JP2007135469A - 核酸増幅方法 - Google Patents

Abstract

【課題】標的となる核酸配列に対する特異性を高めた新規の核酸増幅方法を提供するものである。
【解決手段】核酸増幅方法は、第１配列と、第２配列と、第１配列と第２配列の間にある第３配列を有する標的核酸に対して、第１配列に相補的な第１のプライマーと、第２配列に相補的な第２のプライマーとが結合する第１工程と、第３配列及び所定配列を有する第１増幅二本鎖核酸を合成する第２工程と、第２工程の産物に対してエキソヌクレアーゼ処理をする第３工程と、第１増幅二本鎖核酸を、所定配列付一本鎖核酸に分離する第３工程と、所定配列付一本鎖核酸に対して、所定配列に相補的な第３のプライマーと、第３配列に相補的な第４のプライマーとが結合する第４工程と、第２増幅二本鎖核酸を合成する第５工程とを備える。
【選択図】図１

Description

本発明は、核酸増幅方法に関し、特に、核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法に関する。

従来、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などの核酸増幅方法によって、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）などのウイルス量が定量されてきている。例えば、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した装置を用いて、ＰＣＲでの増幅産物の生成過程をリアルタイムでモニタリングして解析するＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法などによって、ＲＮＡをウイルスゲノムとし、ＲＮＡをＤＮＡに転写する逆転写酵素を持つＲＮＡウイルスの一種であるレトロウイルス（例えば、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）など）のウイルス量が定量されている。

また、宿主細胞内でウイルスのＲＮＡがある程度存在している場合には、宿主細胞内のウイルスＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを増幅するＲＴ−ＰＣＲを行うことによって、ウイルス量の定量が行われている。

しかし、近年、薬物治療によって一時的にＲＮＡを合成しないＨＩＶの存在が確認された。この一時的にＲＮＡを合成しないＨＩＶは、薬物に耐性があることが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。このため、例えば、診断、治療方針の選定、研究などのために、このようなＨＩＶのウイルス量を定量する必要性が高まってきている。

例えば、ＨＩＶなどの宿主細胞内にインテグレートしたウイルスＤＮＡを定量するために、一方のプローブとしてウイルスのＬＴＲに結合可能な核酸配列を用いた、ＰＣＲ法が開発された。

しかし、宿主細胞内において、ウイルスによって逆転写されたＤＮＡと、宿主細胞の染色体にインテグレートされたＤＮＡとを、区別して核酸を増幅することは、非常に困難である。

このため、ウイルスによって逆転写されたがインテグレートされていないＤＮＡと、宿主細胞の染色体にインテグレートされたＤＮＡを区別するため、一方のプライマーとしてウイルスのＬＴＲに結合可能な核酸配列を用い、他方のプライマーとして宿主細胞の染色体中に大量（一細胞あたり約１００万個）にコードされているＡｌｕ配列に結合可能な核酸配列を用いる、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法が開発された。

しかし、この核酸増幅方法であっても、第２段階のＰＣＲでＬＴＲに対するプライマーを使用しているために、インテグレートしていないウイルスのＤＮＡが検出されてしまう（非特許文献３）。このため、この核酸増幅方法による増幅産物を診断や治療方針の選定、研究などに用いるのは困難である。

さらに、検出精度を上昇するための方法の一つとして、所定配列のタグ配列を有するプライマーを用いたＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法が開発された（非特許文献３）。この方法は、一方のプライマーとしてタグ配列を有するプライマーを用いて、第一段階のＰＣＲを行う。このため、第一段階のＰＣＲ産物には、タグ配列を有するプライマーの配列が導入される。第二段階のＰＣＲ時に、タグ付のプライマーに含まれている所定配列に対して相補的なプライマーを使用することによって、第一段階のＰＣＲ産物に特異的に核酸増幅が行われ得る。
Ｃｈｕｎ， Ｔ．−Ｗ．， Ｄ． Ｆｉｎｚｉ， Ｊ． Ｍａｒｇｏｌｉｃｋ， Ｋ． Ｃｈａｄｗｉｃｈ， Ｄ． Ｓｃｈｗａｒｔｚ， ａｎｄ Ｒ． Ｆ． Ｓｉｌｉｃｉａｎｏ． １９９５． Ｆａｔｅ ｏｆ ＨＩＶ−１−ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ： ｒａｔｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｔｏ ｓｔａｂｌｅ ｌａｔｅｎｃｙ． Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １：１２８４−１２９０． Ｃｈｕｎ， Ｔ． Ｗ．， Ｌ． Ｓｔｕｙｖｅｒ， Ｓ． Ｂ． Ｍｉｚｅｌｌ， Ｌ． Ａ． Ｅｈｌｅｒ， Ｊ． Ｍ． Ｍｉｃａｎ， Ｍ． Ｂａｓｅｌｅｒ， Ａ． Ｌ． Ｌｌｏｙｄ， Ｍ． Ａ． Ｎｏｗａｋ， ａｎｄ Ａ． Ｓ． Ｆａｕｃｉ． １９９７． Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＨＩＶ−１ ｌａｔｅｎｔ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ ｄｕｒｉｎｇ ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：１３１９３−１３１９７． Ｂｒｕｓｓｅｌ Ａ， Ｓｏｎｉｇｏ Ｐ． ２００３ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｐｒｏｖｉｒｕｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ７７（１８）：１０１１９−２４．

しかし、上記の核酸増幅方法であっても、第一段階のＰＣＲにおいてＬＴＲを標的とするプライマーから一本鎖ＤＮＡの伸長反応が起こってしまうため、第二段階のＰＣＲにおいて不要な核酸配列が対数的に増幅され得る。このため、上記の核酸増幅方法による増幅産物を用いても、不要な核酸配列が大量に増幅され得るため、正確なウイルス量の定量は困難である。このため、不要な核酸配列が増幅されず、標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法の提供が望まれている。

本発明は、上述したような課題に鑑みてなされたものである。その目的は、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供するものである。

以上のような目的を達成するために、本発明は、以下のようなものを提供する。

（１） 第１配列と、第２配列と、第１配列と第２配列の間にある第３配列を有する標的核酸に対して、所定配列を有し前記標的核酸の前記第１配列に相補的な第１のプライマーと、前記標的核酸の前記第２配列に相補的な第２のプライマーとが結合する第１工程と、前記第１のプライマー又は前記第２のプライマーが結合した前記標的核酸を鋳型にして核酸を伸張し、前記第３配列及び前記所定配列を有する第１増幅二本鎖核酸を合成する第２工程と、前記第２工程の産物に対してエキソヌクレアーゼ処理を行なう第３工程と、前記第１増幅二本鎖核酸を、前記第３配列及び前記所定配列を有する所定配列付一本鎖核酸に分離する第４工程と、前記所定配列付一本鎖核酸に対して、前記所定配列付一本鎖核酸の前記所定配列に相補的な第３のプライマーと、前記所定配列付一本鎖核酸の前記第３配列に相補的な第４のプライマーとが結合する第５工程と、前記第３のプライマー又は前記第４のプライマーが結合した前記所定配列付一本鎖核酸を鋳型にして核酸を伸張し、第２増幅二本鎖核酸を合成する第６工程とを備える核酸増幅方法。

（１）に記載の発明によれば、第１工程において、第１配列と、第２配列と、第１配列と第２配列の間にある第３配列を有する標的核酸に対して、所定配列を有し標的核酸の第１配列に相補的な第１のプライマーと、標的核酸の第２配列に相補的な第２のプライマーとが結合する。さらに第１工程において、第１のプライマーが、第１配列と第３配列を有しかつ第２配列を有しない核酸に対して結合する。第２工程において、第１のプライマー又は第２のプライマーが、結合した核酸を鋳型にして核酸を伸張し、第３配列及び所定配列を有する第１増幅二本鎖核酸を合成する。この第２工程においては所定配列、第１配列、第２配列及び第３配列を有する二本鎖核酸と、所定配列、第１配列及び第３配列を有するが第２配列を有しない一本鎖核酸が合成される。第３工程において、エキソヌクレアーゼ処理を行うと、合成された一本鎖核酸及び一本鎖核酸の状態で存在する未反応のプライマーが選択的に分解され、非特異的増幅を抑えることが出来る。第４工程において、第１増幅二本鎖核酸を、第３配列及び所定配列を有する所定配列一本鎖核酸に分離する。第５工程において、所定配列付一本鎖核酸に対して、所定配列付一本鎖核酸の所定配列に相補的な第３のプライマーと、所定配列付一本鎖核酸の第３配列に相補的な第４のプライマーとが結合する。第６工程において、第３のプライマー又は第４のプライマーが結合した所定配列付一本鎖核酸を鋳型にして核酸を伸張し、第２増幅二本鎖核酸を合成する。このように、第２工程の産物に対して添加されたエキソヌクレアーゼが、非特異的増幅の原因となる一本鎖核酸を選択的に分解することによって、意図しない核酸増幅反応を防止することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。

（２） （１）に記載の核酸増幅方法であって、前記第５工程が、前記第１配列に対して第１のプライマーと競合的に結合する競合核酸を加えて行われることを特徴とする核酸増幅方法。

（２）の発明によれば、（１）の発明の効果に加えて、第５工程において、添加される第１の配列に対して第１のプライマーと競合的に結合する競合核酸が、第１の配列に対して結合するため、第３工程によるエキソヌクレアーゼ処理により分解されず、第４工程までに未反応の第１のプライマーが第１の配列に結合することを阻害する。このように、第５工程において添加された競合核酸が、第１工程から第４工程までにおいて未反応の第１のプライマーの結合を阻害することによって、未反応の第１のプライマーによる意図しない核酸増幅反応を防止することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性をより高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。

（３） （１）又は（２）に記載の核酸増幅方法であって、前記第２工程の後、前記第３工程の前に、前記第２工程で合成した第１増幅二本鎖核酸を第１増幅一本鎖核酸に分離し、分離した前記第１増幅一本鎖核酸に、前記第１のプライマーと、前記第２のプライマーとを結合し、前記第１のプライマー又は前記第２のプライマーが結合した前記第１増幅一本鎖核酸を鋳型にして核酸を伸張し、前記第３配列及び前記所定配列を有する第１増幅二本鎖核酸を合成する核酸増幅工程を少なくとも１回反復することを特徴とする核酸増幅方法。

（３）の発明によれば、（１）又は（２）の発明の効果に加えて、第２工程の後、第３工程の前に、第２工程で合成した第１増幅二本鎖核酸を第１増幅一本鎖核酸に分離し、分離した第１増幅一本鎖核酸に、第１のプライマーと、第２のプライマーとを結合し、第１のプライマー又は第２のプライマーが結合した第１増幅一本鎖核酸を鋳型にして核酸を伸張し、第３配列及び所定配列を有する第１増幅二本鎖核酸を合成する核酸増幅工程を少なくとも１回反復することによって、第１のプライマーと第２のプライマーが使用され、所定配列付一本鎖核酸がさらに増幅される。このため、反応によって、第１のプライマーが使用され、未反応の第１のプライマーが減少するとともに、第４工程以降の増幅の対象である所定配列付一本鎖核酸が増幅され、第３のプライマーや第４のプライマーがより効率よく標的となる核酸配列を増幅することができる。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。

（４） （１）乃至（３）いずれか記載の核酸増幅方法であって、前記第６工程の後に、前記第２増幅二本鎖核酸を増幅標的一本鎖核酸に分離する第７工程を備え、前記第５工程から前記第７工程を少なくとも１回反復することを特徴とする請求項１乃至３いずれか記載の核酸増幅方法。

（４）の発明によれば、（１）乃至（３）いずれか発明の効果に加えて、第５工程から第７工程を少なくとも１回反復することによって、第２増幅二本鎖核酸がさらに増幅される。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。

（５） （１）乃至（４）いずれかに記載の核酸増幅方法において、前記第１配列が、ウイルス由来の核酸配列であることを特徴とする核酸増幅方法。

（５）の発明によれば、例えば、ＨＩＶなどのウイルス由来の核酸配列を標的にして、プライマーを設計している。このため、（１）乃至（４）いずれかの発明の効果に加えて、例えば、宿主細胞にウイルス由来の核酸配列がインテグレートされた場合に、ウイルス由来の核酸配列に第１のプライマーが結合することによって、標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅を行うことが可能となる。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。

（６） （５）に記載の核酸増幅方法において、前記ウイルス由来の核酸配列が、ＬＴＲ配列であることを特徴とする核酸増幅方法。

（６）の発明によれば、例えば、ＨＩＶに含まれているＬＴＲ配列を標的にして、プライマーを設計している。このため、（５）の発明の効果に加えて、例えば、どの部位にウイルス由来の核酸配列がインテグレートされたか不明であっても、ＬＴＲ配列に第１のプライマーが結合することによって、標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅を行うことが可能となる。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。

（７） （５）に記載の核酸増幅方法において、前記ウイルス由来の核酸配列が、Ｇａｇ配列である核酸増幅方法。

（７）の発明によれば、例えば、ＨＩＶに含まれているＧａｇ配列を標的にして、プライマーを設計している。このため、（５）の発明の効果に加えて、例えば、どの部位にウイルス由来の核酸配列がインテグレートされたか不明であっても、Ｇａｇ配列に第１のプライマーが結合することによって、標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅を行うことが可能となる。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。

（８） （１）乃至（７）いずれかに記載の核酸増幅方法において、前記第２の配列が、Ａｌｕ配列である核酸増幅方法。

（８）の発明によれば、例えば、ヒトやサルなどの宿主細胞に数多く含まれているＡｌｕ配列を標的にして、プライマーを設計している。このため、（１）乃至（７）いずれかの発明の効果に加えて、例えば、どの部位にウイルス由来の核酸配列がインテグレートされたか不明であっても、Ａｌｕ配列に第２のプライマーが結合することによって、標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅を行うことが可能となる。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。

（９） （１）乃至（８）のいずれか記載の核酸増幅方法において、前記第６工程が、インターカレーター性蛍光物質を添加して行われる核酸増幅方法。

（９）の発明によれば、（１）乃至（８）のいずれかの発明の効果に加えて、第６工程において、核酸が伸張する際に、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する試薬であるインターカレーター性蛍光物質を添加して行われる。インターカレーター性蛍光物質は、合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発光する。この蛍光強度の検出により、増幅産物の生成量を定量することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性の高い増幅産物の測定方法として利用できる核酸増幅方法を提供することが可能である。

（１０） （１）乃至（８）のいずれか記載の核酸増幅方法において、前記第５工程が、一端に蛍光物質が結合している蛍光部と他端にクエンチャーが結合しているクエンチャー部とを有する標識核酸、及びＲＮａｓｅＨを添加して行われる核酸増幅方法。

（１０）の発明によれば、（１）乃至（８）のいずれかの発明の効果に加えて、第５工程が、一端に蛍光物質が結合している蛍光部と他端にクエンチャーが結合しているクエンチャー部を有する標識核酸、及びＲＮａｓｅＨを添加して行われる。第５工程において、所定配列付一本鎖核酸に標識核酸が結合する。第６工程において、核酸が伸張する際に、ＲＮａｓｅＨが、標識核酸のＲＮＡ部を分解することによって、標識核酸の蛍光部とクエンチャー部が分離する。例えば、励起光の照射を受けることによって、分離した蛍光部が蛍光を発光する。この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量を定量することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性の高い増幅産物の測定方法として利用できる核酸増幅方法を提供することが可能である。

（１１） （１）乃至（８）のいずれか記載の核酸増幅方法において、前記第５工程が、ＴａｑＭａｎプローブを添加して行われる核酸増幅方法。

（１１）の発明によれば、（１）乃至（８）のいずれかの発明の効果に加えて、第４工程が、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）を添加して行われる。第５工程において、所定列付の一本鎖核酸にＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）が特異的に結合する。第５工程において、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制されている。第６工程において、核酸が伸張する際に、所定配列付一本鎖核酸に結合したＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）が分解され、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）の蛍光色素がプローブから遊離する。励起光の照射によって、遊離した蛍光色素が蛍光を発光する。この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量を定量することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性の高い増幅産物の測定方法として利用できる核酸増幅方法を提供することが可能である。

（１２） （２）に記載の核酸増幅方法において、前記競合核酸が、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）であることを特徴とする核酸増幅方法。

（１２）の発明によれば、（２）の発明の効果に加えて、競合核酸がＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）である。第５工程において、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）が、第１の配列に対して第１のプローブ（登録商標）と競合的に結合する。第５工程において、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制されている。第６工程において、核酸が伸張する際に、所定配列付一本鎖核酸に結合したＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）が分解され、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）の蛍光色素がプローブから遊離する。励起光の照射によって、遊離した蛍光色素が蛍光を発光する。この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量を定量することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性の高い増幅産物の測定方法として利用できる核酸増幅方法を提供することが可能である。

（１３） （１）乃至（１２）のいずれか記載の核酸増幅方法を行うためのキット。

（１３）の発明によれば、（１）乃至（１２）のいずれかの核酸増幅方法を行うためのキットによって、（１）乃至（１２）のいずれかの核酸増幅方法を行うことができる。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性の高い増幅産物の測定方法として利用できる核酸増幅方法を行うことができるキットを提供することが可能である。

本発明によれば、第２工程産物に対して添加されたエキソヌクレアーゼが、非特異的増幅の原因となる一本鎖核酸を選択的に分解することによって、意図しない核酸増幅反応を防止することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。

以下に、本発明に好適な実施形態について説明する。

図１は、本発明に係る核酸増幅法を説明する概念図である。図１に示すように、ウイルス由来の核酸がインテグレートされた宿主細胞の核酸配列には、複数のＡｌｕ配列と、ウイルス由来のＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）配列とが含まれている。Ａｌｕ配列と相補的なプライマー及びＬＴＲ配列に相補的なプライマーを用いて第１段階のＰＣＲを複数サイクル行う。次に、第１段階のＰＣＲにより増幅された増幅産物を一部取出し、それを鋳型にし、所望の配列に対するプライマーを用いて、第２段階のＰＣＲを行う（所謂Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法）。

しかし、従来の核酸増幅法を用いると、第１段階のＰＣＲにより増幅された増幅産物には、インテグレーションされているウイルスＤＮＡと、インテグレーションされていないＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）とが含まれている。この第１段階のＰＣＲにより増幅産物を用いて第２段階のＰＣＲを行なうと、インテグレーションされていないＤＮＡも増幅のための鋳型となり得てしまう。

このように、従来の方法においては、第２段階のＰＣＲにおいて、第１段階のプライマーによって、ウイルス由来核酸配列がインテグレートされていない核酸配列も増幅され得るため、感度が低くなるという課題があった。

なお、ここで、Ａｌｕ配列とは、ヒトやサルなどのゲノム中に散在する小型の反復配列であり、ヒトゲノムのマーカーとして、また遺伝子クローニングでの人ＤＮＡ断片のプローブとしても利用される。ＬＴＲ配列とは、レトロウイルスゲノムＤＮＡの両端末で重複している長い末端反復配列の略であり、Ｕ３、Ｒ、Ｕ５の配列からなる。この配列がウイルスＤＮＡの染色体へのランダムな部位への組込みに関与すると考えられている。

本発明に係る核酸増幅法は、第２段階のＰＣＲの前にエキソヌクレアーゼを加える。加えられたエキソヌクレアーゼは、第１段階のＰＣＲ増幅産物内に含まれるインテグレーションされていないウイルスＤＮＡ由来核酸を分解する。これによって、インテグレーションされていないウイルスＤＮＡを鋳型とする核酸増幅を抑えることが可能となる。さらに、第１段階ＰＣＲから混入する未反応プライマーを分解するため、この未反応プライマーを鋳型とする核酸増幅を抑えることが可能となる。このため、意図しない核酸の増幅を抑制し、ウイルス由来の核酸がインテグレートした核酸配列を特異的に増幅することが可能となり得る。

本発明に係る核酸増幅法では、Ｇａｇ配列（第１の配列）に相補的な第１のプライマーとＡｌｕ配列（第２の配列）と相補的な第２のプライマーを用いて第１段階のＰＣＲを１２サイクル行う。このとき、Ｇａｇ配列に相補的な第１のプライマーは、Ｔａｇ配列（所定の配列）を有している。次に、第１段階のＰＣＲにより増幅された増幅産物を一部取出し、それにエキソヌクレアーゼ処理を行なう。エキソヌクレアーゼ処理を行なった増幅産物を鋳型にし、ＬＴＲ配列内のＵ５配列（第３の配列）に対する第３のプライマーとタグ配列に対して相補的な第４のプライマーを用いて、第２段階のＰＣＲを行う。さらに、Ｇａｇ配列に対して競合的に結合する核酸を加えて行なっても良い。

より具体的に本発明に係る核酸増幅法を説明すると、第１配列と、第２配列と、第１配列と第２配列の間にある第３配列を有する標的核酸に対して、タグ配列などの所定配列を有し標的核酸の第１配列に相補的な第１のプライマーと、この標的核酸の第２配列に相補的な第２のプライマーとが結合する第１工程が行われる。次に、第１のプライマー又は第２のプライマーが結合した標的核酸を鋳型にして核酸を伸張し、第３配列及び前記所定配列を有する第１増幅二本鎖核酸を合成する第２工程が行われる。次に、第２工程の産物に対してエキソヌクレアーゼ処理を行なう第３工程が行なわれる。さらに、第１増幅二本鎖核酸を、第３配列及び所定配列を有する所定配列付一本鎖核酸に分離する第４工程が行われる。次に、所定配列付一本鎖核酸に対して、所定配列付一本鎖核酸の所定配列に相補的な第３のプライマーと、所定配列付一本鎖核酸の第３配列に相補的な第４のプライマーとが結合する第５工程が行われる。さらに、第３のプライマー又は第４のプライマーが結合した所定配列付一本鎖核酸を鋳型にして核酸を伸張し、第２増幅二本鎖核酸を合成する第６工程が行われる。

これによって、第１工程において、第１配列と、第２配列と、第１配列と第２配列の間にある第３配列を有する標的核酸に対して、所定配列を有し標的核酸の第１配列に相補的な第１のプライマーと、標的核酸の第２配列に相補的な第２のプライマーとが結合する。さらに第１工程において、第１のプライマーが、第１配列と第３配列を有しかつ第２配列を有しない核酸に対して結合する。第２工程において、第１のプライマー又は第２のプライマーが、結合した核酸を鋳型にして核酸を伸張し、第３配列及び所定配列を有する第１増幅二本鎖核酸を合成する。この第２工程においては所定配列、第１配列、第２配列及び第３配列を有する二本鎖核酸と、所定配列、第１配列及び第３配列を有するが第２配列を有しない一本鎖核酸が合成される。第３工程において、エキソヌクレアーゼ処理を行うと、合成された一本鎖核酸及び一本鎖核酸の状態で存在する未反応のプライマーが選択的に分解され、非特異的増幅を抑えることが出来る。第４工程において、第１増幅二本鎖核酸を、第３配列及び所定配列を有する所定配列一本鎖核酸に分離する。第５工程において、所定配列付一本鎖核酸に対して、所定配列付一本鎖核酸の所定配列に相補的な第３のプライマーと、所定配列付一本鎖核酸の第３配列に相補的な第４のプライマーとが結合する。第６工程において、第３のプライマー又は第４のプライマーが結合した所定配列付一本鎖核酸を鋳型にして核酸を伸張し、第２増幅二本鎖核酸を合成する。このように、第２工程の産物に対して添加されたエキソヌクレアーゼが、非特異的増幅の原因となる一本鎖核酸を選択的に分解することによって、意図しない核酸増幅反応を防止することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。

さらに、本発明に係る増幅方法は、第５工程が、第１配列に対して第１のプライマーと競合的に結合する競合核酸を加えて行われても良い。これによって、第５工程において、添加された第１の配列に対して第１のプライマーと競合的に結合する競合核酸が、第１の配列に対して結合するため、第４工程までに未反応の第１のプライマーが第１の配列に結合することを阻害する。第６工程において、第３のプライマー又は第４のプライマーが結合した所定配列付一本鎖核酸を鋳型にして核酸を伸張し、第２増幅二本鎖核酸を合成する。このように、第５工程において添加された競合核酸が、第１工程から第４工程までにおいて未反応の第１のプライマーの結合を阻害することによって、未反応の第１のプライマーによる意図しない核酸増幅反応を防止することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。ここで競合的に結合するとは、第１配列を有する標的となる核酸に対して結合する部位を持つ第１のプライマーと、第１のプライマーが第１配列と結合する部位と少なくとも一部が重複して結合する部位を持つ非伸張性の競合核酸とが、競合して標的となる核酸の第１配列に結合することを言う。つまり、競合核酸が、標的となる核酸の第１の配列に結合すると第１のプライマーが結合できなくなる。また、競合核酸は、第１のプライマーよりも標的となる核酸に結合しやすいものならば、いかなるものでもよく、例えば、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）やＥＮＡ（登録商標）であっても良い。

さらに、本発明に係る核酸増幅法は、第２工程後、第３の工程の前に、第２工程で合成した第１増幅二本鎖核酸を第１増幅一本鎖核酸に分離し、分離した第１増幅一本鎖核酸に、第１のプライマーと、第２のプライマーとを結合し、第１のプライマー又は第２のプライマーが結合した第１増幅一本鎖核酸を鋳型にして核酸を伸張し、第３配列及び所定配列を有する第１増幅二本鎖核酸を合成する核酸増幅工程を少なくとも１回反復し、より好ましくは、１２回以上反復しても良い。このように、核酸増幅工程を少なくとも１回反復することによって、第１のプライマーと第２のプライマーが使用され、所定配列一本鎖核酸がさらに増幅される。このため、反応によって、第１のプライマーが使用され、未反応の第１のプライマーが減少するとともに、第５工程以降の増幅の対象である所定配列付一本鎖核酸が増幅され、第３のプライマーや第４のプライマーがより効率よく標的となる核酸配列を増幅することができる。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。なお、核酸増幅工程の反復回数は、本実施例において、１回、３回、１２回と例示されているが、本発明は、これに限定されない。第５の工程以降において、核酸を増幅するために十分な核酸を増幅するために必要ないかなる回数であっても良い。

さらに、本発明に係る核酸増幅法は、第６工程後に、増幅標的二本鎖核酸を増幅標的一本鎖核酸に分離する第７工程を備え、第５工程から第７工程を少なくとも１回反復し、より好ましくは１２回以上反復しても良い。第５工程から第７工程を少なくとも１回反復することによって、第２増幅標的二本鎖核酸がさらに増幅される。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。

さらに、本発明に係る核酸増幅法は、第１の配列が、ウイルス由来の核酸配列であっても良い。この場合、例えば、ＨＩＶやなどのレトロウイルス由来の核酸配列を標的にして、プライマーを設計しても良い。このため、例えば、宿主細胞にウイルス由来の核酸配列がインテグレートされた場合に、ウイルス由来の核酸配列に第１のプライマーが結合することによって、標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅を行うことが可能となる。なお、本発明のレトロウイルスの例としては、哺乳類Ｂ型レトロウイルスグループ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｙｐｅ Ｂ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、哺乳類Ｃ型レトロウイルスグループ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｙｐｅ Ｃ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、鳥類Ｃ型レトロウイルスグループ（Ａｖｉａｎ ｔｙｐｅ Ｃ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、鳥類Ｄ型レトロウイルスグループ（Ａｖｉａｎ ｔｙｐｅ Ｄ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、ウシ白血病ウイルス‐ヒトリンパ球向性ウイルス（ＢＬＶ−ＨＴＬＶ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、ＨＩＶなどのレンチウイルス族（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）、スプマウイルス族（Ｓｐｕｍａｖｉｒｕｓ）が含まれる。

さらに、本発明に係る核酸増幅法は、ウイルス由来の核酸配列が、ＬＴＲ配列やＧａｇ配列であっても良い。例えば、ＨＩＶに含まれているＬＴＲ配列やＧａｇ配列を標的にして、プライマーを設計する。このため、例えば、どの部位にウイルス由来の核酸配列がインテグレートされたか不明であっても、ＬＴＲ配列やＧａｇ配列に第１のプライマーが結合することによって、標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅を行うことが可能となる。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。なお、ウイルス由来の核酸配列の例として、ＬＴＲ配列やＧａｇ配列記載されているが、本発明はこれに限定されず、例えば、Ｐｏｌ配列やｅｎｖ配列など他の外皮タンパクをコードする遺伝子や、転写促進に働くｔａｔ配列、ｍ−ＲＮＡの輸送を促進するｒｅｖ配列など、プロウイルスに含まれる他の遺伝子配列であっても良い。

さらに、本発明に係る核酸増幅法は、第２の配列が、Ａｌｕ配列であっても良い。例えば、ヒトやサルなどの宿主細胞に数多く含まれているＡｌｕ配列を標的にして、プライマーを設計すると、どの部位にウイルス由来の核酸配列がインテグレートされたか不明であっても、Ａｌｕ配列に第２のプライマーが結合することによって、標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅を行うことが可能となる。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。

さらに、本発明に係る核酸増幅法を使用して、核酸の量を定量する場合に、第６工程が、インターカレーター性蛍光物質を添加して行われても良い。つまり、第６工程において、核酸が伸張する際に、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する試薬であるインターカレーター性蛍光物質を添加して行われる。インターカレーター性蛍光物質は、合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発光する。この蛍光強度の検出により、増幅産物の生成量を定量することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性の高い増幅産物の測定方法として利用できる核酸増幅方法を提供することが可能である。例えば、インターカレーター性蛍光物質として、タカラバイオ株式会社のインターカレーター（ＳＹＢＲ（Ｒ） Ｇｒｅｅｎ Ｉ（登録商標））やアマシャム バイオサイエンシズ会社のインターカレーター（Ｖｉｓｔｒａ Ｇｒｅｅｎ）などが知られている。

さらに、本発明に係る核酸増幅法を使用して、核酸の量を定量する場合に、第５工程が、蛍光物質（ＦＡＭなど）が結合している蛍光部とクエンチャー（ＴＡＭＲＡなど）が結合しているクエンチャー部とを有する標識核酸、及びＲＮａｓｅＨを添加して行われても良い。つまり、第５工程が、一端に蛍光物質が結合している蛍光部と他端にクエンチャーが結合しているクエンチャー部を有する標識核酸、及びＲＮａｓｅＨを添加して行われる。第５工程において、所定配列付一本鎖核酸に標識核酸が結合する。第６工程において、核酸が伸張する際に、ＲＮａｓｅＨが、標識核酸のＲＮＡ部を分解することによって、標識核酸の蛍光部とクエンチャー部が分離する。例えば、励起光の照射を受けることによって、分離した蛍光部が蛍光を発光する。この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量を定量することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性の高い増幅産物の測定方法として利用できる核酸増幅方法を提供することが可能である。なお、蛍光物質の一例としてＦＡＭを、クエンチャーの一例としてＴＡＭＲＡを記載したが、蛍光物質は、特定の波長によって発光する物質であればどのような物質でもよく。また、クエンチャーは、その蛍光物質からの発光を吸収し、他の波長に変更する物質であればどのような物質でも良い。このような目的で使われる核酸には、Ｔａｑｍａｎプローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブ、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎプローブ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）がある。

さらに、本発明に係る核酸増幅法を使用して、核酸の量を定量する場合に、第５工程が、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）を添加して行われても良い。第５工程が、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）を添加して行われる。第５工程において、所定列付の一本鎖核酸にＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）が特異的に結合する。第５工程において、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制されている。第６工程において、核酸が伸張する際に、所定配列付一本鎖核酸に結合したＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）が分解され、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）の蛍光色素がプローブから遊離する。励起光の照射によって、遊離した蛍光色素が蛍光を発光する。この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量を定量することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性の高い増幅産物の測定方法として利用できる核酸増幅方法を提供することが可能である。Ｔａｑｍａｎ プローブを用いたキットとしては、例えば、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＡｓｓａｙｓやＰｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ＴａｑＭａｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔｓ がある。

さらに、本発明に係る核酸増幅法を使用して、核酸の量を定量する場合に、競合核酸として、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）を使用しても良い。第５工程において、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）が、第１の配列に対して第１のプローブと競合的に結合する。第５工程において、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制されている。第６工程において、核酸が伸張する際に、所定配列付一本鎖核酸に結合したＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）が分解され、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）の蛍光色素がプローブから遊離する。励起光の照射によって、遊離した蛍光色素が蛍光を発光する。この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量を定量することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性の高い増幅産物の測定方法として利用できる核酸増幅方法を提供することが可能である。

以下、本発明に係る核酸増幅法を用いた実験例について図２を用いて説明する。

［実験例］
エキソヌクレアーゼ処理の有無による核酸増殖特異性の違いを調べた。第１段階のＰＣＲでは、ＰＣＲ用試薬としてＡＢＩ社より販売されているＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを使用した。０．６２５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ、２．５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ ９．０）、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ ｄＮＴＰ）、各２．５μｌのプライマー（フォワードプライマー ３μＭ及びリバースプライマー３μＭ）、ゲノムＤＮＡ １００ｎｇを含む溶液を１μｌ、滅菌水を加えて２５μｌの溶液とした。

第１フォワードプライマー（１ｓｔＰＣＲ／Ｆ）は、配列番号１のプライマーを使用した、第１リバースプライマー（１ｓｔＰＣＲ／Ｒ）は、配列番号２の配列のプライマーを使用した。ＰＣＲ反応にはサーマルサイクラー（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ９６００， パーキンエルマー社）を用いた。ＰＣＲ反応条件は、初期変性を９６℃で１０分間行った後、合成反応サイクル（変性９６℃で１分間、アニーリング５８℃で１分間、伸長反応７２℃で５分間）を１２回行い、その後７２℃で５分間置いた。

エキソヌクレアーゼ処理にはＮＥＢ社のエキソヌクレアーゼ Ｉを用いた。１０μｌの第一段階ＰＣＲ産物を新しいチューブに移し、そこにエキソヌクレアーゼ Ｉを１μｌ加えた。３７℃２時間のインキュベーションの後に８０℃３０分、さらに続けて９０℃３０分の条件で処理しエキソヌクレアーゼの不活化を行った。

第２のＰＣＲは、ＰＣＲ用試薬としてＡＢｇｅｎｅ社から販売されているＡＢｓｏｌｕｔｅ ｑＰＣＲ Ｒｏｘ ｍｉｘを使用した。１２．５μｌのｑＰＣＲ ｍｉｘ、各２．５μｌのプライマー・プローブ（フォワードプライマー ３μＭ、リバースプライマー３μＭ、及びプローブ２μＭ）、第１ＰＣＲ反応液２．５μｌ、水を５μｌ加え、２７．５μｌの溶液とした。プライマーとして、第２フォワードプライマー（２ｎｄＰＣＲ／Ｆ）は、配列番号３の配列のプライマーを使用した、第２リバースプライマー（２ｎｄＰＣＲ／Ｒ）は、配列番号４の配列のプライマーを使用した。また測定用のプローブとして、ＡｌｕＬＴＲ ｐｒｏｂｅ１（配列番号５）を使用した。

ＰＣＲ反応にはＡＢＩ ７７００ シークエンス ディテクター システムを用いた。ＰＣＲ反応条件は、初期変性を９６℃で１５分間行った後、合成反応サイクル（変性９６℃で１５秒間、アニーリング及び伸長反応６０℃で１分間）を４５回行った。

図２は、実験の結果を示す説明図である。野生型インテグレースを持つＨＩＶは細胞のゲノムＤＮＡにインテグレーションできるが、変異型インテグレースを持つＨＩＶは細胞のゲノムＤＮＡにインテグレーションできないことが知られている。

図２に示されるように、エキソヌクレアーゼ処理をしない方法では野生型インテグレースを持つＨＩＶを感染させた細胞では３６サイクルで蛍光強度が０．０２を超えている。変異型インテグレースを持つＨＩＶを感染させた細胞では３９サイクルで蛍光強度の値が０．０２を超えている。

変異型インテグレースを持つＨＩＶを感染させた細胞では、インテグレーションに必須な酵素であるインテグレースに変異が入っているため、インテグレーションが起こらないはずである。このため、理論的には、核酸の増幅は起こらないはずである。しかし、実際には、変異型インテグレースを持つＨＩＶを感染させた細胞は、３９サイクルで蛍光強度の値が０．０２を超えている。野生型インテグレースを持つＨＩＶを感染させた細胞の蛍光強度の値が０．０２を超えたサイクル数と変異型インテグレースを持つＨＩＶを感染させた細胞の蛍光強度の値が０．０２を超えたサイクル数とは、３サイクルしか異ならない。ＰＣＲは１回のサイクルで約２倍に核酸を増幅するため、標的となる核酸を多数含む野生型インテグレースを持つＨＩＶを感染させた細胞と、標的となる核酸を含まないはずの変異型インテグレースを持つＨＩＶを感染させた細胞との核酸検出サイクル数が近いため、エキソヌクレアーゼを使わない方法は、あまり特異性が高くない。

一方エキソヌクレアーゼで処理をする方法では野生型インテグレースを持つＨＩＶを感染させた細胞では３６サイクルで蛍光強度が０．０２を超えているが、変異型インテグレースを持つＨＩＶを感染させた細胞ではシグナルが４５サイクルの後にも蛍光強度が０．０２を超えておらず、意図しない核酸の増幅が抑制されていることが示された。

このように、第一段階ＰＣＲの後にエキソヌクレアーゼ処理を行うことによって、インテグレーションをしていないウイルスＤＮＡに由来する非特異的核酸増幅反応と未反応の第１のプライマーによる意図しない核酸増幅反応を防止することが可能である。このため、新規の標的となる核酸配列に対する特異性を高めた核酸増幅方法を提供することが可能である。

本発明に係る核酸増幅法を説明する概念図である。 インテグレーションを起こすウイルスまたは起こさないウイルスを感染させた細胞における、従来法と本発明に係る核酸増幅法の蛍光強度を見た図である。

Claims (13)

1. 第１配列と、第２配列と、第１配列と第２配列の間にある第３配列を有する標的核酸に対して、所定配列を有し前記標的核酸の前記第１配列に相補的な第１のプライマーと、前記標的核酸の前記第２配列に相補的な第２のプライマーとが結合する第１工程と、
   前記第１のプライマー又は前記第２のプライマーが結合した前記標的核酸を鋳型にして核酸を伸張し、前記第３配列及び前記所定配列を有する第１増幅二本鎖核酸を合成する第２工程と、
   前記第２工程の産物に対してエキソヌクレアーゼ処理を行なう第３工程と、
   前記第１増幅二本鎖核酸を、前記第３配列及び前記所定配列を有する所定配列付一本鎖核酸に分離する第４工程と、
   前記所定配列付一本鎖核酸に対して、前記所定配列付一本鎖核酸の前記所定配列に相補的な第３のプライマーと、前記所定配列付一本鎖核酸の前記第３配列に相補的な第４のプライマーとが結合する第５工程と、
   前記第３のプライマー又は前記第４のプライマーが結合した前記所定配列付一本鎖核酸を鋳型にして核酸を伸張し、第２増幅二本鎖核酸を合成する第６工程とを備える核酸増幅方法。
2. 前記第５工程が、前記第１配列に対して第１のプライマーと競合的に結合する競合核酸を加えて行われることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅方法。
3. 前記第２工程の後、前記第３工程の前に、
   前記第２工程で合成した第１増幅二本鎖核酸を第１増幅一本鎖核酸に分離し、
   分離した前記第１増幅一本鎖核酸に、前記第１のプライマーと、前記第２のプライマーとを結合し、
   前記第１のプライマー又は前記第２のプライマーが結合した前記第１増幅一本鎖核酸を鋳型にして核酸を伸張し、前記第３配列及び前記所定配列を有する第１増幅二本鎖核酸を合成する核酸増幅工程を少なくとも１回反復することを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸増幅方法。
4. 前記第６工程の後に、前記第２増幅二本鎖核酸を増幅標的一本鎖核酸に分離する第７工程を備え、
   前記第５工程から前記第７工程を少なくとも１回反復することを特徴とする請求項１乃至３いずれか記載の核酸増幅方法。
5. 前記第１配列が、ウイルス由来の核酸配列であることを特徴とする請求項１乃至４いずれか記載の核酸増幅方法。
6. 前記ウイルス由来の核酸配列が、ＬＴＲ配列であることを特徴とする請求項５に記載の核酸増幅方法。
7. 前記ウイルス由来の核酸配列が、Ｇａｇ配列であることを特徴とする請求項５に記載の核酸増幅方法。
8. 前記第２配列が、Ａｌｕである請求項１乃至７いずれか記載の核酸増幅方法。
9. 前記第６工程が、インターカレーター性蛍光物質を添加して行われる請求項１乃至８のいずれか記載の核酸増幅方法。
10. 前記第５工程が、一端に蛍光物質が結合している蛍光部と他端にクエンチャーが結合しているクエンチャー部とを有する標識核酸、及びＲＮａｓｅＨを添加して行われる請求項１乃至８のいずれか記載の核酸増幅方法。
11. 前記第５工程が、ＴａｑＭａｎプローブを添加して行われる請求項１乃至８のいずれか記載の核酸増幅方法。
12. 前記競合核酸が、ＴａｑＭａｎプローブである請求項２に記載の核酸増幅方法。
13. 請求項１乃至請求項１２のいずれか記載の核酸増幅方法を行うためのキット。
    

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