KR101845957B1 - 프로히비틴 유전자 타깃 백혈병 진단용 키트 및 이를 이용한 진단 방법 - Google Patents

프로히비틴 유전자 타깃 백혈병 진단용 키트 및 이를 이용한 진단 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101845957B1
KR101845957B1 KR1020160021320A KR20160021320A KR101845957B1 KR 101845957 B1 KR101845957 B1 KR 101845957B1 KR 1020160021320 A KR1020160021320 A KR 1020160021320A KR 20160021320 A KR20160021320 A KR 20160021320A KR 101845957 B1 KR101845957 B1 KR 101845957B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
leukemia
kit
pro
gene
diagnosis
Prior art date
Application number
KR1020160021320A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20170099218A (ko
Inventor
신명근
김혜란
원용관
Original Assignee
전남대학교기술지주회사(주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 전남대학교기술지주회사(주) filed Critical 전남대학교기술지주회사(주)
Priority to KR1020160021320A priority Critical patent/KR101845957B1/ko
Priority to US16/079,432 priority patent/US11339421B2/en
Priority to PCT/KR2017/001867 priority patent/WO2017146432A1/ko
Priority to EP17756770.8A priority patent/EP3421611B1/en
Publication of KR20170099218A publication Critical patent/KR20170099218A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101845957B1 publication Critical patent/KR101845957B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/113—Real time assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Abstract

본 발명은 백혈병 진단용 키트 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 백혈병 진단용 키트는 백혈병 환자의 검체 내의 프로히비틴-1 및 프로히비틴-2의 발현 정도를 확인할 수 있는 RT-PCR용 키트로서, 종래 RT-PCR 키트보다 백혈병 진단의 정확도 및 재현성이 높아 백혈병 진단, 잔류병소측정 및 치료효과 판정용 키트로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

프로히비틴 유전자 타깃 백혈병 진단용 키트 및 이를 이용한 진단 방법{Kit for diagnosis of leukemia and diagnostic method targeting prohibitin gene}
본 발명은 백혈병 진단용 키트 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다.
혈액암 중에서도 백혈병(leukemia)은 다양한 발병원인이 밝혀지고 있으나, 가장 일반적인 원인은 유전자변이 및 이를 포함하는 염색체변이에 의하여 발생하는 것으로 알려져 있어, 주로 염색체변이의 종류에 따라, 예후가 달라지며 이에 따라 환자의 치료방향을 결정하고 있다.
현재 백혈병 진단을 위해서는 세포형태학적 소견, 면역표현학소견 및 유전자변이를 포함한 염색체변이를 이용하고 있다. 유전자 및 염색체변이를 확인하기 위해 전통적인 염색체검사와 중합효소연쇄반응을 기반으로한 분자유전학적 방법이 이용되고 있으며, 실제 검사현장에서 용이하게 적용할 수 있는 다양한 분자유전검사법 개발에 대한 다양한 연구가 진행되고 있다.
예를 들어, 장거리 역방향 중합효소연쇄반응(long distance inverse polymerase chain reaction)을 이용하여 융합유전자의 배열을 확인하는 방법(참조: Joseph Wiemeles et al., Blood, 99:3801-3805, 2003), 세포유전학과 FISH(fluorescent in situ hybridization)를 결합한 진단방법(참조: Mancini et al, British Journal of Haematology, 91:878-884, 1995), 체세포 DNA에 대한 PCR을 이용한 방법(참조: Tashiro et al, Japanese Journal of Cancer Research, 84:110-113, 1993) 및 RT-PCR을 이용한 방법(참조: Castaigne et al., Blood, 79:3110-3115, 1991; Fukutani et al, Leukemia, 9:588-593, 1995) 등이 개발되었다.
그러나 상기 방법 중 FISH는 염색체 전좌가 발생된 개별세포를 직접 검출하는 방법으로, 백혈병의 초기에는 검출되지 않으며, PCR 또는 RT(reverse transcrtion)-PCR에 의한 방법은 민감도는 뛰어나나, 시료의 오염 등으로 인하여 오류양성(false-positive) 반응을 나타낼 수 있으며, 질병의 진행정도를 정확하게 파악할 수 없다는 단점이 있다.
상술한 단점을 극복하기 위한 방법으로, 최근에는 미량의 시료로부터 표적 RNA의 정량까지 가능한 실시간 정량(Real Time) PCR 방법을 활용한 백혈병 진단 키트들이 개발되어 시판되고 있으나, 한명의 환자로부터 수득한 시료를 대상으로 할 경우에도, 진단의 정확성을 향상시키기 위하여 백혈병의 발병과 관련된 다양한 유전자를 검사하여야만 하므로, 상당한 비용과 시간이 소요되기 때문에, 보다 신속한 백혈병의 진단을 수행하기가 어렵다는 단점이 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 종래 진단의 정확성을 향상시키기 위하여 백혈병의 발병과 관련된 다양한 유전자를 검사해야하는 문제점을 해결하고, 신속한 백혈병의 진단을 수행하기 위해 프로히비틴-1 유전자 발현양과 프로히비틴-2 유전자 발현양을 조합하여 백혈병을 진단할 수 있는 키트 및 이를 이용한 백혈병 진단 방법을 제공하는데 있다.
1. 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하는 프로히비틴-1 유전자; 및 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머를 포함하는 프로히비틴-2 유전자를 포함하는 백혈병 진단용 키트.
2. 위 1에 있어서, 상기 백혈병 진단용 키트는 프로히비틴-1 유전자 발현양과 프로히비틴-2 유전자 발현양을 측정하여 비교하는 것인 백혈병 진단용 키트.
3. 위 1에 있어서, 상기 백혈병 진단은 하기 수학식 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 수학식에 의해 결정되는 것인 백혈병 진단용 키트:
Figure 112016017815632-pat00001
(상기 수학식 1에서,
상기 T는 정상군과 환자군의 프로히비틴-2에 대한 발현양의 경계값이고,
상기 x 2는 프로히비틴-2의 발현양이며,
상기 Y가 양수이면 '정상'으로, 음수이면 '환자'로 진단한다)
Figure 112016017815632-pat00002
(상기 수학식 2에서,
상기 x 1는 프로히비틴-1(PHB1) 발현양이고,
상기 x 2는 프로히비틴-2(PHB2) 발현양이며,
상기 Y가 '양(Positive)'의 값을 가지면, '정상'으로 판정하고, '음(Negative)' 값을 가지면, '환자'로 판정한다)
Figure 112016017815632-pat00003
상기 수학식 3에 있어서,
상기 g는 함수로서, 하기 수학식 4로 정의되고,
상기 Y가 '양(Positive)'의 값을 가지면 '정상'으로 판정하고, '음(Negative)' 값을 가지면, '환자'로 판정한다.
Figure 112016017815632-pat00004
4. 위 1에 있어서, 상기 백혈병 진단용 키트는 프로히비틴-1 유전자와 프로히비틴-2 유전자의 mRNA를 RT-PCR을 수행하기 위한 것인 백혈병 진단용 키트.
5. 위 1에 있어서, 상기 백혈병 진단용 키트는 PCR 반응용 시약을 더 포함하는 것인 백혈병 진단용 키트.
6. 위 1에 있어서, 상기 백혈병 진단용 키트는 RNA 추출용 시약을 더 포함하는 것인 백혈병 진단용 키트.
7. 위 1에 있어서, 상기 백혈병은 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 또는 만성 림푸구성 백혈병인 백혈병 진단용 키트.
8. 위 1의 백혈병 진단용 키트를 이용하되, 프로히비틴-1 유전자(PHB1)와 프로히비틴-2(PHB2) 유전자의 발현양을 측정한 후, 상기 유전자 발현양을 비교하여 백혈병을 진단하는 단계를 포함하는 백혈병 진단 방법.
9. 위 8에 있어서, 상기 백혈병 진단은 하기 수학식 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 수학식에 의해 결정되는 것인 백혈병 진단 방법:
[수학식 1]
Figure 112016017815632-pat00005
(상기 수학식 1에서,
상기 T는 정상군과 환자군의 프로히비틴-2에 대한 발현양의 경계값이고,
상기 x 2는 프로히비틴-2의 발현양이며,
상기 Y가 양수이면 '정상'으로, 음수이면 '환자'로 진단한다)
[수학식 2]
Figure 112016017815632-pat00006
(상기 수학식 2에서,
상기 x 1은 프로히비틴-1(PHB1) 발현양이고,
상기 x 2는 프로히비틴-2(PHB2) 발현양이며,
상기 Y가 '양(Positive)'의 값을 가지면, '정상'으로 판정하고, '음(Negative)' 값을 가지면, '환자'로 판정한다)
[수학식 3]
Figure 112016017815632-pat00007
(상기 수학식 3에 있어서,
상기 g는 함수로서, 하기 수학식 4로 정의되고,
상기 Y가 '양(Positive)'의 값을 가지면 '정상'으로 판정하고, '음(Negative)' 값을 가지면, '환자'로 판정한다)
[수학식 4]
Figure 112016017815632-pat00008
.
본 발명에 따른 백혈병 진단용 키트는 백혈병 환자의 검체 내의 프로히비틴-1 및 프로히비틴-2의 발현 정도를 확인할 수 있는 RT-PCR용 키트로서, 종래 RT-PCR 키트보다 백혈병 진단의 정확도 및 재현성이 높아 백혈병 진단, 잔류병소측정 및 치료효과 판정용 키트로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 백혈병 환자군으로부터 얻은 검체에서 확보된 프로히비틴-1 및 프로히비틴-2의 mRNA 발현양을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 정상군로부터 얻은 검체에서 확보된 프로히비틴-1 및 프로히비틴-2의 발현양을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 백혈병 환자군 및 정상군으로부터 얻은 검체에서 확보된 프로히비틴-2의 발현양을 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 수평축을 프로히비틴-1으로 하고 수직축을 프로히비틴-2로 하여 2차원 평면상의 좌표에 나타낸 백혈병 진단을 위한 선형 경계선을 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 수평축을 프로히비틴-1으로 하고 수직축을 프로히비틴-2로 하여 2차원 평면상의 좌표에 나타낸 백혈병 진단을 위한 비선형 경계선을 나타내는 도면이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하는 프로히비틴-1 유전자; 및 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머를 포함하는 프로히비틴-2 유전자를 포함하는 백혈병 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 백혈병 진단용 키트는 진단 외에도 잔류병소측정 및 치료효과 판정에도 유용하게 사용될 수 있고, 본 발명의 상기 백혈병은 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 또는 만성 림프구성 백혈병을 포함한다.
본 발명의 상기 백혈병 진단용 키트는 프로히비틴-1 유전자와 프로히비틴-2 유전자의 mRNA를 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)를 수행하기 위한 것일 수 있다.
본 발명에 따르면, mRNA를 얻기 위하여, 시료, 바람직하게는 말초혈액 및 골수검체에서 백혈구를 채취한 후 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, Trizol을 이용하여 용이하게 세포 내의 총 RNA를 분리할 수 있다.
이어, 분리된 mRNA를 주형으로 cDNA를 합성하고, 상기 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 합성된 cDNA를 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용하여 증폭한다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다.
증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 명세서에 기술된 용어"증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.
한편, PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명에서 증폭 반응에 이용되는 프라이머는 프로히비틴-1 또는 프로히비틴-2의 cDNA 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다. 본 명세서에서 용어 "프라이머"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다.
일례로, 본 발명에서 이용되는 프라이머는 프로히비틴-1 또는 프로히비틴-2의 cDNA 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 갖는 것이다. 본 발명의 프라이머는 서열목록 제1 서열에 기재된 프로히비틴-1의 mRNA(즉, cDNA) 서열에 상보적인 서열로 제조될 수 있으며, 서열목록 제3 서열에 기재된 프로히비틴-2의 mRNA(즉, cDNA) 서열에 상보적인 서열로 제조될 수 있다.
이러한 프라이머의 디자인은 프로히비틴-1 또는 프로히비틴-2의 cDNA 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.
이렇게 증폭된 프로히비틴-1 또는 프로히비틴-2의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 프로히비틴-1 및 프로히비틴-2의 유전자의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, cDNA를 프로히비틴-1,2 유전자와 상보적인 서열로 합성된 프라이머와 SYBR Green I시약을 혼합하여 RT-PCR에 적용하여 프로히비틴-1 또는 프로히비틴-2의 발현양을 측정한다. 이때, 개개인의 유전자 발현의 차이를 제거하기 위해 House-Keeping Gene관 연관된 것으로 널리 알려진 베타-Actin 유전자의 발현양을 동시에 측정할 수 있다.
이러한 증폭 반응을 통하여, 이러한 실시간 정량 PCR의 증폭 반응을 통하여 도 1 및 2에 나타낸 바와 같이 환자군 및 정상군에 대한 프로히비틴-1 유전자 발현양과 프로히비틴-2 유전자 발현양의 측정치를 얻을 수 있다.
상기 백혈병 진단은 하기 수학식 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 수학식에 의해 결정될 수 있고, 하기 수학식 1 내지 3의 본 발명에서 적용하는 경계값 또는 경계선은 통상적으로 널리 활용될 수 있는 수학, 통계학, 인공지능 및 데이터마이닝 등과 같은 방법으로 결정할 수 있으며, 선형식 및 비선형식 모두 적용 될 수 있다.
즉, 상기 수학식 1 내지 3은 '정상'과 '환자'를 구분하는 경계선에 해당하는 수식의 일례로 직선 또는 비선형의 식을 나타내고 있으나, 최적의 경계선을 산출하는 방법에 따라 다른 수식으로 나타낼 수도 있다.
[수학식 1]
Figure 112016017815632-pat00009
(상기 수학식 1에서,
상기 T는 정상군과 환자군의 프로히비틴-2에 대한 발현양의 경계값이고,
상기 x 2는 프로히비틴-2의 발현양이며,
상기 Y가 양수이면 '정상'으로, 음수이면 '환자'로 진단한다).
[수학식 2]
Figure 112016017815632-pat00010
(상기 수학식 2에서,
상기 x 1는 프로히비틴-1(PHB1) 발현양이고,
상기 x 2는 프로히비틴-2(PHB2) 발현양이며,
상기 Y가 '양(Positive)'의 값을 가지면, '정상'으로 판정하고, '음(Negative)' 값을 가지면, '환자'로 판정한다).
[수학식 3]
Figure 112016017815632-pat00011
(상기 수학식 3에 있어서,
상기 g는 함수로서, 하기 수학식 4로 정의되고,
상기 Y가 '양(Positive)'의 값을 가지면 '정상'으로 판정하고, '음(Negative)' 값을 가지면, '환자'로 판정한다).
[수학식 4]
Figure 112016017815632-pat00012
또한 본 발명은 상기 백혈병 진단용 키트를 이용하되, (1) 백혈병 검체로부터 채취한 프로히비틴-1 유전자 발현양과 프로히비틴-2 유전자 발현양을 측정하는 제1 단계; 및
(2) 상기 제1 단계에서 측정된 프로히비틴-1 유전자 발현양과 프로히비틴-2 유전자 발현양을 조합하여 백혈병을 진단하는 제2 단계;를 포함하는 백혈병 진단 방법을 제공한다.
상기 백혈병 진단은 상기 백혈병 진단은 하기 수학식 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 수학식에 의해 결정될 수 있고,
하기 수학식 1 내지 3의 본 발명에서 적용하는 경계값 또는 경계선은 통상적으로 널리 활용될 수 있는 수학, 통계학, 인공지능 및 데이터마이닝 등과 같은 방법으로 결정할 수 있으며, 선형식 및 비선형식 모두 적용 될 수 있다.
즉, 상기 수학식 1 내지 3은 '정상'과 '환자'를 구분하는 경계선에 해당하는 수식의 일례로 직선 또는 비선형의 식을 나타내고 있으나, 최적의 경계선을 산출하는 방법에 따라 다른 수식으로 나타낼 수도 있다.
[수학식 1]
Figure 112016017815632-pat00013
(상기 수학식 1에서,
상기 T는 정상군과 환자군의 프로히비틴-2에 대한 발현양의 경계값이고,
상기 x 2는 프로히비틴-2의 발현양이며,
상기 Y가 양수이면 '정상'으로, 음수이면 '환자'로 진단한다).
[수학식 2]
Figure 112016017815632-pat00014
(상기 수학식 2에서,
상기 x 1은 프로히비틴-1(PHB1) 발현양이고,
상기 x 2는 프로히비틴-2(PHB2) 발현양이며,
상기 Y가 '양(Positive)'의 값을 가지면, '정상'으로 판정하고, '음(Negative)' 값을 가지면, '환자'로 판정한다).
[수학식 3]
Figure 112016017815632-pat00015
(상기 수학식 3에 있어서,
상기 g는 함수로서, 하기 수학식 4로 정의되고,
상기 Y가 '양(Positive)'의 값을 가지면 '정상'으로 판정하고, '음(Negative)' 값을 가지면, '환자'로 판정한다).
[수학식 4]
Figure 112016017815632-pat00016
본 발명의 상기 백혈병은 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 또는 만성 림푸구성 백혈병이다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
환자군 및 정상군 선별
본 발명에서 사용된 백혈병 검체는 94명의 급성골수성백혈병 환자로부터 말초혈액 및 골수검체를 채취하여 사용하였다. 정상군은 별도의 기본 검사를 통하여 특이한 질병을 갖지 않은 52명의 일반인의 말초혈액을 채취하였다.
실시예 1: PCR에 의한 유전자 발현양 측정
(1) 단계 1: 말초혈액 및 골수검체에서 백혈구 세포 채집
전혈을 3.500 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 혈장을 제거한 후, 총량이 5 ml이 되도록 PBS(pH 7.4)를 첨가한 다음 lymphoprep 3 ml를 첨가하고, 천천히 혼합한 다음 1,500 rpm에서 30 min 동안 원심분리하여 백혈구(WBC) 층을 회수하였다.
그 다음 PBS(pH 7.4)를 7 ml이 되도록 첨가하고 천천히 혼합한 후 1,500 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, pellet(세포)만 회수하였다.
(2) 단계 2: RNA 추출
본 발명에서는 Ambion kit(RNA queous phenol-free total RNA isolation_AM1912) 사용하였다.
검체에 lysis/binging sol. 500 μl 첨가 후, vortex mixing한 후, 64 % 에탄올 500 μl 첨가(lysis/binging sol.과 동량)하였다. 그 다음 column에 sample 700 μl을 넣어 준 다음 14,000 rpm에서 1 min 동안 원심분리한 후, 하층액 제거하였다.
그 다음 Wash sol.1을 700 μl을 넣어 준 후 14,000 rpm에서 1 min 동안 원심분리 하층액 제거한 다음 다시 Wash sol.2, 3을 500 μl을 넣어 준 다음 14,000 rpm에서 30 sec 동안 원심분리 한 다음 하층액 제거하는 과정을 두번 수행하였고, 마지막으로 14,000 rpm에서 3 min 동안 원심분리하여 새로운 tube에 column을 옮겨서 elution buffer 40 μl 첨가하여 RNA를 추출하였다.
상기 추출된 RNA는 Nano Drop을 이용해서 정량화하였다.
(3) cDNA 합성
시판되는 Invitrogen kit(SuperScript III First-strand synthesis system for RT-PCR_18080-051)를 사용하여 cDNA를 합성하였고, 상기에서 정량화 한 total RNA 500 ng를 cDNA 합성에 이용하였다.
(4) Real-Time PCR 반응 조건
상기에서 합성된 cDNA(500 ng)를 20 ng(1/25)으로 ultra pure water를 이용하여 희석하고, SYBR PCR Master Mix와 프로히비틴-1과 프로히비틴-2 프라이머와 혼합하여 Real Time PCR를 수행하였다.
프로히비틴-1과 프로히비틴-2 발현을 탐지하기 위하여 사용된 프라이머는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
구분 서열목록 primer
size		 NCBI Reference Sequence
PHB-1 정방향 프라이머 5'-GGA GGC GTG GTG AAC TCT G-3' 175 bp NM_
002634
PHB-1 역방향 프라이머 5'-CTG GCA CAT TAC GTG GTC GA-3'
PHB-2 정방향 프라이머 5'-CTT GGT TCC AGT ACC CCA TT-3' 115 bp NM_

001144831
PHB-2 역방향 프라이머 5'-CGA GAC AAC ACT CGC AGG G-3'
(5) 유전자 발현양 측정 결과
실시간 정량 PCR 측정의 대상은 프로히비틴-1, 프로히비틴-2 및 베타-Actin 유전자이며, 시료(사람)간의 유전자 발현 정도의 차이를 극복하기 위해 하기 수학식 5로 데이터를 보정하였다.
이러한 데이터 변환 과정으로 얻어진 숫자는 '값이 클수록 유전자 발현양이 상대적으로 많음'을 의미하게 된다.
94명의 백혈병 환자의 프로히비틴-1 및 프로히비틴-2의 발현양은 하기 표 2 및 도 1에 나타내었고, 52명의 정상인의 프로히비틴-1 및 프로히비틴-2의 발현양은 표 3 및 도 2에 나타내었다.
이때, 상기 과정을 거쳐 얻어진 실시간 정량 PCR 증폭반응 결과로 측정된 값은 해당 실시간 정량 PCR 측정기기에 의해 유전자의 존재가 감지되기 위해 필요한 최소한의 증폭 횟수(Ct values)를 나타낸다. 즉, 실시간 정량 PCR 기기에 의해 측정이 가능한 양까지 유전자가 증폭된 횟수로서, 값이 클수록 원래 존재한 (발현한) 유전자의 양이 적음을 의미한다.
Figure 112016017815632-pat00017
Figure 112016017815632-pat00018
상기 x 1은 프로히비틴-1(PHB-1) 발현양이고,
상기 x 2는 프로히비틴-2(PHB-2) 발현양이고,
상기 P 1은 프로히비틴-1의 PCR 측정치이고,
상기 P 2는 프로히비틴-2의 PCR 측정치이고,
상기 A는 Actin의 PCR 측정치이다.
백혈병 환자의 프로히비틴-1 및 프로히비틴-2의 발현양
Index PHB-1 PHB-2 Index PHB-1 PHB-2 Index PHB-1 PHB-2
P1 0.5154 0.3879 P38 1.0453 0.8669 P71 1.9777 1.1125
P3 1.5303 0.4456 P39 2.7970 2.0054 P72 1.0525 0.5880
P4 0.8790 1.0097 P40 0.9618 0.5880 P73 2.0761 1.1438
P5 0.4245 0.2259 P41 1.5093 1.6631 P76 5.4788 0.6524
P7 0.8201 0.7867 P42 3.2577 1.8073 P77 1.6176 0.5839
P9 1.1760 0.8669 P43 1.8453 1.2780 P78 3.0607 0.7139
P10 0.2167 0.1953 P44 0.8032 0.4910 P79 1.3985 0.7442
P11 1.6176 0.6848 P45 0.9685 0.4581 P80 1.3048 0.3401
P12 0.7867 0.5083 P46 0.6661 0.4743 P81 2.3848 0.7442
P13 1.3985 0.8201 P47 1.4378 0.5486 P82 1.1049 0.2724
P14 1.8453 0.9958 P48 1.9641 1.2174 P83 0.9753 0.3961
P15 5.1832 0.5799 P49 1.1598 0.4518 P84 1.3415 0.7239
P16 1.6176 1.5517 P50 1.0525 0.6258 P85 1.6863 0.7239
P17 1.5734 0.8144 P51 1.3230 1.0453 P86 0.9099 0.4016
P19 1.6064 0.7977 P52 1.2780 0.5524 P87 1.9104 1.1760
P20 1.9641 1.5410 P53 2.4518 1.3048 P88 4.9721 1.1598
P21 0.3721 0.1822 P54 0.8974 0.5880 P89 1.4279 0.8790
P22 0.4395 0.3262 P55 1.3230 0.7977 P90 1.1679 0.4710
P23 1.1598 0.9163 P56 1.8581 1.1359 P91 2.0333 1.1842
P24 1.9237 0.3961 P57 1.0598 0.5921 P92 2.0475 0.9889
P25 2.1493 1.3792 P58 0.6570 0.3988 P93 2.6645 1.2691
P27 1.7098 1.1518 P59 4.3889 0.6801 P94 1.1438 0.5719
P28 3.0820 1.2259 P60 1.8581 0.7759 P95 2.0054 0.9552
P29 0.9163 0.7442 P61 1.3792 0.5680 P97 2.9564 0.9291
P30 1.9370 0.4158 P62 5.3290 3.4915 P98 3.3032 0.5299
P31 2.0617 1.1924 P64 0.6801 0.4944 P99 2.5559 0.7239
P32 1.5198 1.1679 P65 2.8360 0.2820 P100 6.5154 0.8258
P33 0.4678 0.2489 P66 1.5410 0.7239 P102 3.0607 0.1490
P34 0.5759 0.3448 P67 1.3048 0.4425 P104 2.0054 0.8201
P35 1.7098 0.7494 P68 3.3960 0.9685 P105 1.2780 0.7813
P36 3.9010 0.8729 P69 1.1518 0.7494
P37 1.7948 0.8032 P70 1.8453 0.2064
정상인의 프로히비틴-1 및 프로히비틴-2의 발현양
Index PHB-1 PHB-2 Index PHB-1 PHB-2 Index PHB-1 PHB-2
N1 2.0475 0.3696 N19 1.3985 0.1861 N37 6.7452 0.0301
N2 2.1944 0.4518 N20 0.9163 0.1202 N38 3.4197 0.0475
N3 1.9641 0.3852 N21 2.2561 0.1654 N39 1.9641 0.0334
N4 2.0905 0.4613 N22 2.6461 0.2405 N40 0.5680 0.1532
N5 1.0167 0.1400 N23 2.3519 0.1631 N41 0.6258 0.1011
N6 0.4613 0.3044 N24 1.5093 0.1861 N42 5.9954 0.0044
N7 1.3697 0.4275 N25 4.3285 0.1362 N43 2.5208 0.0188
N8 0.9355 0.1609 N26 5.1474 0.2152 N44 5.7114 0.0185
N9 2.1051 0.2455 N27 1.9777 0.1848 N45 6.1214 0.1501
N10 1.9237 0.1430 N28 2.0054 0.3521 N46 4.7696 0.1099
N11 2.6645 0.2323 N29 1.9370 0.4245 N47 4.7696 0.1069
N12 5.2556 0.4100 N30 0.3086 0.0970 N48 4.3586 0.1069
N13 1.2430 0.2650 N31 0.3773 0.1228 N49 5.7912 0.0265
N14 0.7494 0.1797 N32 0.3570 0.1253 N50 2.1344 0.0041
N15 0.7289 0.2801 N33 0.7652 0.2650 N51 4.2101 0.0331
N16 2.4861 0.1712 N34 0.6258 0.1522 N52 2.4181 0.0397
N17 1.5198 0.1106 N35 0.7340 0.1953
N18 1.4680 0.2388 N36 0.7652 0.1620
상기 표 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따르면, 상기 프로히비틴-2의 값만을 가지고 환자와 정상을 구분할 수 있다. 좀 더 상세하게는, 도 1과 도 2에서 확인된 바와 같이, '프로히비틴-1은 환자와 정상 사이에 뚜렷한 차별성을 보이지 않으나, 프로히비틴-2는 정상군보다는 환자군에서 더 높게 발현됨'을 관찰할 수 있다.
따라서, 프로히비틴-2의 경계값을 기준으로 '경계값보다 높으면 환자, 낮으면 정상'으로 진단할 수 있다.
실시예 2: 측정값 분석 및 진단
(1) 프로히비틴-2 발현양을 이용한 백혈병 진단
상기 표 2와 표 3에 나타낸 프로히비틴-1 및 프로히비틴-2의 발현양에 따라 '환자'와 '정상'을 명확하게 구분하기 위해, 측정값을 하기 수학식 4로 분석하였다.
도 3a에 앞서 표 2 및 3에서 확인된 프로히비틴-2의 발현양만을 나타낸 후, 단일 값을 한 축에 표시할 경우에 발생되는 중첩으로 인한 관찰의 불편함을 제거하기 위하여 편의상 환자군은 수직축의 1 선상에, 정상군은 수직축의 0.5 선상에 표시하였고, 도 3b에 정상군과 환자군의 프로히비틴-2의 값이 중첩되는 부분만을 확대하여 나타낸 결과, 점선으로 표시된 영역이 중첩되는 구간으로 확인되었다(0.14 ~ 0.47).
이렇게 중첩된 부분들 중에서, 도 3b의 세 개의 수직선(0.2, 0.315, 0.435)들은 경계값의 사례들로, 만약 중간의 수직선(0.315)을 정상과 환자의 경계선으로 선택할 경우, 표 2 및 표 3의 시료들에 있어 8명의 환자가 정상으로 진단되고 8명의 정상이 환자로 진단되게 된다. 이러한 진단방법은 다음 수식 1에 의해 정의될 수 있다.
[수학식 1]
Figure 112016017815632-pat00019
상기 수학식 1에서,
상기 T는 정상군과 환자군의 프로히비틴-2에 대한 발현양의 경계값이고,
상기 x 2는 프로히비틴-2의 발현양이며,
상기 Y가 양수이면 '정상'으로, 음수이면 '환자'로 진단한다.
즉, 상기 수학식 1에 의한 진단방법에 T=0.315 값을 적용할 경우, 표 2 및 표 3의 시료들에 대한 진단 결과는 하기 표 4에 나타난 바와 같은 진단 정확도를 얻을 수 있다.
소속군 진단 환자 정상 합계
환자 86 (91.5%) 8 (8.5%) 94 (100%)
정상 8 (15.4%) 44 (84.6%) 52(100%)
(2) 프로히비틴-1(PHB1)의 발현양과 프로히비틴-2(PHB2)의 발현양을 이용한 백혈병 진단-1
또한 본 발명은 상기 표 2 및 표 3의 프로히비틴-1(PHB1)의 발현양과 프로히비틴-2(PHB2)의 발현양을 조합하여 진단하는 방법을 도 4에 도식된 바와 같이 수평축을 프로히비틴-1으로 하고 수직축을 프로히비틴-2로 하여 2차원 평면상에 좌표로 나타내었을 때, 환자군과 정상군을 구분하는 경계선의 상단에 위치하면 '환자'로 하단에 위치하면 '정상'으로 진단하였는데, 이는 하기 수학식 2를 통해 나타낼 수 있다.
[수학식 2]
Figure 112016017815632-pat00020
(상기 수학식 2에서,
상기 x 1은 프로히비틴-1(PHB1) 발현양이고,
상기 x 2는 프로히비틴-2(PHB2) 발현양이며,
상기 Y가 '양(Positive)'의 값을 가지면, '정상'으로 판정하고, '음(Negative)' 값을 가지면, '환자'로 판정한다).
수학식 2에 의한 진단방법에 따르면, 상기 표 2 및 표 3의 시료들에 대한 진단 결과는 다음 표 5에 나타난 바와 같은 진단 정확도를 얻을 수 있다.
진단
소속 군		 환자 정상 합계
환자 88 (93.6%) 6 (6.4%) 94 (100%)
정상 12 (23.1%) 40 (76.9%) 52 (100%)
(3) 프로히비틴-1(PHB1)의 발현양과 프로히비틴-2(PHB2)의 발현양을 이용한 백혈병 진단-2
또한 본 발명은 상기 표 2 및 표 3의 프로히비틴-1(PHB1)의 발현양과 프로히비틴-2(PHB2)의 발현양을 조합하여 비선형 경계선에 의한 진단방법에 적용하였다.
하기 도 5에 표시된 바와 같은 비선형 경계선을 적용할 경우 하기 수학식 3 및 수학식 4에 의해 표 2 및 표 3의 시료들에 대해 표 6과 같은 진단 정확도를 얻을 수 있다.
[수학식 3]
Figure 112016017815632-pat00021
상기 수학식 3에 있어서,
상기 g는 함수로서, 하기 수학식 4로 정의되고,
상기 Y가 '양(Positive)'의 값을 가지면 '정상'으로 판정하고, '음(Negative)' 값을 가지면, '환자'로 판정한다.
[수학식 4]
Figure 112016017815632-pat00022
진단
소속 군		 환자 정상 합계
환자 90 (95.7%) 4 (4.3%) 94 (100%)
정상 4 (7.7%) 48 (92.3%) 52 (100%)
<110> Chonnam National University Dongshin University <120> Kit for diagnosis of leukemia and diagnostic method targeting prohibitin gene <130> 15P11046 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prohibitin-1 FORWARD PRIMER <400> 1 ggaggcgtgg tgaactctg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prohibitin-1 BACKWARD PRIMER <400> 2 ctggcacatt acgtggtcga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prohibitin-2 FORWARD PRIMER <400> 3 cttggttcca gtaccccatt 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prohibitin-2 BACKWARD PRIMER <400> 4 cgagacaaca ctcgcaggg 19

Claims (9)

  1. 프로히비틴-1 유전자 증폭용 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머; 및
    프로히비틴-2 유전자 증폭용 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머를 포함하는 백혈병 진단용 키트.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 백혈병 진단용 키트는 검체에서 프로히비틴-1 유전자 발현양과 프로히비틴-2 유전자 발현양을 측정하여 비교하는 것인 백혈병 진단용 키트.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 백혈병 진단은 하기 수학식 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 수학식에 의해 결정되는 것인 백혈병 진단용 키트:
    [수학식 1]
    Figure 112017082586483-pat00023

    (상기 수학식 1에서,
    상기 T는 정상군과 환자군의 프로히비틴-2에 대한 발현양의 경계값이고,
    상기 x 2는 프로히비틴-2의 발현양이며,
    상기 Y가 양수이면 '정상'으로, 음수이면 '환자'로 진단한다)
    [수학식 2]
    Figure 112017082586483-pat00024

    (상기 수학식 2에서,
    상기 x 1는 프로히비틴-1(PHB1) 발현양이고,
    상기 x 2는 프로히비틴-2(PHB2) 발현양이며,
    상기 Y가 '양(Positive)'의 값을 가지면, '정상'으로 판정하고, '음(Negative)' 값을 가지면, '환자'로 판정한다)
    [수학식 3]
    Figure 112017082586483-pat00025

    (상기 수학식 3에 있어서,
    상기 x 1는 프로히비틴-1(PHB1) 발현양이고,
    상기 x 2는 프로히비틴-2(PHB2) 발현양이며,
    상기 g는 함수로서, 하기 수학식 4로 정의되고,
    상기 Y가 '양(Positive)'의 값을 가지면 '정상'으로 판정하고, '음(Negative)' 값을 가지면, '환자'로 판정한다)
    [수학식 4]
    Figure 112017082586483-pat00026
    .
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 백혈병 진단용 키트는 프로히비틴-1 유전자와 프로히비틴-2 유전자의 mRNA를 RT-PCR을 수행하기 위한 것인 백혈병 진단용 키트.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 백혈병 진단용 키트는 PCR 반응용 시약을 더 포함하는 것인 백혈병 진단용 키트.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 백혈병 진단용 키트는 RNA 추출용 시약을 더 포함하는 것인 백혈병 진단용 키트.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 백혈병은 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 또는 만성 림프구성 백혈병인 백혈병 진단용 키트.
  8. 삭제
  9. 삭제
KR1020160021320A 2016-02-23 2016-02-23 프로히비틴 유전자 타깃 백혈병 진단용 키트 및 이를 이용한 진단 방법 KR101845957B1 (ko)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160021320A KR101845957B1 (ko) 2016-02-23 2016-02-23 프로히비틴 유전자 타깃 백혈병 진단용 키트 및 이를 이용한 진단 방법
US16/079,432 US11339421B2 (en) 2016-02-23 2017-02-21 Leukemia diagnostic kit targeting prohibitin gene and diagnostic method using same
PCT/KR2017/001867 WO2017146432A1 (ko) 2016-02-23 2017-02-21 프로히비틴 유전자 타깃 백혈병 진단용 키트 및 이를 이용한 진단 방법
EP17756770.8A EP3421611B1 (en) 2016-02-23 2017-02-21 Acute myelogenous leukemia diagnostic method targeting prohibitin gene

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160021320A KR101845957B1 (ko) 2016-02-23 2016-02-23 프로히비틴 유전자 타깃 백혈병 진단용 키트 및 이를 이용한 진단 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170099218A KR20170099218A (ko) 2017-08-31
KR101845957B1 true KR101845957B1 (ko) 2018-04-05

Family

ID=59685335

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160021320A KR101845957B1 (ko) 2016-02-23 2016-02-23 프로히비틴 유전자 타깃 백혈병 진단용 키트 및 이를 이용한 진단 방법

Country Status (4)

Country Link
US (1) US11339421B2 (ko)
EP (1) EP3421611B1 (ko)
KR (1) KR101845957B1 (ko)
WO (1) WO2017146432A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220120441A (ko) 2021-02-22 2022-08-30 전남대학교산학협력단 백혈병 표적 치료를 위한 프로히비틴 동반 진단용 조성물
WO2022186673A1 (ko) * 2021-03-05 2022-09-09 전남대학교산학협력단 차세대 염기서열분석 기반 표적유전자 rna 염기서열 분석 패널 및 분석알고리즘

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL86724A (en) 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
DE68908054T2 (de) 1988-01-21 1994-03-10 Genentech Inc Verstärkung und nachweis von nukleinsäuresequenzen.
CA1340807C (en) 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
WO1990001069A1 (en) 1988-07-20 1990-02-08 Segev Diagnostics, Inc. Process for amplifying and detecting nucleic acid sequences
BR8907830A (pt) 1988-12-16 1991-10-22 Siska Diagnostics Inc Processo para preparar uma dna de filamento duplo que codifica uma sequencia que corresponde a uma sequencia objetivada de acido nucleico e processo util para deteccao de pelo menos uma sequencia de acido nucleico objetivada especifica
CA2035010C (en) 1990-01-26 1996-12-10 Keith C. Backman Method of amplifying target nucleic acids applicable to both polymerase and ligase chain reactions
CA2483284A1 (en) 2004-11-08 2006-05-08 Institut Pasteur Method of diagnosis/prognosis of human chronic lymphocytic leukemia comprising the profiling of lpl/adam genes
KR20140056472A (ko) 2012-10-26 2014-05-12 전남대학교산학협력단 백혈병에 대한 바이오마커 및 이를 이용한 백혈병 진단

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220120441A (ko) 2021-02-22 2022-08-30 전남대학교산학협력단 백혈병 표적 치료를 위한 프로히비틴 동반 진단용 조성물
WO2022186673A1 (ko) * 2021-03-05 2022-09-09 전남대학교산학협력단 차세대 염기서열분석 기반 표적유전자 rna 염기서열 분석 패널 및 분석알고리즘

Also Published As

Publication number Publication date
WO2017146432A1 (ko) 2017-08-31
US20190048396A1 (en) 2019-02-14
EP3421611A1 (en) 2019-01-02
EP3421611A4 (en) 2019-07-10
KR20170099218A (ko) 2017-08-31
EP3421611B1 (en) 2023-11-29
US11339421B2 (en) 2022-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7384459B2 (ja) ヌクレアーゼ協同ｐｃｒ原理に基づいて低存在比のｄｎａ突然変異を濃縮する検出技術システムおよび使用
JP5789605B2 (ja) 染色体異数性の検出方法
DK3260555T3 (en) Hitherto UNKNOWN PROTOCOL FOR PREPARING SEQUENCE LIBRARIES
EP0655090B1 (en) Detection of gene sequences in biological fluids
JP5456950B2 (ja) 短いタンデム反復遺伝子座の多重増幅
EP2010676B1 (en) Method and kit for molecular chromosomal quantification
EP2698436A1 (en) Colorectal cancer markers
CN107849606A (zh) 提高下一代测序灵敏度的方法
WO2012118802A9 (en) Kit and method for sequencing a target dna in a mixed population
CN112280848A (zh) 一种人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法及试剂盒
CN107022619A (zh) Kras基因突变检测引物探针及其试剂盒
Fan Molecular counting: from noninvasive prenatal diagnostics to whole-genome haplotyping
KR101845957B1 (ko) 프로히비틴 유전자 타깃 백혈병 진단용 키트 및 이를 이용한 진단 방법
CN107513577A (zh) 一种高效检测egfrt790m突变体的方法以及用于检测的探针和试剂盒
CN105734136B (zh) 一种检测人braf基因突变的探针法及检测试剂盒
JP5239853B2 (ja) 変異遺伝子の検出方法
CN110846408A (zh) 用于检测ttn基因突变的引物组合及其应用
TWI780315B (zh) 量化標的基因的突變型等位基因負擔的方法
CN105018490A (zh) 用于检测人类mthfr基因多态性的引物对、探针及试剂盒
EA013373B1 (ru) Определение нуклеиновой кислоты
CN115948532A (zh) 基于数字pcr技术的sma检测试剂盒
CN111593115B (zh) 用于β-地中海贫血基因突变多重实时荧光PCR检测的引物和探针组合及试剂盒
CN106222264A (zh) 琐核酸探针荧光定量pcr检测试剂盒及其专用引物、探针和应用
CN111334592A (zh) 一种用于检测幽门螺杆菌耐药基因的核酸组合物及其试剂盒和应用
CN113728114A (zh) 用于检测样本中的核酸的数位聚合酶连锁反应方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right