ES2933132T3 - Procedimiento para detectar una respuesta celular inmune - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con un método para detectar una respuesta celular inmune en una muestra biológica de origen animal, que puede contener al menos una célula que secreta al menos una molécula efectora inmune, que comprende los pasos que consisten en: (a) aspirar una cantidad definida de la muestra biológica tomada por medio de un dispositivo automático de succión/descarga, (b) descargar esta cantidad definida, usando dicho dispositivo automático de succión/descarga, en un contenedor R, conteniendo dicho contenedor R, previamente, al menos un estimulante para la secreción de dicha molécula por dicha al menos una célula, o bien dicho recipiente R que no contiene dicho al menos un estimulante, (c) cuando el recipiente no contenga, previamente, al menos un estimulante de secreción, introducir en dicho recipiente R dicho al menos un estimulante de secreción contenido en un contenedor E,utilizando dicho dispositivo de succión/descarga automatizado, y (d) dejar incubar la cantidad definida de muestra y dicho al menos un estimulante, formando una mezcla, para la secreción de dicha molécula por dicha al menos una célula (i) en dicho recipiente R o (ii) en otro recipiente S después de la succión y descarga de dicha mezcla utilizando dicho dispositivo automático de succión/descarga, y (e) detectar la respuesta inmune celular, en el que la detección de la respuesta inmune celular indica la presencia de una respuesta inmune celular específico para dicho al menos un estimulante de la secreción.para la secreción de dicha molécula por dicha al menos una célula (i) en dicho contenedor R o (ii) en otro contenedor S después de la succión y descarga de dicha mezcla usando dicho dispositivo automático de succión/descarga, y (e) detectar el sistema inmunológico celular respuesta, en el que la detección de la respuesta inmune celular indica la presencia de una respuesta inmune celular específica para dicho al menos un estimulante de la secreción.para la secreción de dicha molécula por dicha al menos una célula (i) en dicho contenedor R o (ii) en otro contenedor S después de la succión y descarga de dicha mezcla usando dicho dispositivo automático de succión/descarga, y (e) detectar el sistema inmunológico celular respuesta, en el que la detección de la respuesta inmune celular indica la presencia de una respuesta inmune celular específica para dicho al menos un estimulante de la secreción. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para detectar una respuesta celular inmune

La presente invención se refiere al campo de la detección de respuestas celulares inmunes. En particular, la invención se refiere a un nuevo procedimiento para detectar una respuesta celular inmune en una muestra biológica, siendo dicha respuesta útil tanto en el campo del diagnóstico como en el campo de la terapia, en particular para estudios de toxicidad de futuros medicamentos y vacunas.

El campo de la detección de respuestas celulares inmunes es un campo en auge desde los últimos años. Así, con el desarrollo del ensayo ELIspot (Enzyme-linked immunospot) en los años 1980, originalmente utilizado para medir la secreción de inmunoglobulinas por parte de las células B de un organismo humano, después extendido a todas las células sanguíneas circulantes capaces de segregar una molécula después de su estimulación in vitro, incluso presentes en pequeñas cantidades, se ha abierto un amplio campo de aplicación médica, en particular para comprender mejor y monitorear la respuesta inmune, por ejemplo en el ámbito de enfermedades infecciosas o enfermedades autoinmunes, y en el campo del cáncer (Cox J.H. et al., 2006).

La respuesta inmune, provocada después de la entrada de un antígeno en un organismo, es de dos tipos: es una respuesta inmune humoral o bien una respuesta inmune con mediación celular. La respuesta inmune humoral, que incluye la inmunidad adaptativa a la producción de anticuerpos, consta de cuatro grandes etapas: reconocimiento del antígeno y selección clonal, proliferación clonal, diferenciación de linfocitos B en plasmocitos que segregarán inmunoglobulinas (también denominadas anticuerpos), formando así complejos inmunes para neutralizar el antígeno. Esta respuesta permite actuar contra los microorganismos extracelulares. La respuesta inmune con mediación celular, también llamada respuesta celular inmune o respuesta CMI (CMI por Cell-Mediated Immunity), es la inmunidad adaptativa en la que los linfocitos T (también llamados células T) tienen un papel central activando toda una cascada de señales y respuestas que hacen frente a una infección o una agresión, como por ejemplo la producción de citocinas. Las células efectoras de la inmunidad con mediación celular, tales como los linfocitos T citotóxicos, permiten actuar contra los microorganismos. Estos dos tipos de respuestas inmunitarias “humorales” o “con mediación celular” usan células que segregan moléculas, llamadas moléculas efectoras inmunes, a saber, anticuerpos o citocinas, incluidas las quimiocinas.

Los antígenos que provocan esta respuesta inmune pueden ser de origen infeccioso, exógeno, por ejemplo debido a patógenos tales como virus, bacterias, hongos o parásitos, o debido a alérgenos, o bien de origen endógeno, por ejemplo en el contexto de enfermedades autoinmunes tales como esclerosis múltiples, diabetes tipo 1, lupus, tiroiditis autoinmunes, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, síndrome de Goujerot-Sjogren, enfermedad de Crohn, enfermedades cancerosas, etc.

La multiplicación de un agente patógeno dentro del organismo, o la liberación con patrones conservados relacionados con patógenos ([PAMPs]), así como la liberación de señales de peligro durante un traumatismo, una quemadura o una intervención quirúrgica, por ejemplo, son responsables de una reacción inmunitaria e inflamatoria. Esta reacción tiene un lado humoral y un lado celular. Además, asocia en el conjunto de estas situaciones una respuesta proinflamatoria (que hoy en día se considera responsable de la aparición de fallos orgánicos y mortalidad precoz), así como una respuesta compensatoria antiinflamatoria que, cuando persiste, es responsable de una fase de inmunosupresión, tal como se encuentra en los pacientes inmunodeprimidos, y que pone a los pacientes en riesgo de infecciones secundarias.

A parte de estas patologías agudas, otras alteraciones en el equilibrio inmunitario son responsables de patologías. Así, las enfermedades inflamatorias crónicas subrayan un desequilibrio de la respuesta a favor de una activación excesiva del sistema inmunitario, con una destrucción crónica de los tejidos afectados, y la aparición de una pérdida de función del órgano afectado. A la opuesta, las situaciones de inmunosupresión innatas (inmunodeficiencias) o adquiridas (infección por el virus del SIDA, quimioterapia, inmunosupresión inducida durante un trasplante de órgano, por ejemplo) subrayan una respuesta insuficiente del sistema inmunitario con un mayor riesgo de infección y de formación de tumor.

La detección de moléculas efectoras producidas por células inmunitarias ex vivo permite mejorar el tratamiento de los pacientes, ya sea para ayudar al diagnóstico de estas patologías o para guiar/personalizar el tratamiento terapéutico.

Los ensayos para detectar la respuesta inmune con mediación celular (CMI) se pueden utilizar en diversas disciplinas de la inmunología. Por ejemplo, las evaluaciones de CMI permiten detectar las células T circulantes reactivas al donante durante un trasplante de órgano; medir la actividad de los linfocitos T citotóxicos para la investigación contra el cáncer; medir las respuestas de memoria para enfermedades infecciosas o el desarrollo de vacunas; y detectar células autorreactivas (que se presentan típicamente con baja frecuencia) en enfermedades autoinmunes. El ensayo ElIspot también se puede usar en la fase preclínica para determinar si un producto ensayado podría provocar una respuesta inmune no deseada, antes de usarlo en seres humanos.

El procedimiento para detectar la respuesta celular inmune comprende dos fases:

1) Fase 1 - Secreción: Incubación de las células de interés procedentes de una muestra biológica que las contiene y susceptible de segregar la molécula a detectar, en condiciones que permiten la secreción de la molécula. Se puede hablar entonces para esta etapa de “cultivo celular” o “estimulación”. Las células se cultivan en un medio líquido, pudiendo ser este medio líquido un fluido biológico (el de la muestra), puro o diluido en un tampón, o un medio de cultivo, o una mezcla de los dos. Esta secreción se obtiene en presencia de un estimulante, pudiendo ser este estimulante específico, como en el caso de respuestas inmunitarias dirigidas contra un agente infeccioso, o pudiendo ser no específico, como por ejemplo en el caso de respuestas inmunitarias celulares que se deben a una deficiencia inmunitaria.

2) Fase 2 - Detección de la respuesta celular inmune: se puede llevar a cabo por detección o cuantificación de la molécula segregada al final de la fase 1 (se habla entonces más bien de un analito) llevando a cabo una evaluación de la molécula segregada, mediante cualquier tipo de técnica adecuada para la detección de moléculas segregadas, tal como por inmunoensayo, por ejemplo del tipo ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), RIA, quimioluminiscencia o ELFA (Enzyme-Linked Fluorescent Assay), por bioensayo, o por técnica bioquímica, por evaluación de proliferación, por ensayo de biología molecular o por citometría de flujo.

Un ejemplo de patología infecciosa en la que el diagnóstico tiene en cuenta la detección de la respuesta celular inmune debida a células del organismo infectado es la tuberculosis. Durante varias décadas, el único ensayo disponible era el ensayo de cuti. Este permite saber si el individuo ensayado ha estado en contacto con el bacilo Mycobacterium tuberculosis. Para ello, el médico lleva a cabo una reacción intradérmica para poner en contacto las células inmunitarias del individuo con una preparación de tuberculina. Esta última provoca una respuesta inflamatoria (reacción cutánea) en pacientes que han estado en contacto con el bacilo Mycobacterium tuberculosis (presencia de enrojecimiento a nivel de la inyección). Sin embargo, la realización de la técnica es compleja y la lectura del resultado es subjetiva y requiere una valoración del cuidador. Además, este ensayo no permite cuantificar las citocinas segregadas.

Existen dos ensayos sanguíneos comerciales que muestran si los pacientes han estado en contacto con el bacilo Mycobacterium tuberculosis midiendo in vitro la liberación de interferón gamma (IFN-y ) por las células en respuesta a estimulantes que son antígenos altamente específicos de Mycobacterium tuberculosis. Estos antígenos de estimulación son en particular al menos ESAT6 y CFP10, y están ausentes de la vacuna BCG (Bacille Calmette-Guérin) y de la mayoría de las microbacterias no tuberculosas (Lalvani, A., 2007). Estos ensayos se denominan ensayos IGRA (por Interferon Gamma Release Assay).

^{El primer ensayo es el ensayo T-SPOT}® ^{.TB de Oxford Immunotec [Oxford, Reino Unido], evaluación ELISpot en sangre} que mide la liberación de citocinas de células aisladas. Para este ensayo, la muestra de sangre se extrae primero en ^{un laboratorio en un tubo estéril heparinizado, por ejemplo, un tubo Vacutainer}® ^{(Becton-Dickinson) o un tubo Greiner,} Terumo, Sarstedt, etc. Después, las células PBMC (células mononucleares de sangre periférica) se separan de la sangre total mediante varias etapas de centrifugación en un gradiente de densidad de Ficoll, se lavan y se cuentan. Para cada muestra de sangre, las PBMC resultantes se cultivan en una placa de microtitulación (también denominada microplaca) en 3 condiciones diferentes: (i) en presencia de antígenos de estimulación específicos (por ejemplo, ESAT-6, CFP-10), (ii) en presencia de uno o más mitógenos no específicos (control positivo), y (iii) en presencia del medio de estimulación únicamente (control negativo). Las microplacas así preparadas se incuban en condiciones que ^{permiten la secreción de IFN-y , por ejemplo a 37°C, 5% de CO}2 ^{en una incubadora de cultivo celular durante 16 a 20} horas. Esta etapa de introducir células secretoras y de cultivo celular se lleva a cabo bajo un huésped de flujo laminar para mantener condición estéril durante el cultivo celular. La última etapa consiste en detectar la citocina así segregada ^{usando un anticuerpo de captura anti-IFN-}Y ^{previamente aplicado al fondo de la placa de microtitulación, de una pareja} de detección que se une a la citocina y de un sustrato, formando así puntos que se pueden contar en la membrana, cada punto corresponde a una célula secretora. El principio de tal evaluación ELIspot se describe, por ejemplo, en el documento Handbook of Elispot, 2005, y en particular en la página 17. Este ensayo tiene como inconveniente de que es manual, que requiere la purificación (separación) previa de PBMC a partir de la sangre total usando una o más etapas de centrifugación, así como el uso de un equipo especial (campana de flujo laminar) a fin de garantizar la esterilidad para transferir la muestra de sangre en la placa y durante el cultivo celular. Además, este ensayo es un ensayo complejo de alta tecnicidad que necesita personal técnico bien formado.

^{El segundo ensayo es el ensayo QuantiFERON}® ^{-TB Gold [Qiagen] que mide la concentración total de IFN-y liberado} por todas las células en el sobrenadante de una muestra de sangre por ELISA. En este ensayo, la muestra de sangre debe extraerse del paciente directamente en tres tubos de extracción de sangre estériles específicos, uno que contiene los antígenos de estimulación (ESAT-6, CFP-10 y TB7.7), el otro que contiene un mitógeno (control positivo) y siendo el último tubo el llamado NIL (control negativo). Después, los tubos, aún estériles, se incuban a 37°C durante 16 a 24 horas para permitir la secreción de interferón gamma, de manera que la etapa de estimulación se desarrolle en condición estéril. Los tubos se centrifugan entonces, el plasma se extrae y se coloca con la ayuda de una pipeta en ^{una microplaca que contiene un anticuerpo de captura anti-IFN-}Y ^{. Se mide entonces la cantidad de IFN-y mediante} ELISA con la ayuda de una pareja de revelación y un sustrato enzimático. Este ensayo tiene varios inconvenientes. ^{En primer lugar, este ensayo no está automatizada. Necesita una centrifugación, como el ensayo T-SPOT}® ^{, por lo que} no es fácilmente automatizable. Además, como los tubos de extracción de sangre utilizados ya contienen los antígenos de estimulación, las células secretoras de interferón gamma se ponen en contacto inmediatamente con estos antígenos de estimulación, lo que lleva a una manipulación particular y restrictiva hasta la evaluación del IFN-y. En efecto, estos tubos deben colocarse a temperatura ambiente (22 /- 5°C) para ralentizar la secreción, y llevar a cabo la evaluación de IFN-y en un tiempo determinado desde la puesta en contacto de la sangre y de los estimulantes (16 horas como máximo). Esto también perjudica a la reproducibilidad de los resultados: en función de las limitaciones organizativas de los laboratorios, el tiempo entre la recogida de muestras y la estimulación a 37°C para la secreción puede variar mucho. Finalmente, como se indicó anteriormente, este ensayo utiliza tubos especiales de extracción estériles, que no solo contienen previamente los antígenos de estimulación, sino que difieren según la altitud a la que se realizan las evaluaciones (referencias de tubos diferentes), lo que es más difícil desde un punto de vista de gestión de stocks para un laboratorio con respecto al uso de tubos estériles convencionales, como para el ensayo T-SPOT®.

Por supuesto, la tuberculosis no es la única patología para la que se utilizan los ensayos celulares, como se ha señalado anteriormente. Además, estos ensayos también se utilizan para otros mamíferos (Wood P.R., 1990).

Sin embargo, sea cual sea el ensayo, un gran inconveniente, además de la dificultad de automatización por la necesidad de una etapa de centrifugación, está relacionado con la falta de reproducibilidad (Pal M. et al., 2014). Esta falta de reproducibilidad se explica por varios factores, uno de los cuales, importante, se refiere al volumen de la muestra, que puede ser diferente de una extracción de sangre a otra. Esto tiene como consecuencia disminuir la sensibilidad de los ensayos (Gaur RL, et al., 2013). La fluctuación del volumen de la muestra se debe a la extracción de muestra de sangre realizada gracias a los tubos utilizados, los cuales están al vacío, con una depresión calculada para extraer aproximadamente 1 ml de sangre, es decir entre 0,8 y 1,2 ml. Así, la relación antígenos estimulantes del tubo específico/volumen de sangre es diferente de una muestra a otra, lo que tiene obligatoriamente un impacto sobre la cantidad de citocina segregada y por lo tanto en la reproducibilidad de su medida. Poder disponer de un sistema que extraería siempre exactamente la misma cantidad de muestra permitiría superar este inconveniente.

Almeida CA. M. et al, 2009 proponen un ensayo ELIspot automatizado después de la purificación de PBMC por centrifugación, que comprende el recuento de células y el recuento de puntos. Para ello, utilizan la robótica de manipulación de muestras y reactivos y un sistema de información integrado para realizar un seguimiento electrónico del rendimiento del ensayo. Este ensayo solo está parcialmente automatizado ya que la automatización no incluye en particular la preparación de las PBMC y la introducción de los péptidos de estimulación en las placas de 96 pocillos. Además, Este ensayo incluye etapas específicas, bien antes de la automatización, tal como una etapa de centrifugación de la muestra para separar las células, lo que es difícil de automatizar, o bien durante la automatización, como tal como una etapa de recuento de células.

Neubauer J.C. et al., 2017 proponen un ensayo ELIspot más automatizado después de la purificación de PBMC por centrifugación, que va desde el recuento de células hasta el recuento de puntos, y para por el cultivo celular (estimulación de la secreción por las células). Se trata del uso de un robot pipeteador tipo Tecan, a fin de automatizar las etapas de distribución de las células, los diversos reactivos y las disoluciones de lavado. Sin embargo, esta solución requiere al menos dos equipos particulares y costosos, lo que complicaría la producción a gran escala. En efecto, esta automatización requiere en particular el uso de una campana de flujo laminar encima de todo el dispositivo de automatización para respetar la esterilidad durante el cultivo celular, una condición necesaria y que constituye la base del cultivo celular (Coligan J.E., 1994). Finalmente, como con el ensayo de Almeida CA. M. et al, 2009, son necesarias etapas específicas, (i) bien antes de esta automatización, tal como una etapa de centrifugación de la muestra para separar las células, lo que es, como se indicó anteriormente, difícil de automatizar, (ii) o bien durante la automatización, tal como una etapa de recuento de células.

La solicitante ha descubierto, contra todo pronóstico, que era posible superar los inconvenientes de los procedimientos de la técnica anterior, y proceder a la detección de la respuesta celular inmune mediante la automatización de la etapa de estimulación de células que se lleva a cabo directamente en la muestra biológica a ensayar tal como se extraen, y por lo tanto no modificada después de la extracción, sin recurrir ni a una etapa de centrifugación, ni a una etapa de separación de células, ni a una etapa de recuento de células, lo que permite simplificar enormemente los instrumentos automatizados que se usan para tal detección automática.

Asimismo, la invención se refiere a un procedimiento para detectar una respuesta celular inmune en una muestra biológica de origen animal, susceptible de contener al menos una célula secretora de al menos una molécula efectora inmune, que comprende las etapas que consisten en:

(a) aspirar una cantidad definida de la muestra biológica que se ha extraído previamente, por un dispositivo automatizado de aspiración/expulsión,

(b) expulsar esta cantidad definida, con la ayuda de dicho dispositivo automatizado de aspiración/expulsión, en un recipiente R, conteniendo dicho recipiente R previamente al menos un estimulante de secreción de dicha molécula por dicha al menos una célula, o bien no conteniendo dicho recipiente R dicho al menos un estimulante, (c) cuando el recipiente no contiene previamente al menos un estimulante de secreción, introducir en dicho recipiente R con la ayuda de dicho dispositivo automatizado de aspiración/expulsión, dicho al menos un estimulante de secreción contenido en un recipiente E, y

(d) dejar incubar la cantidad definida de muestra y dicho al menos un estimulante, formando una mezcla, para la secreción de dicha molécula por dicha al menos una célula (i) en dicho recipiente R, o (ii) en otro recipiente S después de la aspiración y expulsión de dicha mezcla con la ayuda de dicho dispositivo automatizado de aspiración/expulsión, y

(e) detectar la respuesta celular inmune, en la que la detección de la respuesta celular inmune indica la presencia de una respuesta celular inmune específica de dicho al menos un estimulante de secreción, caracterizado por que dicha muestra biológica es una muestra de sangre total que se extrajo previamente de un organismo animal.

Como se ha indicado anteriormente, el procedimiento de detección de la respuesta celular inmune de la invención puede dividirse en dos fases: una fase de estimulación de las células secretoras o capaces de segregar al menos una molécula efectora inmune, contenidas en una muestra biológica de origen animal, para la secreción de dicha molécula (etapas (a) a (d)) y una fase de detección de dicha respuesta después de la estimulación (etapa (e)). Asimismo, la invención se refiere también a la primera fase, a saber, un procedimiento automatizado para estimular al menos una célula capaz de segregar una molécula efectora inmune para la secreción de dicha molécula, estando dicha al menos una célula contenida en una muestra biológica de sangre total que se ha extraído previamente de un organismo animal, caracterizada por que comprende o consta en las etapas que consisten en:

(a) aspirar una cantidad definida de la muestra biológica que se ha extraído previamente, por un dispositivo automatizado de aspiración/expulsión,

(b) expulsar esta cantidad definida, con la ayuda de dicho dispositivo automatizado de aspiración/expulsión, en un recipiente R, conteniendo dicho recipiente R previamente al menos un estimulante de secreción de dicha molécula por dicha al menos una célula o bien no conteniendo dicho recipiente R dicho al menos un estimulante,

(c) cuando el recipiente no contiene previamente al menos un estimulante de secreción, introducir en dicho recipiente R con la ayuda de dicho dispositivo automatizado de aspiración/expulsión, dicho al menos un estimulante de secreción contenido en un recipiente E, y

(d) dejar incubar la cantidad definida de muestra y dicho al menos un estimulante, formando una mezcla, para la secreción de dicha molécula por dicha al menos una célula (i) en dicho recipiente R o (ii) en otro recipiente S después de la aspiración y expulsión de dicha mezcla usando dicho dispositivo automatizado de aspiración/expulsión.

La respuesta celular inmunitaria así obtenida es particularmente útil en diversas aplicaciones médicas. La invención se refiere también al uso del procedimiento para detectar la respuesta celular inmune de la invención o del procedimiento de estimulación automática de la invención para el diagnóstico de patologías, para los estudios de toxicidad de medicamentos y vacunas y para determinar el estado inmunológico de un paciente.

Por lo tanto, la solicitante ha descubierto, contra todo pronóstico, que era posible mejorar considerablemente la detección de la respuesta celular inmune en una muestra biológica de origen animal susceptible de contener al menos una célula que secreta al menos una molécula efectora inmune automatizando la etapa de estimulación de las células directamente en la muestra biológica a ensayar, que no se ha modificado jamás después de la extracción, como por ejemplo que no haya sufrido jamás una etapa de centrifugación, en particular para separar las células antes o después de la estimulación, ni a una etapa de recuento de células como en el contexto de un ensayo por ELIspot y que nunca han estado en contacto con un estimulante de estimulación. Esto tiene numerosas ventajas como, entre otras, el uso de un instrumento automatizado simple, el uso de tubos estándares de extracción de la muestra biológica, es decir, que no contienen previamente ningún estimulante y adaptados a cualquier condición de uso, tales como los tubos que contienen heparina de litio, un mejor control del tiempo total entre poner en contacto la muestra con el o los estimulantes, y la detección de la respuesta celular inmune, así como el control del volumen de la muestra para la estimulación celular.

Por respuesta celular inmune, se entiende tanto la respuesta inmune con mediación celular como la respuesta inmune humoral generada después de la estimulación de las células secretoras o capaces de segregar una molécula efectora inmune con al menos un estimulante de secreción, células que están contenidas en una muestra biológica.

Las células contenidas en la muestra biológica y capaces de segregar al menos una molécula efectora inmune incluyen células efectoras de la inmunidad con mediación celular, por ejemplo linfocitos tales como las células Natural Killer (NK) y las células T (CD4+ y/o CD8+), que segregan una o más citocinas, las células efectoras de la inmunidad con mediación humoral, por ejemplo las células B, que segregarán anticuerpos, los macrófagos y los monocitos, así como las células dendríticas, que segregarán citocinas o quimioquinas. Como se indicó anteriormente, estas células inmunes son capaces de segregar las moléculas de interés en presencia de uno o más estimulantes de secreción.

Por estimulante de secreción, se entiende cualquier elemento que conlleve la secreción por la célula, puesta en contacto con este estimulante, de una molécula efectora inmune que es una proteína tal como una citocina, un anticuerpo o un marcador, o un transcrito de ARN del gen de la molécula efectora inmune. Por “transcrito de ARN” se entienden los ARN, y en particular los ARN mensajeros, resultantes de la transcripción del gen de la molécula efectora inmune. Según la respuesta inmune que se desea obtener, relacionada con el estado patológico en cuestión, el cual está el mismo ligado o no a un microorganismo patógeno, el estimulante será específico del microorganismo patógeno o no específico, lo que constituye una realización particular de la invención. A diferencia del estimulante específico de un patógeno, se podrá utilizar indiferentemente para todos los demás estimulantes que son no específicos, bien estimulantes no específicos, o bien estimulantes no específicos de un patógeno.

Así, para estados patológicos no relacionados a un microorganismo patógeno, como por ejemplo enfermedades autoinmunes (por ejemplo esclerosis múltiples, diabetes tipo 1, lupus, tiroiditis autoinmunes, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, síndrome de Goujerot-Sjogren, enfermedad de Crohn), los traumatismos, incluyendo traumatismos graves que comprenden varios traumatismos tales como polilesiones tales como heridas, fracturas, quemaduras, etc., injertos, el procedimiento de la invención puede usar uno o más estimulantes no específicos, también llamados mitógenos, tales como proteína quinasa A (PKA), acetato de miristato de forbol (PMA), fitohemaglutina (PHA), concanavalina A (conA), mitógeno de Pokeweed (PWM), Enterotoxina Estafilocócica B (SEB) y lipopolisacárido (LPS).

Para estados patológicos relacionados con un microorganismo patógeno, por ejemplo estados patológicos relacionados con un virus como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (virus VIH, SIV, FIV), hepatitis (virus VHC, VHB, VHA, VHE), varicela (virus VZV), infecciones relacionadas al citomegalovirus (CMV), mononucleosis infecciosas (virus EBV), diversas infecciones de tipo herpes (virus VHS1, VHS2), estados patológicos relacionados con bacterias como la tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae), enfermedad de Lyme (Borreliosis - Borrelia burgdorferi stricto sensu, Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Borrelia spielmanii), infecciones relacionadas con Clostridia (por ejemplo Clostridium difficile, Clostridium botulinum), salmonelosis, neumonía y otras patologías del sistema respiratorio (por ejemplo Klebsiella, Leugionella), enfermedades urinarias (Proteus, Klebsiella), infecciones intestinales (por ejemplo Escherichia coli, Shigella), infecciones nosocomiales (por ejemplo Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus) o sífilis (Treponema pallidum), estados de enfermedad relacionados con levaduras, como la candidiasis (Candida albicans), infecciones fúngicas como la aspergilosis (Aspergillus fumigatus) y mucormicosis (Mucorales), patologías relacionadas con un parásito como la malaria (Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium knowlesi), esquistosomiasis (esquistosomía mansoni, esquistosomía japonicum), el estimulante será específico para el patógeno. Comprenderá al menos un antígeno específico del patógeno que conlleva la producción por las células resultantes de la muestra biológica de una citocina o bien de un anticuerpo dirigido contra este antígeno, en función de la naturaleza de las células estimuladas.

Ejemplos de estimulantes específicos de patógenos incluyen moléculas peptídicas (proteínas o partes de proteínas) que pueden provenir del patógeno, por ejemplo, de la envoltura en el ámbito de un virus, o pueden ser segregadas por el patógeno en sí. Estas moléculas pueden utilizarse enteras o en forma de fragmentos peptídicos de longitud variable, por ejemplo de al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos y de cómo máximo la proteína entera, o de cómo máximo 30, 35, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 aminoácidos. El procedimiento de la invención puede usar uno o más estimulantes peptídicos, de igual o diferente longitud de aminoácidos. Por ejemplo, puede utilizar al menos un estimulante peptídico de longitud comprendida entre 7 y 15 aminoácidos y al menos otro estimulante peptídico de al menos 16 aminoácidos y de como máximo la proteína entera. El procedimiento de la invención puede utilizar uno o más estimulantes que provienen de diferentes cepas de patógenos.

Cuando existe una vacuna, los estimulantes específicos utilizados pueden no ser los presentes en la vacuna para permitir entonces un uso del procedimiento de la invención en aplicaciones de diagnóstico, por ejemplo para comprobar en el paciente vacunado si ha estado en contacto con el patógeno. La composición de las vacunas es conocida, de manera que es fácil para el experto en la materia escoger los estimulantes antigénicos específicos de patógenos apropiados.

Estimulantes específicos de patógenos son bien conocidos por el experto en la materia. A modo de ejemplos no limitativos se puede citar el estimulante PPD (Protein Purified Derivate), las proteínas ESAT-6, CFP-10, TB7.7, TB37.6, Rv3615c o sus fragmentos para el patógeno Mycobacterium tuberculosis (EP2154248A, EP1144447A, EP2417456A), las proteínas pp28, pp50, pp65, IE-1, IE-2, gB o sus fragmentos para el patógeno del citomegalovirus y los péptidos del virus de Epstein-Barr (EBV) del tipo Pep Tivator® proporcionado por la compañía Miltenyi Biotec. También se pueden citar las células de Borrelia, por ejemplo, inactivadas por calor, que pueden comprender varias cepas de Borrelia tales como Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii y Borrelia afzelii ((EP2619584A).

Según una realización, el procedimiento de la invención es tal que usa al menos un estimulante específico que es un antígeno altamente específico para Mycobacterium tuberculosis, que puede estar ausente de la vacuna BCG (Bacille Calmette-Guérin). Preferentemente, dicho al menos un estimulante específico se escoge de los antígenos ESAT-6, CFP-10 y TB7.7.

Las citocinas son todas las citocinas conocidas segregadas por células inmunitarias tales como las células T, como por ejemplo el interferón gamma (IFN-y ), interleucinas (IL), tales como IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 , IL-13, IL-16, IL-17, IL-1 a, IL-1 p, IL-1 ra (IL1RN), quimiocinas tales como quimiocinas CC, quimiocinas C, quimiocinas CXC y quimiocinas CX3C, el factor de necrosis tumoral a (TNFa), el factor de estimulación de colonias (CSF) tal como el granulocito (G)-CSF o el granulocito macrófago (GM)-CSF, así como el complemento o los componentes de la ruta biológica del complemento, por ejemplo, C5a, Groa (CXCL1), sICAM-1 (CD54), IP-10 (CXCL10), I-TAC (CXCL11), MCP-1 (CCL2), MIF (GIF), MIP-1a (CCL3), MIP-1 p (CCL4), RANTES (CCL5) y MIG (CXCL9).

Según una realización, las células a estimular son células capaces de segregar al menos una citocina.

Según otra realización, dicha al menos una citocina que se desea hacer segregar se escoge de las interleucinas, las quimioquinas, el factor de necrosis tumoral a (TNFa) y el interferón gamma (IFNy ), siendo el interferón gamma preferiblemente una citocina.

Además de las citocinas, las células a cultivar según el procedimiento automatizado de la invención pueden ser capaces de segregar al menos un anticuerpo.

Así, según una realización particular, las células cultivadas son células B capaces de segregar al menos un anticuerpo en presencia de al menos un estimulante no específico o de al menos un estimulante específico de un microorganismo patógeno.

Los estimulantes no específicos o específicos de un microorganismo patógeno que conllevan la producción de anticuerpos son conocidos por el experto en la materia y los ejemplos incluyen los descritos anteriormente para las células T. Otros ejemplos incluyen los antígenos de superficie de los diversos patógenos, tal como el antígeno HBs para el virus de la hepatitis B, el antígeno de superficie del virus de la gripe, así como las proteínas de un individuo que genera autoanticuerpos. De manera general, sea cual sea el estimulante, éste será el antígeno específico de la respuesta de anticuerpos obtenida. Así, el anticuerpo que será segregado será un anticuerpo dirigido contra estos estimulantes antigénicos.

Las muestras biológicas que contienen las células capaces de segregar la o las moléculas efectoras inmunes adecuadas para los fines de la invención son muestras de sangre total extraídas de un organismo animal.

Las muestras biológicas no se modifican antes de su uso en el procedimiento de la invención, es decir que se utilizan tal cual después de la extracción en el organismo animal y que no se ponen en contacto previamente con al menos un estimulante. Así, la extracción se lleva a cabo en un recipiente, por ejemplo un frasco, que no contiene estimulante. Del mismo modo, y como se ha indicado anteriormente, las muestras biológicas no se someten tampoco a una etapa de separación o recuento de las células. Se puede hablar entonces de una muestra en bruto o de una muestra tal como se extrae o de una muestra de origen, no estando esta muestra previamente puesta en contacto con al menos un estimulante.

Los organismos animales de los que proceden las muestras biológicas son los seres a los que se suelen hacer habitualmente un diagnóstico médico o a los que se dan medicamentos. Comprenden, por ejemplo, los mamíferos, tales como seres humanos, bovinos, cánidos, felinos, equinos, ovinos, caprinos, porcinos, conejos, reptiles, anfibios, así como aves tales como gallináceas o rapaces.

Según una realización, la muestra biológica es una muestra de origen humano, bovino, canino, felino o equino, preferentemente humano.

La primera etapa del procedimiento de detección o cuantificación de la invención comprende la aspiración de una cantidad definida de la muestra biológica que se ha extraído previamente, por un dispositivo automatizado de aspiración/expulsión (etapa (a)).

Por cantidad definida se entiende una cantidad o volumen de muestra calibrada y siempre idéntica de una evaluación a otra debido al uso de un dispositivo automatizado de aspiración/expulsión.

Los dispositivos automatizados de aspiración/expulsión son dispositivos ampliamente conocidos por el experto en la materia y están presentes en un gran número de instrumentos de bioquímica, biología molecular e inmunoensayos, por ejemplo, los instrumentos de la gama VIDAS.® como VIDAS®, miniVIDAS®, VIDAS® 3 (bioMérieux), Simoa® HD-1 (Quanterix), Cobas® o Elecsys® (Roche Diagnostics Gmbh), L iAISON® (Diasorin), Architect® (Abbott), Acces 2 (Beckman Coulter), Clarity™ (Singulex®), Vitros® (Johnson & Johnson), Centaur® (Siemens), eMAG® y easyMAG® (biomérieux). Estos dispositivos automatizados de aspiración/expulsión comprenden uno o varios dispositivos de extracción de muestras que permiten aspirar un medio líquido, tal como la muestra biológica o los medios de reacción, a partir del recipiente en el que se encuentra, y después expulsarlo. Incluyen, por ejemplo, un brazo o un soporte en cuyo extremo se inserta una aguja o una boquilla (tip o cono), boquilla la cual es virgen o previamente revestida con parejas de unión, como por ejemplo SPR® de la gama VIDAS®. Como el dispositivo de extracción sirve para aspirar y después expulsar diferentes medios, en primer lugar la muestra biológica, después varios medios de reacción, las boquillas de dicho dispositivo de aspiración/expulsión se pueden cambiar y desechar en una basura en varios momentos durante el procedimiento. Así, por ejemplo, en el marco del instrumento VIDAS®, se usa una primera boquilla para extraer la muestra biológica, después, si es necesario, se usa otra boquilla para proporcionar dicho al menos un estimulante de secreción, después se usa otra boquilla recubierta con una pareja de unión (SPR®) para medir la respuesta celular. Cuando el dispositivo de aspiración/expulsión comprende varios dispositivos de extracción, cada dispositivo de extracción tiene su propia función. Por ejemplo, un primer dispositivo de extracción puede servir para aspirar/expulsar la muestra biológica y un segundo dispositivo de extracción puede servir para aspirar/expulsar los reactivos necesarios, por ejemplo, para la incubación y para medir la respuesta celular. El dispositivo de extracción está guiado por un dispositivo de control de aspiración/expulsión, como por ejemplo un dispositivo que efectúa una diferencia de presión en el dispositivo de extracción mediante un pistón accionado por cualquier medio conocido por el experto en la materia, como por ejemplo mediante un tornillo acoplado a un motor, que forma un bloque de bombeo, pudiendo conectarse el dispositivo de extracción y el dispositivo de control de aspiración/expulsión por medio de una tubería que comprende juntas para garantizar la estanqueidad. El dispositivo de extracción y el dispositivo de control de aspiración/expulsión pueden estar más o menos alejados. El experto en la materia adaptará la velocidad y la potencia de aspiración del dispositivo de control de aspiración/expulsión en función de la cantidad de muestra que se desea tomar con vistas a la estimulación y, si es necesario, en función de la longitud y sección de la tubería entre el dispositivo de control de aspiración/expulsión y el recipiente de muestra. Así, por ejemplo, en el marco del instrumento VIDAS® 3 en el que el bloque bomba está cerca del cono, la velocidad de aspiración estará comprendida entre 10 y 500 pl/segundo.

El recipiente de muestra es cualquier recipiente adecuado para recibir una muestra: tubo, frasco. Puede ser de material plástico, tal como etileno acetato de vinilo (copolímero EVA), polietileno, polipropileno copolímero, etileno propileno fluorado (Nalgéne), de vidrio o de acero inoxidable. En el caso de sangre o derivado, el recipiente de muestra puede ser un tubo de extracción de sangre al vacío, por ejemplo, un tubo Vacutainer®, Greiner o Terumo, por ejemplo un tubo heparinizado, usado convencionalmente para extraer sangre de un paciente.

El recipiente de muestra o su contenido se colocará en el instrumento que usa el procedimiento automatizado de la invención antes de llevar a cabo este procedimiento, por ejemplo por un operador u otro dispositivo automatizado.

La cantidad/volumen de muestra biológica que será aspirada por dicho dispositivo automatizado de aspiración/expulsión será fácilmente definida por el experto en la materia en función de varios parámetros tales como el instrumento que utilizará y la naturaleza de la muestra biológica. En general, la cantidad de muestra biológica que se aspirará del recipiente de muestra estará comprendida entre 5 y 800 pl, preferentemente entre 10 y 500 pl. Esta cantidad será como mínimo de 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 pl y como máximo de 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 pl.

Una vez aspirada la cantidad definida calibrada de muestra biológica, ésta se expulsa después por el mismo dispositivo de aspiración/expulsión en un recipiente denominado recipiente R en el que podrá tener lugar la estimulación propiamente dicha (incubación).

Como para el recipiente de muestra, el recipiente R puede ser de material plástico, tal como etileno acetato de vinilo (copolímero EVA), polietileno, polipropileno copolímero, etileno propileno fluorado (Nalgéne), de vidrio o de acero inoxidable.

El recipiente R puede contener previamente todos los componentes necesarios para la estimulación, por ejemplo, llegado el caso, dicho al menos un estimulante de la secreción, así como uno o más tampones tales como tampones fosfato, borato, Tris, HEPES, o bien puede contener únicamente algunos de los componentes, por ejemplo, llegado el caso, dicho al menos un estimulante de la secreción, en particular en forma liofilizada (en polvo, microesferas, cápsulas, etc.), estando los demás componentes, presentes en otro recipiente, aportados en el recipiente R por el dispositivo de aspiración/expulsión después de la expulsión de la cantidad definida de muestra biológica para llevar a cabo la etapa de incubación. O también, el recipiente R puede estar vacío y los componentes necesarios para la incubación, presentes en otro recipiente, se aportan al recipiente R mediante el dispositivo de aspiración/expulsión después de la expulsión de la cantidad definida de muestra biológica para llevar a cabo la etapa de incubación. En particular, dicho al menos un estimulante de secreción puede estar contenido en un recipiente E y se introduce en el recipiente R por el dispositivo de aspiración/expulsión después de expulsar la cantidad definida de muestra biológica (etapa (c)). Dicho al menos un estimulante de la secreción está contenido en el recipiente E en forma liofilizada o bien en mezcla con uno o más tampones, como se ha descrito anteriormente. Según una realización, el recipiente R no contiene dicho al menos un estimulante de secreción que está contenido en un recipiente E.

Este recipiente R o E puede consistir en un solo elemento unitario, por ejemplo un frasco, un tubo, una caja o un pocillo, o puede estar incluido en un conjunto de varios recipientes, como por ejemplo una placa de microtitulación o una tira que contiene varios pocillos, tal como la tira vendida para su uso en el instrumento VIDAS® (bioMérieux, Francia). En este último caso, los recipientes R y E podrán estar en la misma placa o en la misma tira.

El recipiente R es estéril o no antes de la introducción de la cantidad definida de muestra biológica. En cualquier caso, está limpio, es decir, contiene muy poca cantidad de gérmenes. El recipiente R puede estar cubierto por un elemento de cierre que será perforado para la introducción de la cantidad definida de muestra. Por ejemplo, el recipiente R será perforado por el dispositivo de aspiración/expulsión durante la etapa de expulsión. Esto también se aplica al recipiente E. El elemento de cierre es, por ejemplo, una lámina de aluminio, una película de polímero, un septo o una lámina de plástico encolada. La apertura del elemento obturador puede variar de parcial a total, es decir que el recipiente de estimulación R puede estar completamente abierto o abierto únicamente en el diámetro del dispositivo de aspiración/expulsión. Por ejemplo, si el dispositivo de extracción contiene una boquilla de pipeta, que tiene una forma cónica en su extremo, el dispositivo de aspiración/expulsión será programado por su dispositivo de control de aspiración/expulsión para que el elemento obturador sea perforado solo por la parte que comprende el diámetro más pequeño de la boquilla. Así, el elemento obturador puede perforarse en un diámetro comprendido entre 0,5 mm y 5 mm.

La incubación de la cantidad definida de muestra y dicho al menos un estimulante, formando una mezcla muestraestimulante, también denominada etapa de estimulación, puede llevarse a cabo a una temperatura a la que habitualmente se encuentran las células in vivo, es decir, a una temperatura próxima a la temperatura central media del organismo animal del que procede la muestra biológica, lo que constituye una realización particular de la invención. En efecto, cada organismo tiene su propia temperatura central media. Así, la temperatura central media para un ser humano es de 37°C, la de los bovinos es de 38,6°C, la de los perros de 38,9°C, la de los gatos de 38,6°C, la de los caballos de 37,8°C, la de los conejos de 39,5°C, y la de los pollos 41,7°C. Para los vertebrados de sangre fría, la temperatura central promedia está comprendida entre 18° y 25°C. Así, según que la muestra biológica provenga de un organismo animal u otro, la temperatura a usar en la etapa de incubación del procedimiento de la invención podrá ser diferente, y el experto en la materia escogerá la temperatura correcta en función de la muestra biológica utilizada y de la temperatura central media correspondiente. Como las células son capaces de soportar una variación, la temperatura de incubación en el procedimiento de la invención será preferentemente la de la temperatura central del organismo animal del que proviene la muestra biológica o - 3°C, preferiblemente o - 2°C, o o - 1°C. Por ejemplo, para el ser humano, las células se estimularán entre 34 y 40°C, preferentemente entre 35 y 39°C, o bien entre 36 y 38°C, o incluso a 37°C. Generalmente, la temperatura de incubación estará comprendida entre 18 y 45°C, preferentemente entre 35°C y 43°C. Según una realización, la temperatura de la etapa de incubación será de al menos 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35°C. La temperatura puede ser como máximo de 38, 39, 40, 41,42, 43 o 44°C.

La duración de la etapa de incubación puede variar, en particular en función de la cantidad de células presentes en la muestra biológica, y está generalmente comprendida entre 1 h y 72 h. Según una realización, la duración de la etapa de incubación es de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18 h, y de cómo máximo 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 70 o 71 h. Preferiblemente, la duración de la etapa de incubación está comprendida entre 2 y 24 h, y más preferiblemente entre 6 y 18 h.

La incubación puede desarrollarse (i) en dicho recipiente R, lo que se prefiere, o bien (ii) en otro recipiente S después de la aspiración y expulsión de dicha mezcla con la ayuda de dicho dispositivo automatizado de aspiración/expulsión.

Es convencionalmente conocido llevar a cabo la etapa de incubación de las células inmunitarias, contenidas en la muestra biológica o separadas, como en Elispot, con el o los estimulantes de la secreción en condición estéril. Ahora bien, la Solicitante ha mostrado que esta condición no era necesaria. Además, el recipiente R no necesita ser colocado en condición estéril durante la etapa de incubación de las células. Así, según una realización, el recipiente R no es estéril después de la introducción de la cantidad definida de muestra y/o la etapa de incubación (d) se desarrolla en condición no estéril, lo que es totalmente inesperado.

Si llevar a cabo una etapa de incubación en condición estéril requiere un dispositivo particular para respectar esta condición, como una campana de flujo laminar o un tubo de extracción de sangre al vacío, la realización de una etapa de incubación en condición no estéril es particularmente fácil en la medida en que no requiere ningún dispositivo en particular. Por lo tanto, cualquier instrumento de bioquímica, biología molecular o inmunoensayo que comprende un dispositivo automatizado de aspiración/expulsión tal como se describe anteriormente es adecuado para tal etapa de incubación en condición no estéril.

La última etapa del procedimiento de la invención consiste en detectar la respuesta celular inmune que es específica a dicho al menos un estimulante de la secreción, y esto directamente a partir de la mezcla muestra-estimulante ya que, contra todo pronóstico, no es necesaria ninguna centrifugación de las células antes de la detección de esta respuesta celular inmune. Por específico para dicho al menos un estimulante de la secreción se entiende que el uso de otro estimulante con el mismo tipo de célula (B o T) podría dar una respuesta diferente, por ejemplo otros anticuerpos u otras citocinas.

La detección de la respuesta celular inmune puede llevarse a cabo mediante cualquier procedimiento conocido por el experto en la materia, tal como mediante inmunoensayo, mediante evaluación por proliferación, mediante medición del nivel de expresión de transcritos de ARN según métodos conocidos en biología molecular o mediante citometría de flujo. Usará o no al menos una pareja de unión a la molécula efectora inmune o a su transcrito de ARN correspondiente, el cual incluye cualquiera pareja capaz de unirse a dicha molécula o a dicho transcrito. La naturaleza de la pareja de unión dependerá de la naturaleza del analito y del tipo de ensayo llevado a cabo. Preferiblemente, el ensayo será un inmunoensayo o un ensayo de biología molecular.

Por supuesto, el término “inmuno” en “inmunoensayo”, por ejemplo, no debe considerarse en la presente solicitud como una indicación estricta de que la pareja de unión es una pareja inmunológica, tal como un anticuerpo. En efecto, el experto en la materia también utiliza ampliamente este término cuando la pareja de unión, también llamada ligando, no es una pareja inmunológica sino, por ejemplo, un receptor del analito que se desea evaluar. Así, se conoce hablar del ensayo ELISA (“Enzyme-Linked Immunosorbent Assay” literalmente “ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas”) para evaluaciones que utilizan parejas de unión no inmunológicas, más ampliamente denominadas en inglés “Ligand Binding Assay”, que podría traducirse por “Evaluación que usa la unión a un ligando”, mientras que el término “inmuno” está incluido en el acrónimo ELISA. Para más claridad, la Solicitante utilizará a lo largo de la solicitud el término “inmuno” para cualquier ensayo o evaluación que utilice una pareja de unión, incluso cuando no sea una pareja inmunológica.

Si la etapa (e) usa al menos una pareja de unión de la molécula efectora inmune, puede comprender las etapas que consisten en:

(e’) poner en contacto dicha molécula efectora inmune segregada con al menos una pareja de unión a dicha molécula, y

(f’) revelar la presencia o la cantidad de molécula por su unión a dicho al menos una pareja de unión.

Como ejemplos de parejas de unión de inmunoensayo, se pueden citar las parejas de unión de naturaleza u origen inmunológico, tales como anticuerpos (monoclonales o policlonales) y fragmentos de anticuerpos (tales como Fab, Fab’, F(ab’)2), cadenas scFv (Single Chain fragment variable), dsFv (Double-stranded fragment variable)), bien conocidas por el experto en la materia, así como las parejas de unión que no son de la naturaleza u origen inmunológico tales como proteínas distintas de anticuerpos, péptidos, oligonucleótidos, nanofitinas, receptores para la molécula de interés si existen, aptámeros, DARPins o cualquier otra molécula que se conoce por tener una interacción con dicha molécula de interés.

Las nanofitinas (nombre comercial) son pequeñas proteínas que, al igual que los anticuerpos, son capaces de unirse a una diana biológica, lo que permite detectarla, capturarla o simplemente apuntarla dentro de un organismo.

Los aptámeros son oligonucleótidos, generalmente ARN o ADN, identificados en bancos que contienen hasta 1015 secuencias diferentes, mediante un método de selección combinatoria in vitro denominado SELEX para “Systematic Evolution of Ligands by Exponentiel Enrichment” (Ellington AD y Szostak JW., 1990). La mayoría de los aptámeros están compuestos por ARN, debido a la capacidad del ARN a adoptar estructuras variadas y complejas, lo que le permite crear en su superficie cavidades de geometrías variadas, lo que permite fijar ligandos diversos. Se trata de herramientas bioquímicas de interés que pueden ser utilizadas en aplicaciones biotecnológicas, diagnósticas o terapéuticas. Su selectividad y sus propiedades de fijación de ligandos son comparables a las de los anticuerpos.

Los “DARPins” para Designed Ankyrin Repeat ProteINS (Boersma YL y Plütckthun A, 2011) son otra clase de proteínas que permiten imitar los anticuerpos y poder fijarse con afinidad y selectividad elevadas sobre las proteínas diana. Provienen de la familia de las proteínas anquirinas, que son proteínas adaptadoras que permiten fijar las proteínas de membrana integrales a la red espectrina/actina que constituye la “columna vertebral” de la membrana plasmática celular. La estructura de las anquirinas se basa en la repetición de un motivo de aproximadamente 33 aminoácidos y lo mismo ocurre con las DARPins. Cada motivo tiene una estructura secundaria del tipo hélice-codo-hélice (“helix-turnhelix”). Los DARPins contienen al menos tres, preferiblemente de cuatro a cinco motivos repetitivos y se obtienen mediante “screening” de bancos combinatorios.

^{Ejemplos de parejas de unión incluyen anticuerpos anti-IFN-}Y^{, anticuerpos anti-anticuerpos, proteínas de patógeno o} sus fragmentos (por ejemplo, proteína NS3 del VHC, HBsAg del VHB, etc.) y proteínas de fagos, que son ampliamente conocidas por el experto en la materia y disponible en el comercio.

La puesta en contacto de la molécula efectora inmune segregada y dicha al menos una pareja de unión se lleva a cabo en un recipiente diferente del recipiente R o en el recipiente R. En este último caso, la pareja de unión está contenida previamente en el recipiente R o bien se aportará ulteriormente por el dispositivo de aspiración/expulsión. Si la puesta en contacto de la molécula efectora inmune segregada y dicho al menos una pareja de unión se lleva a cabo en un recipiente diferente del recipiente R, por ejemplo en un recipiente T, según una realización, es el contenido del recipiente R el que será aspirado y después expulsado en el recipiente T con la ayuda del dispositivo de aspiración/expulsión. También en este caso, la pareja de unión puede estar contenida previamente en el recipiente T, o bien se aportará ulteriormente por el dispositivo de aspiración/expulsión. Dicha al menos una pareja de unión puede estar inmovilizada en la superficie de los recipientes (R o T), o bien estar presente en los mismos en forma liofilizada. Según otra realización, la pareja de unión está inmovilizada en la superficie de una boquilla utilizada con el dispositivo de aspiración/entrega como, por ejemplo, en el marco de los kits usados con el instrumento VIDAS® (cono SPR®). La aplicación de tal pareja a la superficie de un recipiente o boquilla es ampliamente conocida por el experto en la materia. Los métodos de inmunoensayo son ampliamente conocidos por el experto en la materia e incluyen, por ejemplo, evaluaciones inmunoenzimática o EIA por “Enzyme Linked Immunoassay”. Estos se acoplan a una reacción catalizada por una enzima utilizando un sustrato enzimático. Según el sustrato enzimático escogido, se puede tener una señal colorimétrica (ELISA por Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) (Rassasie, M.J., et al., 1992), una señal de fluorescencia (tecnología ELFA para Enzyme Linked Fluorescent Assay) o una señal quimioluminiscente (CLIA Chemiluminescence Immuno Assays) (Stabler T.V., et al., 1991).

La detección de la respuesta celular inmune puede ser cualitativa, semicuantitativa o cuantitativa. En el contexto de los inmunoensayos, se basa en medidas que permiten cuantificar las señales emitidas durante análisis de la muestra biológica que contiene la molécula de interés. La cantidad de señales detectada es generalmente proporcional a la cantidad de molécula de interés a medir (por ejemplo, durante un ensayo tipo sándwich, utilizando dos parejas de unión) o inversamente proporcional a la cantidad de analito a medir (por ejemplo, durante un ensayo competitivo, utilizando una única pareja de unión y un compuesto que entra en competición con la molécula de interés).

Las etapas convencionales para un inmunoensayo tipo sándwich en una muestra biológica, también denominada muestra de ensayo, susceptible de contener dicho analito o molécula de interés, comprenden o consisten en:

- poner en presencia de dicha al menos una pareja de unión y dicha muestra de ensayo susceptible de contener la molécula de interés para la fijación de la molécula de interés sobre la pareja de unión,

- añadir una pareja de detección, que se acopla directa o indirectamente a un marcador, tal como una enzima capaz de lisar un sustrato enzimático, por ejemplo, fluorogénico para la detección de ELFA, para su fijación sobre el complejo pareja de unión-molécula de interés,

- cuando el marcador es una enzima, poner en presencia un sustrato enzimático y el complejo pareja de uniónmolécula de interés-pareja de detección acoplado a una enzima para la formación de un medio de reacción, y - detectar, por ejemplo por inmunofluorescencia en el contexto de la detección ELFA, la presencia y/o la cantidad de molécula de interés midiendo la señal (por ejemplo fluorescencia) emitida en el medio de reacción.

Por pareja de detección, se entiende cualquier pareja capaz de unirse a la molécula de interés a detectar o cuantificar, que se acoplará directa o indirectamente a un marcador, por ejemplo una enzima. Puede ser de la misma naturaleza que la pareja de unión o de naturaleza diferente. Se han dado ejemplos anteriormente con la pareja de unión.

Por acoplamiento directo o indirecto del marcador a la pareja de detección, se entiende que el marcador se fija directamente a la pareja de detección que reconoce el analito (acoplamiento directo) o bien la enzima se acopla a una pareja de unión que reconoce la pareja de detección que reconoce el mismo el analito (acoplamiento indirecto). Así, en el contexto del acoplamiento directo, el complejo formado al final de la evaluación, denominado conjugado, estará compuesto por: “pareja de unión/molécula de interés/pareja de detección acoplado al marcador”.

En el contexto del acoplamiento indirecto, el complejo formado al final de la evaluación consistirá en: “pareja de unión/molécula de interés/pareja de detección/pareja de unión acoplada al marcador”.

Por marcador se entiende, en particular, cualquier molécula que contiene un grupo reactivo con un grupo de la pareja de detección, directamente sin modificación química, o después de la modificación química para incluir tal grupo, molécula la cual es capaz de generar directa o indirectamente una señal detectable. Una lista no limitativa de estos marcadores de detección directa consiste en:

• las enzimas que producen una señal detectable, por ejemplo, por colorimetría, fluorescencia, luminiscencia, tal como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, • los cromóforos tales como los compuestos fluorescentes, luminiscentes, colorantes,

• las moléculas radiactivas tales como 32P, 35S o 125I,

• las moléculas fluorescentes como Alexa o ficocianinas, y

• las sales electroquimioluminiscentes tales como derivados organometálicos a base de acridinio o rutenio.

Por supuesto, pareja de unión puede estar ella misma marcada como se ha indicado anteriormente. En el contexto de un ensayo sándwich, la segunda pareja utilizada no estará entonces marcada.

Así, según una realización, el procedimiento de detección de la invención se caracteriza por que la etapa (e) usa una pareja de unión a la molécula efectora inmune que es una pareja de inmunoensayo y por que la revelación de la unión o no de dicha molécula se lleva a cabo por un ensayo tipo sándwich utilizando otra pareja de unión a la molécula, de naturaleza diferente o no, estando una de las dos parejas marcada.

Las etapas clásicas para un inmunoensayo de tipo competitivo, en una muestra de ensayo susceptible de contener dicha molécula de interés, incluyen:

- poner en presencia dicha al menos una pareja de unión, un análogo de la molécula de interés acoplada a un marcador, por ejemplo una enzima capaz de lisar un sustrato enzimático, por ejemplo fluorogénico, y dicha muestra, los cuales entran en competición para la fijación sobre la pareja de unión,

- cuando el marcador es una enzima, poner en presencia un sustrato enzimático, complejos pareja de uniónmolécula de interés y pareja de unión-análoga de la molécula de interés para la formación de un medio de reacción, y

- detectar, por ejemplo por inmunofluorescencia, la presencia y/o cantidad de analito midiendo la señal, por ejemplo la fluorescencia, emitida en el medio de reacción.

Por análogo al analito se entiende cualquier molécula que tiene las mismas capacidades de unión a la pareja de unión que la molécula de interés.

El marcador acoplado al análogo de la molécula de interés es equivalente al marcador útil en el contexto de un ensayo sándwich.

Según otra realización particular de la invención, el procedimiento de detección de la invención se caracteriza por que la etapa (e) usa una pareja de unión a la molécula efectora inmune que es una pareja de inmunoensayo y por que la revelación de la unión o no de dicha molécula se lleva a cabo mediante un ensayo de competición utilizando un compuesto marcado que entra en competición con la molécula de interés.

Sea cual sea el tipo de procedimiento utilizado, tipo sándwich o de competición, la enzima es un marcador ampliamente apropiado y se pueden citar en particular como ejemplos la sulfatasa, la peroxidasa, la fosfatasa alcalina (PAL), la fosfatasa ácida, la glucosa oxidasa (GOx), la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) y la p-galactosidasa (p-gal). Los sustratos enzimáticos correspondientes son ampliamente conocidos por el experto en la materia e incluyen, por ejemplo, el fosfato de 4-metilumbeliferilo o el 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranósido.

Según una realización particular, en el procedimiento de detección según la invención, la revelación del analito se lleva a cabo utilizando una enzima y un sustrato enzimático catalizado por dicha enzima, preferentemente la fosfatasa alcalina y el 4-metilumbeliferilfosfato.

Cuando la respuesta celular inmune se obtiene mediante la detección del transcrito de ARN del gen de la molécula efectora inmune, también denominada gen diana, la medida de su nivel de expresión usa métodos de detección de ARN bien conocidos por el experto en la materia, con la ayuda de instrumentos clásicos tales como el Filmarray® (bioMérieux), LightCycler1.0, 2.0 y 480 (System II), Applied Biosystems 7500, 7500 Fast, 7500 Fast Dx, 7300, ViiA™ 7 Real-Time PCR System, StepOne, Rotor-Gene, Dx Real-Time System y CFX 96 Real-Time System.

Así, estos métodos pueden comprender en primer lugar una etapa previa de extracción de los ARN totales de la muestra biológica (ARN ribosomales, ARN de transferencia y ARN mensajero). A esta etapa le sigue una etapa de transcripción inversa de estos diferentes ARN para obtener su ADN complementario (ADNc). Después, los ADNc específicos del gen diana se amplifican, se detectan y después se cuantifican.

La extracción se lleva a cabo mediante todos los protocolos de extracción y purificación de ácidos nucleicos bien conocidos por el experto en la materia. A título indicativo, la extracción de ácidos nucleicos puede realizarse por lisis de las células presentes en la muestra biológica seguida de purificación, por ejemplo en perlas magnéticas, o también por extracción con fenol, cloroformo y ‘alcohol. Estas etapas son bien conocidas por el experto en la materia y se describen, por ejemplo, en las patentes US5234809, EP0245945, WO93/01312, WO00/21973, WO02/16383 o en las instrucciones técnicas de los kits y plataformas de preparación de muestras (sample prep) MagNa Pure, QiaCube, EasyMAG®, mini kit QiaAmp DNA.

A continuación, se lleva a cabo una reacción de transcripción inversa con la ayuda de una enzima transcriptasa inversa que permite obtener, a partir de un fragmento de ARN, un fragmento complementario de ADN (ADNc). La realización de tal etapa es bien conocida por el experto en la materia (revisión general, 2003). Cuando se desea más particularmente obtener únicamente los ADN complementarios de los ARN mensajeros, se lleva a cabo esta etapa enzimática en presencia de fragmentos nucleotídicos que comprenden únicamente bases de timina (poliT), que se hibridan por complementariedad sobre la secuencia poliA de los diferentes ARNm a fin de formar un complejo poliT poliA que sirve después como punto de partida para la reacción de transcripción inversa llevada a cabo por la enzima transcriptasa inversa. Se obtienen entonces diferentes ADN complementarios de los diferentes ARN mensajeros inicialmente presentes en la muestra biológica.

Después, con el objetivo de amplificar específicamente los ADNc específicos del gen diana, se lleva a cabo una reacción de amplificación enzimática. Una reacción de amplificación enzimática es un proceso que genera múltiples copias de un fragmento nucleotídico por la acción de al menos una enzima. Tales reacciones de amplificación son bien conocidas por el experto en la materia y se pueden citar en particular las siguientes técnicas:

- PCR (Polymerase Chain Reaction), tal como se describe en las patentes US4683195, US4683202 y US4800159, y todas sus variantes;

- LCR (Ligase Chain Reaction), expuesta por ejemplo en la solicitud de patente EP0201184;

- RCR (Repair Chain Reaction), descrita en la solicitud de patente WO90/01069;

- 3SR (Self Sustained Sequence Replication) con la solicitud de patente WO90/06995;

- NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) con la solicitud de patente WO91/02818;

- TMA (Transcription Mediated Amplification) con la patente US5399491;

- LAMP (Loop mediated isothermal amplification) con la patente US6410278;

- SDA (Strand Displacement Amplification) descrita en Y. Masamute y C.C. Richardson, 1971, J. Biol. Chem. 246, 2692-2701; R.L. Lechner et al., 1983, J. Biol. Chem. 258, 11174-11184; o R.C. Lundquist y B.M. Olivera, 1982, Cell 31,53-60;

- CRCA (cascade rolling circle amplification);

- ICAN (isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids) descrita en T Uemori, 2007, J Biochem. 2007 de agosto;142(2):283-92;

- HDA (target based-helicase dépendent amplification) descrita en Vincent et al., 2004, Embo reports, 5(8): 795-800. Se habla entonces de amplicones para designar los polinucleótidos generados por una técnica de amplificación enzimática. Preferentemente, cuando la amplificación enzimática es una PCR, el reactivo específico comprende al menos 2 cebadores de amplificación específicos para amplificar una determinada región del ADN complementaria al ARNm procedente del gen diana. Cuando la amplificación enzimática es una PCR realizada después de una reacción de transcripción inversa, se habla de RT-PCR. Entre las variantes de PCR, se puede citar en particular la reacción en cadena por polimerasa encajada o PCR anidada (Nested-PCR) que implica dos amplificaciones de PCR gracias a la presencia de dos PCR sucesivas y dos pares de cebadores diferentes: el primer par de cebadores sirve para la primera PCR (PCR convencional), el segundo par de cebadores sirve durante la segunda PCR y se define de tal manera que se hibrida con una secuencia presente en el producto de amplificación (amplicón) de la primera PCR.

Después de esta etapa de amplificación, cualquiera que sea la técnica utilizada, se determina el nivel de expresión del gen diana, por ejemplo, por hibridación con la ayuda de al menos una sonda de hibridación específica del producto de expresión de este gen diana, que corresponde a la pareja de unión al transcrito ARN de interés, o con la ayuda de un intercalador de ADN de doble hebra tal como SybrGreen®.

Por sonda de hibridación se entiende un fragmento nucleotídico que comprende de 5 a 100 motivos nucleotídicos, en particular de 6 a 35 motivos nucleotídicos, que posee una especificidad de hibridación en determinadas condiciones para formar un complejo de hibridación con un fragmento nucleotídicos diana. En la presente invención, el fragmento nucleotídico diana puede ser una secuencia nucleotídica incluida en un ARN mensajero o una secuencia nucleotídica incluida en un ADN complementario obtenido por transcripción inversa de dicho ARN mensajero.

Las técnicas de hibridación son bien conocidas por el experto en la materia, y se puede citar en particular la técnica transferencia Northern.

La cuantificación de los ARNm, productos de expresión del gen diana, para por una etapa de detección de la reacción de hibridación, entre la sonda de hibridación o el intercalador de ADN y el fragmento nucleotídico diana.

Por detección, se entiende una detección directa mediante un método físico o bien un método de detección con la ayuda de un marcador. Existen numerosos métodos de detección para la detección de ácidos nucleicos (Keller G.H., 1993; Kricka, 1999).

El experto en la materia podrá referirse en particular a las publicaciones de Bustin SA y Giulietti A. et al. (Bustin SA, 2002; Giulietti A, 2001).

Todo lo que se ha descrito anteriormente sobre inmunoensayos con respecto a las diversas etapas del procedimiento y del uso de una pareja de unión se puede aplicar a la detección por biología molecular.

El procedimiento de detección de la invención también puede comprender una o más etapas suplementarias de aclarado después de cada etapa, como por ejemplo:

- antes de la adición de la pareja de detección, una etapa de aclarado para eliminar la molécula no unida al complejo pareja de unión-molécula de interés; y

- después de la adición de la pareja de detección, una etapa de aclarado para eliminar la pareja de detección no unida.

Las etapas de aclarado son etapas conocidas por el experto en la materia. Se llevan a cabo con tampones compatibles con el medio de reacción y la lectura de la señal.

Por supuesto, las etapas (a) a (d) se llevan a cabo antes de la etapa (e), pero son posibles varias realizaciones. Así, el procedimiento de detección de la invención comprende una o más de las siguientes características:

- las etapas (a) a (e) se llevan a cabo con el mismo instrumento;

- las etapas (a) a (e) se llevan a cabo sucesivamente en el mismo día;

- las etapas (a) a (d) se llevan a cabo un primer día o durante varios días, por ejemplo hasta 3 días, como se ha definido anteriormente, y la etapa (e) se llevan a cabo entonces otro día, por ejemplo 1,2 o 3 días más tarde.

Por mismo instrumento se entiende el mismo instrumento para realizar todas las etapas sucesivamente, o bien dos instrumentos de la misma gama, uno para reunir dicho al menos un estimulante y la muestra biológica tal como se ha extraído, y el otro para detectar la respuesta celular inmune. Así, gracias al uso del mismo instrumento, el procedimiento está completamente automatizado utilizando un equipo simplificado que no requiere la presencia de personal altamente calificado, ni el uso de condiciones muy específicas cuando la etapa de incubación se lleva a cabo en condición no estéril. En esta realización particular, el dispositivo de aspiración/expulsión podrá utilizarse para transferir la muestra biológica que contiene la molécula de interés segregada hacia el o los recipientes utilizados para la etapa (e), como se ha indicado anteriormente. El o los diferentes recipientes necesarios para llevar a cabo todas las etapas del procedimiento de la invención se pueden colocar en el instrumento antes de la etapa (a) o bien se pueden colocar en dos tiempos, dependiendo de la fase (estimulación/detección).

Los ejemplos de instrumentos que se pueden usar incluyen todos los instrumentos de diagnóstico ya disponibles en el comercio, por ejemplo, los de inmunoensayo o biología molecular, los cuales incluyen:

- Un dispositivo de aspiración/expulsión para extraer la muestra biológica procedente de un paciente y colocarla en un recipiente para estimulación, después para la detección de la respuesta celular inmune,

- Un conjunto de recipientes para poder realizar estimulación y la detección,

- Opcionalmente un sistema para mantener la temperatura del recipiente que sirve para la incubación a la temperatura escogida, y

- Un sistema para detectar la respuesta celular inmune.

Ejemplos no limitativos de instrumentos de inmunoensayo adecuados incluyen instrumentos de la gama VIDAS® tal como VIDAS®, miniVIDAS®, VIDAS® 3 (bioMérieux), Simoa® HD-1 (Quanterix), Cobas® o Elecsys® (Roche Diagnostics Gmbh), LIAIs On® (Diasorin), Architect® (Abbott), Access 2 (Beckman Coulter), Clarity™ (Singulex®) y Vitros® (Johnson & Johnson).

Por ejemplo, el instrumento de la gama VIDAS® (bioMérieux) utiliza un dispositivo de aspiración/expulsión que consta de un cono (SPR®) sobre un soporte, cono el cual está revestido con una pareja de unión, una tira compuesta por 10 pocillos (por lo tanto, 10 recipientes) que incluyen un pocillo de muestra, un pocillo de estimulación, un pocillo de lectura de la señal representativa de la detección de la molécula efectora inmune y pocillos que pueden contener los diversos constituyentes, por ejemplo los necesarios para la estimulación y para el inmunoensayo usado para la detección del cultivo celular inmune. Este instrumento también tiene un sistema para regular la temperatura de los pocillos de la tira. El instrumento VIDAS® 3 también tiene un brazo provisto de una boquilla.

Como se ha indicado anteriormente, el procedimiento de detección de la respuesta celular inmune de la invención se puede dividir en dos fases, la primera fase constituye otro objeto de la invención, que es un procedimiento automatizado para estimular al menos una célula susceptible de segregar una molécula efectora inmune para la secreción de dicha molécula, procediendo dicha al menos una célula de una muestra biológica de origen animal, caracterizado por que comprende o consta de las etapas que consisten en:

(a) aspirar una cantidad definida de la muestra biológica extraída por un dispositivo automatizado de aspiración/expulsión,

(b) expulsar esta cantidad definida, con la ayuda de dicho dispositivo automatizado de aspiración/expulsión, en un recipiente R, conteniendo dicho recipiente R previamente al menos un estimulante de secreción de dicha molécula por dicha al menos una célula o bien no conteniendo dicho recipiente R dicho al menos un estimulante, (c) cuando el recipiente no contiene previamente al menos un estimulante de secreción, introducir en dicho recipiente R con la ayuda de dicho dispositivo automatizado de aspiración/expulsión, dicho al menos un estimulante de secreción contenido en un recipiente E, y

(d) dejar incubar la cantidad definida de muestra y dicho al menos un estimulante, formando una mezcla, para la secreción de dicha molécula por dicha al menos una célula (i) en dicho recipiente R o (ii) en otro recipiente S, después de la aspiración y expulsión de dicha mezcla con la ayuda de dicho dispositivo automatizado de aspiración/expulsión.

Las características relacionadas con la muestra biológica, con las células a cultivar, con la molécula efectora inmune, también llamada molécula de interés o también analito, con las enfermedades de interés, con las condiciones de estimulación/incubación, con o sin estimulante o estimulantes específicos al patógeno, a los dispositivos de automatización utilizados, a los métodos para detectar la respuesta inmune, etc., tales como se describen anteriormente en el ámbito del procedimiento de detección de la invención también se aplican para el procedimiento de estimulación.

La molécula así obtenida por estimulación automatizada y su detección son particularmente útiles en el campo médico. Asimismo, la invención se refiere también al uso del procedimiento para detectar una respuesta celular inmune o del procedimiento automático de estimulación tales como se han descrito anteriormente para el diagnóstico y seguimiento de patologías, para estudios de toxicidad de medicamentos y vacunas y para determinar el estado inmunitario de un paciente.

Las patologías en cuestión se han descrito anteriormente. Paralelamente, es importante que los medicamentos y vacunas, futuros o no, no sean tóxicos, y los procedimientos de la invención puedan utilizarse en este sentido. Finalmente, dado que el estado inmunitario de un paciente se evalúa a través de la capacidad de las células implicadas en la respuesta inmune para segregar moléculas efectoras inmunes, el procedimiento de la invención está particularmente bien adaptado para este objetivo.

La invención se comprenderá mejor con la ayuda de los siguientes ejemplos que se dan a título ilustrativo y no limitativo, así como con la ayuda de la Figura 1 que es una representación esquemática del cono y la tira utilizados con el instrumento VIDAS®, perteneciendo el cono al dispositivo de aspiración/expulsión para aspirar y expulsar la cantidad definida de muestra biológica en un pocillo de estimulación.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Automatización de la etapa de estimulación, extracción de sangre total, estimulación con un estimulante no específico, evaluación del interferón gamma

1.1. Realización de la etapa de secreción.

Las muestras de sangre utilizadas en este ejemplo se obtuvieron de Etablissements Frangais du Sang (EFS) y se extrajeron de donantes sanos. Se extrajeron estérilmente cinco muestras de sangre en tubos Vacutainer® (Becton-Dickinson) que contienen heparina de litio, o una referencia equivalente de otro proveedor.

Estas muestras se estimularon según dos condiciones (1 y 2)

Condición 1: Estimulación en tubo, según la técnica anterior - condiciones estériles de estimulación. Para esta condición, se utilizan tubos secos estériles (Cat. No. 367614, Becton-Dickinson). En condición estéril, bajo una campana de flujo laminar, cada muestra de sangre se estimula de 3 maneras diferentes:

Ensayo 1: Tubo PBS (control negativo): se mezclan 400 pl de tampón PBS con 400 pl de sangre total.

Ensayo 2: Tubo de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) - fitohemaglutinina (PHA): se mezclan 400 gl de estimulantes PMA (2,30 ng/ml) y PHA (0,46 gg/ml) con 400 gl de sangre total.

Ensayo 3: Tubo de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) - fitohemaglutinina (PHA): se mezclan 400 gl de estimulantes PMA (25 ng/ml) y PHA (5 gg/ml) con 400 gl de sangre total.

Los tubos se volvieron a tapar bajo una campana y después se incubaron verticalmente a 37°C durante 17h30. Condición 2: Estimulación automática con cartucho VIDAS® - condiciones de estimulación no estériles. La tira del autómata de inmunoanálisis VIDAS® se describe en la Figura 1. Ésta (11) está compuesta por 10 pocillos (1 a 10) parcialmente cubiertos con una lámina de aluminio sellada etiquetada (no mostrada). El último pocillo (10) es una cubeta óptica en la que se mide la fluorescencia y contiene el sustrato enzimático. Los diversos reactivos necesarios para la estimulación y/o el análisis como el estimulante (aquí pocillos PBS o pocillos PMA-PHA), las disoluciones de lavado o el anticuerpo de revelación están contenidos en los diversos otros pocillos (1 a 9).

Las tiras así preparadas se insertaron en el autómata VIDAS® 3 así como los tubos de sangre total extraída de donantes. Antes de cargar los tubos en el autómata, se retiran las tapas. A partir de este momento, las muestras de sangre total ya no se tratan en condición estéril. El instrumento VIDAS® 3 se ha programado a fin de realizar automáticamente las siguientes etapas:

1) Aspirar a través del dispositivo de aspiración/expulsión un volumen preciso de sangre total (400 gl) a partir del tubo de extracción primario

2) Perforar la lámina de aluminio que cubre el pocillo de estimulación con la ayuda del dispositivo de aspiración/expulsión,

3) Expulsar la sangre total en el pocillo de estimulación

4) Incubar el cartucho a 37°C durante 17h30.

Después de esta etapa de estimulación, el VIDAS® 3 puede continuar automáticamente con la etapa de detección del IFNy segregado, según el modo de funcionamiento descrito a continuación en el apartado 1.2.

Las condiciones de estimulación en un tubo estéril (tubo) o en la tira del VIDAS® (pocillos) se resumen en la Tabla 1 a continuación.

1.2. Etapa de detección de IFN^y : procedimiento de inmunoensayo automatizado

Principio de detección

La detección de IFN^y en muestras biológicas se lleva a cabo mediante inmunoensayo sándwich de una sola etapa, utilizando el autómata de inmunoensayo VIDAS® (biomérieux). El cono de uso único (que se muestra en 12 en la Figura 1) sirve al mismo tiempo como fase sólida para la reacción y como sistema de pipeteo. Se utiliza en combinación con la tira (11), tal como se describe en el punto 1.1 anterior. Todas las etapas del ensayo se llevan a cabo así automáticamente por el instrumento. Consisten en una sucesión de ciclos de aspiración/expulsión del medio de reacción.

^{sensibilización y pasivación de los conos. Los conos se sensibilizaron con 270} g ^{l de una disolución de un primer anticuerpo monoclonal anti-IFN}Y ^{(4G1E12, bioMérieux, Francia) a 5} g^{g/ml en tampón de carbonato. Después de} aproximadamente 6-8 h de incubación a 18/25°C con la disolución de sensibilización, se vaciaron los conos. Después, ^{se añaden 300} g ^{l de tampón fosfato que contiene 10 g/l de albúmina bovina para la pasivación de los conos a 18/25°C} durante aproximadamente 18-24 h. Los conos se vacían entonces, se secan y después se conservan a 4°C hasta su uso, protegidos de la humedad.

Preparación de disoluciones de anticuerpos conjugados. La disolución conjugada (pareja de detección) contiene un ^{segundo anticuerpo monoclonal anti-IFN}Y ^{acoplado a fosfatasa alcalina (2A4B11, bioMérieux). Los anticuerpos} conjugados se diluyeron a aproximadamente 500 ng/ml en tampón fosfato/BSA.

inmunoensayo. Tan pronto como el cono VIDAS® está en contacto con la muestra, comienza la reacción inmunológica ya que los anticuerpos de captura se inmovilizan en este cono. El autómata mezcla la muestra a ensayar (100 pl - en este caso la sangre después de la estimulación) con 250 pl de la disolución conjugada. La incubación tarda aproximadamente 10 minutos a 37°C y permite la unión específica de IFNy con el anticuerpo adsorbido sorbe el cono por un lado (anticuerpo de captura) y con el anticuerpo conjugado (anticuerpo de detección) por otra parte. Después, los componentes no unidos se eliminan mediante 3 lavados con tampón Tris NaCl. Durante la etapa de revelación final, el sustrato de fosfato de 4-metilumbeliferilo se aspira y después se expulsa en el cono; la enzima de los anticuerpos conjugados cataliza la reacción de hidrólisis de este sustrato en 4-metilumbeliferona cuya fluorescencia emitida se mide a 450 nm. El valor de la señal de fluorescencia (RFV: relative fluorescence value) es proporcional a la concentración del antígeno presente en la muestra.

Los resultados de las evaluaciones se dan en la Tabla 2:

Tabla 2: Medición de IFN or VIDAS

Se observa una secreción muy fuerte de INFy (señales > 8000 RFV) cuando las células son estimuladas usando una alta concentración de PHA en la mezcla PMA/PHA mientras que la secreción es moderada (señales < 800 RFV) si la concentración de PHA es baja en la mezcla PMA/PHA. Este fenómeno se observa tanto para la estimulación llevada a cabo en el tubo como para la llevada a cabo en el pocillo.

La secreción no específica en ausencia de estimulante (ensayo PBS) es muy baja en el tubo (señales < 30 RFV) y casi inexistente en el pocillo (señales < 20 RFV).

El nivel de secreción de INFy obtenido después de la estimulación se compara con el medido en ausencia de estimulante calculando una relación entre las 2 mediciones. Si la relación es al menos de 3, se concluye positivamente.

Cuando la estimulación se lleva a cabo en el pocillo, las relaciones oscilan de 6 a 1366 mientras que, cuando la estimulación se lleva a cabo en el tubo, las relaciones oscilan de 7 a 755. Por lo tanto, se puede concluir que la estimulación que conlleva a la secreción de INFy es equivalente o mejor en el pocillo que en el tubo.

Ejemplo 2: Automatización de la etapa de estimulación, extracción de sangre total, estimulación con un estimulante específico (antígenos Mycobacterium tuberculosis), evaluación del interferón gamma

Las muestras de sangre utilizadas en este ejemplo se obtuvieron de Biotech Bank (Angers, Francia) y se extrajeron de personas que han tenido tuberculosis o de su entorno cercano. Se extrajeron estérilmente cuatro muestras de sangre en tubos Vacutainer® (Becton-Dickinson) que contienen heparina de litio o una referencia equivalente de otro proveedor.

Cada muestra de sangre se ha estimulado según 3 protocolos diferentes detallados en la Tabla 3 a continuación, utilizando como agente de estimulación el contenido de los tubos Quantiferon® TB (Cat. n.° T0590-0301, Qiagen). Los tubos Quantiferon® TB son tubos de extracción de sangre al vacío, especiales, que permiten recoger sangre total en condiciones perfectamente estériles. Son 3:

El tubo AG, para antígeno, contiene péptidos procedentes de las proteínas ESAT-6, CFP-10 y TB7.7 de Mycobacterium tuberculosis; se trata del tubo para la estimulación específica. Si hay secreción de IFNy en este tubo, es que la muestra contiene células T que son capaces de reaccionar específicamente contra los péptidos de M. tuberculosis.

El tubo NIL corresponde al control negativo y el tubo MIT, que contiene un mitógeno, corresponde al control positivo.

Cada muestra se ha estimulado mediante el contenido de los 2 tubos AG y NIL Quantiferon y según 2 protocolos, lo que corresponde a un total de 4 condiciones por muestra.

En uso de rutina, según las instrucciones del fabricante, se extraen de 0,8 a 1,2 ml de sangre total directamente de los tubos Quantiferon® TB de manera estéril, y la fase de estimulación se lleva a cabo de manera estéril en los tubos que contienen previamente los estimulantes de secreción. Después, las muestras así estimuladas se centrifugan y se lleva a cabo la detección del interferón gamma en una microplaca en el plasma así obtenido. Sin embargo, para poder realizar la comparativa con la estimulación automatizada, se ha modificado ligeramente este modo de realización, como se indica en la Tabla 3:

Tabte 3: condiciones de estimulación detección del interferón amma

La detección de IFN^y en las muestras de sangre después de la estimulación se llevó a cabo según el modo de realización detallado en el apartado 1.2 del Ejemplo 1.

Los resultados (señal RFV medida por el VIDAS®) según las condiciones experimentales, se dan en la Tabla 4 a continuación:

Tabla 4: medición de IFN or VIDAS

Resultados: El protocolo de estimulación y detección de la respuesta celular inmune automatizada, sin centrifugación y en condición no estéril, permite obtener señales (11-1954 RFV) equivalentes o superiores a las obtenidas con el protocolo de referencia en tubo estéril (14-1083 RFV). La relación Ag /NIL oscila de 1,1 a 43,6 para la condición automatizada, y de 1,1 a 17,1 para la condición de referencia, lo que refleja una estimulación específica equivalente o mayor en la condición automatizada.

Las muestras BK-37, BK-38, BK-33 y BK-34 tienen relaciones AG/NIL que oscila de 1,0 a 2,8 en las 2 condiciones ensayadas. El nivel de secreción de IFNy detectado es basal (relación < 3) y no es específico de los antígenos de M.

tuberculosis. En consecuencia, la condición automatizada y la condición de referencia permiten concluir que estos pacientes no estaban infectados por M. tuberculosis: interpretación negativa (Neg.).

La muestra BK-40 tiene relaciones AG/NIL entre 4,2 y 5,3 según el protocolo de estimulación, que son muy concordantes. En esta muestra, se observa una secreción de IFN^y (relación > 3) iniciada específicamente por los antígenos de M. tuberculosis. Se puede concluir que el paciente BK-40 ya fue infectado con M. tuberculosis: interpretación positiva (Pos.). Se obtiene la misma interpretación para las muestras BK-39 y BK-20 para las que se demuestran los niveles más altos de secreción específica de IFNy. Para estos pacientes, las relaciones AG/NIL no son equivalentes entre las 2 condiciones: se observan relaciones de 43,6 y 17,1 respectivamente para la condición automatizada frente a 9,1 y 6,1 para la condición de referencia, lo que muestra una sensibilidad analítica mejorada para la condición automatizada, sin etapa de centrifugación y en una condición no estéril con una cantidad de sangre calibrada, en comparación con la condición de referencia (condiciones estériles con una cantidad variable de sangre).

Ejemplo 3: Automatización de la etapa de estimulación, extracción de sangre total, estimulación no específica de ^p M^a + PHA, evaluación de TNF alfa

3.1. Realización de la etapa de secreción.

Las muestras de sangre utilizadas en este ejemplo se obtuvieron de Etablissements Frangais du Sang (EFS) y se extrajeron de donantes sanos. Se extrajeron 2 muestras de sangre estérilmente en tubos Vacutainer® (Becton-Dickinson) que contienen heparina de litio, o referencia equivalente de otro proveedor, y estimuladas en un tubo (condición de referencia estéril) o bien en pocillos VIDAS® (según la invención) según el modo de realización descrito en el apartado 1.1.

Las condiciones de estimulación en un tubo estéril (tubo) o en la tira del VIDAS® (pocillos) se resumen en la Tabla 5 a continuación:

T l : n i i n im l i n n ril n ill m

Al final de la etapa de estimulación, se extrae la muestra a fin de medir la concentración de TNFa con el kit Quantikine® HS ELISA human TNFa immunoassay de R&D systems (Cat. n° HSTA00D) aplicando el modo de realización preconizado por el fabricante (instrucciones versión 12/13).

3.2. Resultados de la evaluación de TNF alfa

Los resultados experimentales obtenidos se dan en la Tabla 6 a continuación:

T l : m i i n TNF r ELI A

Como se muestra en la Tabla 6, se observa una secreción muy alta de TNFa (concentración superior a 32 pg/ml) cuando las células se estimulan usando una concentración alta de PHA en la mezcla PMA/PHA. Este fenómeno se observa tanto para la estimulación realizada en el tubo como para la realizada en el pocillo.

La secreción no específica en ausencia de estimulante (ensayo PBS) es muy baja, tanto en el tubo como en el pocillo (concentración < 3 pg/ml).

Cuando la estimulación se lleva a cabo en pocillo, las relaciones son de 10,8 y 33, comparables a las calculadas cuando la estimulación se lleva a cabo en tubo, respectivamente de 14,9 y 24,1. Por lo tanto, se puede concluir que la secreción de TNFa se estimuló por la mezcla PMA-PHA de manera equivalente en el tubo y en el pocillo.

Ejemplo 4: Automatización de la etapa de estimulación, extracción de sangre total, estimulación no específica de LPS, ensayo de TNF alfa

4.1. Realización de la etapa de secreción.

Las muestras de sangre utilizadas en este ejemplo se obtuvieron de Etablissements Frangais du Sang (EFS) y se extrajeron de donantes sanos. Se extrajeron 2 muestras de sangre estérilmente en tubos Vacutainer® (Becton-Dickinson) que contienen heparina de litio o una referencia equivalente de otro proveedor.

Las muestras se estimularon en tubos (condición estéril REF) o bien en pocillos VIDAS® (según la invención), según el modo de realización descrito en el apartado 1.1 del Ejemplo 1, con la diferencia de que se ha sustituido la mezcla de PMA+PHA por una mezcla a partes iguales de lipopolisacáridos de E. coli (LPS, Sigma, Cat. n° L3012, L2637 y L3137). Las condiciones de estimulación se resumen en la Tabla 7:

T l 7: n i i n im l i n n ril n ill m

Al final de la etapa de estimulación, se extrae la muestra para medir la concentración de TNF alfa con el kit Quantikine® HS ELISA human TNF alpha immunoassay de R&D systems (Cat. n° HSTA00D) aplicando el modo de realización preconizado por el fabricante (instrucciones versión 12/13).

4.2. Resultados de la evaluación de TNF alfa

Los resultados experimentales obtenidos se dan en la Tabla 8:

Como se muestra en la Tabla 8, se observa una secreción muy fuerte de TNFa (concentración > 32 pg/ml) cuando las células se estimulan usando LPS. Este fenómeno se observa tanto para la estimulación realizada en el tubo como para la realizada en el pocillo.

La secreción no específica en ausencia de estimulante (ensayo PBS) es muy baja, tanto en el tubo como en el pocillo (concentración < 3 pg/ml).

Cuando la estimulación se lleva a cabo en el pocillo, las relaciones son de 10,8 y 33, comparables a las calculadas cuando la estimulación se lleva a cabo en el tubo, respectivamente de 14,9 y 24,1. Por lo tanto, se puede concluir que la secreción de TNFa se estimuló por LPS de manera equivalente en el tubo y en el pocillo.

Ejemplo 5: Automatización de la etapa de estimulación, extracción de sangre total, estimulación con un estimulante específico (antígenos Citomegalovirus), evaluación de interferón gamma

Las muestras de sangre utilizadas en este ejemplo se obtuvieron de Etablissements Frangais du Sang (EFS Rhóne-Alpes, Francia). Se extrajeron trece muestras de sangre estérilmente en tubos Vacutainer® (Becton-Dickinson) que contienen heparina de litio o una referencia equivalente de otro proveedor.

Cada muestra de sangre se estimuló según el protocolo “Condición automatizada, según la invención” descrito en la Tabla 3 del Ejemplo 2 utilizando, como agente de estimulación, el contenido de los tubos Quantiferon® CMV (Cat. n° 0192-0301, Qiagen). Los tubos Quantiferon® CMV son tubos especiales de extracción de sangre al vacío que permiten la extracción de sangre total en condiciones perfectamente estériles. Son 3:

El tubo AG, para antígeno, contiene péptidos de citomegalovirus; se trata de del tubo para la estimulación específica. Si hay secreción de IFNy durante esta estimulación se debe a que la muestra de sangre contiene células T que son capaces de reaccionar específicamente contra los péptidos del citomegalovirus.

El tubo NIL corresponde al control negativo y el tubo MIT, que contiene un mitógeno, corresponde al control positivo.

Cada muestra se estimuló con el contenido de los tubos AG y NIL Quantiferon.

La detección de IFNy en las muestras de sangre después de la estimulación se llevó a cabo según el modo de realización detallado en el apartado 1.2 del Ejemplo 1.

Los resultados (señal RFV medida por el VIDAS®) según las condiciones experimentales) se dan en la Tabla 9 a continuación.

Tabla 9: medición de IFN or VIDAS®

Resultados: El protocolo de estimulación y detección de la respuesta celular inmune automatizada, sin centrifugación y en condición no estéril, permite obtener señales de 3 a 12053 RFV y relaciones AG/NIL que oscilan de 0,9 a 1339. Las muestras 59180446129, 59180447383, 59180447498, 59180447500, 5918040405-, 59180404113, 59174894208 y 59174890020 tienen relaciones AG/NIL que oscilan de 0,9 y 3,9. El nivel de secreción de IFNy detectado es basal (relación <5) y no está inducido por los péptidos de citomegalovirus. En consecuencia, la estimulación en condición automatizada permite concluir que estos pacientes no estaban infectados por el citomegalovirus: interpretación negativa (Neg.).

Las muestras 59180404025, 59180404324, 59180404076, 59174894224 y 59174890039 tienen relaciones AG/NIL entre 17,2 y 1339. En estas muestras, se observa secreción de IFNy (relación > 5) iniciada específicamente por los péptidos de citomegalovirus. En consecuencia, la estimulación en condición automatizada permite concluir que estos pacientes estaban infectados por citomegalovirus: interpretación positiva (Pos).

Ejemplo 6: Automatización de la etapa de estimulación, extracción de sangre total, estimulación con un estimulante específico (antígenos del virus de Epstein-Barr)

Las muestras de sangre utilizadas en este ejemplo se obtuvieron de Etablissements Frangais du Sang (EFS, Rhóne-Alpes, Francia). Se extrajeron diez muestras de sangre estérilmente en tubos Vacutainer® (Becton-Dickinson) que contienen heparina de litio o una referencia equivalente de otro proveedor.

Cada muestra de sangre se estimuló según el protocolo “Condición automatizada, según la invención” detallado en la Tabla 3 del Ejemplo 2, utilizando como agente de estimulación unos péptidos del virus de Epstein-Barr (Pep Tivator®). Para la condición NIL, la muestra se puso en contacto únicamente con PBS.

La detección de IFNy en las muestras de sangre después de la estimulación se llevó a cabo según el modo de realización detallado en el apartado 1.2 del Ejemplo 1.

Los resultados (señal RFV medida por el VIDAS® según las condiciones experimentales) se dan en la Tabla 10 a continuación.

Tabla 10: medición de IFN or VIDAS®

Resultados: El protocolo de estimulación y detección de la respuesta celular inmune automatizada, sin centrifugación y en condición no estéril, permite obtener señales de 7 a 4838 RFV y relaciones AG/NIL que oscilan de 0,4 a 131. Las muestras 59174878208, 59180477734 y 59180477697 tienen relaciones AG/NIL que oscilan entre 0,4 y 2,0. Estas relaciones son bajas (<4), lo que significa que la secreción de IFNy no está relacionada con los péptidos del virus EBV. En consecuencia, la estimulación en condición automatizada permite concluir que estos pacientes no estaban infectados por el virus de Epstein-Barr: interpretación negativa (Neg).

Las muestras 59174878275, 59174878101, 59174878136, 59174878179, 59180477726, 59180477718 y 5918047770- dan relaciones AG/NIL entre 17,9 y 131. Estas relaciones son altas (> 4), lo que significa que la secreción de IFNy está específicamente relacionada con los péptidos del virus de Epstein-Barr. En consecuencia, la estimulación en condición automatizada permite concluir que estos pacientes estaban infectados por el virus de Epstein-Barr: interpretación positiva (Pos).

Ejemplo 7: Automatización de la etapa de estimulación, extracción de sangre total, estimulación no específica de LPS, evaluación por biología molecular

Las muestras de sangre utilizadas en este ejemplo se obtuvieron de Etablissements Frangais du Sang (EFS, Rhone-Alpes, Francia). Se extrajeron cinco muestras de sangre estérilmente en tubos Vacutainer® (Becton-Dickinson) que contienen heparina de litio o una referencia equivalente de otro proveedor.

Cada muestra de sangre se estimuló según el protocolo “Condición automatizada, según la invención” detallado en la Tabla 3 del Ejemplo 2, utilizando LPS como agente de estimulación. Para la condición NIL, la muestra se puso en contacto únicamente con PBS.

La detección de la respuesta celular inmune por cuantificación de los ARNm de los siguientes genes: gen de IFNy, gen de IL1p y gen de ZAP70 (kit internos de bioMérieux), en las muestras de sangre después de la estimulación, se llevó a cabo de la siguiente manera: los ARNm se extrajeron después de la lisis de 100 gl de la mezcla de reacción utilizando un método automatizado (tecnología BOOM). Después, los ARNm se amplificaron mediante RT-nested PCR de 2 etapas (1a PCR de 26 ciclos, seguida de una 2a PCR de 35 ciclos). La detección propiamente dicha se llevó a cabo utilizando un intercalador, y se adquirieron las medidas en tiempo real para construir una curva de amplificación y obtener un punto Cp (“crossing point”) para cada diana y para 3 genes de referencia (DECR1, PPIB y FPGS). La señal, que corresponde al nivel de expresión del ARNm, se normalizó sustrayendo el Cp diana por una media geométrica de los 3 genes de referencia.

Los resultados (valores de Cp normalizados ± desviación estándar) se dan en la Tabla 11 a continuación. Cuanto menor sea el valor normalizado de Cp, mayor será el nivel de expresión.

Tabla 11

Los resultados de la Tabla 11 anterior muestran que es posible detectar una respuesta celular inmune mediante un ensayo de biología molecular después de la estimulación automatizada según la invención.

Referencias bibliográficas

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Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para detectar una respuesta celular inmune en una muestra biológica de origen animal, susceptible de contener al menos una célula que segrega al menos una molécula efectora inmune, que comprende las etapas que consisten en:

(a) aspirar una cantidad definida de la muestra biológica extraída previamente por un dispositivo automatizado de aspiración/expulsión,

(b) expulsar esta cantidad definida, con la ayuda de dicho dispositivo automatizado de aspiración/expulsión, en un recipiente R, conteniendo dicho recipiente R previamente al menos un estimulante de secreción de dicha molécula por dicha al menos una célula o bien no conteniendo dicho recipiente R dicho al menos un estimulante, (c) cuando el recipiente no contiene previamente al menos un estimulante de secreción, introducir en dicho recipiente R con la ayuda de dicho dispositivo automatizado de aspiración/expulsión, dicho al menos un estimulante de secreción contenido en un recipiente E, y

(d) dejar incubar la cantidad definida de muestra y dicho al menos un estimulante, formando una mezcla, para la secreción de dicha molécula por dicha al menos una célula (i) en dicho recipiente R o (ii) en otro recipiente S, después de la aspiración y expulsión de dicha mezcla con la ayuda de dicho dispositivo automatizado de aspiración/expulsión, y

(e) detectar la respuesta celular inmune, en la que la detección de la respuesta celular inmune indica la presencia de una respuesta celular inmune específica para dicho al menos un estimulante de la secreción, caracterizado por que dicha muestra biológica es una muestra de sangre total previamente extraída de un organismo animal.

2. Procedimiento para detectar una respuesta celular inmune según la reivindicación 1, caracterizado por que el estimulante de secreción es un estimulante no específico o un estimulante específico para un microorganismo patógeno.

3. Procedimiento para detectar una respuesta celular inmune según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que dicho al menos un estimulante de secreción es un antígeno altamente específico para Mycobacterium tuberculosis, el cual puede estar ausente de la vacuna BCG (Bacillus Calmette-Guerin).

4. Procedimiento para detectar una respuesta celular inmune según la reivindicación 3, caracterizado por que dicho al menos un estimulante de la secreción se escoge de los antígenos ESAT-6 (6-kDa early secretory antigenic target), CFP-10 (10-kDa culture filtrate protein) y TB7.7 (Tuberculosis 7.7).

5. Procedimiento para detectar una respuesta celular inmune según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que dicha al menos una célula es una célula susceptible de segregar al menos una citocina.

6. Procedimiento para detectar una respuesta celular inmune según la reivindicación 5, caracterizado por que dicha al menos una citocina se escoge de interleucinas, quimiocinas, factor de necrosis tumoral a (TNFa) e interferón gamma (IFNy), preferentemente del interferón gamma.

7. Procedimiento para detectar una respuesta celular inmune según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que las células son células B susceptibles de segregar al menos un anticuerpo.

8. Procedimiento para detectar una respuesta celular inmune según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que la muestra biológica es una muestra biológica de origen humano, bovino, canino, felino o equino.

9. Procedimiento para detectar una respuesta celular inmune según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que el recipiente R no es estéril después de la introducción de la cantidad definida de muestra.

10. Procedimiento para detectar una respuesta celular inmune según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la duración de la etapa de incubación es de 2 a 72 h.

11. Procedimiento para detectar una respuesta celular inmune según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que la etapa (e) usa una pareja de unión a la molécula efectora inmune que es una pareja de inmunoensayo, y por eso la revelación de la unión o no de dicha molécula se lleva a cabo mediante un ensayo sándwich utilizando otra pareja para la unión a la molécula, que puede ser o no de diferente naturaleza, estando marcado uno de las das parejas.

12. Procedimiento para detectar una respuesta celular inmune según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que la etapa (e) usa una pareja de unión a la molécula efectora inmune que es una pareja de inmunoensayo, y por eso la revelación de la unión o no de dicha molécula se lleva a cabo mediante un ensayo de competición utilizando un compuesto marcado que entra en competición con dicha molécula.

13. Procedimiento para detectar una respuesta celular inmune según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por que las etapas (a) a (e) se llevan a cabo con el mismo instrumento.

14. Procedimiento para detectar una respuesta celular inmune según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado por que las etapas (a) a (e) se llevan a cabo sucesivamente en el mismo día.

15. Procedimiento para detectar una respuesta celular inmune según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado por que las etapas (a) a (d) se llevan a cabo en un primer día o en el transcurso de varios días, y después la etapa (e) se lleva a cabo en otro día.

16. Procedimiento automatizado para estimular al menos una célula capaz de segregar una molécula efectora inmune para la secreción de dicha molécula, estando dicha al menos una célula contenida en una muestra de sangre total previamente extraída de un organismo animal, caracterizado por que comprende o consta de las etapas que consisten en:

(a) aspirar una cantidad definida (calibrada) de la muestra biológica extraída previamente por medio de un dispositivo automatizado de aspiración/expulsión,

(b) expulsar esta cantidad definida, con la ayuda de dicho dispositivo automatizado de aspiración/expulsión, en un recipiente R, conteniendo dicho recipiente R, previamente, al menos un estimulante para la secreción de dicha molécula por dicha al menos una célula, o bien no conteniendo dicho recipiente R tal al menos un estimulante, (c) cuando el recipiente no contiene previamente al menos un estimulante de secreción, introducir en dicho recipiente R con la ayuda de dicho dispositivo automatizado de aspiración/expulsión dicho al menos un estimulante de secreción contenido en un recipiente E, y

(d) dejar incubar la cantidad definida de muestra y dicho al menos un estimulante, formando una mezcla, para la secreción de dicha molécula por dicha al menos una célula (i) en dicho recipiente R o (ii) en otro recipiente S después de la aspiración y expulsión de dicha mezcla con la ayuda de dicho dispositivo automatizado de aspiración/expulsión.

17. Procedimiento automatizado de estimulación según la reivindicación 16, caracterizado por que el recipiente R no es estéril después de la introducción de la cantidad definida de muestra.

18. Procedimiento automatizado de estimulación según las reivindicaciones 16 o 17, caracterizado por que el estimulante de secreción es un estimulante no específico o un estimulante específico de un microorganismo patógeno.

19. Procedimiento automatizado de estimulación según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizado por que la muestra biológica es una muestra de origen humano, bovino, canino, felino o equino.

20. Uso de un procedimiento para detectar una respuesta celular inmune según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o del procedimiento automatizado de estimulación según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, para el diagnóstico de patologías, para los estudios de toxicidad de medicamentos y vacunas, y para determinar el estado inmunitario de un paciente.