KR20230002017A - 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법, 이로부터 제조된 코로나 바이러스 진단 키트 및 이를 사용하여 코로나 바이러스를 진단하는 방법 - Google Patents
코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법, 이로부터 제조된 코로나 바이러스 진단 키트 및 이를 사용하여 코로나 바이러스를 진단하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
서열번호 1 및 서열번호 2의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 및 서열번호 7 및 서열 번호 8의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트; 및 서열번호 9의 염기 서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 10의 염기 서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 11의 염기 서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 12의 염기 서열로 이루어지는 프로브를 혼합하여 1액형의 프라이머/프로브 혼합물을 제조하는 단계를 포함하는 것인, 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법, 이를 사용하여 제조된 코로나 바이러스 진단 키트 및 이를 사용하여 코로나 바이러스를 진단하는 방법이 제공된다.
Description
본 발명은 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법, 이로부터 제조된 코로나 바이러스 진단 키트 및 이를 사용하여 코로나 바이러스를 진단하는 방법에 관한 것이다.
최근 코로나 바이러스의 유행으로 인하여 확진자 및 사망자가 폭증하고 있는 상태에 있다. 코로나 바이러스 감염증-19(Coronavirus Disease-19; COVID-19)를 유발하는 코로나 바이러스(SARS-CoV-2; Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2)는 접촉자 간에 전파 속도가 매우 빠를 뿐만 아니라 현재 유효한 치료제나 백신도 없는 상태이다. 따라서 빠른 시일 내에 코로나 바이러스에 걸린 사람들을 구별해내어 추가적인 감염 확산을 막는 방법 밖에는 없는 실정이다.
이를 위하여, 실시간 PCR(real-time polymerase chain reaction; 실시간 중합 효소 연쇄 반응)을 이용한 코로나 바이러스의 진단 키트가 사용되고 있다. 실시간 PCR을 이용한 진단 키트는 채취한 시료 중 바이러스의 RNA를 추출한 다음 추출한 바이러스의 RNA를 역전사 반응시켜 특정 유전자만을 증폭시켜 확인하는 방법에 기초한다.
바이러스의 진단 신뢰성을 높이기 위해서는 바이러스의 RNA 중 특정 부위를 증폭할 목적으로 타깃하는 복수 개의 프라이머 쌍과 이에 맞는 프로브가 필요하다. 통상적으로 진단 키트는 각각의 타깃 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍과 이에 맞는 프로브를 별개의 용기에 각각 넣은 다음 타깃 바이러스를 진단할 때 각각 사용하였다. 그런데, 이러한 경우 사용자는 복수 개의 용기를 동시에 다룰 수 밖에 없어 사용상 어려움이 있었다. 특히, 바이러스 진단 키트의 경우 검체 사용량이 많고 실험 과정상에서 오염이 빈번히 발생할 수 밖에 없어 이러한 어려움은 더 커질 수 있다.
그렇다고 무작정 복수 개의 프라이머 쌍과 프로브를 혼합할 경우 바이러스 진단시 분석 신뢰성이 떨어질 수 있다는 문제점이 있다. 당업자에게 알려진 바와 같이 바이러스 RNA는 수 개의 염기 서열로 이루어진만큼 해당 염기 서열 중에서 어느 부위를 특이하게 증폭하느냐에 따라 검사 결과가 달라질 수 있다. 또한, 바이러스 RNA의 증폭 부위에 따라서는 프라이머들 간에 간섭이 일어날 수도 있어 바이러스 진단시 신뢰성에 문제가 생길 수 있다.
본 발명의 목적은 사용자로 하여금 코로나 바이러스를 편리하게 검출할 수 있게 하는 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 복수 개의 프라이머 쌍과 프로브를 포함하더라도 코로나 바이러스의 분석 신뢰성이 높은 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 관점은 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법이다.
코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 및 서열번호 7 및 서열 번호 8의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트; 및 서열번호 9의 염기 서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 10의 염기 서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 11의 염기 서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 12의 염기 서열로 이루어지는 프로브를 혼합하여 1액형의 프라이머/프로브 혼합물을 제조하는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 방법은 코로나 바이러스의 RdRp gene이 포함된 플라스미드, 코로나 바이러스의 N gene이 포함된 플라스미드, 코로나 바이러스의 E gene이 포함된 플라스미드, 인간 RNase P gene이 포함된 플라스미드를 포함하는 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 1액형의 프라이머/프로브 혼합물은 상기 플라스미드를 포함하는 조성물 대비 별개 용기에서 제조될 수 있다.
상기 방법에 의해 제조된 코로나 바이러스 진단 키트는 실시간 PCR에 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 관점은 코로나 바이러스 진단 키트이다.
코로나 바이러스 진단 키트는 본 발명의 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법에 의해 제조된다.
본 발명의 또 다른 관점은 코로나 바이러스 진단 방법이다.
코로나 바이러스 진단 방법은 본 발명의 코로나 바이러스 진단 키트를 사용하는 단계를 포함한다.
본 발명은 사용자로 하여금 코로나 바이러스를 편리하게 검출할 수 있게 하는 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법을 제공하였다.
본 발명은 복수 개의 프라이머 쌍과 프로브를 포함하더라도 코로나 바이러스의 분석 신뢰성이 높은 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법을 제공하였다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
첨부한 실시예에 의해 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 또한, 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 측정자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 다른 용어로 사용될 수 있다. 그러므로 그 정의는 특허청구범위를 포함한 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 결정되어야 한다.
본 발명은 사용자로 하여금 코로나 바이러스를 편리하게 검출할 수 있도록 하였다. 이를 위해, 본 발명 일 실시예의 코로나 바이러스의 진단 키트의 제조 방법은 코로나 바이러스의 감염 여부를 확인할 수 있도록 하기 위하여, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 및 서열번호 7 및 서열 번호 8의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트; 및 서열번호 9의 염기 서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 10의 염기 서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 11의 염기 서열로 이루어지는 프로브 및 서열번호 12의 염기 서열로 이루어지는 프로브를 혼합하여 1 액형의 프라이머/프로브 혼합물을 제조하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "진단"은 병리 상태를 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 기존의 다양한 코로나 바이러스에 특이적인 유전자의 발현 유무를 확인하여 코로나 바이러스에 의해 야기되는 질병의 발생 여부 및 발병 후 항바이러스 약제 치료 과정에서의 예후를 확인하는 것이다.
본 명세서에서 용어 "프라이머"는 짧은 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형과 염기쌍과 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충 용액 및 온도에서 중합 반응을 위한 시약(DNA 중합 효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4개 종류의 dNTP의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에 의하면 상기 프라이머는 20 뉴클레오타이드 내외의 염기 서열을 가지는 각각의 정방향 및 역방향의 핵산으로 구성되는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 용어 "코로나 바이러스"는 신종 코로나 바이러스(SARS-CoV-2)를 의미할 수 있다.
본 발명에서는 코로나 바이러스를 검출하는데 필요한 프라이머 쌍과 프로브를 독립적으로 별개의 용기에 포함시키는 대신에, 코로나 바이러스의 전장 염기 서열 중에서 특이적인 부위만을 중합 효소 연쇄 반응을 통해 증폭시키는 특정 조합의 프라이머 쌍과 프로브를 선택하고 이를 1 액형으로 혼합하여 제조하였다. 본 명세서에서 "1액형"은 프라이머와 프로브를 하나의 용기에 함유하고 있음을 나타낸다.
프라이머 쌍 및/또는 프로브를 별개 용기에 담을 경우 오염이 생길 가능성이 높고 프라이머 쌍 및/또는 프로브의 개수만큼 용기가 더 필요하다는 문제점이 있다. 그렇다고 무작정 코로나 바이러스의 전장 염기 서열 중에서 특이적인 부위를 인식하는 프라이머 쌍과 프로브를 가져와 혼합한다고 하더라도 코로나 바이러스의 유전자 확인이 어렵거나 분석적 특이도, 분석적 민감도, 재현성, 반복성 및 간섭성에서 문제가 발생될 수 있다. 반면에, 본 발명에서는 하기에서 설명되는 특정 서열의 조합으로 프라이머 쌍 및 프로브를 선택하고 이를 1 액형으로 프라이머와 프로브를 모두 포함하는 하나의 혼합물로 혼합함으로써 목적으로 하는 코로나 바이러스의 유전자 확인시 분석적 특이도, 분석적 민감도, 재현성, 반복성 및 간섭성에서 문제도 발생하지 않도록 하였다.
구체적으로, 본 발명에서는 코로나 바이러스를 다른 종류의 바이러스와 구별시킬 수 있는 유전자로서, 코로나 바이러스의 RNA-dependent RNA polymerase 유전자(RdRp gene), 코로나 바이러스의 핵 단백질 유전자(N gene), 코로나 바이러스의 외피 단백질 유전(E gene) 등을 사용하였다.
보다 구체적으로, 본 발명에서는 코로나 바이러스의 RdRp gene을 증폭하는 정방향 핵산(서열번호 1), 코로나 바이러스의 RdRp gene을 증폭하는 역방향 핵산(서열번호 2)을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명에서는 코로나 바이러스의 N gene을 증폭하는 정방향 핵산(서열번호 3), 코로나 바이러스의 N gene을 증폭하는 역방향 핵산(서열번호 4)을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명에서는 코로나 바이러스의 E gene을 증폭하는 정방향 핵산(서열번호 5), 코로나 바이러스의 E gene을 증폭하는 역방향 핵산(서열번호 6)을 포함한다.
한편, 본 발명에서는 코로나 바이러스의 유전자 확인 시 RNA 추출 과정의 유효성에 대한 판단 기준을 제공하고, 핵산 추출 및 증폭 과정 상의 오류를 확인하기 위하여, 인터널 콘트롤 프라이머(internal control primer)로서 인간 리보핵산 가수분해 효소 유전자(RNase P gene)을 증폭하는 정방향 핵산(서열번호 7), 인간 RNase P gene을 증폭하는 역방향 핵산(서열번호 8)을 추가로 포함한다. 이들 서열번호 7, 서열번호 8은 상기 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머 쌍, 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머 쌍, 서열번호 5와 서열번호 6의 프라이머 쌍과 1액형으로 조합시 코로나 바이러스의 유전자 확인시 분석적 특이도, 분석적 민감도, 재현성, 반복성 및 간섭성에서 문제도 발생하지 않도록 할 수 있다.
프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본적인 성질을 변화시키지 않는 범위 내에서 추가적인 특징을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는 효소, 방사성 동위원소, 형광성 분자, 화학 그룹 등이 될 수 있다.
본 발명에서는 코로나 바이러스의 특이적인 유전자를 검출할 수 있도록 프로브를 포함한다. 본 발명자는 실시간 PCR을 수행하여 그 증폭 산물을 검출하는 경우 그 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링할 수 있으므로 DNA 및 RNA의 정확한 정량이 가능하고, 전기 영동이 필요없어 신속하고 간편하게 해석할 수 있으며 오염의 위험이 적고, 코로나 바이러스의 유전자 확인 시 상술한 서열번호 1-2의 염기 서열, 서열번호 3-4의 염기 서열, 서열번호 5-6의 염기 서열, 및 서열번호 7-8의 염기 서열과 혼합하더라도 분석적 특이도, 분석적 민감도, 재현성, 반복성 및 간섭성에서 문제가 발생하지 않도록 하였다.
본 명세서에서 용어 "프로브"는 상보적인 염기 서열과 특이적 결합을 이룰 수 있으며, 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 DNA 또는 RNA 등의 핵산 단편을 의미한다. 프로브는 라벨링되어 있어서 특정 염기 서열의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단일쇄(single stranded) DNA 프로브, 이중쇄(double stranded) DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 또한, 실시간 PCR을 수행하기 위해서는 형광 표식 프로브를 이용할 수 있다. 보다 구체적으로 TaqMan 프로브를 이용하는 경우 5' 말단은 형광 물질로 수식되고 3' 말단은 소거(quencher) 물질로 수식된 올리고뉴클레오타이드를 PCR 반응액에 첨가한다.
일 구체예에서, 형광 물질은 FAM, JOE, Texas Red, Cy5, Cal Red 610, VIC, Quaser 670 등이 될 수 있지만, 특별히 이에 제한되지 않는다.
일 구체예에서, 소거 물질은 BHQ(Black hole quencher), SFCQ(SFC Quencher) 등이 될 수 있지만, 특별히 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 본 발명에서는 코로나 바이러스의 RdRp gene을 검출하는 프로브(서열번호 9), 코로나 바이러스의 N gene을 검출하는 프로브(서열번호 10), 코로나 바이러스의 E gene을 검출하는 프로브(서열번호 11) 및 인간 RNase P gene을 검출하는 프로브(서열번호 12)를 포함한다.
본 발명의 프라이머 및/또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용해서 화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 핵산 서열은 당해 분야에서 공지된 많은 수단을 이용해서 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 동족체로의 치환 등을 들 수 있다.
상술 프라이머/프로브 혼합물은 프라이머, 프로브의 보관 및 유지를 위하여 당업자에게 통상적으로 사용되는 완충액(예를 들면 TE-buffer)을 더 포함할 수 있다.
상술 프라이머, 프로브는 각각 상술 혼합물 내에서 1㎕ 당 50pmol 내지 150pmol로 포함될 수 있지만, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상술 프라이머/프로브 혼합물은 튜브 또는 다른 적절한 앰플 등을 포함하는 용기 내에 담겨 보관 및 저장될 수 있다.
본 발명의 방법은 실시간 PCR을 수행하기 위한 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 조성물은 상술한 프라이머/프로브의 혼합물 대비 별개의 용기에서 보관될 수 있다.
상기 조성물은 코로나 바이러스의 유전자인 RNA로부터 상보적인 cDNA (complementary DNA)를 합성하기 위한 역전사 효소 (Reverse Transcriptase), cDNA를 증폭하기 위한 Taq polymerase, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양하게 조절될 수 있음), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs, dATP, dTTP, dGTP, dCTP), RNase 억제제, DEPC-처리된 water 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 코로나 바이러스의 검출시 신뢰도를 높이기 위한 양성 대조군용 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 조성물은 상술한 프라이머/프로브의 혼합물 대비 별개의 용기에서 보관될 수 있다. 상기 조성물은 상술한 실시간 PCR을 수행하기 위한 조성물 대비 별개의 용기에서 보관될 수 있다.
구체적으로, 양성 대조군용 조성물은 코로나 바이러스의 RdRp gene이 포함된 플라스미드, 코로나 바이러스의 N gene이 포함된 플라스미드, 코로나 바이러스의 E gene이 포함된 플라스미드, 인간 RNase P gene이 포함된 플라스미드를 포함할 수 있다. 이들 플라스미드는 각각 코로나 바이러스의 RdRp gene, N gene, E gene, 및 인간 RNase P gene을 가지고 당업자에게 알려진 통상의 방법으로 제조될 수 있다.
상술 양성 대조군용 조성물은 플라스미드의 보관 및 유지를 위하여 당업자에게 통상적으로 사용되는 완충액(예를 들면 TE-buffer)을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 코로나 바이러스의 검출시 신뢰도를 높이기 위한 음성 대조군용 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 조성물은 상술한 프라이머/프로브의 혼합물 대비 별개의 용기에서 보관될 수 있다. 상기 조성물은 상술한 실시간 PCR을 수행하기 위한 조성물, 양성 대조군용 조성물 대비 별개의 용기에서 보관될 수 있다.
상기 음성 대조군용 조성물은 초순수 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예의 코로나 바이러스 진단 키트는 상술 프라이머/프로브의 혼합물을 함유하는 제1 용기를 포함한다.
상기 용기는 튜브 또는 다른 적절한 앰풀 등을 들 수 있다.
코로나 바이러스 진단 키트는 상술한 실시간 PCR을 수행하기 위한 조성물을 함유하는 제2 용기, 상술한 양성 대조군용 조성물을 함유하는 제3 용기, 상술한 음성 대조군용 조성물을 함유하는 제4 용기를 포함할 수 있다.
코로나 바이러스 진단 키트는 환자가 코로나 바이러스로 인한 질환이 발병되었는지 여부를 확인하도록 할 수 있으며, 코로나 바이러스의 진단을 위한 정보를 제공할 수도 있다. 또한, 코로나 바이러스 진단 키트는 분석적 특이도, 분석적 민감도, 재현성, 반복성이 높고 간섭성의 문제점이 없으며 사용자로 하여금 편리하게 코로나 바이러스를 진단하도록 할 수 있다.
본 발명 일 실시예의 코로나 바이러스 진단 방법은 검체 RNA를 본 발명 일 실시예의 코로나 바이러스 진단 키트를 사용해서 진단하는 방법을 포함한다.
보다 구체적으로, 코로나 바이러스 진단 방법은 상기 검체를 사용해서 역선자 반응 및 실시간 PCR 반응을 수핸하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 "검체"는 코로나 바이러스 감염이 의심되는 호흡기관으로부터 추출될 수 있다. 예를 들면 검체는 폐포 세척액(alveolar lavage fluid), 목구멍 면봉 채취에 의한 검체(throat swab), 가래(sputum), 침 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
발명의 실시를 위한 형태
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 본 발명의 바람직한 예시로 제시된 것이며 어떠한 의미로도 이에 의해 본 발명이 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1: 코로나 바이러스 특이적인 프라이머 및 프로브의 제작
실시예 1-1: 코로나 바이러스 특이적인 프라이머 제작
본 발명자들은 코로나 바이러스의 RdRp gene을 증폭하는 서열번호 1, 서열번호 2의 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍, 코로나 바이러스의 N gene을 증폭하는 서열번호 3, 서열번호 4의 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍, 코로나 바이러스의 E gene을 증폭하는 서열번호 5, 서열번호 6의 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍을 통상의 방법을 사용해서 각각 제작하였다. 또한, 인터널 콘트롤 프라이머로서 인간 RNase P gene을 증폭하는 서열번호 7, 서열번호 8의 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍을 통상의 방법을 사용해서 각각 제작하였다.
[표 1]
실시예 1-2: 코로나 바이러스의 특이적인 프로브의 제작
본 발명자들은 코로나 바이러스의 RdRp gene을 검출할 수 있는 서열번호 9의 염기 서열을 가지는 프로브, 코로나 바이러스의 N gene을 검출할 수 있는 서열번호 10의 염기 서열을 가지는 프로브, 코로나 바이러스의 E gene을 검출할 수 있는 서열번호 11의 염기 서열을 가지는 프로브, 인간 RNase P gene을 검출할 수 있는 서열번호 12의 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍을 통상의 방법을 사용해서 각각 제작하였다.
[표 2]
실시예 2: 프라이머/프로브 혼합물 제조
상기 표 1과 표 2에서 제조된 프라이머 쌍과 프로브를 각각 TE buffer 1㎕ 당 100 pmol의 용량으로 50ml 튜브에 넣은 다음 혼합하여 1액형의 프라이머/프로브 혼합물을 제조하였다.
실시예 3: 양성 대조군용 조성물과 음성 대조군용 조성물 제조
실시예 3-1: 유전자 확보
NCBI(Ntional Center for Biotechnology Information) 및 GISAID로부터 코로나 바이러스의 RdRp gene, N gene, E gene, 인간 Rnase P gene의 유전자 정보를 각각 수집하였다. 본 발명에서 사용하고자 하는 프라이머 쌍, 프로브를 고려한 특이적 증폭 구간에 대한 DNA 서열을 확인하여 DNA를 합성하였다.
실시예 3-2: 형질 전환
합성이 완료된 RdRp gene, N gene, E gene, RNase P gene을 포함하는 플라스미드 클론에 TE buffer 50㎕를 첨가하고 1분 동안 볼텍싱하여 클론을 완전히 녹였다. 100㎕ Hit-DH5 alpha Competent cell(RBC)에 합성된 각각의 클론을 2㎕(10ng/㎕) 첨가한 후 가볍게 탭핑(tapping)한 후 얼음 위에서 5분 동안 방치하였다. LB(ampicillin+) 아가 플레이트를 준비한 후 각 클론이 포함된 70㎕의 Competent cell 혼합물을 스프레더를 이용하여 도말하였다. 추가적으로 다른 LB(ampicillin+) 아가 플레이트를 준비한 후 각 클론이 포함된 30㎕의 Competent cell 혼합물을 스프레더를 이용하여 도말하였다. 이들 두개의 아가 플레이트를 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 이들 두 개의 아가 플레이트 중에서 싱글 콜로니가 잘 생성된 콜로니를 선별하고 형질 전환된 콜로니를 다시 한번 선택하여 LB Broth에서 16시간 동안 진탕 배양하였다.
실시예 3-3: 플라스미드 제조
상기 배양한 배양액을 10000g에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 가능한 많이 제거하였다. 250㎕의 Buffer S1(Exprep Plasmid SV mini; GeneAll, Korea)를 첨가한 후 볼텡싱하여 현탁시킨 다음 새로운 1.5ml 튜브에 현탁액을 옮겼다. 250㎕의 Buffer S2(Exprep Plasmid SV mini; GeneAll, Korea)를 첨가하고 4회간 inverting 하였다. 350㎕의 Buffer S3(Exprep Plasmid SV mini; GeneAll, Korea)를 첨가하고 즉시 4~6회간 inverting 하였다. 1300rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 조심스럽게 SV 컬럼에 옮긴 뒤 30초간 원심 분리하였다. SV 컬럼을 제거한 뒤 용액을 버리고 SV 컬럼을 포집 튜브에 다시 장착한다. 700㎕의 Buffer PW(Exprep Plasmid SV mini; GeneAll, Korea)를 첨가 후 30초간 원심분리 후 SV 컬럼을 제거한 뒤 얻은 용액을 버리고 다시 포집 튜브에 장착하였다. 남아있는 수세 버퍼를 제거하기 위해 1분간 원심분리 한 뒤 SV 컬럼를 새로운 1.5ml 튜브에 옮겼다. 50ul의 Buffer EB를 첨가하거나 초순수를 첨가한 뒤 1분간 방치하고 1분간 원심 분리하여 플라스미드를 제조하였다.
실시예 3-4: 양성 대조군용 조성물의 제조
상기 제조된 플라스미드를 각각 TE buffer 1㎕ 당 10 ng의 용량으로 50ml 튜브에 넣은 다음 혼합하여 양성 대조군용 조성물을 제조하였다.
실시예: 3-5: 음성 대조군용 조성물의 제조
초순수를 50ml 튜브에 넣어 음성 대조군용 조성물을 제조하였다.
실시예 4: 코로나 바이러스 진단 키트의 제조
실시예 1에서 제조한 프라이머/프로브 혼합물을 함유하는 제1 용기, 실시예 3-4에서 제조한 양성 대조군용 조성물을 함유하는 제3 용기, 실시예 3-5에서 제조한 음성 대조군용 조성물을 함유하는 제4 용기, 그리고 역전사 효소, dNTP 등을 함유하는 실시간 PCR용 조성물을 함유하는 제2 용기 총 4개의 용기로 구성되는 진단 키트를 제조하였다.
실시예 5: 코로나 바이러스 진단 방법
검체로부터 RNA 추출 키트(QIAamp Viral RNA mini kit, Qiagen, Germany)를 사용해서 RNA를 추출하였다. 실시간 PCR용 조성물 10㎕당 프라이머/프로브 혼합물 5㎕를 혼합하여 RT-PCR Matser mixture를 제조하였다. 상기 제조한 RT-PCR Matser mixture 15㎕를 각각 웰에 분주하고 상기 추출된 RNA 5㎕ 를 상기 웰에 넣고 잘 섞었다. 양성 대조군용 조성물, 음성 대조군용 조성물도 상기 프라이머/프로브 혼합물과 동일한 방식으로 처리하였다.
실시간 PCR 장치에 넣고 반응을 진행하였다. 구체적인 PCR 반응 조건은 하기 표 3과 같다.
[표 3]
*단계에서 Fluorescence scan
양성 대조군용 조성물과 음성 대조군용 조성물을 대상으로 반응시켰을 때 Ct값은 다음 표 4와 같고, 시료의 Ct 값이 각 항목 모두 35 이하인 경우에 양성으로 판정하였다.
[표 4]
실험예 1: 분석적 특이도
실시예 4에서 제조한 코로나 바이러스 진단 키트를 사용해서 하기 표 5의 바이러스(연소구중앙센터(KNRRC) 및 국가 병원체 자원 은행(NCCP)으로부터 입수) 및 를 대상으로 실시간 PCR 반응을 수행하였다. 각 DNA/RNA 농도는 1ng/㎕로 조절하여 3회 반복 실시하였다. 그 결과, 모든 바이러스에 대해 음성 판정이 나왔다. 따라서, 본 발명의 코로나 바이러스 진단 키트는 코로나 바이러스에 대한 분석적 특이성이 우수함을 확인할 수 있다.
[표 5]
실험예 2: 분석적 민감도
입수한 코로나 바이러스의 표적 RNA를 이용하여 민담도 실험을 하였다. 표적 RNA를 다양한 농도로 준비하고, 상기 제조한 코로나 바이러스 진단 키트를 사용해서 실시간 PCR 반응을 진행하였다. 그 결과 CLSI EP17-A에 따른 계산된 분석적 민감도는 코로나 바이러스의 RdRp gene, E gene, N gene 10 카피/반응으로 확인되었다.
실험예 3: 재현성
실시예 4와 동일한 방법으로 코로나 바이러스 진단 키트를 다른 날에 제조하였다. 그런 다음 동일한 농도의 코로나 바이러스의 표적 RNA를 대상으로 동일한 방법으로 PCR 진행하였다. 그 결과 CV 5% 미만으로 재현성이 우수하였다.
실험예 4: 반복성
실시예 4의 진단 키트, 동일한 농도의 코로나 바이러스의 표적 RNA를 대상으로 12일 동안 하루에 2회씩 진단하였다. 모든 진단 결과는 CV 5% 미만으로 반복성이 우수하였다.
실험예 5: 간섭 반응
간섭 물질로 뮤신(mucin), NaCl, 혈액(blood), 호흡기 세포 융합 바이러스 A(respiratory syncytial virus A), 1X PBS를 준비하였다. 목구멍 면봉 채취에 의한 시료에 상술한 각각의 간섭 물질을 첨가하고 그로부터 코로나 바이러스 RNA를 추출하였다. 그 결과, 간섭 물질에 상관 없이 코로나 바이러스를 100% 양성 판정할 수 있었다.
비교예 1:
실시예 1에서 서열번호 1-2의 프라이머 쌍 대신에 서열번호 13(정방향)과 서열번호 14(역방향)(서열번호 13: RdRp-1_F, 서열번호 14: RdRp-1_R)의 프라이머 쌍을 사용한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 방법으로 바이러스 진단 키트를 제조하였다. 제조된 바이러스 진단 키트를 사용해서 상기 실험예 1 내지 실험예 5와 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과, 코로나 바이러스의 RdRp gene의 민감도가 저하되는 문제점이 있었다.
비교예 2:
실시예 1에서 서열번호 3-4의 프라이머 쌍 대신에 서열번호 15(정방향)와 서열번호 16(역방향)(서열번호 15: N-F-1, 서열번호 16: N-R-1)의 프라이머 쌍을 사용한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 방법으로 바이러스 진단 키트를 제조하였다. 제조된 바이러스 진단 키트를 사용해서 상기 실험예 1 내지 실험예 5와 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과, 코로나 바이러스의 N gene의 민감도가 저하되는 문제점이 있었다.
비교예 3:
실시예 1에서 서열번호 5-6의 프라이머 쌍 대신에 서열번호 17(정방향)과 서열번호 18(역방향)(서열번호 17: E-F-1, 서열번호 18: E-R-2)의 프라이머 쌍을 사용한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 방법으로 바이러스 진단 키트를 제조하였다. 제조된 바이러스 진단 키트를 사용해서 상기 실험예 1 내지 실험예 5와 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과, 코로나 바이러스의 E gene의 민감도가 저하되는 문제점이 있었다.
비교예 1 내지 비교예 3에서 사용된 프라이머 쌍의 염기 서열을 하기 표 6에 나타내었다.
[표 6]
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> OSANG HEALTHCARE CO., LTD.
<120> METHOD FOR PREPARING DIAGNOSTIC KIT OF CORONA VIRUS, DIAGNOSTIC
KIT OF CORONA VIRUS PREPARED USING THE SAME AND METHOD OF
DIAGNOSING CORONA VIRUS USING THE SAME
<130> AJP20728/PCT
<160> 18
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B_RdRP_F1 FORWARD PRIMER
<400> 1
gtgaaatggt catgtgtggc gg 22
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B_RdRP_R1 REVERSE PRIMER
<400> 2
caaatgttaa aaacactatt agcata 26
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N_F FORWARD PRIMER
<400> 3
ggggaacttc tcctgctaga at 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N_R REVERSE PRIMER
<400> 4
cagacatttt gctctcaagc tg 22
<210> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B_E_F1 FORWARD PRIMER
<400> 5
acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B_E_R1 REVERSE PRIMER
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atattgcagc agtacgcaca ca 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rnase_F FORWARD PRIMER
<400> 7
agatttggac ctgcgagcg 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rnase_R REVERSE PRIMER
<400> 8
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B_RdRP_P2 PROBE
<400> 9
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<220>
<223> N_P PROBE
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<223> RnaseP_P PROBE
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<220>
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<220>
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<220>
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<400> 17
caggtacgtt aatagttaat agcgt 25
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E-R-2 REVERSE PRIMER
<400> 18
atattgcagc agtacgcaca c 21
Claims (6)
- 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 및 서열번호 7 및 서열 번호 8의 염기 서열로 이루어지는 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트; 및
서열번호 9의 염기 서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 10의 염기 서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 11의 염기 서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 12의 염기 서열로 이루어지는 프로브를 혼합하여 1액형의 프라이머/프로브 혼합물을 제조하는 단계를 포함하는 것인,
코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법은 코로나 바이러스의 RdRp gene이 포함된 플라스미드, 코로나 바이러스의 N gene이 포함된 플라스미드, 코로나 바이러스의 E gene이 포함된 플라스미드, 인간 RNase P gene이 포함된 플라스미드를 포함하는 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 1액형의 프라이머/프로브 혼합물은 상기 플라스미드를 포함하는 조성물 대비 별개 용기에서 제조되는 것인, 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법에 의해 제조된 코로나 바이러스 진단 키트는 실시간 PCR에 사용되는 것인, 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법에 의해 제조된 것인, 코로나 바이러스 진단 키트.
- 제5항의 코로나 바이러스 진단 키트를 사용하여 코로나 바이러스를 진단하는 단계를 포함하는, 코로나 바이러스 진단 방법.
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