JP2023516568A - Ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２診断用組成物、キット及びこれを用いたｓａｒｓ－ｃｏｖ－２の診断方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２：Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２）感染の有無を診断するための組成物、該組成物を含むキット及びこれを用いて新型コロナウイルス感染の有無を診断する方法に関する。具体的に、本発明は、新型コロナウイルスに感染された細胞において最も豊富に存在するリーダ（ｌｅａｄｅｒ）配列をターゲットにして特異的に増幅可能な核酸オリゴマーを含む、新型コロナウイルス感染の有無を診断するための組成物、前記組成物を含むキット及びこれを用いて新型コロナウイルス感染の有無を診断する方法に関する。【選択図】図３
Description
本発明は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２：Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２）感染の有無を診断するための組成物、該組成物を含むキット及びこれを用いて新型コロナウイルス感染の有無を診断する方法に関する。具体的に、本発明は、新型コロナウイルスに感染された細胞において最も豊富に存在するリーダ（ｌｅａｄｅｒ）配列をターゲットにして特異的に増幅できる核酸オリゴマーを含む新型コロナウイルス感染の有無を診断するための組成物、該組成物を含むキット及びこれを用いて新型コロナウイルス感染の有無を診断する方法に関する。
コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）は、約２７～３２ｋｂ程度の一本鎖陽方向鎖ＲＮＡゲノム（（＋）ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ ｇｅｎｏｍｅ）で構成されたウイルスであり、人と他の哺乳動物に分布する。コロナウイルスは、複製及び転写過程を経て、ゲノムＲＮＡ（ｇｅｎｏｍｅ－ＲＮＡ）、及び６～８個の３’末端に共通のｍＲＮＡを有するサブゲノムＲＮＡ（ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ）を生産すると知られている（Ｉｍｂｅｒｔ Ｉ ｅｔ ａｌ．；Ａ ｓｅｃｏｎｄ，ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ ＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｉｎ ＳＡＲＳ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ．Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ．２００６，２５：４９３３－４９４２）。
大部分の人にとってコロナウイルス感染は軽い症状で済むが、感染力が高いため、去る２０余年間１０，０００名以上の人々にＳＡＲＳ（重症呼吸器症候群、致死率１０％）コロナウイルス及びＭＥＲＳ（中東呼吸器症候群、致死率３７％）コロナウイルスが感染された（Ｃｈａｏｌｉｎ Ｈｕａｎｇ，Ｙｅｍｉｎｇ Ｗａｎｇ，Ｘｉｎｇｗａｎｇ Ｌｉ，Ｌｉｌｉ Ｒｅｎ，Ｊｉａｎｐｉｎｇ Ｚｈａｏ，Ｙｉ Ｈｕ ｅｔ ａｌ．；Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ２０１９ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｗｕｈａｎ，Ｃｈｉｎａ．Ｌａｎｃｅｔ ２０２０）。
ただし、最近に発見された新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染症は、２０１９年１２月１日に中国で発見（Ｃｈａｏｌｉｎ Ｈｕａｎｇ，Ｙｅｍｉｎｇ Ｗａｎｇ，Ｘｉｎｇｗａｎｇ Ｌｉ，Ｌｉｌｉ Ｒｅｎ，Ｊｉａｎｐｉｎｇ Ｚｈａｏ，Ｙｉ Ｈｕ ｅｔ ａｌ．；Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ２０１９ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｗｕｈａｎ，Ｃｈｉｎａ．Ｌａｎｃｅｔ ２０２０）され、２０１９年１２月１２日に初報告された急性呼吸器症候群であり、発熱と咳、呼吸困難、非定型肺炎などの症状を示す。
２０２０年１月からは中国以外の国にも広範囲に伝播され、中国内の春節連休を前後にして急速な伝染によって感染者が急増し、武漢市の都市機能全般が麻痺するなど、憂慮すべき事態に進んだ。
一般に、ウイルスのゲノム分析には、ＳＳＰ－ＰＣＲ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｉｍｅｒ－Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、実時間ＰＣＲ、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ（ＰＣＲ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎａｌｙｓｉｓ）及びシーケンシングなどの方法が用いられている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の有無の診断は、まず、パンコロナウイルス検査によってコロナウイルス検出の有無を確認し、次に、実時間ＰＣＲとシーケンシング方法を組み合わせた方法を用いている。このため、感染有無の診断に２４時間以上もかかる問題があった。
近年、米国疾病管理本部とＷＨＯでは、検査時間を短縮するためにＲＴ－実時間ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）法を開発して供給している（Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ Ｐａｎｅｌ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ２０１９－Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ．Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓｅｓ Ｂｒａｎｃｈ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）。米国疾病管理本部が開発した検査法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシド（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ）タンパク質を作るＮ遺伝子の３つの部位を増幅する方法である。ＷＨＯで開発した方法は、スクリーニング確診が同時に可能な単一段階実時間ＰＣＲ（Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）方法であって、既存ＳＡＲＳ関連ウイルスと配列一致度が高いＥ遺伝子部位を、スクリーニングのための目的で使用し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染有無の確診のためにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を特異的に検出できるＲｄＲＰ（ＲＮＡ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）遺伝子を増幅する方式である（図１）。
しかしながら、Ｅ遺伝子及びＲｄＲＰ遺伝子は、ウイルス感染細胞内で存在量が低いため、実験的エラーや検体のＲＮＡ安全性によって検出が不可能な場合があり得る。
また、米国疾病管理本部とＷＨＯでは、ＲＮＡ検体適合性判定のための内部対照群遺伝子としてヒトＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子を使用したし、ＲＮａｓｅ Ｐ ｃＤＮＡを増幅するためのプライマー及びプローブ配列を公開したことがある。しかし、本出願発明者は、公開されたプライマー及びプローブ配列はＲＮＡスプライシングを考慮しないで一番目のエクソン内部をターゲットするプライマーであり、ゲノムＤＮＡに適用時に偽陽性増幅が発生し得ること確認した。検査現場では検体からＲＮＡ抽出時にゲノムＤＮＡが完全に除去されない場合が頻繁であるため、検体適合性判定にエラーが発生し得る。
このような技術的背景の下に、本出願の発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の有無を診断するために、初期感染細胞内に最も豊富に存在するリーダ配列をターゲットとする新しい検出方法を開発した。また、ゲノムＤＮＡ由来偽陽性増幅が発生しないように、ＲＮＡスプライシングを考慮して内部対照群ＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子に対するプライマーを作製した。
本背景技術の部分に記載された上記の情報は、本発明の背景に関する理解を向上させるためのものに過ぎず、よって、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者にとって既に知られた先行技術に関する情報は含まなくてもよい。
本発明の目的は、上述した従来技術の問題点を認識し、正確ながらも偽陽性の発生無しでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の有無を診断できる組成物、キット及びこれを用いた診断方法を提供することである。
上記の目的を達成するために、本発明は、配列番号１０の配列を含むコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２：Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２）リーダ（ｌｅａｄｅｒ）を特異的に増幅できる核酸オリゴマーを含むコロナウイルス診断用組成物に関する。
本発明は、また、前記組成物を含むコロナウイルス診断用キットに関する。
本発明は、さらに、配列番号１０の配列を含むコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２：Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２）リーダ（ｌｅａｄｅｒ）を特異的に増幅できる核酸オリゴマーをサンプルに処理する段階を含むコロナウイルス診断のための情報提供方法に関する。
特に断りのない限り、本明細書で使われる技術的及び科学的用語はいずれも、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野でよく知られており、通常使われるものである。
本出願の発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染有無の診断のために初期感染細胞内に最も豊富に存在するリーダ配列をターゲットとする新しい検出方法によって新型コロナウイルス感染の有無を迅速且つ正確に診断できることを確認した。
このような観点で、本発明は、配列番号１０の配列を含むコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２：Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２）リーダ（ｌｅａｄｅｒ）を特異的に増幅できる核酸オリゴマーを含むコロナウイルス診断用組成物に関する。
また、本発明は、配列番号１０の配列を含むコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２：Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２）リーダ（ｌｅａｄｅｒ）を特異的に増幅できる核酸オリゴマーをサンプルに処理する段階を含むコロナウイルス診断のための情報提供方法に関する。
前記リーダ配列と関連して、コロナウイルスのうちゲノムＲＮＡ及び転写発現したサブゲノムｍＲＮＡ（ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ ｍＲＮＡ）は、５’末端に、約７２～７７ｂｐで構成されたリーダ配列を共通に有しており、これがコロナウイルスの独特の特徴であり、ウイルス配列のうち感染細胞において最も豊富に存在するターゲットである。これは、コロナウイルスの全てのサブゲノムＲＮＡは、ゲノムＲＮＡの５’末端から誘導された約７２ｂｐに該当するリーダ配列（ｌｅａｄｅｒ ＲＮＡ）が、各サブゲノムＲＮＡの５’末端に結合するリーダジョイニング（ｌｅａｄｅｒ ｊｏｉｎｉｎｇ）現象を示すためである。
したがって、リーダ配列は、細胞内でウイルス遺伝子のうち最も複製数が高く、Ｎタンパク質をコードするサブゲノムＲＮＡの複製数がその次に高い。したがって、軽微な症状の初期感染において低い量で存在するコロナウイルスの効果的な検出のためには、リーダ配列を検出の標的として用いることが最も効果的であるといえる。
本明細書において、核酸オリゴマーは、核酸を単量体にして重合して生成される２個以上のヌクレオチドを含む物質を意味できる。前記核酸オリゴマーは、プライマー又はプローブとして働くことができる。
本明細書において「プライマー」は、適切な温度及び緩衝液中で適切な条件（すなわち、４種の異なるヌクレオシドトリホスフェート及び重合反応酵素）下で鋳型－指示ＤＮＡ合成の開始点として作用し得る一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。前記プライマーは、増幅される遺伝子ローカスの各鎖と“たいてい”相補性を有するように作製されてよい。これは、重合反応を行う条件においてプライマーが対応の核酸手順とハイブリダイゼーションされるに十分な相補性を有することを意味する。
一実施例において、配列番号１０の配列を含むコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）リーダを特異的に増幅できる核酸オリゴマーは、例えば、配列番号１又は配列番号２の配列を含むプライマーであってよい。
前記プライマーは、例えば、ＰＣＲのために正方向及び逆方向プライマーを対にして同時に使用することができる。配列番号１０の配列を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２リーダ配列を特異的に増幅する正方向プライマーとして、例えば、配列番号１の配列を含むことができる。前記逆方向プライマーとして、例えば、配列番号２の配列を含むことができる。
また、ＲＮＡスプライシングを考慮して内部対照群ＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子に対するプライマーを作製し、ゲノムＤＮＡ由来偽陽性増幅が発生しないことを確認した。
内部対照群遺伝子は、ＲＮＡ検体適合性の判定のためのオリゴヌクレオチドであり、標的遺伝子と相補性がなくてよい。本発明の具体的実施例において、従来の内部対照群遺伝子としてヒトＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子を使用した。
ＣＤＣによって公開されたＲＮａｓｅ Ｐ ｃＤＮＡを増幅するためのプライマー及びプローブ配列は、ＲＮＡスプライシングを考慮しないで一番目のエクソン内部をターゲットするプライマーであり、ゲノムＤＮＡに適用時に偽陽性増幅が発生し得ることを確認した。検査現場では検体からＲＮＡ抽出時にゲノムＤＮＡが完全に除去されない場合が頻繁であるため、検体適合性の判定にエラーが発生し得る。
一実施例において、配列番号１１の配列を含むＲＮａｓｅ Ｐを特異的に増幅できる核酸オリゴマーをさらに含むことができる。
前記核酸オリゴマーは、例えば、配列番号７又は配列番号９の配列を含むプライマーであってよい。本願発明に係るプライマーは、一番目のエクソンの５’部位に相補的な配列をターゲットにし、ゲノムＤＮＡに適用時に偽陽性増幅が発生しないことを確認した。
前記プライマーは、例えば、ＰＣＲのために正方向及び逆方向プライマーを対にして同時に使用することができる。配列番号１１の配列を含むＲＮａｓｅ Ｐを特異的に増幅する正方向プライマーとして、例えば、配列番号７の配列を含むことができる。前記逆方向プライマーとして、例えば、配列番号８の配列を含むことができる。
本発明は、核酸オリゴマーによって特異的に増幅されたコロナウイルスリーダ又はＲＮａｓｅ Ｐ産物に相補的に混成化できるプローブをさらに含むことができる。
前記プローブと関連して、これは特定条件で増幅産物と混成化可能なオリゴヌクレオチドを意味する。
混成化反応において、厳格な特定レベルを達成するために用いられる条件は、混成化される核酸の性質によって様々である。例えば、混成化される核酸部位の長さ、相同性程度、ヌクレオチド配列組成（例えば、ＧＣ／ＡＴ組成比）及び核酸タイプ（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）などが混成化条件を選択する上で考慮される。追加の考慮条件は、核酸が例えばフィルターなどに固定化しているか否かである。
非常に厳格に進行される条件の例を挙げると、次の通りである：室温での２Ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ（混成化条件）；室温での０．２Ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ（厳格性が低い条件）；４２℃での０．２Ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ（普通の厳格性を有する条件）；６８℃での０．１Ｘ ＳＳＣ（高い厳格性を有する条件）。洗浄過程は、これらのいずれか一条件を用いて行うことができ、例えば、高い厳格性を有する条件、又は前記条件のそれぞれを用いることができ、前記記載された順にそれぞれ１０～１５分ずつ、前記記載された条件を全部又は一部反復して行うことができる。ただし、上述した通り、最適条件は、含まれた特別な混成化反応によって様々であり、実験によって決定できる。一般に、重要なプローブの混成化には、高い厳格性を有する条件が用いられる。
一実施例において、前記増幅されたコロナウイルスリーダに相補的に混成化できるプローブは、例えば、配列番号３の配列を含むことができる。
一実施例において、内部対照群として用いられた前記増幅されたＲＮａｓｅ Ｐ産物に相補的に混成化できるプローブは、配列番号９の配列を含むことができる。
場合によって、プローブは、検出可能に標識され、例えば、放射線同位元素、蛍光化合物、バイオ発光化合物、化学発光化合物、金属キレート又は酵素で標識されてよい。上記のようなプローブを適当に標識することは、当該分野で広く知られた技術であり、通常の方法によって行うことができる。
前記増幅産物の量は、蛍光信号によって検出されてよい。プローブが結合した増幅産物の二重螺旋ＤＮＡに結合して蛍光を示す試薬（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）を使用するインターカレーティング（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ）法、５’末端は蛍光物質、３’末端は消光子（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）で標識されたオリゴヌクレオチドを使用する方法などがある。
本願発明に係る増幅は、逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を用いて実時間定量増幅、例えば実時間重合酵素連鎖反応（Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ）によって行われてよく、実時間重合酵素連鎖反応においてＰＣＲ増幅産物の量は蛍光信号によって検出できる。実時間重合酵素連鎖反応が進行しながら増加するポリヌクレオチド量によって蛍光信号の強度が増加し、増幅サイクル回数による蛍光信号強度を示す増幅プロファイル（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ）曲線が得られる。
増幅プロファイル曲線は、一般に、実質的なポリヌクレオチド量が反映されていない背景の蛍光信号が見られるベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）領域、ポリヌクレオチド生成物量の増加による蛍光信号の増加が見られる指数的領域（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｒｅｇｉｏｎ）、及びＰＣＲ反応が飽和状態に達し、蛍光信号強度の増加が見られない停滞状態領域（ｐｌａｔｅａｕ ｒｅｇｉｏｎ）に分けられる。
通常、ベースライン領域から指数的領域に移る地点、すなわち、ＰＣＲ増幅産物量が蛍光で検出可能な量に到達した時の蛍光信号強度を臨界値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）といい、増幅プロファイル曲線において臨界値に対応する増幅サイクル回数を臨界サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ：Ｃｔ）値という。
前記Ｃｔ値を測定し、標準物質に対するＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）値に基づいて濃度が決定された標準曲線を分析して、増幅された遺伝子の濃度を確認することにより、メチル化特異的敏感度及び／又は特異度を決定することができる。
一実施例において、前記検体は、疑いのある患者又は診断対象個人又は個人由来の体液、細胞株、組織培養などから得られる広範囲なあらゆる生物学的体液を含むことができ、例えば、下気道の淡、上気道の口腔咽頭スワブ及び／又は鼻咽頭スワブ、培養検体、組織検体又は血液などでよいが、これに制限されるものではない。
前記検体から核酸を抽出する段階をさらに含むことができ、核酸の抽出は、例えば、商業化して供給されている様々なキット又は抽出試薬を用いて行われてよい。
本発明は、他の観点において、前記組成物を含むキットに関する。
一実施例において、前記キットは、サンプルを入れる区画したキャリア手段、試薬を含有する容器、核酸オリゴマーを含有する容器を含むことができる。場合によって、遺伝子増幅産物のそれぞれを検出するためのプローブを含有する容器をさらに含むことができる。
前記キャリア手段は、瓶、チューブのような一つ以上の容器を収容するのに適し、各容器は、本発明の方法に用いられる独立的構成要素を含有する。本発明の明細書において、当該分野における通常の知識を有する者は、容器中の必要な製剤を容易に分配することができる。
本発明に係るキットは、場合によって、重合酵素、バッファー、デオキシリボヌクレオチド－５－トリホスフェートのような核酸増幅ＰＣＲ反応を実施するのに必要な試薬を選択的に含むことができる。本発明に係るキットは、また、様々なポリヌクレオチド分子、様々なバッファー及び試薬をさらに含むことができる。
前記キットにおいて特定反応のために用いられる試薬、バッファー又は反応物の最適量は当業者によって決定されてよく、先に言及されたプライマー又はプローブをそれぞれ含む別個の包装又はコンパートメント（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）として制作されてよい。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
実施例１：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出及び内部対照遺伝子検出用プライマー及びプローブ設計
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９８８６６８．１：配列番号１２）のリーダ配列ｃＤＮＡ（配列番号１０）及び内部対照遺伝子ＲＮａｓｅ Ｐ（配列番号１１）の増幅のためのプライマー及びプローブは、Ｐｒｉｍｅｒ ３（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｕｔ．ｅｅ／ｐｒｉｍｅｒ３－０．４．０／）プログラムを用いて設計した（表１）。
実施例２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２リーダ及びＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子ＲＮＡ合成
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のリーダ配列に該当するＲＮＡを合成するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のうちリーダ配列７２ｂｐ（配列番号１０）を含む１１０ｂｐ（配列番号１３）に該当するＤＮＡを合成した（ＮｅｏＰｒｏｂｅ，韓国）。ＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＣ＿００００１０．１１：配列番号１４）のＲＮＡを合成するために、ＲＮａｓｅ Ｐ配列に該当する１８０ｂｐ ＤＮＡ（配列番号２）を合成した。各合成されたＤＮＡの５’末端にはＴ７プロモーター配列を連結してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）方法でＲＮＡを作製した。
（１）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）
２個の鋳型ＰＣＲ産物を５０ｎｇずつ使用してＭＥＧＡＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｔ７転写キット，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてメーカー指針に従って下記のように行った。
２時間の反応が終わった後、残余ＤＮＡ除去のためにＤＮａｓｅ ４μｌを添加し、３７℃で１５分間反応させた。合成されたリーダ及びＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡは、ＱＩＡａｍｐ ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてメーカー指針に従って精製した。最終的に合成されたＲＮＡは、５０μｌ ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ＤＷで溶出した。
実施例３：逆転写重合酵素実時間ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２リーダｃＤＮＡ及びＲＮａｓｅ Ｐ ｃＤＮＡ検出
ＲＴ－ｑＰＣＲは、次のような方法で行った。反応液の組成は下表の通りであり、ＲＴ－ｑＰＣＲ反応は、ＡＢ ７５００ Ｆａｓｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）装備を用いた。一番目の逆転写段階（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ＲＴ）でＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを作り、二番目の実時間ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）段階でｃＤＮＡを増幅した。
（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２リーダＲＮＡ配列検出結果
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２リーダＲＮＡ配列に相補的なｃＤＮＡ検出を確認するためにリーダＲＮＡ（１０４コピー）、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に使用したリーダＤＮＡ（１０４コピー）、ヒトゲノムＤＮＡ（ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）（１０ｎｇ）及びヒト全ＲＮＡ（ｈｕｍａｎ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）（１０ｎｇ）を使用して単一段階ＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ）を行った（図３）。その結果、リーダｃＤＮＡ及びリーダＤＮＡにおいてのみ増幅が確認され、残りの鋳型における非特異的な増幅はないことを確認した（表５）。
実際のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２リーダＲＮＡの増幅の有無を確認するために、韓国国家病原体資源銀行で韓国人から分離したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を培養して分離したＲＮＡを使用した。単一段階ＲＴ－ｑＰＣＲは上記と同じ方法で行った。試験の結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のリーダＲＮＡが正常に増幅されることを確認した（図４、表６）
（２）ＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡ検出結果
ＲＮＡ検体適合性判定のための内部対照群遺伝子は、ヒトＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子を使用した。ＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡを増幅するためのプライマー及びプローブは、米国疾病管理本部が公開した配列があるが、本出願の発明者が確認した結果、ＲＮＡスプライシングを考慮しないで一番目のエクソン内部でプライマーが作製され、ゲノムＤＮＡにおいて偽陽性増幅が発生した。
これは、検体からＲＮＡ抽出時にゲノムＤＮＡが完全に除去されない場合が頻繁であるため、検体適合性判定にエラーが発生することがあり、よって、本発明者らはこのような問題を解決するために、ＲＮＡスプライシングを考慮してゲノムＤＮＡ由来偽陽性増幅が発生しないように新規逆方向プライマーを作製した。
図５Ａに示すように、ＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子は、総３６．６ｋｂ程度の配列で構成された遺伝子であり、総１１個のエクソンで構成されている。
米国疾病管理本部が提供するＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子配列に該当するプライマー及びプローブはいずれもＲＮＡスプライシングを考慮しないで一番目のエクソンに該当する部位において作製され、ヒトゲノムＤＮＡを対象に増幅した時に、偽陽性増幅が起きた（図５Ｂの（ａ））。これに対し、本発明者らが開発した逆方向プライマーを使用した場合には、ヒトゲノムＤＮＡから偽陽性増幅が発生しなかった（図５Ｂの（ｂ））。
したがって、本発明者は、約２．８ｋｂ離れている二番目のエクソンの５’部位に相補的な部位に対する逆方向プライマーを新規に作製することにより、ゲノムＤＮＡによる偽陽性増幅問題を解決した。ＩＶＴしたＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡとヒト全ＲＮＡを対象に増幅した結果、正常の増幅が起きることを確認した（表７）。
実施例４：リーダ配列を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２診断能力評価
配列番号１０のリーダ配列を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の診断能力を評価するためにヨンナム大学校病院（ＩＲＢ Ｎｏ．ＹＵＭＣ２０２０－０７－００１）に保管中の既にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２診断結果を知っている上気道検体（陰性１８０例、陽性７６例）からＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ：５２９０４ ｏｒ ５２９０６）を用いてメーカーのプロトコルに従ってＲＮＡを抽出した。ＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子を内部対照群として用いた（表８のＩＣ ＣＴ値参照）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の有無を診断するために、ＲＴ－ｑＰＣＲは実施例３に記述の方法で行った（表８）。
リーダ配列を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２診断の結果、敏感度は１００％（７６／７６）そして特異度は１００％（１８０／１８０）と優れていることを確認した（表９）。したがって、リーダ配列を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２診断の有効性があることを確認した。
本発明によれば、短時間で結果確認が可能なので、新型コロナウイルス感染の有無を迅速に診断でき、偽陽性が発生しないようにすることにより、正確な診断が可能である。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施の態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるものでない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。
Claims (10)
- 配列番号１０の配列を含むコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２：Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２）リーダ（ｌｅａｄｅｒ）を特異的に増幅できる核酸オリゴマーを含む、コロナウイルス診断用組成物。
- 前記コロナウイルスリーダを特異的に増幅可能な核酸オリゴマーは、配列番号１又は配列番号２の配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
- 前記核酸オリゴマーによって特異的に増幅されたコロナウイルスリーダ配列の産物に相補的に混成化できるプローブをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記増幅されたコロナウイルスリーダに相補的に混成化できるプローブは、配列番号３の配列を含むことを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
- 請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物を含む、コロナウイルス診断用キット。
- 配列番号１０の配列を含むコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２：Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２）リーダ（ｌｅａｄｅｒ）を特異的に増幅可能な核酸オリゴマーをサンプルに処理する段階を含む、コロナウイルス診断のための情報提供方法。
- 前記コロナウイルスリーダを特異的に増幅できる核酸オリゴマーは、配列番号１又は配列番号２の配列を含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
- 前記核酸オリゴマーによって特異的に増幅されたコロナウイルスリーダ配列の産物に相補的に混成化できるプローブをさらに含む、請求項６に記載の方法。
- 前記増幅されたコロナウイルスリーダに相補的に混成化できるプローブは、配列番号３の配列を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
- 前記増幅は、ＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）によって行われることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
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