KR20080083949A - 레이블링된 프라이머를 이용한 뉴클레오타이드 변이 검출방법 - Google Patents

레이블링된 프라이머를 이용한 뉴클레오타이드 변이 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 타깃 뉴클레오타이드 서열의 최소 2 종류 이상의 뉴클레오타이드 변이를 동시에 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따르면, 종래의 부가적인 제한효소 처리나 염기서열분석 과정 없이 간단한 증폭 반응 및 혼성화 과정을 통하여, 2종 이상의 뉴클레오타이드 변이를 오류 없이 동시에 정확하게 검출할 수 있다.
변이, 뉴클레오타이드, 증폭, 프라이머, 혼성화, 프로브

Description

레이블링된 프라이머를 이용한 뉴클레오타이드 변이 검출 방법{Method for Detecting Nucleotide Variations Using Labelled Primers}
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라, 인간 MTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase) 유전자의 뉴클레오타이드 변이를 검출하는 과정을 보여주는 개략도이다.
본 발명은 뉴클레오타이드 변이를 검출하는 방법에 관한 것이다.
유전자 변이는 학문적으로 그리고 의학적으로 매우 중요한 의미를 갖는다. 이에, 유전자 변이를 정확하게 그리고 보다 편리하게 검출할 수 있는 많은 방법들이 개발되어 있다.
예를 들어, 약재 내성을 보이는 B형 간염바이러스(Hepatitis B virus, HBV)의 변이를 검출하기 위하여, PCR 뒤에 직접적으로 유전자 염기 서열 분석을 하거 나, 제한효소 처리 후 전기영동, 제한효소 처리 후 질량분석법(PCR-RFMP법), LightCycler probe hybridization, primer-specific real-time PCR법 등이 있으나, 이 방법들은 정확도에서 문제가 있거나 편리성이 떨어지는 문제점이 있다.
한편, 뉴클레오타이드 1종을 검출하는 것도, 현재 기술로는 정확도가 문제가 되지만, 2종 이상의 뉴클레오타이드 변이를 동시에 검출하는 것은 신뢰성 있는 방법이 제시되고 있지 못하다.
예를 들어, 테트라-프라이머 PCR 방법에 의한 대립유전자(allele) 특이 증폭 반응을 통하여, 2종의 뉴클레오타이드 변이를 검출하는 방법이 제시되었다(Shu Ye, et al., Nucleic Acids, Res., 20(5):1152(1992)). 그러나 이 방법에 의해서도 재현성 있는 데이터가 나오지 않고 있다.
따라서, 지놈 DNA와 같은 핵산 상의 2종 이상의 변이를 간편하면서도 정확하고 민감하게 검출할 수 있는 방법이 요구되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 발명자는 상술한 당업계의 요구를 해결하고자 노력한 결과, 독특 한 구조를 가지는 프라이머를 제작하였고 이를 적합한 표지로 레이블링하여 증폭 반응을 실시한 다음 프로브와 혼성화 반응을 실시하는 경우에는 뉴클레오타이드 변이를 오류 없이 정확하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 최소 2 종류의 변이를 동시에 용이하게 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 뉴클레오타이드 타깃 뉴클레오타이드 서열의 최소 2 종류 이상의 뉴클레오타이드 변이를 동시에 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 뉴클레오타이드 변이가 나타나는 타깃 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 시료에서 타깃 뉴클레오타이드 서열의 최소 2 종류의 뉴클레오타이드 변이를 동시에 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 하기 (i) 내지 (iv)의 프라이머와 타깃 뉴클레오타이드 서열을 혼성화 조건 하에서 접촉시키는 단계:
(i) 제 1 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 뉴클레오타이드를 갖는 타깃 뉴클레오타이드 서열의 변이-발생 부위에 특이적으로 혼성화되며, 상기 제 1 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하 고, 5‘-말단에 검출가능한 표지가 결합되어 있는 제1 뉴클레오타이드 변이 특이적 프라이머(nucleotide variation specific primer 1: NVS-P1);
(ⅱ) 상기 NVS-P1 프라이머가 혼성화되는 상기 변이-발생 부위의 업스트림에 위치하는 타깃 뉴클레오타이드 서열의 특정 부위에 혼성화되는 타깃 서열 특이적 프라이머 1(target specific primer 1: TSP1);
(ⅲ) 상기 제 1 뉴클레오타이드 변이가 나타나는 동일 자리 또는 그의 인접 자리에서 제 2 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 뉴클레오타이드를 갖는 타깃 뉴클레오타이드 서열의 변이-발생 부위에 상보적인 서열에 특이적으로 혼성화되며, 상기 제 2 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 뉴클레오타이드를 포함하고, 5‘-말단에 검출가능한 표지가 결합되어 있는 제 2 뉴클레오타이드 변이 특이적 프라이머(nucleotide variation specific primer 2: NVS-P2); 및
(ⅳ) 상기 NVS-P2 프라이머가 혼성화되는 상기 변이-발생 부위의 다운스트림에 위치하는 타깃 뉴클레오타이드 서열의 특정 부위에 혼성화되는 타깃 서열 특이적 프라이머 2(target specific primer 2: TSP2);
(b) 최소한 2 사이클의 프라이머 어닐링, 프라이머 신장 및 변성 단계를 실시하여 타깃 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 생성된 증폭 산물을 제 1 프로브 및 제2 프로브와 혼성화시키는 단계로서, 상기 제1 프로브는 상기 단계 (b)에서 증폭될 수 있는 산물 중에서 상기 (ⅰ) 및 (ⅱ)의 프라이머 세트에 의해 증폭되는 산물에 대해서만 특이적으로 혼성화 되는 것이고, 상기 제2 프로브는 상기 단계 (b)에서 증폭될 수 있는 산 물 중에서 상기 (ⅲ) 및 (ⅳ)의 프라이머 세트에 의해 증폭되는 산물에 대해서만 특이적으로 혼성화 되는 것이고; 그리고,
(d) 상기 단계 (c)의 혼성화 시그널을 검출하는 단계.
본 발명은 뉴클레오타이드 서열 내의 다양한 뉴클레오타이드 변이 또는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 동시에 검출하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 뉴클레오타이드 서열 내의 동일한 염기 또는 동일한 코돈에서의 변이들을 동시에 정량적으로 또는 정성적으로 검출할 수 있는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 방법은 전 과정을 자동화할 하는 데 매우 유리한 방법이다.
현재까지, 2종 이상의 뉴클레오타이드 변이, 특히, 동일한 염기 또는 동일한 코돈에서의 2종 이상의 변이들을 동시에 검출할 수 있는 방법은 실제적으로 개발되지 않았다. 본 발명은 이러한 동시 변이 검출을 증폭반응과 혼성화 반응을 조합하는 방식으로 확인할 수 있는 실제적인 방법을 최초로 제공한다.
본 명세서에서 용어 “뉴클레오타이드 변이(nucleotide variation)”는 동일 유전자에서 나타나는 다양한 대립유전자형(allele)을 의미한다. 즉, 용어 “뉴클레오타이드 변이”는 야생형(wild) 및 변이형 (mutants)을 모두 포괄한다. 따라서, 본 발명의 청구 대상인 “뉴클레오타이드 변이의 검출방법”은, “지노타이핑(genotyping) 방법” 또는 “대립유전자형의 검출방법”으로 표현될 수 있다.
본 발명에서의 검출 대상인 뉴클레오타이드 서열은 gDNA, cDNA 및 RNA를 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 NVS-P1 및 NVS-P2 프라이머는 다음의 일반식 I로 표시된다:
5'-X-Ap-Yq-Vr-3' (I)
상기 일반식에서, X는 검출가능한 표지이고, Ap는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 변이 인접 특이성 구역(variation adjacent specificity portion)이고, Yq는 최소 3 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역(separation portion)이며, Vr은 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하며 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 변이 특이성 구역(variation specificity portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 변이 인접 특이성 구역의 Tm은 변이 특이성 구역의 Tm 보다 높으며, 상기 분할 구역은 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 구역은 혼성화 특이성 측면에서 변이 인접 특이성 구역이 변이 특이성 구역으로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성이 변이 인접 특이성 구역과 변이 특이성 구역에 의해 이중적으로 결정되도록 하고, 이는 결국 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다.
본 발명에서 이용되는 변이 특이적 프라이머(nucleotide variation specific prime: NVS)가 가지는 기본적인 구조는 본 발명자에 의해 최초로 제안되는 것이고, 이중 특이성(dual specificity) 구조라 명명할 수 있고, 이러한 구조를 가지는 올리고뉴클레오타이드는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(dual specificity oligonucleotide: DSO)라 명명된다. DSO는 본 발명자에 의하여 개발된 신 개념의 올리고뉴클레오타이드로서, 분할 구역에 의해 분리된 5'-고 Tm 특이성 구역(5'-high Tm specificity portion)과 3'-저 Tm 특이성 구역(3'-low Tm specificity portion)에 의해 이중적으로 혼성화가 결정되기 때문에 크게 향상된 혼성화 특이성을 나타낼 수 있다(참조: PCT/KR2005/001206).
본 발명에서의 NVS 프라이머는 상기 DSO를 변형한 것으로서, 상기 일반식 I의 구조를 갖는다. NVS 프라이머는 변이 인접 특이성 구역(variation adjacent specificity portion), 분할 구역(separation portion) 및 변이 특이성 구역(variation specificity portion)을 포함한다.
상기 분할 구역은 변이 인접 특이성 구역 및 변이 특이성 구역을 물리적으로 그리고 기능적으로 분할시키는 기능을 갖는다. 이러한 분할에 의해, 변이 인접 특이성 구역 및 변이 특이성 구역은, 혼성화 특이성 측면에서 서로 분할된다. 이러한 특이성 분할은 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화(어닐링) 특이성이 변이 인접 특이성 구역과 변이 특이성 구역에 의해 이중적으로 결정되도록 하고, 이는 결국 프라이머 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다.
보다 상세하게는, NVS 프라이머가 뉴클레오타이드 변이-포함 타깃 서열에 어닐링 될 때, 특이성은 종래 프라이머와 같이 프라이머 전체 길이에 의해 결정되는 것이 아니라, 서로 분할된 변이 인접 특이성 구역 및 변이 특이성 구역에 의해 이 중적으로 결정된다. 따라서, NVS 프라이머는 타깃 서열에 어닐링될 때, 종래의 프라이머와 다른 방식(performance)으로 어닐링되며, 이는 어닐링 특이성을 크게 향상시키는 결과를 초래한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분할 구역에 위치하는 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2‘-디옥시이노신, 2-아자-2’-디옥시이노신, 2‘-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2’-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는, 디옥시이노신, 이노신, 1-(2‘-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌이고, 가장 바람직하게는 디옥시이노신이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분할 구역은 연속된 유니버설 염기를 포함한다.
바람직하게는, 상기 변이 인접 특이성 구역의 길이는 변이 특이성 구역보다 길다. 상기 변이 인접 특이성 구역은 바람직하게는, 15-40 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 15-25 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.
상기 변이 특이성 구역은 바람직하게는, 3-15 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 5-15 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 6-13 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.
상기 분할 구역은 바람직하게는 3-10 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 4-8 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 5-7 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 변이 인접 특이성 구역은 40-80℃의 Tm을 가지며, 바람직하게는, 45-65℃의 Tm을 갖는다. 바람직하게는, 상기 변이 특이성 구역은 10-40℃의 Tm을 갖는다. 상기 분할 구역은 바람직하게는 3-15℃의 Tm을 갖는다.
본 발명의 프라이머의 변이 특이성 구역은, 뉴클레오타이드 변이에 해당하는(corresponding) 또는 상보적인(complementary) 뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 프라이머가 타깃 뉴클레오타이드 서열의 센스 가닥과 혼성화 되는 경우에는, 변이 특이성 구역은 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하며, 안티센스 가닥과 혼성화 되는 경우에는, 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 뉴클 레오타이드를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드는 변이 특이성 구역의 3'-말단 또는 3'-말단으로부터 1 내지 10 염기 이격된 자리에 위치하며, 보다 바람직하게는 변이 특이성 구역의 3'-말단으로부터 2 내지 7 염기, 보다 더 바람직하게는 3'-말단으로부터 3 내지 6 염기 이격된 자리에 위치한다. 가장 바람직하게는 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드는 변이 특이성 구역의 가운데(center) 또는 그 근처(around the center)에 위치한다. 예컨대, 변이 특이성 구역이 8 뉴클레오타이드를 포함하는 경우, 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드는 변이 특이성 구역의 3'-말단으로부터 3 내지 6 염기 이격된 자리, 바람직하게는 4-5 염기 이격된 자리, 보다 바람직하게는 4 염기 이격된 자리에 위치한다.
상기 NVS 프라이머의 변이 특이적 구역에서, 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드가 변이 특이성 구역의 3'-말단으로부터 3 내지 6 염기 이격된 자리에 위치하거나 또는 가운데에 치우쳐서 위치하게 되면, 다음과 같은 유리한 효과가 발생된다.
예를 들어, 일반적인 프라이머를 이용하여, SNP를 검출할 때에는 변이 발생 부위를 3‘-말단에 위치하게 되는 데, 이 경우 3‘-말단의 염기가 타깃 서열에 어닐링 될 때와 되지 않을 때(즉, 미스매칭이 될 때) Tm 값이 크게 차이가 나지 않는다. 따라서 미스매칭 될 때에도 어닐링 되어 증폭 반응이 일어나 위양성 결과가 나오는 경향이 크다. 반대로, 변이 발생 부위를 가운데에 치우쳐서 위치시키면, 변이 발생 부위가 타깃 서열에 어닐링 될 때와 되지 않을 때(즉, 미스매칭이 될 때) Tm 값이 어느 정도 크게 차이가 나지만, 대부분의 열안정성 중합효소는 미스매칭 되는 부분에서도 중합반응을 촉매하여 위양성 결과를 초래한다.
본 발명에 따르는 경우에는, 상술한 종래 기술의 문제점을 완벽하게 극복할 수 있다. 예컨대, 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드가 변이 특이성 구역의 가운데에 치우쳐서 위치하는 경우, 만일 이 위치에서 미스매칭이 발생되면, 변이 특이성 구역만으로 볼 때에는 구조의 중앙에서 미스매칭이 발생된 것이기 때문에, 변이 특이성 구역의 Tm 값이 매칭될 때와 비교하여 크게 감소하게 되며, 프라이머 전체 구조로 볼 때에는 3‘-말단에서의 미스매칭이기 때문에, 열안정성 중합효소는 중합반응을 촉매하지 않는다. 따라서, 미스매칭되는 경우, 위양성 결과가 발생되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 NVS 프라이머는 다음 일반식 Ⅱ로 표현된다:
5'-X-Ap-(dI)q-Vr-3' (I)
상기 일반식에서, X는 검출가능한 표지이고, Ap는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 변이 인접 특이성 구역(variation adjacent specificity portion)이고, (dI)q는 연속적인 디옥시이노신 잔기를 포함하는 분할 구역(separation portion)이며, Vr은 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하며 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 변이 특이성 구역(variation specificity portion)이고, p는 15-25이며, q는 4-8이고, r은 6-13이며, 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드는 Vr의 가운데에 위치해 있다.
상기 일반식 Ⅱ의 NVS 프라이머에서, (dI)는 연속적인 디옥시이노신 잔기를 포함하는 분할 구역이며, 디옥시이노신 잔기의 개수는 4-8이다. 이 경우, (dI)가 분할 구역 역할을 할 수 있는 범위 내에서 다른 염기가 삽입될 수도 있다.
또한, 상기 일반식 Ⅱ의 NVS 프라이머에서, 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드는 Vr의 가운데에 위치해 있다. 예를 들어, Vr이 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13개의 뉴클레오타이드 잔기로 이루어져 있는 경우, 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드는 Vr의 3‘-말단으로부터 각각 3-4, 3-5, 4-5, 4-6, 5-6, 5-7, 6-7 및 6-8 뉴클레오타이드에 위치해 있는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 용어 “프라이머”는 합성 또는 자연의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머는 주형에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합체의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용한다. 증폭의 최대 효율을 위하여, 바람직하게는 프라이머는 단일쇄이다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프라이머는 자연 (naturally occurring) dNMP (즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다.
본 명세서에서 용어“혼성화”는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링 (pairing)에 의하여 이합체 구조 (duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우 (perfect match) 일어나거나 일부 미스매치 (mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 일반적으로, 혼성화 온도가 높으면, 완전한 매치일 경우 혼성화가 일어날 가능성이 높으며, 혼성화 온도가 낮으면, 일부 미스매치가 존재하더라고 혼성화가 일어날 수 있다. 혼성화 온도가 낮으면, 낮을수록 혼성화가 일어날 수 있는 미스매치의 정도는 증가할 것이다.
프라이머 어닐링, 프라이머 신장 및 변성 단계를 실시하여 타깃 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 혼성화(어닐링) 온도는 40℃ 내지 70℃이고 보다 바람직하게는 45℃ 내지 68℃이고, 보다 더 바람직하게는 50℃ 내지 65℃이며, 가장 바람직하게는 60℃ 내지 65℃이다.
변이를 포함하는 핵산 서열을 증폭하기 위한 본 발명의 방법은 소망하는 어떠한 변이도 검출할 수 있도록 한다. 이러한 핵산 분자는 DNA 또는 RNA이다. 상기 핵산 분자는 이중쇄 또는 단일쇄일 수 있고, 바람직하게는 이중쇄이다. 출발물질로서 핵산이 이중쇄인 경우, 두 쇄를 단일쇄로, 또는 부분적인 단일쇄 형태로 만드는 것이 바람직하다. 쇄를 분리하는 방법은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 쇄 분리는 80-105℃의 온도로 열 처리하여 달성될 수 있다. 상술한 처리의 일반적인 방법은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있다.
mRNA가 출발물질로 이용되는 경우, 역전사 단계가 증폭 전에 필요로 하며, 역전사 단계의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)에 개시되어 있다. 역전사 단계에서, mRNA의 폴리 A 테일에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머가 이용된다. 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머는 dTMPs로 이루어져 있고, dT 프라이머가 프라이머로서 작용할 수 있는 한도 내에서 dTMPs 중 하나 또는 그 이상은 다른 dNMPs로 대체될 수 있다. 역전사 단계는 RNase H 활성을 갖는 역전사 효소에 의해 이루어질 수 있다. RNase H 활성을 갖는 효소를 이용하는 경우, 반응조건을 주의하여 선택하면 개별적인 RNase H 절단 과정을 피할 수 있다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다. 또한, 본 발명에 이용되는 중합효소는 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다.
증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건(즉, 분할 구역이 타깃 서열에 수소결합을 할 수 없는 조건) 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 바람직하게는, 어닐링 온도는 40℃ 내지 70℃이고 보다 바람직하게는 45℃ 내지 68℃이고, 보다 더 바람직하게는 50℃ 내지 65℃이며, 가장 바람직하게는 60℃ 내지 65℃이다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR에 따라 실시된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 NVS 프라이머에 결합되는 검출가능한 표지(detectable label)는, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 알칼린 포스파타아제, 퍼옥시다아제, β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제), 방사능 표지(예컨대, I125 및 C14), 형광 표지(예컨대, 플루오리신, 피코에리트린, 로다민, 리사민, TAMRA, Cy5, Cy3, HEX, TET, Dabsyl 및 FAM), 발광 표 지, 화학발광(chemiluminescent) 표지, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 또는 중금속 표지(예컨대, 금)이다. 보다 바람직하게는, 상기 표지는 화학적 표지 또는 금속 표지이고, 보다 더 바람직하게는 화학적 표지이며, 가장 바람직하게는 바이오틴이다. 상기 효소 표지로는, 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소가 이용될 수 있다. 표지 물질에 의한 프라이머의 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다.
본 발명에서 이용되는 타깃 서열 특이적 프라이머(TSP)는 분석 목적의 변이 발생 바깥 부위(outer region)에 어닐링 되는 것이기 때문에, 종래의 프라이머 즉 분할 구역이 없는 통상적인 프라이머 구조를 가지는 프라이머가 이용될 수 있다. 바람직하게는, TSP는 상기 일반식 I로 표시되는 구조를 가지며 이 경우 변이 특이성 구역은 뉴클레오타이 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드 없이 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 갖는다.
본 발명의 다른 변형예에 따르면, 단계 (a)는 상기 NVS-P1 프라이머와 NVS-P2 프라이머가 혼성화 되는 변이 이외의 다른 변이에 혼성화되는 1개 이상의 뉴클레오타이드 변이 특이적 프라이머(nucleotide variation specific primer)를 추가적으로 이용하여 실시된다. 예를 들어, B형 간염 바이러스(HBV)의 라미부딘 내성 변이체를 검출하기 위하여 본 발명의 방법을 적용하는 경우, YIDD 모티프, YVDD 모 티프 및 L528M의 변이에 혼성화 되는 3종 이상의 NVS-P 프라이머를 이용하여 3개의 변이를 동시에 검출할 수 있다.
상술한 증폭 과정을 실시한 다음, 생성된 증폭 산물을 2종의 프로브와 혼성화시킨다. 상기 2종의 프로브 중 하나는 상기 단계 (b)에서 증폭될 수 있는 산물 중에서 상기 (ⅰ) 및 (ⅱ)의 프라이머 세트에 의해 증폭되는 산물에 대해서만 특이적으로 혼성화 되는 것이고, 나머지 프로브는 상기 단계 (b)에서 증폭될 수 있는 산물 중에서 상기 (ⅲ) 및 (ⅳ)의 프라이머 세트에 의해 증폭되는 산물에 대해서만 특이적으로 혼성화 되는 것이다. 도 1을 참조하여 설명하면, 프로브 1 및 프로브 2가 혼성화 반응에 이용되는 최소한의 프라이머이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 프로브는 적합한 기질(substrate)에 고정화되어 마이크로어레이를 구성한다. 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기질 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌글리콜 올 리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.
단계 (c)의 혼성화에 적합한 조건은, Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격조건 (stringent condition)은 온도, 이온세기 (완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 따라 다르게 결정될 수 있다.
예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.
혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 NVS 프라이머에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다.
예를 들어, NVS가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다.
NVS가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 니트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (d)는 다음의 소단계(sub-steps)를 포함한다: (d-1) 상기 단계 (c)의 혼성화 결과물에 아비딘-HRP(horseradish peroxidase) 또는 스트렙타비딘-HRP를 접촉시키는 단계; (d-2) 상기 소단계 (d-1)의 결과물에 HRP의 기질을 반응시키는 단계; 및 (d-3) 상기 소단계 (d-1)의 반응 발생 여부를 검출하는 단계.
혼성화 시그널을 검출함으로써, 최종적으로 시료 핵산 분자에 어떠한 변이가 있는 지 여부를 확인할 수 있다. 예컨대, 제1 프로브와의 혼성화 반응만 검출되었다면, 시료 핵산 분자는 제1 뉴클레오타이드 변이에 대하여 호모 유전자형을 갖는 것으로 분석되며, 반대로 제2 프로브와의 혼성화 반응만 검출되었다면, 시료 핵 산 분자는 제2 뉴클레오타이드 변이에 대하여 호모 유전자형을 갖는 것으로 분석된다. 만일, 제1 프로브와 제2 프로브 모두에 대하여 혼성화 반응이 검출되었다면, 시료 핵산 분자는 제1 뉴클레오타이드 변이 및 제2 뉴클레오타이드 변이 모두를 갖는 것으로서, 헤테로 유전자형으로 분석된다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 혼성화 시그널 검출 단계는, “Array tube”기술로 공지된 방법에 따라 실시될 수 있다(Stefan Monecke et al, Genome Letters, 2:106-118(2003)). 상기 기술을 구현하는 데 적합한 도구(device)는 Clondiag 사(독일)에서 “ArrayTube"로 판매되고 있다.
본 발명의 방법은 다양한 뉴클레오타이드 변이의 검출에 이용될 수 있다. 예를 들어, 인간 지놈에 있는 다양한 변이(예컨대, MTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase) 유전자의 변이), 약제 내성 병원체의 뉴클레오타이드 변이 및 암 발생-관련 뉴클레오타이드의 변이를 검출하는 데 이용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 약제 내성 병원체, 보다 바람직하게는 약제 내성 바이러스를 검출하기 위한 것이다. 상기 약제 내성 바이러스는 바람직하게는, HIV(human immunodeficiency virus)-1, HIV-2, HBV(hepatitis B virus), HCV(hepatitis C virus) 또는 인간 헤르페스 바이러스(human herpesvirus)이며, 가장 바람직하게는 HBV이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 바이러스가 내성을 나타내는 약제는 지도부딘(zidovudine), 디다노신(didanosine), 잘시타빈(zalcitabine), 스타부 딘(stavudine), 라미부딘(lamivudine), 네비라핀(nevirapine), 델라비르딘(delavirdine), 에파비렌즈(efavirenz), 아데포비르(adefovir), 아데포비르 디피복실(adefovir dipivoxil), FTC, D4FC, BCH-l89, F-ddA, 테트라하이드로이미다조[4,5,1-jk[]1,4]벤조디아제핀-2(1H)-온(tetrahydroimidazo[4,5,1-jk[]1,4]benzodiazepine-2(1H)-one), 테트라하이드로이미다조[4,5,1-jk[]1,4]벤조디아제핀-2(1H)-티온(tetrahydroimidazo[4,5,1-jk[]1,4]benzodiazepine-2(1H)-thione), (S)-4-이소프로폭시카보닐-6-메톡시-3-(메틸티오메틸)-3,4-디하이드로퀴녹살린-2(1H)-티온((S)-4-isopropoxycarbonyl-6-methoxy-3-(methylthiomethyl)-3,4,- dihydroquinoxaline-2(1H)-thione), 사퀴나비르(saquinavir), 리토나비르(ritonavir), 인디나비르(indinavir), 넬피나비르(nelfinavir) 암프레나비르(amprenavir), 엔테카비르(entecavir), 팜시클로비어(famciclovir), 벤조-1,2,4-티아진 항바이러스제(benzo-1,2,4-thiadiazine antiviral agent), 리바비린(ribavirin) 및 인터페론으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 항바이러스 약제이며, 가장 바람직하게는 라미부딘이다.
본 발명의 방법에 따르면, 상기 약제 내성을 나타내는 병원체의 변이된 뉴클레오타이드 서열을 참조하여 NVS-P 프라이머를 제작한다.
HIV-1 역전사효소에 변이가 발생되어 항바이러스제(잘시타빈, 지도부딘, 디다노신, 라미부딘 등)에 대한 내성을 나타내는 변이의 예는 다음과 같다: Met41Leu, Glu44Asp, Glu44Ala, Ile50Val, Ala62Val, Lys65Arg, Asp67Asn, Ser68Gly, Thr69Asp, Thr69Ser-Ser-Gly, Thr69Ser-Thr-Gly, Thr69Ser-Val-Gly, Lys70Arg, Lys70Glu, Leu74Ile, Leu74Val, Val75Ile, Val75Leu, Val75Thr, Phe77Leu, LeulOOIle, Lysl03Asn, VallO8Ala, VallO8Ile, Proll9Ser, Ilel35Thr, Ilel35Val, Glnl51Met, Thrl65Ile, Vall79Asp, Tyrl81Ile, Metl84Ala, Metl84Ile, Metl84Val, Tyrl88His, Tyrl88Leu, Glyl90Ala, Glyl90Cys, Glyl90Glu, Gryl90Gln, Glyl90Ser, Glyl90Thr, Leu210Trp, Leu214Phe, Thr215Tyr, Thr215Phe, Thr215Ser, Lys219Gln, Pro294Ser 및 Gly333Glu.
HIV-1 프로테아제에 변이가 발생되어 항바이러스제(사퀴나비르, 리토나비르, 인디나비르, 넬피나비르, 암프레나비르 등)에 대한 내성을 나타내는 변이의 예는 다음과 같다: Leu10Ile, LeulOVal, LeulOPhe, Val32Ile, Glu35Asp, Met36Ile, Met46Ile, Met45Leu, Ile47Val, Gly48Val, Ile50Val, Ile54Met, Ile54Ser, Ile54Val, Leu63Pro, Ala71Thr, Ala71Val, Val77Ile, Val82Ala, Val82Ile, Val82Phe, Val82Thr, Ile84Ala, Ile84Val, Asn88Asp, Asn88Ser, Leu89Met, Leu89Pro 및 Leu90Met.
HCV RNA-의존성 RNA 중합효소에 변이가 발생되어 항바이러스제(예컨대, 벤조-1,2,4-티아진 항바이러스제)에 대한 내성을 나타내는 변이의 예는 다음과 같다: Lys50Arg, Met71Val, Asn41 lSer, Met414Thr, Phe415Ty 및 Val581Ala.
HCV NS5A 단백질에 변이가 발생되어 항바이러스제(예컨대, 인터페론 등)에 대한 내성을 나타내는 변이의 예는 다음과 같다: Leu2190Lys, Val2198Leu, Val2198Met, Val2198Glu, Thr2217Ala, Thr2217Val, Asn2218Asp, Asn2218Lys, Asn2218Ser, Asp2220Glu, Asp2223Glu, Glu2225Asp, Glu2228Gln, Glu2236Ala, Asn2248Asp, He2252Val, Ile2268Val, Arg2276Leu, Lys2277Arg, Ser2278Pro, Arg2280Lys, Arg2280Glu, Ala2282Thr, Pro2283Gln, Pro2283Arg, Val2287Ile, Leu2298Val, Leu2298Ile, Thr2300Pro, Thr2300Ala, Lys2302Asn, Lys2303Asn, Asp2305Gly 및 Pro2315Ala.
HBV 중합효소에 변이가 발생되어 항바이러스제에 대한 내성을 나타내는 예는 다음과 같다: (ⅰ) 라미부딘: Leu426Ile, Leu426Val, Val173Leu, Met552Ile, Met552Val, Met552Ser, Val555Ile, Leu528Met; (ⅱ) 엔테카비르: Ile169Thr, Thr184Gly, Ser202Ile, Met250Val; (ⅲ) 팜시클로비어: Val173Leu, Met552Ile, Val555Ile; 및 (ⅳ) 아데포비르 디피복실: Asn236Thr.
본 발명에서 사용되는 뉴클레오타이드 변이 특이적 NVS-P 프라이머는 상기한 약제 내성 병원체의 변이된 뉴클레오타이드 서열을 참조하여 디자인된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 HBV의 중합효소에서의 약제 내성 뉴클레오타이드 변이, 보다 바람직하게는 HBV의 중합효소에서의 라미부딘 내성 뉴클레오타이드 변이, 가장 바람직하게는 HBV의 중합효소에서의 552번째 코돈에서의 변이를 검출하는 데 적용된다.
본 발명은 2 종 이상의 뉴클레오타이드 변이를 동시에 검출하는 데 유용하다. 본 명세서에서 용어 “동시에”는 하나의 증폭 반응액에서 2종 이상의 변이 존재 여부를 확인할 수 있는 반응 결과물을 얻는다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 방법에 따르면 멀티플렉스 증폭 반응이 필수적으로 수반된다.
본 발명의 방법이 동일 자리에서의 변이를 검출하는 데 이용되는 경우에는, 2종의 SNP를 동시에 검출하는 데 유용하다. 본 발명의 방법이 서로 다른 자리, 즉 인접 자리 또는 이격된 자리에서 발생되는 2종 이상의 변이를 검출하는 데 이용되는 경우에는, 크게 다음과 같은 적용성(applicability)이 있다. (ⅰ) 동일 자리는 아니지만, 동일 코돈 내의 인접한 자리에서의 2종의 뉴클레오타이드 변이를 동시에 검출; 및 (ⅱ) 동일 코돈 내에 포함되지 않은 인접한 자리 또는 이격된 위치에서의 2종 이상의 뉴클레오타이드 변이를 동시에 검출.
동일 자리 또는 동일 코돈에 있는 2 종 이상의 변이를 검출하는 경우, 본 발명은 2 종의 뉴클레오타이드를 동시에 검출하는 데에 유리하다. 이 경우 사용되는 NVS-P1 프라이머 및 NVS-P2 프라이머는 중첩되는 서열을 가지게 되는 것이 일반적이며, 서로 혼성화되어 이합체(duplex)를 형성할 수 있다. 이러한 프라이머 사이의 이합체 형성은 증폭반응을 비정상적으로 만들어, 잘못된 증폭 결과를 초래할 수 있다. 그러나 본 발명의 NVS 프라이머는 프라이머 사이의 이합체 형성에 따른 문제점을 극복하며, 이 특징 및 장점은 2 종의 변이를 동시에 검출하는 것이 실제적으로 가능하게 한다.
B형 간염 바이러스(HBV)의 라미부딘 내성 변이체를 검출하기 위한 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따라, 본 발명의 과정을 설명하면 다음과 같다.
우선, 라미부딘 내성을 유발하는 뉴클레오타이드 변이가 발생되는 타깃 서열로서의 HBV의 DNA 중합효소의 코딩 서열을 얻는다. 상기 서열은, 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대, GenBank 접근번호 NC003977, AY167096, AY167095 및 AY306136에서 확인할 수 있다. 이 서열에서 라미부딘 내성을 유발하는 단일염기 변이가 있으며, 야생형에서는 메티오닌을 코딩한다(YMDD 모티프). 그러나 라미부딘 및 팜시클로비어와 같은 항바이러스 약제에 내성을 갖는 HBV는 YMDD 모티브에서 메티오닌이 이소루신(YIDD 모티프), 발린(YVDD 모티프) 또는 세린(YSDD 모티프)으로 치환된 변이를 갖는다. YIDD 모티프에서는 g가 t로 변이되어 있고, YVDD 모티프에서는 a가 g로, YSDD 모티프에서는 tg가 gt로 변이되어 있다.
변이형인 YVDD 모티프 및 YIDD 모티프를 동시에 검출하기 위하여, 서열목록 제3서열의 YVDD-R 프라이머 및 서열목록 제4서열의 YIDD-F 프라이머를 이용한다. YVDD-R 프라이머는 HLT-F 프라이머(서열목록 제1서열)와 쌍을 이루어 증폭산물을 형성하고, YIDD-F 프라이머는 HLT-R 프라이머(서열목록 제2서열)와 쌍을 이루어 증폭산물을 형성한다. HLT-F와 HLT-R은 변이가 발생된 바깥쪽(outer region)에 어닐링 하는 프라이머로서, 이 두 프라이머는 서로 쌍을 이루어 증폭산물을 형성시키기도 한다). 상기 프라이머들은 이들에 의해 생성되는 증폭산물이 소정의 크기를 가지며, 각각의 프라이머 세트에 의해 생성되는 증폭 산물의 크기는 서로 다르도록 선택되고 디자인된 것이다. 따라서 증폭산물을 간단한 전기영동을 통하여 그 크기만을 확인해 봄으로써 시료 내의 타깃 뉴클레오타이드 서열이 어떠한 변이를 가지고 있는 지를 용이하게 검출할 수 있다. NVS-P 프라이머에 해당하는 YVDD-R과 YIDD-F는 서로 혼성화될 수 있는 서열을 가지고 있음에도 불구하고, 증폭 반응에서 서로 영향을 주지 않으며, 정확한 증폭 결과를 나타낸다. YSDD 모티프를 검출하려고 하는 경우에는, 서열목록 제4서열의 YSDD-F 프라이머를 이용할 수 있다.
본 발명의 방법은 서로 이격된 위치에 있는 2종 이상의 변이를 동시에 검출 하는 데 유용하게 이용될 수 있다. 만일, 본 발명의 방법을 HBV DNA 중합효소 유전자 상의 서로 이격된 위치에 있는 YIDD-F 모티프 및 L528M 변이를 동시에 검출하는 데 적용하는 경우, 서열목록 제4서열의 YIDD-F 프라이머 및 서열목록 제6서열의 L528M-R 프라이머를 이용한다. L528M-R은 HLT-F 프라이머와 쌍을 이루어 증폭산물을 형성하고, YIDD-F 프라이머는 HLT-R 프라이머와 쌍을 이루어 증폭산물을 형성한다.
본 발명의 방법이 인간 지놈에 있는 다양한 변이, 예컨대 MTHFR 유전자에서 677번째 뉴클레오타이드에서의 변이를 검출하는 경우의 예는 하기 실시예에 기재되어 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 간단한 증폭 반응을 통하여, 2종 이상의 뉴클레오타이드 변이를 오류 없이 동시에 정량적으로 또는 정성적으로 정확하게 검출할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점(advantages)을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명의 방법은 최소 2종 이상의 프라이머 세트를 이용하는 멀티플렉스 증폭 반응 및 혼성화 반응의 조합에 따라 실시된다.
(ⅱ) 본 발명의 방법에 따르면, 타깃 뉴클레오타이드 서열 상의 2종 이상의 뉴클레오타이드 변이를 매우 높은 특이성으로 동시에 검출할 수 있다.
(ⅲ) 본 발명의 방법은 멀티플렉스 반응에서 매우 우수한 작동성(workability)를 나타내어, 하나의 증폭 반응 세트를 이용하여 최종적으로 혼성 화 반응을 통하여 2종 이상의 뉴클레오타이드 변이를 동시에 검출할 수 있다.
(ⅳ) 본 발명의 방법에서 이용되는 NVS-P 프라이머에서, 뉴클레오타이드 변이에 해당하거나 또는 상보적인 뉴클레오타이드가 변이 특이성 구역의 가운데에 치우쳐서 위치하게 되면, 증폭반응에서 단일염기 미스매치를 완벽하게 구별할 수 있다.
(ⅴ) 본 발명의 방법에 따르면, 동일 자리 또는 동일 코돈 내의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 이격된 위치에 있는 2종 이상의 뉴클레오타이드도 동시에 검출할 수 있다.
(ⅵ) 일반적으로 중첩되는 서열을 가지는 프라이머 쌍이 이용되는 경우, 프라이머끼리 이합체를 형성하여 잘못된 증폭 결과를 초래할 수 있는 데, 본 발명의 방법에 따르면, 이러한 이합체 형성의 문제점을 극복할 수 있어 오류의 증폭 결과를 막을 수 있다.
(ⅶ) 본 발명의 방법은 뉴클레오타이드 변이에 대한 정량적 및 정성적 분석을 가능하게 하며, 특히 자동화에 유리하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 I: 프라이머 디자인 및 제조
실시예 I-1: 인간 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머
인간 MTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase) 유전자를 코딩하고 있는 뉴클레오타이드 서열(참조: Ensemble, Vega Havana Gene ID: OTTHUMG00000002277)을 기초로 하여, TSP(target specific primer) 역할을 할 수 있는 전방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머를 디자인하였다.
TSP1 5’- TGG GGT CAG AAG CAT ATC AGI III IAG CCC AGC -3’(서열목록 제7서열)
TSP2 5’- GCT TAT CAA GTG GTT CTG ATG III IIC ACC TTT GG -3’ (서열목록 제8서열)
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다. 상기 두 프라이머에 의해, 712 bp의 MTHFR 유전자 서열이 증폭된다.
실시예 I-2: 인간 MTHFR 유전자 677C 타입 증폭용 프라이머
인간 MTHFR 유전자 677C 타입(MTHFR 유전자의 677번째 서열이 C인 것으로서, 정상적인 기능을 하는 MTHFR 단백질을 코딩한다) 서열을 기초로 하여, 677C에 특이적으로 어닐링 되어 SNP 검출을 PCR 방법에 따라 성공적으로 할 수 있는 뉴클레오타이드 변이 특이적 프라이머(nucleotide variation specific primer: NVS)를 디자인 하였고, 5‘-말단에 바이오틴을 레이블링 한다.
NVS-P1 5’- CAC TTG AAG GAG AAG GTG TII III GGA GCC GA -3’ (서열목록 제9서열)
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다. 서열에서 밑줄 그은 C는 677C를 검출하는 부위이다.
본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 변이 특이적 프라이머는 기본적으로 일반식 I의 구조를 갖도록 하여, 매우 높은 특이성으로 타깃 서열과 혼성화 되도록 하였다. 이러한, 일반식 I의 구조를 갖는 프라이머에서 두 개의 특이성 구역은 분할 구역에 의해 물리적으로 그리고 기능적으로 분할되며, 프라이머 전체 구조의 혼성화 특이성은 변이 인접 특이성 구역과 변이 특이성 구역에 의해 이중적으로 조절된다. 또한, 뉴클레오타이드 변이에 해당되거나 또는 변이에 혼성화 되는 염기는 변이 특이성 구역의 중앙 부분에 위치하도록 하여, 미스매치에 따른 Tm 값 차이를 크게 하면서도 미스매치 시 Taq 중합효소에 의한 DNA 합성이 되지 않도록 하였다.
실시예 I-3: 인간 MTHFR 유전자 677T 타입 증폭용 프라이머
인간 MTHFR 유전자 677T 타입(MTHFR 유전자의 677번째 서열이 T인 것으로서, 낮은 활성을 갖는 MTHFR 단백질 변이체을 코딩한다) 서열을 기초로 하여, 677T에 특이적으로 어닐링 되어 SNP 검출을 PCR 방법에 따라 성공적으로 할 수 있는 뉴클레오타이드 변이 특이적 프라이머(전방향 프라이머)를 디자인 하였고, 5‘-말단에 바이오틴을 레이블링 한다.
NVS-P2 5’- AGA AAA GCT GCG TGA TGI III IAT CGA CTC -3’ (서열목록 제10서 열)
서열에서 I는 디옥시이노신을 나타낸다. 서열에서 밑줄 그은 A는 677T를 검출하는 부위이다.
실시예 Ⅱ: 인간 지놈 DNA의 준비
사람의 혈액을 사용하여 지놈 DNA를 AccuPrep TM Genomic DNA Extraction 키트(Bioneer, South Korea)로 추출하여, PCR 증폭의 주형으로 이용하였다.
실시예 Ⅲ: 인간 MTHFR 유전자의 멀티플렉스 PCR
실시예 Ⅱ에서 얻은 사람 DNA 시료를 이용하여 하기 표 1의 프라이머쌍들을 각각 사용하여 각각 멀티플렉스 PCR를 실시하였다.
타깃 프라이머 쌍 PCR 산물 크기(bp)
인간 MTHFR 유전자 TSP1/TSP2 712
677C 유전자형 TSP1/NVS-P1 470
677T 유전자형 NVS-P2/TSP2 297
15 mM MgCl2을 함유하는 2 ㎕의 10x PCR 반응 완충액(Roche), 1.25 μM 프라이머 쌍 4 ㎕, 2 ㎕의 dNTP(각각 2 mM dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 주형 DNA 20-30 ng 및 0.5 ㎕의 Taq 중합효소(5 units/㎕, Roche)를 포함하는 최종 20 ㎕의 반응혼합물을 사용하여 멀티플렉스 PCR을 실시하였다. 반응혼합물을 포함하는 튜브를 전가열(94℃)된 온도 사이클러(thermal cycler)에 넣고, 94℃ 15분에서 변성 반응시킨 후, 94℃ 30초, 65℃ 30초 및 72℃ 1분의 35 사이클 처리하고, 이어 72℃에서 10분 반응시켰다.
실시예 Ⅳ: 마이크로어레이 분석
우선, DNA 마이크로어레이를 제작한다. 에폭사이드가 코딩된 3 x 3 mm 크기의 유리 표면 상에 아미노-변형 올리고뉴클레오타이드 프로브를 고정화 시킨다. 상기 프로브로서 두 종의 올리고뉴클레오타이드를 디자인 한다. 프로브 2종 중 하나는, 변이 1 특이적 PCR 산물에 특이적으로 결합하는 것으로서, TSP1과 NVS-P1 프라이머쌍에 의해 증폭된 산물, 즉 인간 MTHFR 유전자 677C 타입의 증폭 산물에 특이적으로 결합하는 것이다. 다른 프로브는 변이 2 특이적 PCR 산물에 특이적으로 결합하는 것으로서, TSP2와 NVS-P2 프라이머쌍에 의해 증폭된 산물, 즉 인간 MTHFR 유전자 677T 타입의 증폭 산물에 특이적으로 결합하는 것이다.
DNA 마이크로어레이를 제작한 다음, 이 마이크로어레이를 ArrayTubesTM (Clondiag, Germany)에 삽입한다.
이어, 실시예 Ⅲ의 멀티플렉스 PCR 산물을 상기 ArrayTubes에 있는 프로브와 혼성화 시킨다. PCT 산물을 ArrayTubes에 넣고, 95℃에서 5분 동안 변성시킨 다음 50℃에서 1시간 동안 반응시키고, 이어 2 x SSC, 0.1% SDS에서 30℃에서 세척하여 혼성화 반응을 한다.
그런 다음, 스트렙타비딘-HRP(horseradish peroxidase)를 상기 ArrayTube에 넣고 30℃에서 15분 동안 반응시킨다. 그리고 나서, TMB(tetramethylbenzidine) 기질 용액 100 ㎕를 상기 ArrayTube에 넣은 다음, 실온에서 10분 동안 반응시켜 발색반응을 유도한 다음, ArrayTube를 ATR 03 리더(Clondiag, Germany)에 장착시켜 AT 어레이 이미지를 판독한다.
상기 AT 어레이 이미지에서, 변이 1 특이적 PCR 산물에 특이적으로 결합하는 프로브에서만 발색반응이 관찰되면, 시료는 MTHFR 유전자 677C 호모 유전자형이고, 변이 2 특이적 PCR 산물에 특이적으로 결합하는 프로브에서만 발색반응이 관찰되면, 시료는 MTHFR 유전자 677T 호모 유전자형이며, 변이 1 및 2 특이적 PCR 산물에 특이적으로 결합하는 프로브 2종에서 모두 발색반응이 관찰되면, MTHFR 유전자 677C 및 677T를 갖는 헤테로 유전자형이라는 것을 결정할 수 있다.
실험 결과를 종합하면, 본 발명의 방법에 따르는 경우에는, 생물학적 시료에 있는 DNA에 대한 분석(특히, 지놈타이핑)을 멀티플렉스 방식으로 오류 없이 용이하게 할 수 있다는 것을 알 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 종래의 부가적인 제한효소 처리나 염기서열분석 과정 없이 간단한 증폭 반응 및 혼성화 과정을 통하여, 2종 이상의 뉴클레오타이드 변이를 오류 없이 동시에 정확하게 검출할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Seegene, Inc. <120> Method for Detecting Nucleotide Variations Using Labelled Primers <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLT-F <400> 1 ctcgtggtgg acttctctca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLT-R <400> 2 gtgtaaaagg ggcagcaaag 20 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YVDD-R <220> <221> misc_feature <222> (18)..(22) <223> n denotes deoxyinosine <400> 3 cttggccccc aataccannn nntccacata 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YIDD-F <220> <221> misc_feature <222> (18)..(22) <223> n denotes deoxyinosine <400> 4 ccccactgtt tggctttnnn nnatattgat 30 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YSDD-F <220> <221> misc_feature <222> (18)..(22) <223> n denotes deoxyinosine <400> 5 ccccactgtt tggctttnnn nnatagtga 29 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L528M-R <220> <221> misc_feature <222> (19)..(23) <223> n denotes deoxyinosine <400> 6 aacaaatggc gctagtaann nnngccatga g 31 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP1 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 7 tggggtcaga agcatatcag nnnnnagccc agc 33 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP2 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 8 gcttatcaag tggttctgat gnnnnncacc tttgg 35 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NVS-P1 <220> <221> misc_feature <222> (20)..(24) <223> n denotes deoxyinosine <400> 9 cacttgaagg agaaggtgtn nnnnggagcc ga 32 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NVS-P2 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(22) <223> n denotes deoxyinosine <400> 10 agaaaagctg cgtgatgnnn nnatcgactc 30

Claims (19)

  1. 다음의 단계를 포함하는 뉴클레오타이드 변이가 나타나는 타깃 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 시료에서 타깃 뉴클레오타이드 서열의 최소 2 종류의 뉴클레오타이드 변이를 동시에 검출하는 방법:
    (a) 하기 (i) 내지 (iv)의 프라이머와 타깃 뉴클레오타이드 서열을 혼성화 조건 하에서 접촉시키는 단계:
    (i) 제 1 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 뉴클레오타이드를 갖는 타깃 뉴클레오타이드 서열의 변이-발생 부위에 특이적으로 혼성화되며, 상기 제 1 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하고, 5‘-말단에 검출가능한 표지가 결합되어 있는 제1 뉴클레오타이드 변이 특이적 프라이머(nucleotide variation specific primer 1: NVS-P1);
    (ⅱ) 상기 NVS-P1 프라이머가 혼성화되는 상기 변이-발생 부위의 업스트림에 위치하는 타깃 뉴클레오타이드 서열의 특정 부위에 혼성화되는 타깃 서열 특이적 프라이머 1(target specific primer 1: TSP1);
    (ⅲ) 상기 제 1 뉴클레오타이드 변이가 나타나는 동일 자리 또는 그의 인접 자리에서 제 2 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 뉴클레오타이드를 갖는 타깃 뉴클레오타이드 서열의 변이-발생 부위에 상보적인 서열에 특이적으로 혼성화되며, 상기 제 2 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 뉴클레오타이드를 포함하고, 5‘-말단에 검출가능한 표지가 결합되어 있는 제 2 뉴클레오타이드 변이 특이적 프라이 머(nucleotide variation specific primer 2: NVS-P2); 및
    (ⅳ) 상기 NVS-P2 프라이머가 혼성화되는 상기 변이-발생 부위의 다운스트림에 위치하는 타깃 뉴클레오타이드 서열의 특정 부위에 혼성화되는 타깃 서열 특이적 프라이머 2(target specific primer 2: TSP2);
    (b) 최소한 2 사이클의 프라이머 어닐링, 프라이머 신장 및 변성 단계를 실시하여 타깃 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계;
    (c) 단계 (b)에서 생성된 증폭 산물을 제 1 프로브 및 제2 프로브와 혼성화시키는 단계로서, 상기 제1 프로브는 상기 단계 (b)에서 증폭될 수 있는 산물 중에서 상기 (ⅰ) 및 (ⅱ)의 프라이머 세트에 의해 증폭되는 산물에 대해서만 특이적으로 혼성화 되는 것이고, 상기 제2 프로브는 상기 단계 (b)에서 증폭될 수 있는 산물 중에서 상기 (ⅲ) 및 (ⅳ)의 프라이머 세트에 의해 증폭되는 산물에 대해서만 특이적으로 혼성화 되는 것이고; 그리고,
    (d) 상기 단계 (c)의 혼성화 시그널을 검출하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 NVS-P1 및 NVS-P2 프라이머는 다음의 일반식 I로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:
    5'-X-Ap-Yq-Vr-3' (I)
    상기 일반식에서, X는 검출가능한 표지이고, Ap는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 변이 인접 특이성 구역(variation adjacent specificity portion)이고, Yq는 최소 3 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역(separation portion)이며, Vr은 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하며 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 변이 특이성 구역(variation specificity portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 변이 인접 특이성 구역의 Tm은 변이 특이성 구역의 Tm 보다 높으며, 상기 분할 구역은 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 구역은 혼성화 특이성 측면에서 변이 인접 특이성 구역이 변이 특이성 구역으로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성이 변이 인접 특이성 구역과 변이 특이성 구역에 의해 이중적으로 결정되도록 하고, 이는 결국 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 검출가능한 표지는 화학적 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광(chemiluminescent) 표지, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 또는 금속 표지인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 표지는 바이오틴인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 단계 (d)는 다음의 소단계(sub-steps)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (d-1) 상기 단계 (c)의 혼성화 결과물에 아비딘-HRP(horseradish peroxidase) 또는 스트렙타비딘-HRP를 접촉시키는 단계;
    (d-2) 상기 소단계 (d-1)의 결과물에 HRP의 기질을 반응시키는 단계; 및
    (d-3) 상기 소단계 (d-1)의 반응 발생 여부를 검출하는 단계.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 HRP의 기질은 TMB(tetramethylbenzidine)인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 2 항에 있어서, 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2‘-디옥시이노신, 2-아자-2’-디옥시이노신, 2‘-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2’-디 옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 1-(2‘-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 2 항에 있어서, 상기 변이 인접 특이성 구역은 15-40 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 2 항에 있어서, 상기 변이 특이성 구역은 3-15 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 2 항에 있어서, 상기 분할 구역은 3-10 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 2 항에 있어서, 상기 변이 인접 특이성 구역은 40-80℃의 Tm을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 2 항에 있어서, 상기 변이 특이성 구역은 10-40℃의 Tm을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 2 항에 있어서, 상기 분할 구역은 3-15℃의 Tm을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 2 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드는 변이 특이성 구역의 3'-말단에 위치해 있거나 또는 3'-말단으로부터 1 내지 10 염기 이격된 자리에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드는 변이 특이성 구역의 3'-말단으로부터 2 내지 7 염기 이격된 자리에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드는 변이 특이성 구역의 3'-말단으로부터 3 내지 6 염기 이격된 자리에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 15 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오타이드는 변이 특이성 구역의 중앙 부분에 위치하는 것을 특징으로 하는 방 법.
  19. 제 2 항에 있어서, 상기 NVS-P1 프라이머와 NVS-P2 프라이머의 변이 특이성 구역은 서로 부분적으로 중첩되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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