificial nucleic acids such as PNA (peptide nucleic acid) and LNA (Locked Nucleic Acid) May be included.
  • the length of the HIV detection oligonucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it is a length necessary for functioning as a primer or a probe, but is preferably 10 to 40 bases, more preferably 20 to 30 bases.
  • the present inventors constructed a model cell line and analyzed the phenotype of the latently infected cell using the model cell line.
  • the latently infected cell contained a short RNA of about 60 bases. I found out that it was producing.
  • this short RNA of about 60 bases is a complex of transcripts whose transcription stopped at nucleotide positions 50 to 70 bases from the transcription start point of HIV-1 mRNA. It was also clarified that this short RNA of about 60 bases is a complex of transcription products in which transcription stopped at nucleotide positions 50 to 71 from the transcription start point of HIV-1 mRNA. That is, the short RNA corresponds to the mRNA from nucleotide position 1 (transcription start point) to position 50 to position 70 or position 50 to position 71 of the TAR sequence present at the 5 ′ end of the viral RNA. Was revealed.
  • the sequence of an oligonucleotide recognizing HIV was derived from the gag gene region encoding the structural protein GAG located about 500 bases downstream from the transcription start point.
  • Such oligonucleotides cannot detect short RNA produced by latently infected cells. Further, in infected cells, it takes 12 days from the day of infection exposure to 12 days associated with the growth of the virus until it becomes possible to detect the transcriptionally extended viral RNA containing the GAG region.
  • virus life cycle in latently infected cells virus production in serum is below the detection limit, but transcription has not completely stopped and transcription has started, but transcription extension has progressed efficiently. It is not in a state.
  • HIV-1 has a TAR sequence not only at the 5 ′ end of the viral genome but also at the 3 ′ end. Therefore, according to the oligonucleotide for detecting HIV of the present invention, not only short-chain RNA but also full-length HIV-1 RNA can be detected, so that virus can be detected with high sensitivity.
  • the HIV detection method of this embodiment is (A) adding polyA to the 3 ′ end of mRNA in the nucleic acid sample; (B) synthesizing cDNA complementary to the mRNA from the mRNA by reverse transcription using polyT and an oligonucleotide having a base sequence complementary to the adapter sequence on the 5 ′ side of the polyT; (C) amplifying a target base sequence having an HIV cDNA sequence from the cDNA using the HIV detection oligonucleotide of the present invention and an oligonucleotide having a base sequence complementary to the adapter sequence; (D) detecting an amplification product of the target base sequence.
  • each step will be described.
  • nucleic acid sample is not particularly limited as long as it is a nucleic acid-containing sample, such as an infected person with confirmed HIV infection, a suspected infected person with HIV infection, or a patient undergoing anti-HIV treatment, etc. It is preferably obtained by extracting nucleic acid from a sample such as blood, lymph, cerebrospinal fluid, and semen of a subject. Nucleic acid extraction from these samples can be performed by a conventional method such as using trisol, but when the above-described short RNA of about 60 bases is to be detected, low molecular RNA such as microRNA is extracted. Preferably, the method is used.
  • the short-chain RNA produced from the latently infected cells is a transcription that has stopped midway, and therefore does not have a polyA sequence at the 3 ′ end.
  • the short RNA can be made of a predetermined number of bases by adding polyA to the 3 ′ end of the short RNA using polyA polymerase. Thereby, the efficiency of the reverse transcription reaction in the step (b) and the amplification reaction of the target base sequence in the step (c) can be increased.
  • the length of polyA is not particularly limited, but is preferably 10 to 40 bases, more preferably 20 to 30 bases.
  • step (b) by using polyT and an oligonucleotide having a base sequence complementary to the adapter sequence on the 5 ′ side of the polyT (hereinafter also referred to as polyT oligonucleotide), a reverse transcription reaction is performed.
  • cDNA complementary to the mRNA is synthesized from the mRNA.
  • the polyT possessed by the polyT oligonucleotide is annealed to the polyA added to the mRNA in step (a).
  • the polyT oligonucleotide may have a degenerate sequence at the 3 ′ end, and a cDNA complementary to the mRNA is synthesized by a reverse transcription reaction starting from the 3 ′ end.
  • the reverse transcriptase used for reverse transcription conventionally known ones are used, and examples include reverse transcriptase derived from Moloney Murine Leukemia Virus.
  • the base sequence complementary to the adapter sequence possessed by the polyT oligonucleotide is not particularly limited as long as it does not inhibit the reverse transcription reaction, preferably not complementary to a known gene in vivo, and not complementary to an HIV gene. More preferably.
  • the length of the polyT oligonucleotide is preferably 10 to 40 bases, more preferably 20 to 30 bases, as is the case with the lengths of commonly used primers.
  • a process (a) and a process (b) may be performed simultaneously.
  • RNase such as RNase H is used to decompose the mRNA in advance before step (c). It is preferable.
  • the step (c) from the cDNA using the HIV detection oligonucleotide of the present invention and an oligonucleotide having a base sequence complementary to the adapter sequence (hereinafter also referred to as adapter sequence recognition oligonucleotide).
  • the target base sequence specifically means a sequence having a partial base sequence of TAR sequence cDNA.
  • the length of the adapter sequence recognition oligonucleotide is preferably 10 to 40 bases, more preferably 20 to 30 bases, as in the case of ordinary primers.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • LAMP Long-Mediated Isothermal Amplification
  • NASBA Nucleic Acid Sequence Based Amplification
  • ICAN Isothermal and Chimerical primer-initiated Amplificationof Nucleic acids
  • TRC Transcription Reverse -Transcribation Concerted
  • SDA String Displacement Amplification
  • TMA Transcribion Mediated Amplifying n
  • SMAP SMart Amplification Process
  • RPA Recombines polymerase amplification
  • HDA Helicase-dependent amplification
  • DNA polymerase is a general term for enzymes that synthesize a DNA strand having a base sequence complementary to a template DNA annealed with primers.
  • the DNA polymerase used in the present invention is not particularly limited, but it is preferable to use a thermostable DNA polymerase such as Taq DNA polymerase, Tth DNA polymerase, Vent DNA polymerase, etc., and a hot start function to prevent extension before the start of the test. It is more preferable to use a DNA polymerase having In the step (c), when performing real-time PCR described later, it is particularly preferable to use Taq DNA polymerase having 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity.
  • the oligonucleotide for detecting HIV of the present invention anneals to the 3 ′ end side of the cDNA synthesized in step (b), and an extension reaction is carried out.
  • Complementary strand hereinafter referred to as extension product A
  • extension product B a complementary strand of the extension product A
  • the HIV detection oligonucleotide of the present invention is annealed to the 3 ′ end side of the extension product B, an extension reaction is performed, and a complementary strand of the extension product B (hereinafter referred to as extension product C) is synthesized. Thereafter, the target base sequence is amplified by repeating the step of synthesizing the extension product B and the step of synthesizing the extension product C.
  • amplification programs such as temperature in PCR, it can carry out by a usual method.
  • reaction conditions under which the oligonucleotide for detecting HIV or the adapter sequence recognition oligonucleotide of the present invention anneals to the target base sequence are not particularly limited, and the temperature, pH, etc. are considered in consideration of the Tm value and the like of each oligonucleotide. It can be set under normal conditions such as salt concentration and buffer solution.
  • a primer set comprising the HIV detection oligonucleotide of the present invention and an adapter sequence recognition oligonucleotide is used.
  • the HIV detection oligonucleotide of the present invention recognizes a site that is less susceptible to mutation. Furthermore, since the primer set has only one HIV recognition site, it is not easily affected by viral RNA mutations. Therefore, according to this embodiment, all the mutated viruses can be detected with high accuracy.
  • step (d) an amplification product of the target base sequence is detected.
  • Typical detection methods in step (d) include an end point assay for evaluating whether the target base sequence has been amplified after the reaction and a real time assay for measuring the target base sequence amplification over time (real time). It is done.
  • Examples of the endpoint assay include a method for evaluating amplification of a target base sequence by electrophoresis. This method evaluates whether or not a target base sequence having a predetermined molecular weight has been amplified by performing electrophoresis on the amplification product of a target base sequence and a nucleic acid molecular weight marker and comparing the migration degrees of both. Is the method.
  • the reagent used for detection by electrophoresis is preferably ethidium bromide or cyber green that binds to double-stranded DNA and emits fluorescence.
  • Examples of the real-time assay include an evaluation method using a real-time PCR device.
  • Real-time PCR uses a known amount of serially diluted DNA as a standard, and the amplification of standard DNA and target nucleotide sequence by PCR is measured over time. Within the range of the number of molecules in which amplification of standard DNA occurs exponentially, This is a method for quantifying the number of molecules of a target base sequence present in a nucleic acid sample.
  • Real-time PCR is excellent not only in the presence or absence of HIV infection but also in that the degree of disease state and the course of healing can be grasped by quantifying the amount of virus in the blood of an HIV-infected person or HIV patient.
  • a method using a fluorescent dye can be mentioned. Specifically, a method using a dye such as cyber green that specifically intercalates with double-stranded DNA and emits fluorescence, and amplification And a method using a probe in which a fluorescent dye is bound to an oligonucleotide specific for the DNA to be used. From the viewpoint of more specifically detecting the amplification of the target base sequence, the latter method is preferred.
  • the probe used in the latter method is obtained by modifying both ends of an oligonucleotide that can hybridize to a part of the target base sequence with a fluorescent substance and a quenching substance, respectively.
  • the probe hybridizes to the target base sequence under conditions where the HIV detection oligonucleotide of the present invention anneals to the target base sequence. Subsequently, in the course of the extension reaction, the probe is degraded by the 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease activity of Taq DNA polymerase. As a result, the fluorescent substance and the quenching substance modified in the probe are spatially separated from each other, and the fluorescent substance can emit a fluorescent signal. Such a fluorescent signal is proportional to the number of molecules of the amplified target base sequence.
  • Fluorescent substances include FAM (carboxyfluorescein), JOE (6-carboxy-4 ′, 5′-dichloro2 ′, 7′-dimethoxyfluorescein), FITC (fluorescein isothiocyanate), TET (tetrachlorofluorescein), HEX ( 5'-hexachloro-fluorescein-CE phosphoramidite), Cy3, Cy5, Alexa568 and the like.
  • the quencher include TAMRA (tetramethyl-rhodamine), 4- (4-dimethylaminophenylazo) benzoic acid (DABCYL), BHQ, and the like.
  • the nucleotide sequence of the oligonucleotide used as a probe is not particularly limited as long as it can recognize a TAR sequence or can hybridize to a sequence complementary to the TAR sequence.
  • SEQ ID NO: 2 (5 '-CTAGCTAGCCAGAGAGCTCCCAGG-3': 24mer). By using such a probe, amplification of the target base sequence can be detected more specifically.
  • step (d) Other detection methods in step (d) are not particularly limited, and examples include oligonucleotide labeling with fluorescent dyes, high performance liquid chromatography, mass spectrum, melting curve analysis, growth curve analysis, and the like.
  • Examples of labeling oligonucleotides with fluorescent dyes include a method of labeling an HIV detection oligonucleotide or an adapter sequence recognition oligonucleotide with a labeling substance. By such a method, amplification of the target base sequence can be detected using the labeling substance as an index.
  • Examples of such a labeling substance include fluorescent dyes, energy absorbing substances, radioisotopes, chemiluminescent substances, enzymes, antibodies and the like.
  • the position for labeling the oligonucleotide using such a labeling substance is not particularly limited, but a position that does not inhibit the extension reaction is preferable.
  • the HIV detection method of the present embodiment has the step (a) of adding polyA to the 3 ′ end of HIV-derived mRNA in a nucleic acid sample. Since polyA is added to the 3 ′ end, step (a) may not be included.
  • step (c) instead of the adapter sequence recognition oligonucleotide, an oligonucleotide having a base sequence complementary to the base sequence derived from HIV, or an HIV-derived base sequence Oligonucleotides that can hybridize to the base sequence may be used.
  • the HIV detection oligonucleotide of the present invention preferably recognizes a TAR sequence located at the 3 ′ end of the viral genome.
  • the HIV detection kit of the present invention includes the above-described oligonucleotide for detecting HIV of the present invention. Furthermore, the HIV detection kit of the present invention may contain a cell disruption reagent for nucleic acid sample pretreatment and the reagent described in each step of the above-described HIV detection method of the present invention. Thus, HIV can be detected more easily and in a short time by making a kit necessary for the HIV detection method of the present invention.
  • HIV viral RNA contains a sequence that is not susceptible to mutation during reverse transcription.
  • HIV can be detected with high accuracy even if a mutation occurs in HIV in HIV-infected cells.
  • specific RNA was transcribed in HIV-infected cells during the latent infection period, and a method for detecting an initial transcript expressed by HIV was established. This shortens the HIV detection date, enables highly sensitive detection, and contributes to early diagnosis of HIV infection. Furthermore, the early diagnosis can delay the onset of disease and the start of treatment for AIDS.
  • the present invention it becomes possible to determine early on the reactivation of the virus from within the patient during the treatment of AIDS under the administration of the antiviral agent.
  • the principle of the HIV detection method of the present invention can be applied to detection of other viruses that are known to be latently infected.
  • an oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 2 (5′-CTAGCTAGCCAGAGAGCTCCCAGG-3 ′: 24mer) having FAM at the 5 ′ end and TAMRA at the 3 ′ end was used.
  • the synthesis of these oligonucleotides was commissioned to Oligo House. 10 ⁇ l of a mixed solution of the quantitative PCR reagent, the oligonucleotide, and 75 ng of cDNA per well was dispensed into each well of a 96 plate.
  • ABI 7300 (Life Technology) was used as a quantitative PCR apparatus, and after a reaction at 95 ° C. for 30 seconds, a 2-step reaction at 95 ° C. for 5 seconds and 60 ° C. for 34 seconds was performed for 40 cycles.
  • GAPDH quantitative PCR was performed to prepare a standard curve.
  • Example 1 J Virol. 83, pp. 11569-11580, 2009.
  • Total RNA was extracted from this cell using mirVana microRNA isolation kit (Ambion), and cDNA was synthesized from short-chain RNA in Total RNA using miScript Primer Assay Kit (Qiagen). Using this cDNA, quantitative PCR was performed to quantify the copy number of the target nucleotide sequence in the stable strain U1-mU6-TAR.
  • Example 2 J Virol. 72, pp. 1666 to 1670, as a model cell of latently infected cells published in 1998, cDNA was obtained from a U1 cell line having wild-type HIV-1 in the same manner as in Example 1. The number of copies of the target nucleotide sequence in the U1 cell line was quantified.
  • the measurement results using the quantitative PCR apparatus in Examples 1 and 2 and Comparative Example 1 are shown in FIG. As shown in FIG. 1, in the reactions in Examples 1 and 2, it was confirmed that the signal was enhanced with an increase in the number of cycles. On the other hand, in Comparative Example 1 having no cDNA in the reaction system, signal enhancement was not confirmed even when the number of cycles was increased. From the calculation results using the standard curve, the stable strain U1-mU6-TAR used in Example 1 has a short transcript of about 8 times the copy number compared to the latently infected cell line U1 used in Example 2. Was confirmed. As described above, from the results of Examples 1 and 2, it was confirmed that the short RNA produced in the infected cells can be quantified according to the present invention. From this, it was found that HIV in the early stage of infection can be detected early.
  • Example 2 (Identification of short RNA) Using the PCR product of Example 2, Deep Sequence analysis by Illumina GAIIx (manufactured by Illumina) was performed, and the base sequence of a short-chain RNA of about 60 bases was analyzed. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 2, the short RNA of about 60 bases was clarified to be a transcription product whose transcription stopped at positions 50 to 70 bases from the transcription start point of HIV-1 RNA. It was also revealed that the short RNA of about 60 bases was a transcription product in which transcription was stopped at bases 50 to 71 from the transcription start point of HIV-1 RNA.
  • the oligonucleotide shown by SEQ ID NO: 5 was used as the forward primer, and the adapter sequence recognition oligonucleotide attached to the miScript Primer Assay Kit was used as the reverse primer.
  • an oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 2 (5′-CTAGCTAGCCAGAGAGCTCCCAGG-3 ′: 24mer) having FAM at the 5 ′ end and BHQ-1 at the 3 ′ end was used. The synthesis of these oligonucleotides was commissioned to Oligo House.
  • the present invention even if a mutation occurs in HIV in an HIV-infected cell, such a virus can be detected with high accuracy, and HIV can be detected early and with high sensitivity even during the latent infection period. This is industrially useful.

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Abstract

　本発明は、配列番号１又は６で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基からなる塩基配列と、８０％以上の同一性を有することを特徴とするＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチド、並びにそれを用いたHIV検出キット及びHIV検出方法を提供する。

Description

ＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチド、ＨＩＶ検出キット、及びＨＩＶ検出方法
　本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ；以下、ＨＩＶという。）検出用オリゴヌクレオチド、ＨＩＶ検出キット、及びＨＩＶ検出方法に関する。
本願は、２０１２年１月２５日に、日本に出願された特願２０１２－０１３０８７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　後天性免疫不全症候群（Ａｃｑｕｉｒｅｄ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；以下、エイズという。）の原因であるＨＩＶ感染に対しては、ＨＩＶ感染の根本的な予防をすることと共に、万一感染した疑いが生じた場合に、感染の有無を早期に診断できる技術を確立することが重要である。
　また、治療により体内からＨＩＶが消失したようにみえても、診断技術におけるウイルスの検出感度が低い場合には、体内でＨＩＶが潜伏しているにもかかわらず、体内からＨＩＶが「消失」したものと誤診されるおそれがあり、エイズ再発の禍根を残すことになる。
　ＨＩＶ感染後の急性感染期において、ＨＩＶは宿主細胞内に侵入し、自己のウイルスＲＮＡを逆転写して、ＤＮＡを合成し、該ＤＮＡを宿主細胞のＤＮＡに挿入し、プロウイルス化する。宿主細胞内で、該プロウイルスがウイルス遺伝子を発現し、自己のウイルスタンパク質がウイルスＲＮＡをパッケージングすることによりウイルス粒子が形成され、該ウイルス粒子は宿主細胞外へ出ていく。
　現在、臨床における抗ＨＩＶ治療方法としては、多剤併用療法（Ｈｉｇｈｌｙ　Ａｃｔｉｖｅ　Ａｎｔｉ－Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：以下、ＨＡＡＲＴ療法という。）が一般的である。ＨＡＡＲＴ療法は、上述した急性感染期におけるウイルスＲＮＡの逆転写やウイルスＤＮＡのゲノムＤＮＡへの挿入等を阻害する複数種の阻害剤を投与する方法である。ＨＡＡＲＴ療法により、抗ＨＩＶ治療は著しい発展を遂げてきている。
　一方、ＨＡＡＲＴ療法による治療過程で、一部の感染細胞は、ＨＡＡＲＴ療法に対する耐性を獲得する（以下、この感染細胞を潜伏感染細胞という。）。潜伏感染細胞においては、プロウイルスを有しているにもかかわらず、急性感染期で観察されたウイルスの生活環が休止し、ウイルスＲＮＡが産生されない。ＨＡＡＲＴ療法は、上述したようにウイルス増殖の各ステップを阻害するものであるため、ＨＡＡＲＴ療法により潜伏感染細胞からウイルスを除くことは困難である。しかし、ＨＡＡＲＴ療法を中断すると、潜伏感染細胞におけるウイルスの生活環が再始動する。
　従って、潜伏感染細胞からウイルスを除去できないことが、ＨＩＶ患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ）に悪影響を与えている。
　これに対して、本発明者らは、モデル細胞株を構築し、該モデル細胞株を用いて、潜伏感染細胞の表現型を解析したところ、潜伏感染細胞は、約６０塩基の短鎖ＲＮＡを産出していることを見出した（非特許文献１参照。）。
　ＨＩＶ感染の診断方法において、感染者の血液中のウイルス量を定量することは、病態の程度や治癒経過を把握する指標として重要である。
　現在、リアルタイムＰＣＲ法を標的核酸の増幅・検出の原理とするＨＩＶのＲＮＡ定量法は、ＨＩＶ感染の迅速な診断方法の一つとして知られている。
　リアルタイムＰＣＲ法を用いたＨＩＶのＲＮＡ定量法としては、例えば特許文献１に記載された方法が挙げられる。特許文献１に記載された方法は、ＨＩＶ－１の各種サブタイプを認識できるように設計された縮重プライマーを用いて、ゲノムに挿入されたＨＩＶ－１プロウイルスを増幅・定量する方法である。かかる方法は、日本人感染者の主な感染源であるサブタイプＢのみならず、それ以外の各種サブタイプにも対応できる点で優れている。
特開２００７－２９５８９６号公報
水谷ら、Ｊ　Ｖｉｒｏｌ．、第８３巻、第１１５６９～１１５８０頁、２００９年
　しかしながら、ＨＩＶは、フィデリティ（正確性）の低い逆転写酵素を有しているため、非常に変異しやすいウイルスである。特許文献１に記載のＨＩＶを認識するオリゴヌクレオチドの配列は、転写開始点から約５００塩基下流に位置する構造タンパク質ＧＡＧをコードするｇａｇ遺伝子領域に由来するものであり、当該配列を用いて、変異したすべてのウイルスを高精度に検出するには不十分である。
　また、感染細胞では感染暴露日から定量的にＧＡＧ領域を含む転写伸張されたウイルスＲＮＡを検出可能にするまでにはウイルスの増殖に伴った１２日間という日数を必要とする。そのため、より早期に高感度でウイルス検出をすることができる技術が望まれている。
　更に、特許文献１に記載のオリゴヌクレオチドを用いても、上述した潜伏感染細胞が産出する短鎖ＲＮＡを検出することができず、未だ改善の余地がある。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、高精度かつ高感度に、ＨＩＶを早期検出することができるＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチド、ＨＩＶ検出キット、及びＨＩＶ検出方法を提供することを課題とする。
　本発明は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、潜伏感染期間のＨＩＶ感染細胞において特定のＲＮＡが転写されていること、及び、ＨＩＶのウイルスＲＮＡにおいて逆転写の際に変異を受けにくい配列が存在することを見出し、本発明を完成させた。
　本発明は、下記の特徴を有するＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチド、ＨＩＶ検出キット、及びＨＩＶ検出方法を提供するものである。
（１）配列番号１又は６で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基からなる塩基配列と、８０％以上の同一性を有することを特徴とするＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチド。
（２）配列番号１又は６で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基からなる塩基配列と、９０％以上の同一性を有することを特徴とする（１）に記載のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチド。
（３）配列番号１又は６で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基からなる塩基配列と、９５％以上の同一性を有することを特徴とする（１）に記載のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチド。
（４）配列番号１又は６で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基からなる塩基配列と、９８％以上の同一性を有することを特徴とする（１）に記載のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチド。
（５）配列番号１又は６で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基からなる塩基配列を有する（１）に記載のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチド。
（６）（１）～（５）のいずれかに記載のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするＨＩＶ検出キット。
（７）（１）～（６）のいずれかに記載のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドまたはＨＩＶ検出キットを用いることを特徴とするＨＩＶ検出方法。
（８）（ａ）核酸試料中のｍＲＮＡの３’末端にｐｏｌｙＡを付加する工程と、（ｂ）ｐｏｌｙＴと、該ｐｏｌｙＴの５’側にアダプター配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、逆転写反応により、前記ｍＲＮＡから該ｍＲＮＡに相補するｃＤＮＡを合成する工程と、（ｃ）（１）～（５）のいずれかに記載のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドと、前記アダプター配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、前記ｃＤＮＡから、ＨＩＶのｃＤＮＡの配列を有する標的塩基配列を増幅する工程と、（ｄ）前記標的塩基配列の増幅産物を検出する工程と、を有することを特徴とするＨＩＶ検出方法。
　本発明によれば、ＨＩＶ感染細胞において、ＨＩＶに変異が生じたとしても、かかるウイルスを高精度に検出することができる。
　また、本発明によれば、潜伏感染期間であっても、ＨＩＶを早期かつ高感度に検出することができる。
実施例１、実施例２、及び比較例１における、Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＰＣＲを用いたＨＩＶ－１短鎖ＲＮＡの検出結果である。 実験例２における、約６０塩基の短鎖ＲＮＡの塩基配列解析結果である。 実験例３における、定量PCRの結果である。 実験例３における、検量線である。 本発明の、HIV感染細胞において産生される短鎖RNAの検出系の説明図である。
［ＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチド］
　本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドは、配列番号１又は６で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基からなる塩基配列と、８０％以上の同一性を有する。本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドは、当該同一性の範囲内において、配列番号１又は６で表される塩基配列に対して、１乃至複数の塩基が欠失、挿入、又は置換されていてもよい。
　更に、本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドは、配列番号１又は６で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基からなる塩基配列と、９０％以上の同一性を有することが好ましく、９５％以上の同一性を有することがより好ましく、９８％以上の同一性を有することが特に好ましい。また、配列番号１又は６で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基からなる塩基配列を有することがより好ましい。
　配列番号１（５’－ＧＧＴＣＴＣＴＣＴＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＧＣＴＡＧＧＧＡＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＴ－３’：６５ｍｅｒ）で表される塩基配列及び配列番号６（５’－ＧＧＴＣＴＣＴＣＴＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＧＣＴＡＧＧＧＡＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＧＣＣＴ－３’：７１ｍｅｒ）で表される塩基配列は、ウイルスゲノム中のＨＩＶ　ＬＴＲ（Ｌｏｎｇ　Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｒｅｐｅａｔ）内に存在するＴＡＲ（Ｔｒａｎｓ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｒｅｇｉｏｎ）配列の一部である。
　ＨＩＶとしては、ＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２の２種類が挙げられる。本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドは、サブタイプに依存せずにＨＩＶ－１のみを特異的に検出することができる。
　ＨＩＶのＴＡＲ配列は、ウイルス遺伝子の転写制御に関与し、ウイルスゲノムの５’末端及び３’末端に位置するＬＴＲ内に存在する。ＴＡＲ配列は、ＨＩＶ－１のサブタイプ間で高く保存されており、転写活性因子ｔａｔ（Ｔｒａｎｓ　ＡｃＴｉｖａｔｏｒ）が該ＴＡＲ配列に結合することにより、ウイルス遺伝子の転写が促進される。
　このように、ＴＡＲ配列は、転写活性因子が結合する部位であり、ウイルス遺伝子の転写はかかる結合を介して厳密に制御されているという観点から、本発明者は、ＴＡＲ配列が変異を受けにくい箇所であることを見出した。
　従って、本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドは、ＴＡＲ配列を認識する配列を含むことにより、変異したＨＩＶをも認識することができるため、ＨＩＶを高精度に検出することができる。
　本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡが好ましく、ＤＮＡと同様の機能を有するものであれば、天然、非天然に限られず、ＰＮＡ（ペプチド核酸）やＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）等の人工核酸を含むものであってもよい。
　本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドの長さは、プライマー又はプローブとして機能するために必要な長さであれば特に限定されないが、１０～４０塩基が好ましく、２０～３０塩基がより好ましい。
　上述したように、本発明者らは、モデル細胞株を構築し、該モデル細胞株を用いて、潜伏感染細胞の表現型を解析したところ、潜伏感染細胞は、約６０塩基の短鎖ＲＮＡを産出していることを見出した。
　更に、この約６０塩基の短鎖ＲＮＡが、ＨＩＶ－１ｍＲＮＡの転写開始点から、ヌクレオチド位置５０から７０塩基で転写が止まった転写産物の複合体であることを明らかにした。また、この約６０塩基の短鎖ＲＮＡは、ＨＩＶ－１ｍＲＮＡの転写開始点から、ヌクレオチド位置５０～７１塩基で転写が止まった転写産物の複合体であることも明らかにした。即ち、短鎖ＲＮＡがウイルスＲＮＡの５’末端に存在するＴＡＲ配列のヌクレオチド位置１（転写開始点）から、位置５０から位置７０、又は位置５０から位置７１までのｍＲＮＡに相当するものであることを明らかにした。
　従来、ＨＩＶを認識するオリゴヌクレオチドの配列は、転写開始点から約５００塩基下流に位置する構造タンパク質ＧＡＧをコードするｇａｇ遺伝子領域に由来するものであった。かかるオリゴヌクレオチドは、潜伏感染細胞が産出する短鎖ＲＮＡを検出することができない。また、感染細胞では感染暴露日から定量的にＧＡＧ領域を含む転写伸張されたウイルスＲＮＡを検出可能にするまでにはウイルスの増殖に伴った１２日間という日数を必要とする。
　一方、潜伏感染細胞におけるウイルスの生活環は、血清中でのウイルス産生が検出限界以下であるが、転写は完全に停止しておらず、転写は開始しているが、転写伸張が効率よく進んでいない状態にある。この状況は、ウイルス感染初期と似ており、ウイルス感染初期においても短鎖ＲＮＡが産出されているものと考えられる。従って、本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドによれば、感染暴露から１２日経過を待たずとも、早期にウイルス検出をすることができる。
　また、ＨＩＶ－１は、ウイルスゲノムの５’末端にだけでなく、３’末端にもＴＡＲ配列を有している。従って、本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドによれば、短鎖ＲＮＡの検出だけでなく、ＨＩＶ－１ＲＮＡ全長の検出も可能であるため、ウイルスを高感度に検出することができる。
［ＨＩＶ検出方法］
≪第１実施形態≫
　本実施形態のＨＩＶ検出方法は、
（ａ）核酸試料中のｍＲＮＡの３’末端にｐｏｌｙＡを付加する工程と、
（ｂ）ｐｏｌｙＴと、該ｐｏｌｙＴの５’側にアダプター配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、逆転写反応により、前記ｍＲＮＡから該ｍＲＮＡに相補するｃＤＮＡを合成する工程と、
（ｃ）本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドと、前記アダプター配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、前記ｃＤＮＡから、ＨＩＶのｃＤＮＡの配列を有する標的塩基配列を増幅する工程と、
（ｄ）前記標的塩基配列の増幅産物を検出する工程と、を有する。
　以下、各工程について説明する。
　まず、工程（ａ）において、核酸試料中のｍＲＮＡの３’末端にｐｏｌｙＡを付加する。
　核酸試料は、核酸を含有する試料であれば、特に限定されないが、ＨＩＶ感染が確認されている感染者若しくはＨＩＶ感染が疑われている感染被疑者、又は抗ＨＩＶ治療を受けている患者等の被験者の血液、リンパ液、髄液、精液等のサンプルから核酸を抽出することにより得られるものであることが好ましい。これらのサンプルからの核酸抽出は、トリゾルを用いる等、定法により行うことができるが、上述した約６０塩基の短鎖ＲＮＡを検出対象とする場合には、マイクロＲＮＡ等の低分子ＲＮＡを抽出する方法を利用することが好ましい。
　上述したように、潜伏感染細胞から産出される短鎖ＲＮＡは、転写が途中で止まったものであるため、３’末端にｐｏｌｙＡ配列を有しない。本実施形態においては、ｐｏｌｙＡポリメラーゼを用いて短鎖ＲＮＡの３’末端にｐｏｌｙＡを付加することにより、短鎖ＲＮＡを所定の塩基数からなるものにすることができる。これにより、工程（ｂ）における逆転写反応、及び工程（ｃ）における標的塩基配列の増幅反応の効率を上げることができる。
　ｐｏｌｙＡの長さとしては、特に限定されないが、１０～４０塩基が好ましく、２０～３０塩基がより好ましい。
　次いで、工程（ｂ）において、ｐｏｌｙＴと、該ｐｏｌｙＴの５’側にアダプター配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、ｐｏｌｙＴオリゴヌクレオチドともいう。）を用いて、逆転写反応により、前記ｍＲＮＡから該ｍＲＮＡに相補するｃＤＮＡを合成する。
　ｐｏｌｙＴオリゴヌクレオチドが有するｐｏｌｙＴは、工程（ａ）においてｍＲＮＡに付加されたｐｏｌｙＡにアニールする。ｐｏｌｙＴオリゴヌクレオチドは、３’末端に縮重配列を有していてもよく、かかる３’末端を合成起点とした逆転写反応により、前記ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡが合成される。逆転写に用いられる逆転写酵素としては、従来公知のものが用いられ、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ由来の逆転写酵素等が挙げられる。
　ｐｏｌｙＴオリゴヌクレオチドが有するアダプター配列に相補的な塩基配列は、逆転写反応を阻害しないものであれば特に限定されず、生体内の既知の遺伝子に相補しないものが好ましく、ＨＩＶ遺伝子に相補しないものであることがより好ましい。
　ｐｏｌｙＴオリゴヌクレオチドの長さは、通常用いられるプライマーの長さと同様、１０～４０塩基が好ましく、２０～３０塩基がより好ましい。
　尚、工程（ａ）と工程（ｂ）は同時に行われてもよい。
　また、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡは、鋳型となったｍＲＮＡとのハイブリッドを形成しているため、ＲＮａｓｅＨ等のＲＮａｓｅを用いて、工程（ｃ）の前に、予めｍＲＮＡを分解しておくことが好ましい。　
　次いで、工程（ｃ）において、本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドと、前記アダプター配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、アダプター配列認識オリゴヌクレオチドともいう。）を用いて、前記ｃＤＮＡから、ＨＩＶのｃＤＮＡの配列を有する標的塩基配列を増幅する。
　本発明において、前記標的塩基配列とは、詳細には、ＴＡＲ配列のｃＤＮＡの一部の塩基配列を有するものをいう。
　アダプター配列認識オリゴヌクレオチドの長さは、通常のプライマーと同様、１０～４０塩基が好ましく、２０～３０塩基がより好ましい。
　標的配列の増幅方法としては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｂａｓｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃａｌ ｐｒｉｍｅｒ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅｖｅｒｓｅ－Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＳＭＡＰ（ＳＭａｒｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｓｓ）、ＲＰＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｓ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＨＤＡ（Ｈｅｌｉｃａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等、従来公知の方法が挙げられる。
　ＤＮＡポリメラーゼとはプライマーがアニールした鋳型ＤＮＡと相補的な塩基配列を持つＤＮＡ鎖を合成する酵素の総称である。
　本発明に用いられるＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定されないが、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼ等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましく、試験開始前の伸長を防ぐためにホットスタート機能を持つＤＮＡポリメラーゼを使用することがより好ましい。工程（ｃ）において、後述するリアルタイムＰＣＲを行う場合には、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを使用することが特に好ましい。
　標的塩基配列の増幅方法としてＰＣＲを例に挙げると、工程（ｂ）において合成されたｃＤＮＡの３’末端側に、本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドがアニールし、伸長反応が行われ、前記ｃＤＮＡの相補鎖（以下、伸長産物Ａという。）が合成される。
　次いで、伸長産物Ａの３’末端側に、アダプター配列認識オリゴヌクレオチドがアニールし、伸長反応が行われ、伸長産物Ａの相補鎖（以下、伸長産物Ｂという。）が合成される。
　次いで、伸長産物Ｂの３’末端側に、本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドがアニールし、伸長反応が行われ、伸長産物Ｂの相補鎖（以下、伸長産物Ｃという。）が合成される。
　以後、伸長産物Ｂが合成される工程と、伸長産物Ｃが合成される工程と、を繰り返すことにより、標的塩基配列が増幅される。
　尚、ＰＣＲにおける温度等の増幅プログラムの設定については定法により行うことができる。
　本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチド又はアダプター配列認識オリゴヌクレオチドが、標的塩基配列にアニールする反応条件は、特に限定されるものではなく、各オリゴヌクレオチドのＴｍ値等を考慮した上で、温度、ｐＨ、塩濃度、緩衝液等の通常の条件下で設定することができる。
　本実施形態においては、本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドと、アダプター配列認識オリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットが用いられる。上述したように、本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドは、変異を受けにくい箇所を認識するものである。更に、前記プライマーセットは、ＨＩＶの認識サイトを１箇所のみ有するため、ウイルスＲＮＡの変異による影響を受けにくい。
　従って、本実施形態によれば、変異したすべてのウイルスを高精度に検出することができる。
　次いで、工程（ｄ）において、前記標的塩基配列の増幅産物を検出する。
　工程（ｄ）における代表的な検出方法としては、反応後に標的塩基配列が増幅したか否かを評価するエンドポイントアッセイと、標的塩基配列の増幅を経時的（リアルタイム）に測定するリアルタイムアッセイが挙げられる。
　エンドポイントアッセイとしては、標的塩基配列の増幅を電気泳動により評価する方法が挙げられる。この方法は、標的塩基配列の増幅産物及び核酸分子量マーカーに対して、電気泳動を行い、両者の泳動度を対比することにより、所定の分子量を有する標的塩基配列が増幅された否かを評価する方法である。
　電気泳動による検出に用いる試薬としては、二本鎖ＤＮＡに結合して蛍光を発する臭化エチジウムやサイバーグリーンが好ましい。
　リアルタイムアッセイとしては、リアルタイムＰＣＲ装置を用いた評価方法が挙げられる。リアルタイムＰＣＲは、段階希釈した既知量のＤＮＡをスタンダードとして用い、ＰＣＲによるスタンダードＤＮＡ及び標的塩基配列の増幅を経時的に測定し、スタンダードＤＮＡの増幅が指数関数的に起きる分子数の範囲内で、核酸試料中に存在する標的塩基配列の分子数を定量する方法である。
　リアルタイムＰＣＲは、ＨＩＶ感染の有無だけではなく、ＨＩＶ感染者又はＨＩＶ患者の血液中のウイルス量を定量することにより、病態の程度や治癒経過を把握することができる点で優れている。
　リアルタイムＰＣＲにおける定量方法としては、蛍光色素を用いた方法が挙げられ、具体的には、二本鎖ＤＮＡに特異的にインターカレートして蛍光を発するサイバーグリーン等の色素を用いる方法と、増幅するＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合させたプローブを用いる方法が挙げられる。標的塩基配列の増幅をより特異的に検出する観点から、後者の方法が好ましく挙げられる。
　後者の方法に用いられるプローブは、標的塩基配列の一部にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドの両端を、それぞれ蛍光物質及び消光物質で修飾したものである。かかるプローブにおいては、蛍光物質と消光物質は近接しているため、蛍光物質の有する蛍光シグナルを発する機能が、消光物質によって妨げられている。
　前記工程（ｃ）において、本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドが標的塩基配列にアニールする条件下で、プローブは標的塩基配列にハイブリダイズする。続いて、伸長反応の過程で、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼの有する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によってプローブは分解される。その結果、プローブに修飾されていた蛍光物質及び消光物質は、相互に空間的に分離され、蛍光物質は蛍光シグナルを発することができる。かかる蛍光シグナルは、増幅された標的塩基配列の分子数に比例する。
　蛍光物質としては、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６－カルボキシ－４’,５’－ジクロロ２’ ,７’－ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'－ヘキサクロロ－フルオレセイン－ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８等が挙げられる。
　また、消光物質としては、ＴＡＭＲＡ（テトラメチル－ローダミン）、４－（４－ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、ＢＨＱ等が挙げられる。
　プローブとして用いられるオリゴヌクレオチドの塩基配列としては、ＴＡＲ配列を認識し得るもの、又はＴＡＲ配列に相補する配列にハイブリダイズし得るものであれば特に限定されないが、好ましい塩基配列として配列番号２（５’－ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＧ－３’：２４ｍｅｒ）で表される塩基配列が挙げられる。
　かかるプローブを用いることにより、標的塩基配列の増幅をより特異的に検出することができる。
　工程（ｄ）におけるその他の検出方法としては、特に限定されるものではなく、蛍光色素等によるオリゴヌクレオチドの標識、高速液体クロマトグラフィー、マススペクトル、融解曲線分析、増殖曲線分析等が挙げられる。
　蛍光色素等によるオリゴヌクレオチドの標識としては、例えば、ＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチド、又はアダプター配列認識オリゴヌクレオチドを、標識物質により標識しておく方法が挙げられる。かかる方法により、標識物質を指標として標的塩基配列の増幅を検出することができる。このような標識物質としては、例えば、蛍光色素、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素、抗体等が挙げられる。かかる標識物質を用いて、オリゴヌクレオチドを標識する位置については、特に限定するものではないが、伸長反応を阻害しないような位置が好ましい。
　本実施形態のＨＩＶ検出方法は、核酸試料中のＨＩＶ由来ｍＲＮＡの３’末端にｐｏｌｙＡを付加する工程（ａ）を有しているが、ＨＩＶのＲＮＡ全長を検出対象とする場合には、既にその３’末端にｐｏｌｙＡが付加されているため、工程（ａ）を有しなくともよい。
　また、ＨＩＶのＲＮＡ全長を検出対象とする場合には、工程（ｃ）において、アダプター配列認識オリゴヌクレオチドに代えて、ＨＩＶ由来の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、またはＨＩＶ由来の塩基配列にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを用いてもよい。
　かかる場合、増幅効率の観点から、本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドはウイルスゲノムの３’末端に位置するＴＡＲ配列を認識することが好ましい。
［ＨＩＶ検出キット］
　本発明のＨＩＶ検出キットは、上述した本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドを含む。更に、本発明のＨＩＶ検出キットは、核酸試料前処理用の細胞破壊試薬や、上述した本発明のＨＩＶ検出方法の各工程において説明された試薬を含んでいてもよい。
　このように、本発明のＨＩＶ検出方法に必要な試薬等をキット化することにより、より簡便にかつ短時間でＨＩＶの検出をすることができる。
　以上、本発明において、ＨＩＶのウイルスＲＮＡ中に、逆転写の際に変異を受けにくい配列が存在することが見出された。かかる配列をＨＩＶ診断に用いることにより、ＨＩＶ感染細胞において、ＨＩＶに変異が生じたとしても、ＨＩＶを高精度に検出することができる。
　また、本発明において、潜伏感染期間のＨＩＶ感染細胞において特定のＲＮＡが転写されていることが見出され、ＨＩＶが発現する初期転写産物の検出方法が確立された。これにより、ＨＩＶ検出期日を短縮し、高感度の検出を可能なものとし、ＨＩＶ感染の早期診断に貢献することができる。更に、早期診断により、エイズ発症に対する病態発症時期及び治療開始時期を遅らせることができる。
　本発明において抗ウイルス薬投与下のエイズ治療中の患者体内からのウイルスの再活性化を早期に判断することが可能となる。
　また、本発明のＨＩＶ検出方法の原理を、他の潜伏感染することが知られているウイルス等の検出に応用することが可能である。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
（短鎖ＲＮＡの検出）
　ＨＩＶ感染細胞において産生される短鎖ＲＮＡの検出系を、定量ＰＣＲを用いて構築した（図５）。定量ＰＣＲ試薬として、ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘｔａｑ　ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いた。
　Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号３（５’－ＧＧＧＴＣＴＣＴＣＴＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡＧ－３’ ：２１ｍｅｒ）で示されるオリゴヌクレオチドを用い、Ｒｅｖｅｒｓｅ　ＰｒｉｍｅｒとしてｍｉＳｃｒｉｐｔ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔに添付のアダプター配列認識オリゴヌクレオチドを用いた。Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅとして配列番号２（５’－ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＧ－３’：２４ｍｅｒ）で示されるオリゴヌクレオチドの５’末端にＦＡＭを、３’末端にＴＡＭＲＡを修飾したものを用いた。これらのオリゴヌクレオチドの合成をオリゴハウス社に受託した。
　上記定量ＰＣＲ試薬と、上記オリゴヌクレオチドと、１ウェル当たり７５ｎｇのｃＤＮＡと、の混合溶液１０μｌを、９６プレートの各ウェルに分注した。
　定量ＰＣＲ装置として、ＡＢＩ７３００（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を使用し、９５℃３０秒の反応後、９５℃５秒、６０℃３４秒の２ステップ反応を４０サイクル行った。
　スタンダードＤＮＡとして、ＧＡＰＤＨを用い、定量ＰＣＲを行い、標準曲線を作製した。
〈実施例１〉
　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ．、第８３巻、第１１５６９～１１５８０頁、２００９年に記載された方法に従って、ＨＩＶ－１のＲＮＡの転写開始点から、位置６１のウラシルで転写が止まった転写産物を発現するベクターをＪ　Ｖｉｒｏｌ．、第７２巻、第１６６６～１６７０頁、１９９８年に公表されている、ＨＩＶ－１の潜伏感染細胞のモデル細胞、Ｕ１細胞株に導入し、安定株Ｕ１－ｍＵ６－ＴＡＲを作製した。ｍｉｒＶａｎａ　ｍｉｃｒｏＲＮＡ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いて、この細胞からＴｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、ｍｉＳｃｒｉｐｔ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ中の短鎖ＲＮＡから、ｃＤＮＡを合成した。
　このｃＤＮＡを用いて、定量ＰＣＲを行い、安定株Ｕ１－ｍＵ６－ＴＡＲ中の標的塩基配列のコピー数を定量した。
〈実施例２〉
Ｊ　Ｖｉｒｏｌ．、第７２巻、第１６６６～１６７０頁、１９９８年に公表されている潜伏感染細胞のモデル細胞として、野生型のＨＩＶ－１を有するＵ１細胞株から、実施例１と同様の方法にてｃＤＮＡを合成し、Ｕ１細胞株中の標的塩基配列のコピー数を定量した。
〈比較例１〉
　ｃＤＮＡの溶解液に代えて、滅菌水を用いた以外は、実施例１と同様の方法で定量ＰＣＲを行った。
　実施例１～２、及び比較例１における、定量ＰＣＲ装置を用いた測定結果を図１に示す。図１に示されるように、実施例１～２における反応は、サイクル数の増加とともにシグナルが増強していることが確認された。一方、反応系中にｃＤＮＡを有しない比較例１においては、サイクル数を増加してもシグナルの増強が確認されなかった。
　標準曲線を用いた算出結果から、実施例１で用いられた安定株Ｕ１－ｍＵ６－ＴＡＲでは、実施例２で用いられた潜伏感染細胞株Ｕ１と比較し、およそ８倍のコピー数のｓｈｏｒｔ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔが確認された。
　以上、実施例１及び２の結果から、本発明によれば、感染細胞中に産生される短鎖ＲＮＡを定量できることが確認された。このことから、感染初期のＨＩＶを早期に発見できることが分かった。
［実験例２］
（短鎖ＲＮＡの同定）
　実施例２のＰＣＲ産物を用いてＩｌｌｕｍｉｎａ ＧＡＩＩｘ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）によるＤｅｅｐ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ解析を行い、約６０塩基の短鎖ＲＮＡの塩基配列を解析した。結果を図２に示す。
　図２に示されるように、この約６０塩基の短鎖ＲＮＡは、ＨＩＶ－１のＲＮＡの転写開始点から、位置５０から７０塩基で転写が止まった転写産物であることが明らかになった。また、この約６０塩基の短鎖ＲＮＡは、ＨＩＶ－１のＲＮＡの転写開始点から、位置５０から７１塩基で転写が止まった転写産物であることも明らかになった。
［実験例３］
（短鎖ＲＮＡのコピー数の定量）
スタンダードＲＮＡとして、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ合成した配列番号４（５’－ＧＧＴＣＴＣＴＣＴＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＧＣＴＡＧＧＧＡＡＣＣＣ－３’：５８ｍｅｒ）を用い、実施例１と同様の方法にてｃＤＮＡを１０８コピー～１０コピーまで１０倍希釈の希釈系列を作製し、以下の通りに定量ＰＣＲを行い、検量線を作製した。
Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号５（５’－ＣＴＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣ－３’：２２ｍｅｒ）で示されるオリゴヌクレオチドを用い、Ｒｅｖｅｒｓｅ　ＰｒｉｍｅｒとしてｍｉＳｃｒｉｐｔ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔに添付のアダプター配列認識オリゴヌクレオチドを用いた。Ｔａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅとして配列番号２（５’－ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＧ－３’：２４ｍｅｒ）で示されるオリゴヌクレオチドの５’末端にＦＡＭを、３’末端にＢＨＱ－１を修飾したものを用いた。これらのオリゴヌクレオチドの合成をオリゴハウス社に受託した。
上記定量ＰＣＲ試薬と、上記オリゴヌクレオチドと、１ウェル当り７５ｎｇのｃＤＮＡと、の混合溶液２０μｌを、９６プレートの各ウェルに分注した。
定量ＰＣＲ装置として、ＣＦＸ－９６（ＢＩＯ　ＲＡＤ社製）を使用し、９５℃３０秒の反応後、９５℃５秒、６０℃１０秒の２ステップ反応を５０サイクル行った。
定量ＰＣＲの結果を図３、検量線を図４に示す。１０８コピー～１００コピーのＲＮＡから定量性をもってシグナルを検出することができる。
以上の結果から、本発明によれば、高精度かつ高感度に、ＨＩＶを早期検出することができることが明らかである。
本発明によれば、ＨＩＶ感染細胞において、ＨＩＶに変異が生じたとしても、かかるウイルスを高精度に検出することができ、また、潜伏感染期間であっても、ＨＩＶを早期かつ高感度に検出することができるので、産業上有用である。

Claims (8)

  1. 　配列番号１又は６で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基からなる塩基配列と、８０％以上の同一性を有することを特徴とするＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチド。
  2. 　配列番号１又は６で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基からなる塩基配列と、９０％以上の同一性を有することを特徴とする請求項１に記載のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチド。
  3. 　配列番号１又は６で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基からなる塩基配列と、９５％以上の同一性を有することを特徴とする請求項１に記載のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチド。
  4. 　配列番号１又は６で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基からなる塩基配列と、９８％以上の同一性を有することを特徴とする請求項１に記載のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチド。
  5. 配列番号１又は６で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基からなる塩基配列を有する請求項１に記載のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチド。
  6. 　請求項１～５のいずれか一項に記載のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするＨＩＶ検出キット。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドまたはＨＩＶ検出キットを用いることを特徴とするＨＩＶ検出方法。
  8. 　（ａ）核酸試料中のｍＲＮＡの３’末端にｐｏｌｙＡを付加する工程と、
    　（ｂ）ｐｏｌｙＴと、該ｐｏｌｙＴの５’側にアダプター配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、逆転写反応により、前記ｍＲＮＡから該ｍＲＮＡに相補するｃＤＮＡを合成する工程と、
    　（ｃ）請求項１～５のいずれか一項に記載のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドと、前記アダプター配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、前記ｃＤＮＡから、ＨＩＶのｃＤＮＡの配列を有する標的塩基配列を増幅する工程と、
    　（ｄ）前記標的塩基配列の増幅産物を検出する工程と、
    　を有することを特徴とするＨＩＶ検出方法。
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