JPWO2019152747A5 - - Google Patents
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Description
本明細書に提供される態様のうちのいずれかのキットと使用説明書とを含む製品が、本明細書に提供され、ここで、説明書は、生物学的サンプルから単離された核酸に対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による、サンプルの中のウイルスRNAの存在、非存在、量、または濃度の評価を明記する。いくつかの態様において、PCRは、逆方向転写酵素PCRである。
[本発明1001]
(a)生物学的サンプルの中に存在する場合に1つまたは複数のウイルスDNAをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅するために十分な条件の下で、(i)異種核酸を含むレンチウイルスベクターによる少なくとも1つの細胞の形質導入によって導入された異種核酸を含有する少なくとも1つの細胞に由来するDNAと、(ii)ウイルスDNAの1つまたは複数の配列に特異的な少なくとも1つの順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよび少なくとも1つの逆方向オリゴヌクレオチドプライマーと、(iii)1つまたは複数のウイルスDNAの各々に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと、(iv)DNAポリメラーゼとを含む混合物をインキュベートする工程;ならびに
(b)増幅された核酸の存在、非存在、量、または濃度を検出する工程
を含む、ウイルスDNAの存在、非存在、または量を検出するための方法であって、ウイルスDNAの1つまたは複数の配列が、env遺伝子、gag遺伝子、pol遺伝子、およびrev遺伝子の少なくとも部分より選択されるウイルスDNAを含み、かつ少なくとも1つの順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよび逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、
(i)SEQ ID NO:35、50、51、または54に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、VSV-G env遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマー、ならびにSEQ ID NO:36、52、53、または55に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、env遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマー;
(ii)SEQ ID NO:42、45、または46に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、pol遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマー、ならびにSEQ ID NO:43または47に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、pol遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマー;
(iii)SEQ ID NO:16、19、または22に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、gag遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマー、ならびにSEQ ID NO:17、20、または23に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、gag遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマー;
(iv)SEQ ID NO:38に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、rev遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマー、ならびにSEQ ID NO:39に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、rev遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、方法。
[本発明1002]
PCRが定量的PCR(qPCR)である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
増幅された核酸が50~500塩基対の長さを有する、本発明1001~1002のいずれかの方法。
[本発明1004]
増幅された核酸が100~500塩基対の長さを有する、本発明1001~1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
増幅された核酸が200~500塩基対の長さを有する、本発明1001~1003のいずれかの方法。
[本発明1006]
増幅された核酸が300~500塩基対の長さを有する、本発明1001~1003のいずれかの方法。
[本発明1007]
増幅された核酸が、200塩基対を上回るまたは約200塩基対を上回る長さを有する、本発明1001~1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
ウイルスDNAがVSV-G env遺伝子の少なくとも部分を含み、かつ
(i)env遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:35に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、env遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:36に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含むか;
(ii)env遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:50に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、env遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:52に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含むか;または
(iii)env遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:51に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を有し、env遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:53に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、
本発明1001~1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
ウイルスDNAがVSV-G env遺伝子の少なくとも部分を含み、かつオリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:37または56に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、本発明1001~1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
オリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:37または56に記載の配列を含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
(a)env遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅するために十分な条件の下で、
(i)異種核酸を含むレンチウイルスベクターによる少なくとも1つの細胞の形質導入によって導入された異種核酸を含有する少なくとも1つの細胞に由来するDNAと;
(ii)それぞれ、SEQ ID NO:35およびSEQ ID NO:36に記載の配列;それぞれ、SEQ ID NO:50およびSEQ ID NO:52に記載の配列;またはそれぞれ、SEQ ID NO:51およびSEQ ID NO:53に記載の配列より選択される、VSV-g env遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよびVSV-g env遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーと;
(iii)SEQ ID NO:37に記載の配列を含むVSV-g env遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと;
(iv)DNAポリメラーゼと
を含む混合物をインキュベートする工程;ならびに
(b)増幅された核酸の存在、非存在、量、または濃度を検出する工程
を含む、VSV-G env遺伝子またはその部分を検出するための方法。
[本発明1012]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:35に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:36に記載される、本発明1008~1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:50に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:52に記載される、本発明1008~1011のいずれかの方法。
[本発明1014]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:51に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:53に記載される、本発明1008~1011のいずれかの方法。
[本発明1015]
ウイルスDNAがgag遺伝子の少なくとも部分を含み、かつ
(i)gag遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:16に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、gag遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:17に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含むか;
(ii)gag遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:19に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、gag遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:20に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含むか;または
(iii)gag遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:22に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、gag遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:23に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、
本発明1001~1010のいずれかの方法。
[本発明1016]
オリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:21または24に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、本発明1001~1010および1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
オリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:21または24に記載の配列を含む、本発明1001~1010、1015、および1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
(a)gag遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅するために十分な条件の下で、
(i)異種核酸を含むレンチウイルスベクターによる少なくとも1つの細胞の形質導入によって導入された異種核酸を含有する少なくとも1つの細胞に由来するDNAと;
(ii)それぞれ、SEQ ID NO:16およびSEQ ID NO:17に記載の配列;それぞれ、SEQ ID NO:19およびSEQ ID NO:20に記載の配列;またはそれぞれ、SEQ ID NO:22およびSEQ ID NO:23に記載の配列より選択される、gag遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよびgag遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーと;
(iii)SEQ ID NO:21または24に記載の配列を含む、gag遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと;
(iv)DNAポリメラーゼと
を含む混合物をインキュベートする工程;ならびに
(b)増幅された核酸の存在、非存在、量、または濃度を検出する工程
を含む、gag遺伝子またはその部分を検出するための方法。
[本発明1019]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:16に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:17に記載される、本発明1015~1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:19に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:20に記載される、本発明1015~1018のいずれかの方法。
[本発明1021]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:22に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:23に記載される、本発明1015~1018のいずれかの方法。
[本発明1022]
ウイルスDNAがpol遺伝子の少なくとも部分を含み、かつ
(i)pol遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:42に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、pol遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:43に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含むか;
(ii)pol遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:46に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、pol遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:43に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含むか;または
(iii)pol遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:46に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、pol遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:47に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、
本発明1001~1010および1015~1017のいずれかの方法。
[本発明1023]
ウイルスDNAがpol遺伝子の少なくとも部分を含み、かつpol遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:44、48、または49に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、本発明1001~1010、1015~1017、および1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
オリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:44に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、本発明1023の方法。
[本発明1025]
オリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:44に記載の配列を含む、本発明1023または本発明1024の方法。
[本発明1026]
(a)pol遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅するために十分な条件の下で、
(i)異種核酸を含むレンチウイルスベクターによる少なくとも1つの細胞の形質導入によって導入された異種核酸を含有する少なくとも1つの細胞に由来するDNAと;
(ii)それぞれ、SEQ ID NO:42およびSEQ ID NO:43に記載の配列;それぞれ、SEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:43に記載の配列;またはそれぞれ、SEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:47に記載の配列より選択される、pol遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよびpol遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーと;
(iii)SEQ ID NO:44に記載の配列を含む、pol遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと;
(iv)DNAポリメラーゼと
を含む混合物をインキュベートする工程;ならびに
(b)増幅された核酸の存在、非存在、量、または濃度を検出する工程
を含む、pol遺伝子またはその部分を検出するための方法。
[本発明1027]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:42に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:43に記載される、本発明1022~1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:46に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:43に記載される、本発明1022~1026のいずれかの方法。
[本発明1029]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:46に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:47に記載される、本発明1022~1026のいずれかの方法。
[本発明1030]
DNAの濃度が、混合物50μL当たり200ngまたは約200ngから2000ngまたは約2000ng(両端を含む)である、本発明1001~1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
ウイルスDNAがrev遺伝子の少なくとも部分を含み、かつrev遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:38に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、かつrev遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:39に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、本発明1001~1010、1015~1017、1022~1025、および1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
ウイルスDNAがrev遺伝子の少なくとも部分を含み、かつrev遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:40または63に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、本発明1001~1010、1015~1017、1022~1025、および1030~1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
オリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:40または63に記載の配列を含む、本発明1032の方法。
[本発明1034]
(a)rev遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅するために十分な条件の下で、
(i)異種核酸を含むレンチウイルスベクターによる少なくとも1つの細胞の形質導入によって導入された異種核酸を含有する少なくとも1つの細胞に由来するDNAと;
(ii)それぞれ、SEQ ID NO:38およびSEQ ID NO:39に記載の配列より選択される、rev遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよびrev遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーと;
(iii)SEQ ID NO:40または63に記載の配列を含む、rev遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと;
(iv)DNAポリメラーゼと
を含む混合物をインキュベートする工程;ならびに
(b)増幅された核酸の存在、非存在、量、または濃度を検出する工程
を含む、rev遺伝子またはその部分を検出するための方法。
[本発明1035]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:38に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:43に記載される、本発明1030~1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
ウイルスDNAの1つまたは複数の配列が2つ以上のウイルス配列を含み、2つ以上のウイルス配列が、異なるウイルス遺伝子の少なくとも部分を個々に含む、本発明1001~1010、1015~1017、1022~1025、および1030~1033のいずれかの方法。
[本発明1037]
ウイルスDNAの2つ以上の配列が、VSV-G env遺伝子およびrev遺伝子の少なくとも部分を含むウイルス配列を含む、本発明1036の方法。
[本発明1038]
rev遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよびrev遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、それぞれ、SEQ ID NO:38およびSEQ ID NO:39に記載の配列より選択され;かつ
rev遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:40または63に記載の配列を含む、
本発明1037の方法。
[本発明1039]
ウイルスDNAの2つ以上の配列がVSV-G env遺伝子およびpol遺伝子の少なくとも部分を含むウイルス配列を含む、本発明1036の方法。
[本発明1040]
pol遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよびpol遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、それぞれ、SEQ ID NO:42およびSEQ ID NO:43に記載の配列;それぞれ、SEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:43に記載の配列;またはそれぞれ、SEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:47に記載の配列より選択され;かつ
pol遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:44に記載される、
本発明1039の方法。
[本発明1041]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:42に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:43に記載される、本発明1040の方法。
[本発明1042]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:46に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:43に記載される、本発明1040の方法。
[本発明1043]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:46に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:47に記載される、本発明1040の方法。
[本発明1044]
VSV-g env遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよびVSV-g env遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、それぞれ、SEQ ID NO:35およびSEQ ID NO:36に記載の配列;それぞれ、SEQ ID NO:50およびSEQ ID NO:52に記載の配列;またはそれぞれ、SEQ ID NO:51およびSEQ ID NO:53に記載の配列より選択され;かつ
VSV-g env遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:37に記載される、
本発明1037~1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:35に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:36に記載される、本発明1044の方法。
[本発明1046]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:50に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:52に記載される、本発明1044の方法。
[本発明1047]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:51に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:53に記載される、本発明1044の方法。
[本発明1048]
ウイルスDNA配列各々の増幅された核酸の存在、非存在、量、または濃度の検出が、同一のインキュベーションにおいて実施される、本発明1036~1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
ウイルスDNA配列各々の増幅された核酸の存在、非存在、量、または濃度の検出が、異なるインキュベーションにおいて実施される、本発明1036~1047のいずれかの方法。
[本発明1050]
生物学的サンプルの中のウイルスDNAの存在、量、または濃度が、生物学的サンプルまたは生物学的サンプルが由来するサンプルの中の複製可能ウイルスの存在もしくは非存在またはリスクを示す、本発明1001~1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
ウイルスDNAの非存在および/または検出可能なレベルのウイルスDNAの非存在が、生物学的サンプルまたは生物学的サンプルが由来するサンプルの中の複製可能ウイルスの非存在を示す、本発明1001~1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
ウイルスベクターDNAの存在、量、または濃度が、生物学的サンプルが残留プラスミドDNAを含むことを示す、本発明1001~1049のいずれかの方法。
[本発明1053]
生物学的サンプルの中のウイルスDNAの存在、量、または濃度が、対照サンプルの中のウイルスDNAの存在、量、または濃度と比較される、本発明1052の方法。
[本発明1054]
対照サンプルがプラスミドDNA配列に特異的なプライマーを用いるPCR反応に由来し、ウイルスDNAがプラスミドDNA配列を含まず、任意で、プラスミドがウイルス産生プラスミドである、本発明1053の方法。
[本発明1055]
少なくとも1つの細胞が複数の細胞を含み、かつ
複数の細胞および/もしくは生物学的サンプルが浮遊細胞を含み;
複数の細胞および/もしくは生物学的サンプルが白血球を含み;かつ/または
複数の細胞および/もしくは生物学的サンプルがT細胞もしくはNK細胞を含む、
本発明1001~1054のいずれかの方法。
[本発明1056]
生物学的サンプルの中の対照遺伝子の存在、量、または濃度を評価する工程をさらに含み、対照遺伝子が細胞において発現されていることが既知であり、任意で、対照遺伝子がβアクチンであるかまたはβアクチンを含む、本発明1001~1055のいずれかの方法。
[本発明1057]
SEQ ID NO:42、43、45~47、50~55、57~58、61~62、または64のいずれかに記載の核酸配列を含むプライマー。
[本発明1058]
蛍光部分または標識をさらに含む、本発明1057のプライマー。
[本発明1059]
SEQ ID NO:44、48、49、56、59、62、または63のいずれかに記載の配列を含む、オリゴヌクレオチドプローブ、任意で加水分解プローブ。
[本発明1060]
検出可能標識をさらに含む、本発明1059のプローブ。
[本発明1061]
検出可能標識が蛍光色素およびクエンチャーを含む、本発明1060のプローブ。
[本発明1062]
本発明1057もしくは本発明1058の1つもしくは複数のプライマーおよび/または本発明1059~1061のいずれかのオリゴヌクレオチドプローブを含む、キット。
[本発明1063]
ヌクレアーゼフリー水、逆転写酵素、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、RNアーゼ、およびDNアーゼのうちの1つまたは複数をさらに含む、本発明1062のキット。
[本発明1064]
本発明1001~1056のいずれかの方法を実施するための、1つまたは複数のウイルスDNAの各々に特異的な、少なくとも1つの順方向プライマー、少なくとも1つの逆方向プライマー、およびオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに使用説明書を含む、キット。
[本発明1001]
(a)生物学的サンプルの中に存在する場合に1つまたは複数のウイルスDNAをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅するために十分な条件の下で、(i)異種核酸を含むレンチウイルスベクターによる少なくとも1つの細胞の形質導入によって導入された異種核酸を含有する少なくとも1つの細胞に由来するDNAと、(ii)ウイルスDNAの1つまたは複数の配列に特異的な少なくとも1つの順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよび少なくとも1つの逆方向オリゴヌクレオチドプライマーと、(iii)1つまたは複数のウイルスDNAの各々に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと、(iv)DNAポリメラーゼとを含む混合物をインキュベートする工程;ならびに
(b)増幅された核酸の存在、非存在、量、または濃度を検出する工程
を含む、ウイルスDNAの存在、非存在、または量を検出するための方法であって、ウイルスDNAの1つまたは複数の配列が、env遺伝子、gag遺伝子、pol遺伝子、およびrev遺伝子の少なくとも部分より選択されるウイルスDNAを含み、かつ少なくとも1つの順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよび逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、
(i)SEQ ID NO:35、50、51、または54に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、VSV-G env遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマー、ならびにSEQ ID NO:36、52、53、または55に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、env遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマー;
(ii)SEQ ID NO:42、45、または46に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、pol遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマー、ならびにSEQ ID NO:43または47に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、pol遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマー;
(iii)SEQ ID NO:16、19、または22に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、gag遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマー、ならびにSEQ ID NO:17、20、または23に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、gag遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマー;
(iv)SEQ ID NO:38に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、rev遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマー、ならびにSEQ ID NO:39に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、rev遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、方法。
[本発明1002]
PCRが定量的PCR(qPCR)である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
増幅された核酸が50~500塩基対の長さを有する、本発明1001~1002のいずれかの方法。
[本発明1004]
増幅された核酸が100~500塩基対の長さを有する、本発明1001~1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
増幅された核酸が200~500塩基対の長さを有する、本発明1001~1003のいずれかの方法。
[本発明1006]
増幅された核酸が300~500塩基対の長さを有する、本発明1001~1003のいずれかの方法。
[本発明1007]
増幅された核酸が、200塩基対を上回るまたは約200塩基対を上回る長さを有する、本発明1001~1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
ウイルスDNAがVSV-G env遺伝子の少なくとも部分を含み、かつ
(i)env遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:35に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、env遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:36に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含むか;
(ii)env遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:50に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、env遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:52に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含むか;または
(iii)env遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:51に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を有し、env遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:53に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、
本発明1001~1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
ウイルスDNAがVSV-G env遺伝子の少なくとも部分を含み、かつオリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:37または56に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、本発明1001~1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
オリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:37または56に記載の配列を含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
(a)env遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅するために十分な条件の下で、
(i)異種核酸を含むレンチウイルスベクターによる少なくとも1つの細胞の形質導入によって導入された異種核酸を含有する少なくとも1つの細胞に由来するDNAと;
(ii)それぞれ、SEQ ID NO:35およびSEQ ID NO:36に記載の配列;それぞれ、SEQ ID NO:50およびSEQ ID NO:52に記載の配列;またはそれぞれ、SEQ ID NO:51およびSEQ ID NO:53に記載の配列より選択される、VSV-g env遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよびVSV-g env遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーと;
(iii)SEQ ID NO:37に記載の配列を含むVSV-g env遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと;
(iv)DNAポリメラーゼと
を含む混合物をインキュベートする工程;ならびに
(b)増幅された核酸の存在、非存在、量、または濃度を検出する工程
を含む、VSV-G env遺伝子またはその部分を検出するための方法。
[本発明1012]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:35に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:36に記載される、本発明1008~1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:50に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:52に記載される、本発明1008~1011のいずれかの方法。
[本発明1014]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:51に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:53に記載される、本発明1008~1011のいずれかの方法。
[本発明1015]
ウイルスDNAがgag遺伝子の少なくとも部分を含み、かつ
(i)gag遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:16に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、gag遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:17に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含むか;
(ii)gag遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:19に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、gag遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:20に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含むか;または
(iii)gag遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:22に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、gag遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:23に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、
本発明1001~1010のいずれかの方法。
[本発明1016]
オリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:21または24に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、本発明1001~1010および1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
オリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:21または24に記載の配列を含む、本発明1001~1010、1015、および1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
(a)gag遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅するために十分な条件の下で、
(i)異種核酸を含むレンチウイルスベクターによる少なくとも1つの細胞の形質導入によって導入された異種核酸を含有する少なくとも1つの細胞に由来するDNAと;
(ii)それぞれ、SEQ ID NO:16およびSEQ ID NO:17に記載の配列;それぞれ、SEQ ID NO:19およびSEQ ID NO:20に記載の配列;またはそれぞれ、SEQ ID NO:22およびSEQ ID NO:23に記載の配列より選択される、gag遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよびgag遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーと;
(iii)SEQ ID NO:21または24に記載の配列を含む、gag遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと;
(iv)DNAポリメラーゼと
を含む混合物をインキュベートする工程;ならびに
(b)増幅された核酸の存在、非存在、量、または濃度を検出する工程
を含む、gag遺伝子またはその部分を検出するための方法。
[本発明1019]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:16に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:17に記載される、本発明1015~1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:19に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:20に記載される、本発明1015~1018のいずれかの方法。
[本発明1021]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:22に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:23に記載される、本発明1015~1018のいずれかの方法。
[本発明1022]
ウイルスDNAがpol遺伝子の少なくとも部分を含み、かつ
(i)pol遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:42に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、pol遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:43に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含むか;
(ii)pol遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:46に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、pol遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:43に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含むか;または
(iii)pol遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:46に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、pol遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:47に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、
本発明1001~1010および1015~1017のいずれかの方法。
[本発明1023]
ウイルスDNAがpol遺伝子の少なくとも部分を含み、かつpol遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:44、48、または49に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、本発明1001~1010、1015~1017、および1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
オリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:44に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、本発明1023の方法。
[本発明1025]
オリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:44に記載の配列を含む、本発明1023または本発明1024の方法。
[本発明1026]
(a)pol遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅するために十分な条件の下で、
(i)異種核酸を含むレンチウイルスベクターによる少なくとも1つの細胞の形質導入によって導入された異種核酸を含有する少なくとも1つの細胞に由来するDNAと;
(ii)それぞれ、SEQ ID NO:42およびSEQ ID NO:43に記載の配列;それぞれ、SEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:43に記載の配列;またはそれぞれ、SEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:47に記載の配列より選択される、pol遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよびpol遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーと;
(iii)SEQ ID NO:44に記載の配列を含む、pol遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと;
(iv)DNAポリメラーゼと
を含む混合物をインキュベートする工程;ならびに
(b)増幅された核酸の存在、非存在、量、または濃度を検出する工程
を含む、pol遺伝子またはその部分を検出するための方法。
[本発明1027]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:42に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:43に記載される、本発明1022~1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:46に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:43に記載される、本発明1022~1026のいずれかの方法。
[本発明1029]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:46に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:47に記載される、本発明1022~1026のいずれかの方法。
[本発明1030]
DNAの濃度が、混合物50μL当たり200ngまたは約200ngから2000ngまたは約2000ng(両端を含む)である、本発明1001~1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
ウイルスDNAがrev遺伝子の少なくとも部分を含み、かつrev遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:38に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、かつrev遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:39に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、本発明1001~1010、1015~1017、1022~1025、および1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
ウイルスDNAがrev遺伝子の少なくとも部分を含み、かつrev遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:40または63に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、本発明1001~1010、1015~1017、1022~1025、および1030~1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
オリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:40または63に記載の配列を含む、本発明1032の方法。
[本発明1034]
(a)rev遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅するために十分な条件の下で、
(i)異種核酸を含むレンチウイルスベクターによる少なくとも1つの細胞の形質導入によって導入された異種核酸を含有する少なくとも1つの細胞に由来するDNAと;
(ii)それぞれ、SEQ ID NO:38およびSEQ ID NO:39に記載の配列より選択される、rev遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよびrev遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーと;
(iii)SEQ ID NO:40または63に記載の配列を含む、rev遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと;
(iv)DNAポリメラーゼと
を含む混合物をインキュベートする工程;ならびに
(b)増幅された核酸の存在、非存在、量、または濃度を検出する工程
を含む、rev遺伝子またはその部分を検出するための方法。
[本発明1035]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:38に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:43に記載される、本発明1030~1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
ウイルスDNAの1つまたは複数の配列が2つ以上のウイルス配列を含み、2つ以上のウイルス配列が、異なるウイルス遺伝子の少なくとも部分を個々に含む、本発明1001~1010、1015~1017、1022~1025、および1030~1033のいずれかの方法。
[本発明1037]
ウイルスDNAの2つ以上の配列が、VSV-G env遺伝子およびrev遺伝子の少なくとも部分を含むウイルス配列を含む、本発明1036の方法。
[本発明1038]
rev遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよびrev遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、それぞれ、SEQ ID NO:38およびSEQ ID NO:39に記載の配列より選択され;かつ
rev遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:40または63に記載の配列を含む、
本発明1037の方法。
[本発明1039]
ウイルスDNAの2つ以上の配列がVSV-G env遺伝子およびpol遺伝子の少なくとも部分を含むウイルス配列を含む、本発明1036の方法。
[本発明1040]
pol遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよびpol遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、それぞれ、SEQ ID NO:42およびSEQ ID NO:43に記載の配列;それぞれ、SEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:43に記載の配列;またはそれぞれ、SEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:47に記載の配列より選択され;かつ
pol遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:44に記載される、
本発明1039の方法。
[本発明1041]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:42に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:43に記載される、本発明1040の方法。
[本発明1042]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:46に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:43に記載される、本発明1040の方法。
[本発明1043]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:46に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:47に記載される、本発明1040の方法。
[本発明1044]
VSV-g env遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよびVSV-g env遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、それぞれ、SEQ ID NO:35およびSEQ ID NO:36に記載の配列;それぞれ、SEQ ID NO:50およびSEQ ID NO:52に記載の配列;またはそれぞれ、SEQ ID NO:51およびSEQ ID NO:53に記載の配列より選択され;かつ
VSV-g env遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:37に記載される、
本発明1037~1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:35に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:36に記載される、本発明1044の方法。
[本発明1046]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:50に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:52に記載される、本発明1044の方法。
[本発明1047]
順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:51に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:53に記載される、本発明1044の方法。
[本発明1048]
ウイルスDNA配列各々の増幅された核酸の存在、非存在、量、または濃度の検出が、同一のインキュベーションにおいて実施される、本発明1036~1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
ウイルスDNA配列各々の増幅された核酸の存在、非存在、量、または濃度の検出が、異なるインキュベーションにおいて実施される、本発明1036~1047のいずれかの方法。
[本発明1050]
生物学的サンプルの中のウイルスDNAの存在、量、または濃度が、生物学的サンプルまたは生物学的サンプルが由来するサンプルの中の複製可能ウイルスの存在もしくは非存在またはリスクを示す、本発明1001~1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
ウイルスDNAの非存在および/または検出可能なレベルのウイルスDNAの非存在が、生物学的サンプルまたは生物学的サンプルが由来するサンプルの中の複製可能ウイルスの非存在を示す、本発明1001~1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
ウイルスベクターDNAの存在、量、または濃度が、生物学的サンプルが残留プラスミドDNAを含むことを示す、本発明1001~1049のいずれかの方法。
[本発明1053]
生物学的サンプルの中のウイルスDNAの存在、量、または濃度が、対照サンプルの中のウイルスDNAの存在、量、または濃度と比較される、本発明1052の方法。
[本発明1054]
対照サンプルがプラスミドDNA配列に特異的なプライマーを用いるPCR反応に由来し、ウイルスDNAがプラスミドDNA配列を含まず、任意で、プラスミドがウイルス産生プラスミドである、本発明1053の方法。
[本発明1055]
少なくとも1つの細胞が複数の細胞を含み、かつ
複数の細胞および/もしくは生物学的サンプルが浮遊細胞を含み;
複数の細胞および/もしくは生物学的サンプルが白血球を含み;かつ/または
複数の細胞および/もしくは生物学的サンプルがT細胞もしくはNK細胞を含む、
本発明1001~1054のいずれかの方法。
[本発明1056]
生物学的サンプルの中の対照遺伝子の存在、量、または濃度を評価する工程をさらに含み、対照遺伝子が細胞において発現されていることが既知であり、任意で、対照遺伝子がβアクチンであるかまたはβアクチンを含む、本発明1001~1055のいずれかの方法。
[本発明1057]
SEQ ID NO:42、43、45~47、50~55、57~58、61~62、または64のいずれかに記載の核酸配列を含むプライマー。
[本発明1058]
蛍光部分または標識をさらに含む、本発明1057のプライマー。
[本発明1059]
SEQ ID NO:44、48、49、56、59、62、または63のいずれかに記載の配列を含む、オリゴヌクレオチドプローブ、任意で加水分解プローブ。
[本発明1060]
検出可能標識をさらに含む、本発明1059のプローブ。
[本発明1061]
検出可能標識が蛍光色素およびクエンチャーを含む、本発明1060のプローブ。
[本発明1062]
本発明1057もしくは本発明1058の1つもしくは複数のプライマーおよび/または本発明1059~1061のいずれかのオリゴヌクレオチドプローブを含む、キット。
[本発明1063]
ヌクレアーゼフリー水、逆転写酵素、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、RNアーゼ、およびDNアーゼのうちの1つまたは複数をさらに含む、本発明1062のキット。
[本発明1064]
本発明1001~1056のいずれかの方法を実施するための、1つまたは複数のウイルスDNAの各々に特異的な、少なくとも1つの順方向プライマー、少なくとも1つの逆方向プライマー、およびオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに使用説明書を含む、キット。
Claims (36)
- (a)生物学的サンプルの中に存在する場合に1つまたは複数のウイルスDNAの配列をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅するために十分な条件の下で、(i)異種核酸を含むレンチウイルスベクターによる少なくとも1つの細胞の形質導入によって導入された異種核酸を含有する少なくとも1つの細胞に由来するDNAと、(ii)ウイルスDNA配列の1つまたは複数の配列の各々に特異的な少なくとも1つの順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよび少なくとも1つの逆方向オリゴヌクレオチドプライマーと、(iii)1つまたは複数のウイルスDNAの配列の各々に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと、(iv)DNAポリメラーゼとを含む混合物をインキュベートする工程;ならびに
(b)増幅された核酸の存在、非存在、量、または濃度を検出する工程
を含む、生物学的サンプルの中の、ウイルスDNAの存在、非存在、または量を検出するための方法であって、ウイルスDNAの1つまたは複数の配列が、env遺伝子、gag遺伝子、pol遺伝子、およびrev遺伝子の少なくとも部分より選択されるウイルスDNAを含み、かつ少なくとも1つの順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよび逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、
(i)SEQ ID NO:35、50、51、または54に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、VSV-G env遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマー、ならびにSEQ ID NO:36、52、53、または55に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、env遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマー;
(ii)SEQ ID NO:42、45、または46に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、pol遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマー、ならびにSEQ ID NO:43または47に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、pol遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマー;
(iii)SEQ ID NO:16、19、または22に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、gag遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマー、ならびにSEQ ID NO:17、20、または23に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、gag遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマー;
(iv)SEQ ID NO:38に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、rev遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマー、ならびにSEQ ID NO:39に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、rev遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、方法。 - PCRが定量的PCR(qPCR)である、請求項1記載の方法。
- 増幅された核酸が50~500塩基対、100~500塩基対、200~500塩基対、または300~500塩基対の長さを有する、請求項1~2のいずれか一項記載の方法。
- 増幅された核酸が、200塩基対を上回るまたは約200塩基対を上回る長さを有する、請求項1~3のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数のウイルスDNAの配列がVSV-G env遺伝子の少なくとも部分を含み、かつ
(i)env遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:35に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、env遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:36に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含むか;
(ii)env遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:50に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、env遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:52に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含むか;または
(iii)env遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:51に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を有し、env遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:53に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、
請求項1~4のいずれか一項記載の方法。 - 1つまたは複数のウイルスDNAの配列がVSV-G env遺伝子の少なくとも部分を含み、かつオリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:37または56に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、請求項1~5のいずれか一項記載の方法。
- オリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:37または56に記載の配列を含む、請求項6記載の方法。
- (a)env遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅するために十分な条件の下で、
(i)異種核酸を含むレンチウイルスベクターによる少なくとも1つの細胞の形質導入によって導入された異種核酸を含有する少なくとも1つの細胞に由来するDNAと;
(ii)それぞれ、SEQ ID NO:35およびSEQ ID NO:36に記載の配列;それぞれ、SEQ ID NO:50およびSEQ ID NO:52に記載の配列;またはそれぞれ、SEQ ID NO:51およびSEQ ID NO:53に記載の配列より選択される、VSV-G env遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよびVSV-G env遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーと;
(iii)SEQ ID NO:37に記載の配列を含むVSV-G env遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと;
(iv)DNAポリメラーゼと
を含む混合物をインキュベートする工程;ならびに
(b)増幅された核酸の存在、非存在、量、または濃度を検出する工程
を含む、VSV-G env遺伝子またはその部分を検出するための方法。 - 1つまたは複数のウイルスDNAの配列がgag遺伝子の少なくとも部分を含み、かつ
(i)gag遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:16に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、gag遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:17に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含むか;
(ii)gag遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:19に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、gag遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:20に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含むか;または
(iii)gag遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:22に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、gag遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:23に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、
請求項1~7のいずれか一項記載の方法。 - オリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:21または24に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、請求項1~7および9のいずれか一項記載の方法。
- オリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:21または24に記載の配列を含む、請求項1~7、9、および10のいずれか一項記載の方法。
- (a)gag遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅するために十分な条件の下で、
(i)異種核酸を含むレンチウイルスベクターによる少なくとも1つの細胞の形質導入によって導入された異種核酸を含有する少なくとも1つの細胞に由来するDNAと;
(ii)それぞれ、SEQ ID NO:16およびSEQ ID NO:17に記載の配列;それぞれ、SEQ ID NO:19およびSEQ ID NO:20に記載の配列;またはそれぞれ、SEQ ID NO:22およびSEQ ID NO:23に記載の配列より選択される、gag遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよびgag遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーと;
(iii)SEQ ID NO:21または24に記載の配列を含む、gag遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと;
(iv)DNAポリメラーゼと
を含む混合物をインキュベートする工程;ならびに
(b)増幅された核酸の存在、非存在、量、または濃度を検出する工程
を含む、gag遺伝子またはその部分を検出するための方法。 - 1つまたは複数のウイルスDNAの配列がpol遺伝子の少なくとも部分を含み、かつ
(i)pol遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:42に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、pol遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:43に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含むか;
(ii)pol遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:46に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、pol遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:43に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含むか;または
(iii)pol遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:46に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、pol遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:47に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/もしくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、
請求項1~7および9~11のいずれか一項記載の方法。 - ウイルスDNAがpol遺伝子の少なくとも部分を含み、かつpol遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:44、48、または49に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、請求項1~7、9~11、および13のいずれか一項記載の方法。
- オリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:44に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、請求項14記載の方法。
- オリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:44に記載の配列を含む、請求項14または請求項15記載の方法。
- (a)pol遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅するために十分な条件の下で、
(i)異種核酸を含むレンチウイルスベクターによる少なくとも1つの細胞の形質導入によって導入された異種核酸を含有する少なくとも1つの細胞に由来するDNAと;
(ii)それぞれ、SEQ ID NO:42およびSEQ ID NO:43に記載の配列;それぞれ、SEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:43に記載の配列;またはそれぞれ、SEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:47に記載の配列より選択される、pol遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよびpol遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーと;
(iii)SEQ ID NO:44に記載の配列を含む、pol遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと;
(iv)DNAポリメラーゼと
を含む混合物をインキュベートする工程;ならびに
(b)増幅された核酸の存在、非存在、量、または濃度を検出する工程
を含む、pol遺伝子またはその部分を検出するための方法。 - DNAの濃度が、混合物50μL当たり200ngまたは約200ngから2000ngまたは約2000ng(両端を含む)である、請求項1~17のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数のウイルスDNAの配列がrev遺伝子の少なくとも部分を含み、かつrev遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:38に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含み、かつrev遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:39に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、請求項1~7、9~11、13~16、および18のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数のウイルスDNAの配列がrev遺伝子の少なくとも部分を含み、かつrev遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:40または63に記載の配列の少なくとも90%の同一性および/または少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有する配列を含む、請求項1~7、9~11、13~16、および18~19のいずれか一項記載の方法。
- オリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:40または63に記載の配列を含む、請求項20記載の方法。
- (a)rev遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅するために十分な条件の下で、
(i)異種核酸を含むレンチウイルスベクターによる少なくとも1つの細胞の形質導入によって導入された異種核酸を含有する少なくとも1つの細胞に由来するDNAと;
(ii)それぞれ、SEQ ID NO:38およびSEQ ID NO:39に記載の配列より選択される、rev遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよびrev遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーと;
(iii)SEQ ID NO:40または63に記載の配列を含む、rev遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと;
(iv)DNAポリメラーゼと
を含む混合物をインキュベートする工程;ならびに
(b)増幅された核酸の存在、非存在、量、または濃度を検出する工程
を含む、rev遺伝子またはその部分を検出するための方法。 - 順方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:38に記載され、かつ逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO:43に記載される、請求項18~22のいずれか一項記載の方法。
- ウイルスDNAの1つまたは複数の配列が2つ以上のウイルス配列を含み、2つ以上のウイルス配列が、異なるウイルス遺伝子の少なくとも部分を個々に含む、請求項1~7、9~11、13~16、および18~21のいずれか一項記載の方法。
- ウイルスDNAの2つ以上の配列が、VSV-G env遺伝子およびrev遺伝子の少なくとも部分を含むウイルス配列を含む、請求項24記載の方法。
- (1) VSV-g env遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよびVSV-g env遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、それぞれ、SEQ ID NO:35およびSEQ ID NO:36に記載の配列;それぞれ、SEQ ID NO:50およびSEQ ID NO:52に記載の配列;またはそれぞれ、SEQ ID NO:51およびSEQ ID NO:53に記載の配列より選択され;かつ
VSV-g env遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:37に記載される、かつ
(2) rev遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよびrev遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、それぞれ、SEQ ID NO:38およびSEQ ID NO:39に記載の配列より選択され;かつ
rev遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:40または63に記載の配列を含む、
請求項25記載の方法。 - ウイルスDNAの2つ以上の配列がVSV-G env遺伝子およびpol遺伝子の少なくとも部分を含むウイルス配列を含む、請求項24記載の方法。
- (1) VSV-g env遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよびVSV-g env遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、それぞれ、SEQ ID NO:35およびSEQ ID NO:36に記載の配列;それぞれ、SEQ ID NO:50およびSEQ ID NO:52に記載の配列;またはそれぞれ、SEQ ID NO:51およびSEQ ID NO:53に記載の配列より選択され;かつ
VSV-g env遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:37に記載される、かつ
(2) pol遺伝子に特異的な順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよびpol遺伝子に特異的な逆方向オリゴヌクレオチドプライマーが、それぞれ、SEQ ID NO:42およびSEQ ID NO:43に記載の配列;それぞれ、SEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:43に記載の配列;またはそれぞれ、SEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:47に記載の配列より選択され;かつ
pol遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:44に記載される、
請求項27記載の方法。 - 2つ以上のウイルスDNAの各々に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが検出可能標識を含み、検出可能標識が蛍光色素およびクエンチャーを含む、請求項1~28のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数のウイルスDNAの配列の各々の増幅された核酸の存在、非存在、量、または濃度の検出が、同一のインキュベーションまたは異なるインキュベーションにおいて実施される、請求項24~29のいずれか一項記載の方法。
- 生物学的サンプルの中の1つまたは複数のウイルスDNAの配列の存在、量、または濃度が、生物学的サンプルまたは生物学的サンプルが由来するサンプルの中の複製可能ウイルスの存在もしくは非存在またはリスクを示す、または
ウイルスDNAの非存在および/または検出可能なレベルの1つまたは複数のウイルスDNAの配列の非存在が、生物学的サンプルまたは生物学的サンプルが由来するサンプルの中の複製可能ウイルスの非存在を示す、
請求項1~30のいずれか一項記載の方法。 - ウイルスベクターDNAの存在、量、または濃度が、生物学的サンプルが残留プラスミドDNAを含むことを示す、請求項1~30のいずれか一項記載の方法。
- 生物学的サンプルの中のウイルスDNAの検出された存在、量、または濃度が、対照サンプルの中のウイルスDNAの存在、量、または濃度と比較される、請求項32記載の方法。
- 対照サンプルがウイルス産生プラスミドであるプラスミドDNA配列に特異的なプライマーを用いるPCR反応に由来し、ウイルスDNAがプラスミドDNA配列を含まない、請求項33記載の方法。
- 少なくとも1つの細胞が複数の細胞を含み、かつ
複数の細胞および/もしくは生物学的サンプルが浮遊細胞を含み;
複数の細胞および/もしくは生物学的サンプルが白血球を含み;かつ/または
複数の細胞および/もしくは生物学的サンプルがT細胞もしくはNK細胞を含む、
請求項1~34のいずれか一項記載の方法。 - 生物学的サンプルの中の対照遺伝子の存在、量、または濃度を評価する工程をさらに含み、対照遺伝子が細胞において発現されていることが既知であり、任意で、対照遺伝子がβアクチンであるかまたはβアクチンを含む、請求項1~35のいずれか一項記載の方法。
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