DK175630B1

DK175630B1 - Fremgangsmåde til forstærkning af et RNA-målsegment

Info

Publication number: DK175630B1
Application number: DK199101106A
Authority: DK
Inventors: Thomas Raymond Gingeras; John C Guatelli; Kristina Marie Whitfield
Original assignee: Akzo Nobel Nv
Priority date: 1988-12-16
Filing date: 1991-06-11
Publication date: 2004-12-27
Also published as: KR0148265B1; NO311302B1; FI99143B; PT92602B; CA2005589C; IL112750A0; HU216105B; FI912885A0; IL92732A; FI99143C; BR8907830A; NO912328D0; ATE156192T1; AU6301394A; ZA899593B; AU675520B2; PT92602A; HUT58793A; EP0778352A1; KR910700335A

Description

DK 175630 B1

Den foreliggende opfindelse angår generelt fremskridt inden for molekylær biologi samt rekombinant DNA-teknologi. Nærmere betegnet angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til forstærkning af et RNA-målsegment, som omfatter et 5'-sub-segment, der indbefatter og strækker sig over mindst 9 nukleotider i 3'-retningen fra 5 målsegmentets 5'-termina!e nukleotid, samt et 3'subsegment, som ikke overlapper 5'-subsegmentet, og som indbefatter og strækker sig over mindst 9 nukleotider i 5'-retningen fra målsegmentets 3'-terminale nukleotid.

Den foreliggende opfindelse tager sigte på at opnå forstærkning af en sådan særlig nu-10 kleinsyremålsekvens i et selv-vedligeholdende, enkelt-beholder in vitro-system, hvor forstærkningen af nukleinsyremålsekvensen gennemføres ved hjælp af fremstilling af multiple transkript-produkter, som har den eventuelle evne til selv-replikation. Dette selv-vedligeholdende forstærkningssystem undgår nødvendigheden af gentagen denaturering af nukleinsyre-duplexer, som kræver temperaturpendling. Den foreliggende op-15 findelse kombinerer på en ny måde alle de nødvendige reagenser til i et enkelt reaktionsmiljø at danne et forstærket produkt eller et produkt, som er egnet til påvisning i forstærket form, og som repræsenterer tilstedeværelsen af en nukleinsyremålsekvens.

Til de anvendelser, ved hvilke den foreliggende opfindelse kan benyttes, hører analyser 20 af RNA-sekvenser eller, ved hjælp af extrapolation, DNA-sekvenser, som er karakteristiske for en bestemt eller generel patogen sygdom eller tilstand, ved hjælp af in vitro eller ex vivo nukleinsyresondehybridiseringsanalyser af legemsvæsker og væv indeholdende den eller de nødvendige nukleinsyremålsekvenser.

25 Det er et mål på dette tekniske område at påvise forskellige nukleinsyresekvenser i en biologisk prøve, i hvilken en given sekvens, en såkaldt målnukleinsyre, er til stede i små mængder i forhold til sin eksistens blandt en lang række forskellige andre nuklein-syrearter indbefattende RNA, DNA eller begge dele. Det er således ønskeligt at påvise nukleinsyren, der koder for polypeptider, som kan være associeret med patologiske 30 sygdomme eller tilstande, såsom f.eks. nukleinsyre, der korrelerer med polypeptidet i det humane immunmangelvirus (HIV-1). Foruden påvisningen af nukleinsyre, der ko-

I DK 175630 B1 I

I 2 I

I der for sådanne polypeptider, er det ønskeligt at påvise andre nukleinsyrer, der er ka-

I rakteristiske for en patologisk sygdom, såsom et defekt gen, således som i tilfælde af I

I påvisningen af et defekt humant betagiobingen, som eksemplificeret i hæmophilia. I

I 5 De med sådanne associerede nukleinsyrer er karakteristisk nok, hvis de i det hele taget I

I foreligger, til stede i meget små mængder i forhold til den samlede nukleinsyre i en gi- I

I ven biologisk prøve, såsom blod eller anden legemsvæske eller vævsprøve fra en given I

I person, der skal testes. Påvisningen af sådanne nukleinsyrearter kræver en sådan speci- I

I ficitet, at nukleinsyren, hvis den er til stede, kan påvises og måles blandt den lange I

I 10 række af andre nukleinsyrearter, hvormed den er miljømæssigt associeret. Nogle af dis- I

I se nukleinsyrearter kan have tæt homologi, i det mindste i isolerede segmenter, med I

I målnukleinsyren. Som ovenfor anført findes endvidere disse målnukleinsyrearter meget I

I ofte kun i meget små mængder i den biologiske prøve, d.er testes. Til opnåelse af kor-

I rekt diagnose af den underliggende sygdomstilstand er det alligevel afgørende, at end- I

I 15 og små mængder af en sådan målnukleinsyre kan påvises utvetydigt, af hensyn til ana- I

I lysesystemets nøjagtighed. I

I Flere løsninger har været fremsat til gennemførelse af målsætningen på området. I en I

I ændres eller påvirkes mængden af nukleinsyre i prøven ikke. I stedet udvikles et rap- I

I 20 portørsystem, gennem et stort antal af påviselige molekyler svarende nukleinsyremålet I

I produceres med henblik på let påviselighed og måling. Et sådant rapportørsystem er et I

I signalgenererende system, som er associeret med målnukleinsyren, og som producerer I

I et påviseligt signal, som er repræsentativt for antallet af molekyler i målsekvensen. I

I 25 En anden løsning er blevet udviklet, der er fundamentalt forskellig derved, at den inde- I

I bærer forøgelse af selve målnukleinsyresekvensens kopital. Dette kan foretages ved se- I

I lektiv forstærkning af målnukleinsyresekvensen. Man kan raffinere dyrkningsteknikken I

I for prøven således, at målnukleinsyresekvensen på en eller anden måde fortrinsvis for- I

I stærkes i forhold til andre nukleinsyresekvenser. Disse metoder er besværlige og tids- I

I 30 røvende og genstand for trial og error. I

3 DK 175630 B1

Et andet eksempel på denne løsning består i forstærkning af en målnukleinsyresekvens ved en såkaldt "polymerasekædereaktion" (PCR). Denne metode blev omtalt af Saiki et al., Science 230, 1350 (1985) og Mullis et al., de europæiske patentansøgninger nr.

200.362 og 201.184 (se også US patentskrifteme nr. 4.683.195 og 4.683.202), og inde-5 bærer især (1) hybridisering til et segment af en primer's målnukleinsyresekvens, (2) forlængelse af nævnte primer med en polymerase og (3) at de fra pr i merforlængel sesreaktionen resulterende duplexer gøres enkeltstrengede. Denne procedure kan gentages over et antal cykler med henblik på forstærkning af den underliggende målnukleinsyresekvens.

10

En forbedret, ny løsning er detaljeret beskrevet i PCT-ansøgning nr. WO88/10315, supra. Den benytter et hidtil ukendt RNA-transkriptproduktionstrin i forbindelse med og afledt af en syntetiseret dobbeltstrenget cDNA-kopi af målsekvensen, der er operativt knyttet til en promotor derfor. I kraft af at transkriptionstrinnet er det dominerende 15 nyhedsaspekt, omtales det hensigtsmæssigt som et transkriptionsbaseret forstærkningssystem (TAS).

Opfindelsen indebærer således in vitro eller ex-vivo påvisning af mindst en specifik nukleinsyresekvens (målsekvens eller segment) i en prøve indeholdende nukleinsyre 20 omfattende en fremgangsmåde til fremstilling af en dobbeltstrenget nukleinsyre indeholdende en sekvens svarende til en målsekvens, der er operativt knyttet til en RNA-polymerasepromotor derfor, anvendelse af nævnte dobbeltstrengede nukleinsyre som en dobbeltstrenget nukleinsyreskabelon for fremstillingen af flere RNA-transkripter derfra, der hver bærer en RNA-sekvens svarende til nævnte målsekvens, og påvisning 25 af tilstedeværelsen af nævnte RNA-sekvens samt analogt tilstedeværelsen af målsekvensen.

Den dobbeltstrengede nukleinsyreskabelon fremstilles på sin side ved tilvejebringelse af en første nukleinsyreprimer eller -sonde indeholdende en promotorsekvens, der er 30 operativt knyttet til en sekvens svarende til et segment af en målsekvens, hybridisering under egnede betingelser af nævnte første nukleinsyreprimer med målsekvens i en prø-

I DK 175630 B1 I

I I

I ve indeholdende nukleinsyre, forlængelse af den hybridiserede nævnte første nuklein- I

I syreprimer i en polymeraseforlængelsesreaktion komplementært med målsekvensen til I

I dannelse af en tilsvarende duplex nukleinsyre, separation af strengene i nævnte duplex, I

I hybridisering til den separerede promotorholdige sekvensstreng under egnede betingel- I

I 5 ser af en anden nukleinsyreprimer ved enden modsat nævnte promotorsekvens og for- I

I længelse af den hybridiserede nævnte anden nukleinsyreprimer i en polymerase- for- I længelsesreaktion komplementært med nævnte promotorholdige sekvens.

I Opfindelsen resulterer således i en enkeltstrenget RNA-transkript eller et deraf dannet I

I 10 RNA-DNA-duplex, når foranstaltninger ikke træffes til hindring af dets dannelse, som I

I har en sekvens svarende til målnukleinsyren. Det enkeltstrengede RNA-transkriptpro- I

I dukt bliver mere eller mindre kontinuerligt slået af ("struck-ofP) og bevirker direkte fl I påvisning af målsegment uden nødvendigheden af besværlige, fejltilbøjelige gentagede I PCR-cykler og strengseparation. Sådanne fordele opnås ikke ved hjælp af PCR-teknik-

I 15 ken, der resulterer i dobbeltstrenget DNA (hvis ene streng omfatter målsegment, og I

I hvis anden streng omfatter komplement af målsegment), der nødvendigvis skal fraskil- I

I les før påvisning og først efter et stort antal gentagede cykler, der er nødvendige for at

I opnå acceptable forstærkningsniveauer. I

I 20 Den foreliggende opfindelse tager sigte på som en selektiv udførelsesform at drage

I yderligere fordel af den grundlæggende replikative proces til forstærkning, for at lette I

I påvisningen af målnukleinsyresekvenser, og således opnå eksponentiel kopiering uden I

I behovet for temperaturpendling og på anden måde måling af forløbet af forstærk- I

I ningsmetoden med hensyn til reagenstilsætninger etc. Det er et yderligere formål med H

I 25 den foreliggende opfindelse på en ny måde at kombinere fordelene ved transkriptionen I

I og forlængelsesproduktprocedureme som et middel til påvisning og måling af tilsva- I

I rende målnukleinsyre. H

I Det er et grundlæggende formål med den foreliggende opfindelse at benytte en selektiv H

I 30 enzymatisk digestion af RNA-strengen i et RNA/DNA-duplex, der er dannet ved hybri- I

I disering af en primer til en nukleinsyremålsekvens efterfulgt af primerforlængelse, som I

5 DK 175630 B1 et middel til opnåelse af DNA-strengen som en skabelon for yderligere hybridisering dertil efterfulgt af primerforlængelse. Det frembragte dobbeltstrengede DNA-duplex indeholder mindst en promotorsekvens, som kan genkendes af en DNA-afhængig RNA-polymerase og således tjener som skabelon for produktionen af flere transkripter, 5 der til sidst påvises og måles som et middel til påvisning og måling af målnukleinsyre-sekvens. Dette formål frembyder fordelene af målsekvensforstærkning, som er selv-vedligeholdende uden nødvendigheden af temperaturpendling i en enkelt reaktions-blanding indeholdende (tre) hensigtsmæssige enzymatiske aktiviteter og mindst en primer indeholdende en promotor, der operativt kan genkendes af en DNA-afhængig 10 RNA-polymerase.

Det er således et samlet formål med den foreliggende opfindelse at opfylde de på området opregnede mål og at tilvejebringe selektive midler til yderligere fordelagtig forstærkning af målnukleinsyresekvenser. Opfindelsen angår endvidere en direkte teknik, 15 som kan anvendes reproducerbart inden for et acceptabelt kort tidsrum i et isotermisk reaktionssystem, der hensigtsmæssigt anvender kendte reagenser og har den nødvendige nøjagtighed til opnåelse af konsekvente videnskabelige resultater; en teknik, der kan anvendes i et reproducerbart analysemiljø og kan tilpasses til anvendelse i kits til labo-ratorieanalyser/kliniske analyser.

20

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til forstærkning af et RNA-mål-segment, som omfatter et 5’-subsegment, der indbefatter og strækker sig over mindst 9 nukleotider i 3-retningen fra målsegmentets 5’-termina!e nukleotid, samt et 3'-subseg-ment, som ikke overlapper 5'-subsegmentet, og som indbefatter og strækker sig over 25 mindst 9 nukleotider i 5’-retningen fra målsegmentets 3’-terminale nukleotid, som er ejendommelig ved, at fremgangsmåden omfatter inkubation i en vandig opløsning, der indeholder målsegmentet, af: (a) en første primer, som er en enkeltstrenget DNA og ved sin 3'-ende omfatter (1) et 30 første segment af den samme længde som 3'-subsegmentet af målsegmentet i en sekvens, der er tilstrækkelig komplementær med sekvensen af 3'-subsegmentet af mål-

I DK 175630 B1 I

i 6 I

segmentet til i den vandige opløsning at prime en primerforlængelsesreaktion, ved I

I hvilken en nukleinsyre med målsegmentets sekvens er skabelonen, og (2) et andet seg- I

I ment, som har sekvensen af en første promotors "sense"-streng og er knyttet til den før- I

I ste primers første segment, så at nævnte første promotor i en dobbeltstrenget DNA, I

I 5 som omfatter et segment med den første primers sekvens, er operativ til transskription I

I af et segment, hvoraf ”sense”-strengens 5'-ende er et segment med den samme sekvens I

I som den første primers første segment; I

I (b) en anden primer, som er en enkeltstrenget DNA og ved sin 3'-ende omfatter et før- I

I 10 ste segment af samme længde som 5’-subsegmentet af målsegmentet i en sekvens, der I

I er tilstrækkelig tæt ved sekvensen af 5'-subsegmentet af målsegmentet til i den vandige I

I opløsning at prime en primerforlængelsesreaktion, ved hvilken en nukleinsyre med den I

I til målsegmentets sekvens komplementære sekvens er skabelonen; I

I 15 (c) enzymer, der tilvejebringer DNA-afhængig DNA-polymerase-aktivitet, omvendt I

I transskriptase-aktivitet, RNase H-aktivitet og, sammen med den første promotor, I

I DNA-afhængig RNA-polymeraseaktivitet; og I

I (d) nukleosidtriphosphater, der kræves som substrater for nævnte DNA-polyme- I

I 20 rase-aktivitet, omvendt transskriptase-aktivitet og RNA-polymerase-aktivitet, idet I

I nævnte inkubation finder sted i et temperaturinterval, ved hvilket nævnte enzymer i I

I nævnte opløsning er aktive til opnåelse af nævnte DNA-afhængig I

I DNA-polymeraseaktivitet, omvendt transskriptase-aktivitet, RNase H-aktivitet og I

I DNA-afhængig RNA-polymerase-aktivitet. I

I 25 I

I Den foreliggende opfindelse er baseret på anvendelsen af et middel til "strengsepare- I

I ring" af et RNA/DNA-duplex med henblik på frigørelse af dets DNA-streng til hybridi- I

I sering med oligonukleotider indeholdende RNA-polymerase-bindende sekvenser (PBS) I

I efterfulgt af primerforlængelse til dannelse af et DNA-duplex, der kan tjene som skabe- I

I 30 Ion for fremstillingen af flere tilsvarende RNA-transkripter, der kan gøres til genstand I

I for påvisning og måling som en udledt analyse for tilstedeværelsen af målnukleinsyre- I

7 DK 175630 B1 sekvens. RNA/DNA-duplexet bliver på sin side produceret ved hybridisering til et RNA-mål i en DNA-primer, der operativt indeholder en promotorsekvens, efterfulgt af primerforlængelse.

5 Midlet til frembringelse af "strengseparation" indebærer anvendelse af et enzym med RNase H-1ignende aktivitet, såsom RNase H, som selektivt og fortrinsvis vil opløse (digest) duplexets RNA-streng til frigørelse af DNA-strengen med henblik på yderligere behandling. Anvendelsen af et sådant enzym eliminerer anvendelsen af en temperaturcyklus til denaturering af duplexet.

10

Nukleinsyremålsekvensen kan være en, der som sådan er iboende til stede i en nuklein-syreprøve, eller den kan være et tilsvarende DNA-målsekvens-extrapolationsprodukt. Extrapolationsproduktet fremstilles ved denaturering af dobbeltstrenget DNA-målse-kvens, idet man til den hybridiserer en primersekvens med operativt associeret promo-15 torsekvens efterfulgt af en primerforlængelsesreaktion til dannelse af et DNA-duplex.

Dette DNA/DNA-duplex bliver på sin side denatureret og strengen indeholdende promotorsekvensen hybridiseret ved sin ende modsat promotoren med en anden primer efterfulgt af primerforlængelse til dannelse af et DNA-duplex, som ved at blive bragt i kontakt med en DNA-afhængig RNA-polymerase producerer det tilsvarende transkript, 20 extrapolationsprodukt. RNA'en tjener derpå som målnukleinsyresekvens til den foreliggende opfindelses formål.

Efter at nukleinsyremålsekvensen, uanset dens kilde, er blevet tilvejebragt i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse, hybridiseres den med en primersekvens, 25 der er operativt associeret med en promotorsekvens, efterfulgt af primerforlængelse til dannelse af et RNA/DNA-duplex indeholdende en promotorsekvens ved DNA-stren-gens 5'-ende. Primerforlængelsesreaktionen kan udføres med enhver egnet polymerase, såsom omvendt transkriptase. Det grundlæggende aspekt ved den foreliggende opfindelse tjener derpå til frigørelse af RNA/DNA-duplexets DNA-streng ved behandling af 30 RNA/DNA-duplexet med et enzym, der selektivt opløser RNA-strengen, såsom RNase H. Den således frigjorte DNA-streng enten 1) undergår selv-frembragt primerforlæn-

I DK 175630 B1 I

i 8 I

I gelse via en RNA-primer hidrørende fra den forrige selektive digestion eller 2) hybridi- I

I seres med en udvendigt afledt oligonukleotid-primer, der eventuelt operativt bærer en I

I promotorsekvens. Primerforlængelse frembringer et dobbelt- strenget DNA-duplex in- I

I deholdende en eller to promotorsekvenser, der tjener som en skabelon for DNA-afhæn- I

I 5 gig DNA polymeraseinduktion af transkription til opnåelse af flere transkripter. I

I Forudsat at den forudgående reaktionssekvens kan udføres isotermt og i samtidig bian- I

I ding med de tre hensigtsmæssige enzymaktiviteter, så at omvendt transkriptase, RNase I

I H og DNA-afhængig RNA-polymerase f.eks. er til stede, udføres de forskellige trin i I

I 10 den foregående proces på en kontinuert samtidig måde over et givet tidsrum. På det I

I ovenfor som et slutpunkt angivne punkt kan således de producerede transkripter påvi- I

I ses og måles for udledt tilstedeværelse af udgangsmålnukleinsyresekvens. Forudsat at I

I den ovenfor beskrevne reaktionssekvens's kontinuerte og samtidige natur er uafhængig I

I af temperaturpendling og kun kræver en enkelt indledningsvis tilsætning af enzymakti- I

I 15 viteter, der kræves til udførelse af disse reaktioner, undergår imidlertid transkriptpro- I

I dukteme selv hybridisering med en primer, der eventuelt operativt bærer en yderligere I

I promotorsekvens. Dette hybridiseringskompleks efterfølges af primerforlængelsesreak- I

I tion til fremstilling af et andet RNA/DNA-duplex, som på sin side underkastes indvirk-

I ningen af det selektive RNA-digestionsenzym til frigørelse af DNA-strengen derfra. I

I 20 Den bliver på sin side hybridiseret med en selvfrembragt RNA-primer eller en i reakti- I

I onsblandingen tilstedeværende udvendigt afledt oligonukleotidprimer, som eventuelt

I operativt kan bære en promotorsekvens med henblik på fremstilling af et andet I

I DNA-duplex, der kan gøres til genstand for genkendelse af en DNA-afhængig I

I RNA-polymerase til fremstilling af flere transkripter med en betydning ("sense") mod- I

I 25 sat de indledningsvis producerede transkripter. I

I Selv om mekanismen ved den eller de foregående reaktionssekvenser ikke er blevet I

I fuldt ud belyst, antages det, at fordi reaktionsblandingen i kombination benytter de tre I

I hensigtsmæssige enzymaktiviteter (således som opnået ved hjælp af omvendt transkrip- I

I 30 tase, RNase H og DNA-afhængig RNA-polymerase, f.eks.) og mindst en primer inde- I

I holdende en af polymerasen genkendt promotor, og fordi reaktionerne ikke afhænger af I

9 DK 175630 B1 en temperaturcyklus, antages det, at når to promotorholdige oligonukleotidprimere anvendes, kan reaktionerne gennemløbe flere cykler spontant og kontinuerligt, idet der produceres både "sense"- og anti-"sense"-transkripter, der på forskellig måde kan påvises og måles til opnåelse af en forstærkningsanalyse af mængden af målnukleinsyrese-5 kvens, der findes i den testede prøve.

Kernen i den foreliggende opfindelse angår en reaktionsblanding, som i det væsentlige får lov til at forblive hvilende i et tidsrum ved en egnet temperatur uden noget behov for pendling mellem højere og lavere temperaturer og uden behov for periodisk tilsæt-10 ning af enzym eller andre reagenser, hvorved en målnukleinsyresekvens forstærkes kontinuerligt og spontant på en selv-frembragt måde i nærværelse af mindst en primer, der operativt bærer en promotorsekvens samt enzymaktivitet, således som opnået ved hjælp af RNA-polymerase, der genkender promotorens polymerasebindingssted, en omvendt transkriptase, et enzym, såsom RNase H, der selektivt opløser RNA, når den-15 ne RNA hybridiseres til DNA i duplexform, og nødvendige nukleosidtriphosphat-substrater for RNA-polymerasen og den omvendte transkriptase. I et sådant system som heri defineret kan reproducerbare forstærkningsniveauer så høje som 107 opnås i løbet af ca. 2 timer ved ca. 37°C under anvendelse af f.eks. T7 RNA-polymerase, AMV omvendt transkriptase og E. coli RNase H. En temperatur mellem ca. 4°C og ca. 50°C, 20 fortrinsvis i intervallet omkring 40°C, er brugbart. Størrelsen af nukleinsyremålsekven-sen indeholder i foretrukne udførelsesformer færre end ca. 250 baser. Andre variabler kan påvirke optimeringen af forstærkningen heri, såsom den benyttede RNA- polymerase, den benyttede omvendte transkriptase, pH-værdier, saltkoncentrationer, nukleo-sidtriphosphatkoncentrationer. Disse variabler ligger inden for fagmandens almindelige 25 kunnen.

Den foreliggende opfindelse indebærer således in vitro eller ex-vivo påvisning af i det mindste en specifik nukleinsyremålsekvens i en prøve indeholdende en heterogen samling af RNA'er. Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde omfattende 30 fremstilling af en dobbeltstrenget DNA, der koder for en sekvens svarende til en målsekvens og har en operativ RNA-polymerase promotor, idet nævnte dobbeltstrengede

I DK 175630 B1 I

I 10 I

I DNA på sin side fremstilles ved hybridisering efterfulgt af primerforlængelse til en I

I DNA-streng, som er blevet befriet for sit RNA-komplement i et RNA/DNA-duplex ved I

I indvirkning af et RNA-selektivt digestionssystem, idet nævnte RNA/DNA-duplex er I

I blevet dannet ved hybridisering med en primer, der operativt bærer en promotorse- I

I 5 kvens, til en målnukleinsyresekvens efterfulgt af primerforlængelse. Den dobbeltstren- I

I gede DNA tjener som skabelon for fremstillingen af flere RNA-transkripter derfra, som I

I hvert bærer en RNA-sekvens svarende til nævnte målnukleinsyresekvens. Tilstedevæ- I

I reisen af nævnte RNA-sekvens og, ifølge deduktion, tilstedeværelsen af målsekvens, I

I kan påvises og måles. I

I 10 I

I I en udførelsesform angår den foreliggende opfindelse den eventuelt repetitive frem- I

I gangsmåde til fremstilling af nævnte ovenfor definerede dobbeltstrengede nukleinsyre- I

I skabelon, idet der tilvejebringes en første nukleinsyreprimer indeholdende en promo- I

I torsekvens, der operativt er knyttet til en sekvens svarende til et segment af en mål- I

I 15 nukleinsyresekvens, nævnte første nukleinsyreprimer hybridiseres under egnede betin- I

I gelser med målnukleinsyresekvens i en prøve indeholdende nukleinsyre, den hybridise- I

I rede nævnte første nukleinsyreprimer forlænges ved en polymeraseforlængelsesreak- I

I tion komplementært i forhold til målsekvensen til dannelse af en tilsvarende RNA/- I

I DNA-duplexnukleinsyre, nævnte RNA/DNA-duplex’s RNA fraspaltes enzymatisk, en I

I 20 anden nukleinsyreprimer hybridiseres til den frigjorte promotorholdige DNA-sekvens- I

I streng under egnede betingelser ved enden modsat nævnte promotorsekvens, enten via I

I 1) en produktafledt RNA-primér eller 2) en oligonukleotidprimer, som eventuelt inde- I

I holder en operativt dertil knyttet promotorsekvens, og den hybridiserede nævnte anden I

I nukleinsyreprimer forlænges ved en polymeraseforlængelsesreaktion komplementært i I

I 25 forhold til nævnte promotorholdige sekvens. I

I En yderligere udførelsesform angår fremgangsmåder og midler til anvendelse af nævn- I

I te dobbeltstrengede nukleinsyre, se ovenfor, som en skabelon for fremstillingen af flere I

I RNA-transkripter derudfra ved en reaktion, der katalyseres af en DNA-afhængig I

I 30 RNA-polymerase, som genkender promotoren deraf, samt påvisning og måling af til- I

DK 175630 B1 li stedeværelsen af nævnte RNA-transkripter efter yderligere eventuel pendling som ovenfor beskrevet.

En yderligere udførelsesform angår den forbedring i metoden til forstærkning af en 5 målnukleinsyresekvens, som er dannet som sådan eller som et extrapolationsprodukt fra en mål-DNA-sekvens, som omfatter trinnene til hybridisering med nævnte målsekvens af en DNA-primer, der har en promotorsekvens operativt knyttet dertil, efterfulgt af primerforlængelse til opnåelse af et tilsvarende RNA/DNA-duplex, hybridisering af den frigjorte DNA-forlængelsesproduktstreng, som bærer duplexets promotorsekvens, 10 med en anden primer ved enden modsat promotorsekvensen efterfulgt af primerforlængelse til dannelse af en dobbeltstrenget DNA-skabelon, der anvendes til fremstilling af eventuelt replikerbare RNA-transkripter derfra til påvisning som sådanne eller til recirkulering som ovenfor defineret. Forbedringen omfatter frigørelse af forlængelsespro-dukt-DNA-strengen, der bærer nævnte RNA/DNA-duplex-primers promotorsekvens, 15 ved hjælp af selektiv enzymatisk digestion af RNA/DNA-duplexets RNA-streng.

En udførelsesform angår produktet af fremgangsmåden til behandling af en RNA/-DNA-duplex RNA, som ved DNA-sekvensens 5-ende har tilknyttet en promotorsekvens, med et selektivt RNA-digestionsenzym.

20

En yderligere udførelsesform angår kits omfattende nødvendige reagenser og tilhørende midler, der kan anvendes til in vitro eller ex vivo påvisning af mindst en specifik nukleinsyremålsekvens i en prøve indeholdende RNA, idet de ovenfor definerede metoder og midler og anvendes.

25 1. Kort beskrivelse af teenineen

Fig. 1 viser en skematisk illustration af en udførelsesform for den foreliggende opfindelse. Den skematiske illustration redegør for i alt 12 trin, som i foretrukne aspekter 30 heraf tænkes at være kontinuerte, selv-genererede trin efter tilstedeværelse af de nødvendige tre enzymer i reaktionsblandingen sammen med målsekvens og en given drifts-

I DK 175630 Bl I

I 12 I

I temperatur. De tre enzymer er som anført f.eks. omvendt transkriptase (RT), der benyt- I

I tes til primerforlængelsesreaktion, RNase H, der er et selektivt RNA-digestionsenzym, I

I repræsenterende det grundlæggende træk ved den foreliggende opfindelse, og T7 I

I RNA-polymerase som et eksempel på et anvendeligt enzym til fremstilling af transkrip- I

I 5 ter ud fra DNA-duplexskabelonen. Kernen i opfindelsen, som ovenfor anført, er repræ- I

I senteret ved trin 3 i den skematiske illustration, og det vil forstås og skal tages i be- I

I tragtning, at RNA-transkriptproduktet fra trin 6 kan påvises og måles som sådant eller I

I kan underkastes kontinuert omsætning som anført i trinnene 7 til 12 til dannelse af en I

I RNA- transkript "anti-sense"-streng. De frembragte RNA-transkripter påvises og måles

I 10 som et resultat, der følger af tilstedeværelsen af målnukleinsyresekvensen. PBS beteg- I

I ner promotorsekvensens polymerasebindingssted. TCS betegner mål-komplementær I

I sekvens. I

I 2. Generelle metoder og definitioner I

I 15 I

I Der henvises til standardlærebøger vedrørende molekylær biologi, som indeholder defi- I

I nitioner og metoder og midler til udførelse af den foreliggende opfindelses grundlæg- I

I gende teknik, såsom: I

I 20 fremstilling af DNA-sonde eller primer indbefattende DNA-syntese eller isolation af I

I sekvenser fra naturlig kilde via restriktionsenzymspaltning samt skræddersyning med I

I henblik på at være egnet som sådan eller efter tilknytning til anden DNA til anvendelse I

I som en primer eller sonde heri; I

I 25 fremstilling af oligonukleotider med forskellige funktionelle sekvenser til anvendelse I

I ved hybridisering; I

I hybridiseringsmetodik indbefattende ændringer i stringens- betingelser til opnåelse af I

I større eller mindre hybridiseringsvished afhængigt af primerens grad af homologi med I

I 30 en mål-DNA-sekvens; I

13 DK 175630 B1 identifikation, isolation eller fremstilling af promotorer eller mere specifikt promotorer eller steder, der genkendes af bakteriofag DNA-afhængig RNA-polymerase og bakte-riofag RNA-afhængig RNA-polymerase eller, ved anvendelse af eukaryote systemer, viral DNA- og RNA-afhængig RNA-polymerase, f.eks. adenovirus-indkodet RNA-po-5 lymerase og brome-mosaikvirus-RNA-polymerase; identifikation, isolation eller fremstilling af RNA-polymerase, der er i stand til at genkende nævnte ovenfor omtalte promotorer eller i stand til primerforlængelsesreaktioner; 10 betingelser, der fører til produktion af RNA-transkripter, indbefattende såkaldte tran-skription-forøgersekvenser; betingelser, der fører til initiering og opretholdelse af primerforlængelsesreaktioner, 15 indbefattende anvendelse af DNA-afhængig polymerase og dNTP'er; mekanismen og metodikken til (fremkaldt) replikation; osv.

Se f.eks. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 20 Laboratory, New York (1982), og Colowick et al., Methods in Enzymology Vol. 152, Academic Press, Inc. (1987), og de forskellige deri anførte litteraturhenvisninger;

Hong, Bioscience Reports 1, 243 (1981); Cooke et al., J. Biol. Chem. 255, 6502 (1980); og Zoller et al., Methods in Enzymology 100, 468-500 (1983); Crea et al., nucleic acids Res. 8, 2331 (1980); Narang et al., Meth. Enzyme. 68, 90 (1979); Beau-25 cage et al., Tetrahedron Letters 22, 1859 81981); Brown et al., Meth. Enzym. 68, 109 (1979); Caruthers et al., Meth. Enzym. 154, 287 81985); Hitzeman et al., J. Biol.

Chem. 255, 2073 (1980); Lee et al., Science 239, 1288 (1988); Milligan et al., nucleic acids Res. 15, 8783 (1987); Miller et al., Virology 125, 236 (1983), Ahlquist et al., J.

Mol. Biol. 153, 23 (1981); Miller et al., Nature 313, 68 (1985); Ahlquist et al., J. Mol.

30 Biol. 172, 369 (1984); Ahlquist et al., Plant Mol. Biol. 3, 37 (1984; Ou et al., PNAS 79, 5235 (1982); Chu et al., Nucl. Acids Res. 14, 559,1 (1986); publiceret europæisk pa-

I DK 175630 B1 I

14 i

I tentansøgning nr. (EPA) 194809; Marsh et al., Positive Strand RNA Viruses, side I

I 327-336, Alan R. Liss (publ.; New York) 1987; proceedings of UCLA Symposium I

I (1986); Miller et al., J. Mol. Biol. 187, 537 (1986); Stoflet et al., Science 239, 491 I

I (1988); Kramer et al., J. Mol. Biol. 89, 719 (1974); Saris et al., Nucl. Acids Res. 10, I

I 5 4831 (1982); Bresser et al., PNAS 80, 6523 (1983); Chu et al., nucleic acids Research I

I 16, 3671 (1988); Gubier et al., Gene 25, 263 (1983) og D'Alessio et al., nucleic acids I

I Res. 16,1999 (1988), samt deri anførte litteraturhenvisninger. I

I Med udtrykket "promotor" menes en nukleinsyresekvens (naturligt forekommende eller I

I 10 syntetisk fremstillet eller et produkt af restriktionsdigestion), som specifikt genkendes

I af en RNA-polymerase, der binder til en genkendt sekvens og initierer transkriptions- I

I processen, hvorved en RNA-transkript produceres. Den kan eventuelt indeholde nu- I

I kleotidbaser, som strækker sig udover det aktuelle genkendelsessted, og som tænkes at I

I bibringe yderligere stabilitet mod nedbrydningsprocesser, og kan også indbefatte yder- I

I 15 ligere (+) nukleotider, der grænser op til transkriptions-initieringsstedet. I princippet I

I kan enhver promotorsekvens anvendes, for hvilken der findes en kendt og tilgængelig I

I polymerase, som er i stand til at genkende initieringssekvensen. Kendte og anvendelige I

I promotorer er typisk dem, der genkendes af en bestemt bakteriofag polymerase, såsom I

I bakteriofag T3, T7 eller SP6. Se Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980). Disse er kun ek- I

I 20 sempler på de polymeraser, der kan anvendes ved udøvelsen af den foreliggende opfin- I

I delse i forbindelse med deres tilhørende promotorsekvenser. I

I "RNA-transkripten" heraf er ribonukleinsyresekvensen, der produceres efter transkrip- I

I tionsinitiering, som følger efter RNA-polymerasegenkendelse af promotorsekvensen I

I 25 (se ovenfor). Fremstillingen af sådanne transkripter er mere eller mindre kontinuert, I

I delvis afhængig af mængden af tilstedeværende polymerase. I

I Med udtrykket "sonde" eller "primer” menes i den foreliggende sammenhæng en en- I

I keltstrenget nukleinsyresekvens (naturligt forekommende eller syntetisk fremstillet el- I

I 30 ler et produkt af restriktionsdigestion), som har tilstrækkelig komplementaritet med H

I målsekvensen, så at den under egnede hybridiseringsbetingelser er i stand til at hybridi- I

15 DK 175630 B1 sere, dvs. binde til den pågældende (mål) sekvens. En typisk sonde eller primer er mindst ca. 10 nukleotider lang og har mest foretrukket en længde på ca. 10 eller flere nukleotidbaser, og i sine mest foretrukne udførelsesformer deler den identitet eller meget høj komplementaritet med den pågældende (mål) sekvens. Se f.eks. EPA 128042 5 (publiceret 12. december 1984). En sådan sonde eller primer er sådan, at den vil hybri-disere til en komplement-sekvens til opnåelse af en primerforlængelsesreaktion i nærværelse af hensigtsmæssige reagenser og betingelser.

Udtrykket "operativt tilknyttet" eller "associeret" eller grammatiske varianter deraf, 10 især i forbindelse med bindingen af en promotorsekvens i en RNA-kodende DNA-se-kvens, refererer til dens funktionalitet ved fremstilling af tilsvarende RNA-transkripter, når promotoren genkendes af den egnede polymerase — se ovenfor.

Metoderne til dannelse af et påvisningssignal, såsom via radioaktiv mærkning eller 15 kromogene midler, der anvender et kromogent følsomt enzym, er også velkendte og dokumenterede på området.

En prøve, på hvilken analysemetoden ifølge opfindelsen udføres, kan være en rå prøve af biologisk materiale, såsom serum eller anden legemsvæske, vævskulturmedium eller 20 fødemateriale. Mere typisk udføres fremgangsmåden på en prøve, som er en behandlet prøve, der er opnået fra en rå prøve ved hjælp af forskellige behandlinger til fjernelse af materialer, som kunne genere påvisning af målet, såsom ved at forårsage uspecifik binding af affinitetsmolekyler. Fremgangsmåder til behandling af rå prøver til opnåelse af en prøve, der er mere egnet til analysemetodeme ifølge opfindelsen, er velkendte på 25 området.

Transkripteme (RNA) kan påvises på et antal forskellige måder: Påvisning kan ske ved hjælp af ultraviolet absorbans af RNA, såsom eksempelvis ved 30 hjælp af kontaktfototrykningsmetoden (Kutateladze et al., Anal. Biochem. 100, 129 (1979)).

I DK 175630 B1 I

I 16 I

I Ved anvendelse af et radioaktivt mærket ribonukleosid-5'-triphosphat i reaktionen I

I (f.eks. 3H-mærket eller a-32P04-mærket), så at RNA'en er radioaktiv, kan RNA påvises I

I ved hjælp af enhver af talrige kendte procedurer ved hjælp af sin radioaktivitet. I

I 5 Biotin eller imminobiotin kan inkorporeres i RNA, som derpå kan påvises ved hjælp af I

I kendte metoder med et enzym-avidin- eller enzym-streptavidin-additionsprodukt, som I

I binder til det RNA-bundne biotin og katalyserer produktion af et hensigtsmæssigt påvi- I

I seligt kromogen. Inkorporering af biotin eller iminobiotin kan gennemføres ved an ven- I

I delse UTP, som er biotinyleret via et afstandsstykke til carbon-5 i uracilmolekyldelen, I

I 10 som et substrat for replikasen i replikationsreaktionen. Sådanne UTP'er er kendte for- I

I bindeiser. Det er endvidere kendt, at sådanne UTP'er er substrater for QB-replikase, og I

I at RNA'er, som indbefatter uraciler, der er biotinylerede via afstandsgrupper knyttet til I

I carbon-5-positionen, som følge af anvendelse af sådanne UTP’er til deres syntese, er - I

I skabeloner for QB-replikasekatalyseret replikation. I

I 15 I

I RNA kan gøres fluorescerende ved anvendelse af en T4 RNA-ligasekatalyseret reakti- I

I on til vedføjelse af nukleotider, der er modificeret til at være fluorescerende, til I

I 3'-enden af replikativ RNA. Se Cosstick et al., Nucl. Acids Res. 12, 1791 (1984). Fluo- I

I rescensen af den resulterende RNA kan anvendes til påvisning af RNA ved hjælp af I

I 20 hvilke som helst af flere standardmetoder. I

I Til endnu andre metoder, der kan anvendes til påvisning af RNA, hører de, ved hvilke I

I et rapportørstof, som binder specifikt til nukleinsyre, sættes til systemet, i hvilket repli- I

I kationen har fundet sted, eller til mediet, såsom en positivt ladet bærer som ECTEO- I

I 25 LA-papir, på hvilket replikeret RNA er blevet isoleret, og signal fra rapportørstoffet I

I måles. Sådanne stoffer indbefatter: kromogene farvestoffer, såsom "farver alt" (Dahl- I

I berg et al., J. Mol. Biol. 41, 139 (1969); methylenblåt (Dingman et al., Biochemistry 7, I

I 659 (1968), og sølvfarve (Sammons et al., Electrophoresis 2, 135 (1981); Igloi, Anal. I

I Biochem. 134, 184 (1983); fluorogene forbindelser, der binder til RNA -- f.eks. ethi- I

I 30 diumbromid (Sharp et al., Biochemistry 12, 3055 (1973); Bailey et al., Anal. Biochem. I

I 70, 75 (1976); og fluorogene forbindelser, der binder specifikt til RNA'er, som er ska- I

17 DK 175630 B1 beloner for replikation ved hjælp af QB-replikase — f.eks. et phycobiliprotein (Oi et al., J. Cell Biol. 93, 981 (1982); Stryer et al., US patentskrift nr. 4.520.110), konjugeret til QB-replikases virale subenhed.

5 I analyser ifølge opfindelsen udføres analyser samtidigt under betingelser, der er så ens som muligt, på både testprøver og kontrolprøver. Som det forstås på det foreliggende område minder kontrolprøver om testprøver, men vides at indeholde enten intet mål eller en kendt mængde af mål. En kontrolprøve uden mål danner "baggrunden", under hvilken det ikke er muligt at skelne prøver, som indeholder mål, fra de prøver, der ikke 10 gør. Ved at sammenligne mængden eller koncentrationen af dannet RNA ved en analyse af en testprøve med den producerede mængde eller koncentration i samtidigt analyserede kontrolprøver, kan tilstedeværelsen af mål i testprøven ved et niveau over baggrundsniveauet bestemmes. Hvis kontrolprøver med et interval af kendte målkoncentrationer anvendes, kan koncentrationen af målet i en testprøve bestemmes.

15

Anvendelsen af en "replikase" for (autokatalytisk) induktion af replikation af de eventuelt replikerbare RNA-transkripter ifølge den foreliggende opfindelse er almindeligt kendt på området. Egnede eksempler på sådanne replikaser, der kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, indbefatter den såkaldte QB-virus-replikase, der genken-20 der visse nukleinsyresekvenssteder ved enderne af den givne RNA-transkript, og det såkaldte brome-mosaikvirus (BMV) samt a-virusreplikaseme, der antages at genkende nukleinsyresekvenssteder ved 3'-enden af en given RNA-transkript. Disse replikaser tjener til at replikere, dvs. reproducere, RNA-transkripteme og komplementerne med henblik på mangfoldiggørelse af kopier deraf. Når et sådant enzym er til stede i reakti-25 onsblandingen under transkriptionsprocessen, kan det forudses, at de mangfoldige transkripter, der produceres under transkription, selv kan undergå replikation til eksponentiel forøgelse af mængden af RN A-transkriptprodukt.

30

I DK 175630 B1 I

I 18 I

I 3. Detaljeret beskrivelse af udførelsesformer I

I Kvintessensen i den foreliggende opfindelse er evnen til at fuldføre mangfoldige for- I

I stærkningscykler in vitro uden behov for termisk pendling eller tilsætning af supple- I

I 5 rende enzymer. Den til beskrivelsen hørende figur skitserer skemaet i en foretrukket I

I udførelsesform i diagramform. Et første og overlegent aspekt ved den foreliggende op- I

I findelse består i medtagelsen af enzymet RNase H. Med yderligere henvisning til teg- I

I ningen er trin 1 og trin 2 identiske med de trin, der anvendes ifølge den såkaldte _

I TAS-forskrift, jf. patentansøgningerne og den internationale PCT-ansøgning, hvortil H

I 10 der henvises i begyndelsen af den foreliggende beskrivelse, men i trin 3, i stedet for et I

I termisk denatureringstrin, bliver RNA/DNA-hybridduplexet "streng-separeret" ved I

I hjælp af den selektive digestion af RNA-målet ved anvendelse af RNase H. RNase I

I H-aktiviteten har en specificitet for kun RNA, når den er til stede i et RNA/DNA-hy- I

I bridduplex. Produkterne fra denne digestion kan enten være unikke RNA-oligomerer I

I 15 eller mangfoldige RNA-oligomerer (trin 4), og disse oligomerer kan derpå fungere som H

I primere for DNA-syntese under anvendelse af omvendt transkriptase (RT) som kataly- I

I satoren af denne cDNA-reaktion (trin 5). Den dobbeltstrengede DNA, der er vist i trin I

I 5, kan fungere som en skabelon for T7 RNA-polymerasestyret transkription (trin 6). I

I Dette forstærkede RNA-produkt tjener nu som påvisningsrapportørmolekyler for mål- H

I 20 sekvens og/eller tjener som yderligere målmolekyler til fortsættelse af de i cyklus selv I

I forløbende reaktioner (trin 7 til trin 12). I

I De mest vellykkede reaktioner, der resulterer i en ca. 106 ganges målforstærkning, fun- I

I gerer med tre enzymer og to oligonukleotidprimere indeholdende T7 RNA-polymerase- I

I 25 bindingssekvensen (PBS). De nødvendige enzymer er AMV (omvendt transkriptase, I

I T7 RNA polymerase og E. coli RNase H. Tilsætning af E. coli RNase H til reaktionen I

I supplerer den i AMV omvendt transkriptase tilstedeværende RNase-aktivitet og viser I

I sig at være nødvendig til frembringelse af høje forstærkningsniveauer. Udvælgelse af I

I optimale oligonukleotidprimere centrerer sig om længdeområdeme af længden af den H

I 30 som mål udpegede sekvens, inkorporering af den polymerasebindende sekvens på den H

I ene eller begge primere og effektivitet af primerne, der indeholder den polymerasebin- I

19 DK 175630 B1 dende sekvens som en transkriptionsfremmer. Alle tre påvirker forstærkningsgraden. Inkorporering af to oligonukleotidprimere, der hver indeholder en PBS, resulterer i mere forstærkning end tilfældet var ved inkorporering af en enkelt PBS-holdig primer og en ikke-PBS-holdig primer.

5

Med henvisning til den tilhørende tegning: (1) mRNA-målmolekyle sammenføjes med et målspecifikt syntetisk oligodeoxyribo-nukleotid, der indeholder en T7 RNA-polymerasepromotorbindende sekvens, 10 (2) denne primer forlænges ved hjælp af DNA-polymeraseaktivitet af AMV omvendt transkriptase til syntetisering af den første cDNA-streng, (3) RNase H-aktiviteten af AMV omvendt transkriptase og E. coli RNase H nedbryder 15 RNA/DNA-hybridduplexets RNA, idet DNA'en gøres tilgængelig som skabelon for anden-streng cDNA-syntese, (4) selv-dannede oligoribonukleotider resulterende fra RNase H-digestion eller et syntetisk oligodeoxyribonukleotid, der fortrinsvis indeholder en T7 RNA-polymerase-pro- 20 motorbindende sekvens (ikke vist på tegningen), begynder syntese af anden-strenge af cDNA. AMV omvendt transkriptase forlænger derpå primeren til dannelse af dobbeltstrenget DNA, som indeholder en operativ T7 RNA-polymerase-promotorbindende sekvens, 25 (5) T7 RNA-polymerase binder til den dobbeltstrengede promotorbindende sekvens og transkriberer kopier af RNA komplementært til mål-nukleinsyre, 1 2 en anden oligodeoxyribonukleotid-primer med en PBS sammenføjes med RNA-transkripten, 30 2 AMV omvendt transkriptase katalyserer syntese af en cDNA-streng,

DK 175630 B1 I

20 I

(8) RNase H nedbryder RNA/DNA-hybridduplexets RNA og gør DNA'en tilgængelig I

som en skabelon for anden-streng-syntese, I

(9) en oligodeoxyribonukleotid-primer hybridiserer til anden-streng-cDNA'en, og I

5 AMV omvendt transkriptase syntetiserer DNA’en. Transkription finder sted, og cyklus- I

forløbet fortsætter. I

4. Eksempler I

10 1. Forstærkning af en første H1V-1 env region

En region af HIV-1 RNA blev forstærket ved en isotermisk enzymatisk reaktion, der I

frembragte 106 gange flere kopier af denne region ved reaktionens afslutning. I

15 a. Forstærkningsreaktion

Nukleinsyreudgangsmaterialet var cæsium-pelleteret RNA, der var blevet ekstraheret I

fra HIV-1-inficerede CEM-celler (human lymfoblastoid cellelinie; Folks et al., Proc. I

Natl. Sci. USA 82, 4531 (1985)) ved hjælp af den af Maniatis et al., se ovenfor, be- I

20 skrevne guanidiniumisothiocyanat-cæsiumchloridgradientprocedure. (HIV-1-specifikke I

sekvenser vurderedes til at være 1 -10% af det samlede antal tilstedeværende nukleinsy- I

rer). En tiendedel attomol målnukleinsyre blev anbragt i en reaktionsblanding (samlet I

volumen 100 μΐ) indeholdende (slutkoncentrationer): I

25 40 mM Tris.HCl, pH 8,1 I

12 mM MgCl2 I

25 mM NaCl I

2 mM Spermidin - (HC1)3 I

5 mM Dithiothreitol I

30 80 pg/ml BSA I

1 mM af hver dATPm, dCTP, dGTP, dTTP I

21 DK 175630 B1 1 mM af hver ATP, CTP, GTP, UTP 0,25 Mg af hvert priming oligonukleotid (88-211 og 88-347, se nedenfor) 5 Reaktionskomponenteme blev kombineret i et 1,5 ml eppendorprør og blev derpå rystet kortvarigt og let. Målnukleinsyren blev denatureret ved opvarmning af røret til 65°C i et minut i et vandbad. Efter afkøling til 37°C i 1 minut blev de følgende enzymer tilsat: 25 enheder AMV omvendt transkriptase (15-25 enheder/μΐ) 10 100 enheder T7 RN A polymerase (100 enheder/μΐ) 4 enheder E. coli RNase H (2 enheder/μΐ)

Reaktionen fortsatte i 3 timer ved 37°C uden yderligere manipulation.

15 b. Påvisning af forstærkningsprodukter

Efter ca. en time blev produkterne påvist ved anvendelse af et 32P-mærket oligonukleotid, der var komplementært med en 30 basepar region i det forstærkede fragment (88-298). En aliquot mængde af reaktionsblandingen repræsenterende en 1/40 del af 20 det samlede volumen blev denatureret i 95,0 μΐ 7,4% formaldehyd og lOx SSC (Mania-tis et al., se ovenfor) ved 55°C i et vandbad i 20 minutter. Den aliquot mængde blev øjeblikkelig isafkølet og derpå fyldt på en nitrocellulosemembran via et "slot-biot"ap-parat. Nukleinsyrer blev immobiliseret til nitrocellulosen ved hjælp af UV-stråling (254m).

25

Efter fiksering blev filtrene præhybridiseret ved 55°C i 15 minutter i 50-100 μΐ puf-fer/cm2 filter indeholdende 0,5% BSA, 0,5% polyvinylpyrrolidon, 5x SSPE (20x=3,6 M NaCl, 200 mM NaH2P04, 20 mM EDTA, pH 7-8) og 1% SDS. Hybridisering fandt sted ved 55°C i 2 timer i den samme puffer indeholdende 2-5 x 106 cpm/ml af den 30 phosphorylerede oligonukleotidsonde. Sonden blev sat til præhybridiseringspufferen.

^_.___

I DK 175630 B1 I

I 22 I

I Filtrene blev vasket tre gange ved stuetemperatur i 3 minutter, idet hvert benytter l ml I

I puffer/cm2 filter, lx SSPE, 1% SDS, og derpå i 1 minut i den samme puffer ved 55°C. I

I Filtrene blev autoradiograféret ved -70°C med én intensiverende sortering. I

I 5 I

I Forstærkningsgrader blev bedømt ved sammenligning af intensiteten af signal frem- I

I bragt af det forstærkede produkt og signalet frembragt af kendte mængder af HIV-1 I

I RNA eller pARV7 A/2 (Luciw et al., Nature 312, 760 (1984)), et plasmid indeholdende I

I en cDNA-kopi af HIV-1 -genomet indsat i EcoRJ-stedet af pUC 19. I

I 10 I

I I det ovenfor beskrevne eksempel var forstærkningsgraden lx 106. Northem-aftryk- og I

I Southem-aftryk-analyse af produktet under anvendelse af påvisningssonder 88-297 og I

I 88-298 viser, at det var en blanding af DNA og RNA med RNA som den over- vejende I

I art. Produktet var af diskret størrelse (-210 bp) inden for et snævert interval (20-40 bp). I

I 15 I

I 2. Forstærkning af en anden HIV-1 env-reeion I

I Forstærkning af en anden HIV-1 env-region blev gennemført ved at følge de i eksem- I

I pel 1 beskrevne procedurer, med undtagelse af at priming oligonukleotider 87-284 og I

I 20 88-347 (se nedenfor) blev benyttet til forstærkning, og at påvisningsoligonukleotider I

I 86-272 og 86-273 (se nedenfor) blev benyttet til påvisning. Der opnåedes en 103 ganges I

I forstærkning. I

I 3. Forstærkning af HIV-1 sor-region I

I 25 I

I Forstærkning af HIV-1 sor-regionen blev gennemført ved at følge den i eksempel 1 be- I

I skrevne procedure, med undtagelse af at priming oligonukleotider 88-77 og 87-292 (se I

I nedenfor) blev benyttet til forstærkning, og påvisningsoligonukleotider 86-31 og 86-32 I

I (se nedenfor) blev benyttet til påvisning. Der opnåedes en 103 ganges forstærkning. I

I 30 I

23 DK 175630 B1 4. Forstærkning af den første HIV-l env-region fra kliniske blodprøver fra AIDS-pa-tienter RNA'er fra tre HIV-l-inficerede kliniske prøver blev forstærket. RNA’er blev ekstrahe-5 ret ved hjælp af den organiske ekstraktionsforskrift (se nedenfor).

Forstærkning blev udført som i eksempel 1 under anvendelse af priming oligonukleoti-der 8S-211 og 88-347 (se nedenfor) og påvisningsoligonukleotider 88-297 og 88-298 (se nedenfor).

10

To af prøverne viste positive resultater. Den totale forstærkning var for reaktionerne ved disse forsøg 105 gange. På grund af at signalet påvist efter forstærkning er direkte proportionalt med mængden af tilstedeværende udgangsmateriale ved reaktionens begyndelse (se eksempel 5), er det muligt, at den tredje kritiske prøve ikke blev identifi-15 ceret som værende HIV-l-inficeret, fordi den indeholdt for lidt udgangsmål-HIV-1 -sekvens.

5. Forstærkning af den første HIV-l env-region i ikke-inficerede CEM-celler. der er blandet med varierende mængder af HIV-1-inficerede CEM-celler 20

Forstærkningen blev udført som i eksempel 4 under anvendelse af priming oligonu-kleotider 88-211 og 88-347 (se nedenfor) og påvisningsoligonukleotider 88-297 og 88-298 (se nedenfor). 1 2 3 4 5 6 Målforstærkning under anvendelse af alle ekstraherede nukleinsyrer (se eksempel 7) fra 2 103 til 1 HIV-l-inficerede CEM-celler i en population af 106 uinficerede CEM-celler 3 viste et signal, der er proportionalt med antallet af tilstedeværende inficerede celler i 4 prøven. Den negative kontrol, 106 uinficerede CEM-celler, udviste ringe baggrunds 5 værdi. Dette baggrundssignal var signifikant mindre end signalet opnået fra prøven 6 med 10 inficerede CEM-celler.

I DK 175630 B1 I

I 24 I

I 6. Reagenser og olieonukleotider I

I a. Reagenser: Nukleotidtriphosphater kommer fra Sigma, AMV I

I omvendt transkriptase er fra Life Sciences, T7 I

I 5 RNA-polymerase er fra Stratagene, E. coli-ribo- I

I nuklease H og BSA kommer fra Bethesda Research I

I Labs. I

I b. Oligo'er: Oligonukleotider blev syntetiseret ved hjælp af I

I 10 phosphoramiditkemi under anvendelse af et I

I Applied Biosystems 3S0A, hvorpå der rensédes I

I ved hjælp af HPLC. I

I De som primere og sonder benyttede oligonukleo- I

I 15 tider er specifikke for HIV-1 og svarer til se- I

I kvenseme omtalt af Ratner et al., Nature 313, I

I 277 (1985), for env- og sor-regioneme. I

I 86-211: (priming oligonukleotid; nt 6450-6479; env) I

I 20 I

I 5’AATTTAATACGACTCACTATAGGGATCTATTGTGCCCCGGCT I

I GTTTT GCG ATT CT A-3' I

I 88-297: (påvisningsoligonukleotid; nt 6560-6531; env) I

I 25 I

I 5’-TGGCCTAATTCCATGTGTACATTGTACTGT-3' I

I 88-298: (påvisningsoligonukleotid; nt 6531-6560; env) I

I 30 5'-ACAGTACAATGTACACATGGAATTAGGCCA-3' I

25 DK 175630 B1 88-347: (priming oligonukleotid; nt 6661-6632; env)

S’AATTTAATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATOr.TTTT

AGCATTGTCTGTGA-3' 5 88-77: (NT 5018-4988; sor) priming 5’-aatttaatacgactcactatagggacacctagggctaactat GTGTCCTA AT A AGG-3' 10 87-292: (nt 4766-4796; sor) priming

5’-TAATACGACTCACTATAGGGAAAGAATAAGTTC

AGAAGTACACATCCCACT-3' 15 86- 31: (nt 4901-4932; sor) påvisning 5'-GCACACAAGTAGACCCTGAACTAGCAGACCA-3' 20 86-32: (nt 4932-4901; sor) påvisning 5'-TGGTCTGCTAGTTCAGGGTCTACTTGTGTGC-3’ 87- 284: (nt 6551-6579; env) priming 25 5'-T AAT ACG ACTCACT AT AGGG A AATT AGGCCAGT AGT ATCA ACTCA ACT-3' 86-272: (nt 6591-6620; env) påvisning 5’-TCTAATTACTACCTCTTCTTCTGCTAGACT-3' 30

DK 175630 B1 I

26

86-273: (nt 6620-6591; env) påvisning I

5'-AGTCTAGCAG AAG AAGAGGT AGT AATTAGA-3' I

5 Hvert priming oligonukleotid indeholder en sekvens ved 5'-enden, som er den T7 I

RNA-polymerasebindende sekvens (understreget) og det foretrukne transkriptionale H

initieringssted (tydeligt). Resten af sekvensen er komplementær i forhold til målse- H

kvensen.

10 1 forhold til HIV-1-målsekvensen er oligonukleotideme 88-211, 88-298, 87-292, 86-31, I

87-284 og 86-273 komplementære i forhold til den negative streng, og oligonukleoti- I

deme 88-347, 88-297, 88-77, 86-32 og 86-272 er komplementære i forhold til den post- I

tive streng. I

15 7. Organisk ekstraktion af RNA'er I

Forskrift for nukleinsyreffemstilling på inficerede celleprøver: I

Pellet-celler: 5000 omdrejninger per minut i 10 minutter I

20 fra 1 ml Tris-puffet saltvand. Fjern og bortkast super- I

natant, idet 50 μΐ efterlades sammen med pellet. I

Resuspender pellet i 600 μΐ lyseringspuffer.

25 Ryst kraftigt og inkuber ved 50°C i 45 minutter, idet der I

rystes i 10 til 15 sekunder for hver 10 minutter. I

Tilsæt 600 μΐ phenol:chloroform:isoamylalkohol (50:48:2). I

Ryst og hvirvl rundt til emulgering af blanding. Centri- I

30 fuger ved 14.000 omdrejninger per minut i 2 minutter til I

separation af faser. I

27 DK 175630 B1

Fjern 575 μΐ fra vandig (øverste) fase. Tilsæt 600 μΐ phenol:chlOroform:isoamylalkohol (50:48:2). Rystog hvirvl rundt til emulgering af blanding. Centrifuger ved 14.000 omdrejninger per minut i 2 minutter til separation 5 af faser.

Fjern 525 μΐ fra vandig fase. Tilsæt 600 μΐ chloroform: isoamylalkohol (24:1). Ryst og hvirvl rundt til emulgering af blanding. Centrifuger ved 14.000 omdrejninger per 10 minut i 2 minutter til separation.

Fjern 400 μΐ fra vandig fase. (Overfør ikke noget nedbrudt cellemateriale, som kan foreligge ved grænsefladen).

15

Tilsæt 1/10 volumen (40 μΐ) 8 M LiCl. På dette trin kan prøver blive delt til videre behandling.

Tilsæt 3 volumener iskold 100% ethanol til prøver, der er 20 blevet delt. Tilsæt 2,5 volumener iskold 100% ethanol til prøver, der ikke er blevet delt. Bland godt. Udfæld ved -20°C eller i et tøris/ethanol-bad i 15 minutter.

Reagenser 25

Lvseringspuffer 1

mM Tris, pH 7,5 150 mM NaCl 30 lOmMEDTA

0,2% SDS

I DK 175630 B1 I

I 28 I

I 200 pg/ml proteinase K I

I Tris-pufret saltvand I

I 5 !37mMNaCl I

I 5,1 mM KC1 I

I 24,8 mM Tris-base I

I Indstil pH til 7,4 med 1 N HC1. I

I Steriliser ved autoklavering.

Claims

1. Fremgangsmåde til forstærkning af et RNA-målsegment, som omfatter et 5'-sub-5 segment, der indbefatter og strækker sig over mindst 9 nukleotider i 3’-retningen fra målsegmentets 5'-terminale nukleotid, samt et 3'-subsegment, som ikke overlapper 5'-subsegmentet, og som indbefatter og strækker sig over mindst 9 nukleotider i 5'-ret-ningen fra målsegmentets 3'-terminale nukleotid, kendetegnet ved, at fremgangsmåden omfatter inkubation i en vandig opløsning, der indeholder målsegmentet, af: 10 (a) en første primer, som er en enkeltstrenget DNA og ved sin 3'-ende omfatter (1) et første segment af den samme længde som 3'-subsegmentet af målsegmentet i en sekvens, der er tilstrækkelig komplementær med sekvensen af 3'-subsegmentet af målsegmentet til i den vandige opløsning at prime en primerforlængelsesreaktion, ved 15 hvilken en nukleinsyre med målsegmentets sekvens er skabelonen, og (2) et andet segment, som har sekvensen af en første promotors "sense"-streng og er knyttet til den første primers første segment, så at nævnte første promotor i en dobbeltstrenget DNA, som omfatter et segment med den første primers sekvens, er operativ til transskription af et segment, hvoraf "sense"-strengens 5'-ende er et segment med den samme sekvens 20 som den første primers første segment; (b) en anden primer, som er en enkeltstrenget DNA og ved sin 3'-ende omfatter et første segment af samme længde som 5'-subsegmentet af målsegmentet i en,sekvens, der er tilstrækkelig tæt ved sekvensen af 5'-subsegmentet af målsegmentet til i den vandige 25 opløsning at prime en primerforlængelsesreaktion, ved hvilken en nukleinsyre med den til målsegmentets sekvens komplementære sekvens er skabelonen; (c) enzymer, der tilvejebringer DNA-afhængig DNA-polymeraseaktivitet, omvendt transskriptase-aktivitet, RNase H-aktivitet og, sammen med den første promotor,

30 DNA-afhængig RNA-polymeraseaktivitet; og I DK 175630 B1 I I 30 I I (d) nukleosidtriphosphater, der kræves som substrater for nævnte DNA-polyme- I I raseaktivitet, omvendt transskriptase-aktivitet og RNA-polymerase-aktivitet, idet I I nævnte inkubation finder sted i et temperaturinterval, ved hvilket nævnte enzymer i I I nævnte opløsning er aktive til opnåelse af nævnte DNA-afhængig DNA-polymeraseak- I I 5 tivitet, omvendt transskriptase-aktivitet, RNase H-aktivitet og DNA-afhængig RNA- I I polymerase-aktivitet. I

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at målsegmentet er færre end ca. I I 400 nukleotider i længde, at både 5'-subsegmentet og 3'-subsegmentet af målsegmentet I I 10 har 20-50 nukleotider, og at inkubationen finder sted mellem 4°C og 50°C. I

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at sekvensen af den første primers I I første segment er nøjagtigt komplementær med sekvensen af målsegmentets 3'-sub~ I I segment, og at sekvensen af den anden primers første segment er den samme som se- I 15 kvensen af målsegmentets 5'-subsegment. I

4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-3, kendetegnet ved, at et af enzymerne I er E. coli RNase Η. I I 20 5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-3, kendetegnet ved, at den anden pri- I I mer omfatter et andet segment, som har sekvensen af en anden promotors "sen- I I se"-streng og er knyttet til den anden primers første segment, så at nævnte anden pro- I I motor i en dobbeltstrenget DNA, som omfatter et segment med den samme sekvens I I som nævnte anden primer, er operativ til transskription af et segment, hvoraf 5'-enden I I 25 af "sense"-strengen er et segment med den samme sekvens som den anden primers før- I I ste segment, og at den vandige opløsning omfatter et enzym, der tilvejebringer I I DNA-afhængig RNA-polymeraseaktivitet sammen med den anden promotor. I

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at et af enzymerne er E. coli RNa- I I 30 se Η. I DK 175630 B1

7. Fremgangsmåde ifølge krav 5 eller 6, kendetegnet ved, at det samme enzym tilvejebringer DNA-afhængig RNA-polymeraseaktivitet sammen med både den første og den ariden promotor.

8. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-7, kendetegnet ved, at både den t DNA-afhængige DNA-polymeraseaktivitet og omvendt transskriptaseaktiviteten opnås ved hjælp af en omvendt transskriptase fra et retrovirus valgt blandt AMV og MMLV, og at den DNA-afhængige RNA-polymeraseaktivitet til transskription fra den første promotor opnås ved hjælp af RNA- polymerasen fra en bakteriofag valgt blandt T7, T3 10 ogSP6.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at nævnte RNA-målsegment eller RNA-segmentet med den med RNA-målsegmentets sekvens komplementære sekvens . påvises ved en nukleinsyresondehybridiseringsanalyse efter inkubationen til forstærk-15 ning af RNA-mål segmentet.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at inkubationen sker mellem 33°C og 41°C. 20 t