JP2023523850A - 新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を検出するための手段および方法 - Google Patents

新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を検出するための手段および方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、少なくともSARS-CoV-2 RdRP遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともSARS-CoV-2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、および/または少なくともヒトRNase P遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列を用いて同時増幅工程を実施する段階を含む、PCR法に関する。該PCR法は、少なくとも固有スパイクRNAのためのプライマーヌクレオチド配列を用いて、増幅工程、好ましくは、同時増幅工程を実施する段階をさらに含み得る。本発明のPCR法を実行するための、プライマーおよび任意でプローブを含むキットも、提供される。

Description

配列表
本願は、参照により本明細書に組み入れられる、コンピュータ可読形態の配列表を含有する。
発明の分野
本発明は、SARS-CoV-2の診断の領域における手段および方法に関する。従って、少なくともSARS-CoV-2 RdRP遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともSARS-CoV-2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、および少なくともヒトRNase P遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列を用いて同時増幅工程を実施する段階を含むPCR法が、本発明によって提供される。該PCR法は、少なくとも固有スパイクRNAのためのプライマーヌクレオチド配列を用いて、増幅工程、好ましくは、同時増幅工程を実施する段階をさらに含み得る。
本発明は、本発明のPCR法を実施するための、プライマーおよびプローブを含むキットも提供する。本発明は、（i）試料中のSARS-CoV-2のインビトロ検出、（ii）SARS-CoV-2による対象の感染のインビトロ検出、（iii）SARS-CoV-2の血液試料への混入のインビトロ検出、または（iv）SARS-CoV-2の治療のインビトロモニタリングのための、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、SARS-CoV-2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、およびヒトRNase P遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列の使用にさらに関する。
本発明は、インフルエンザウイルスA型（IAV）およびB型（IBV）を検出し、かつ/または最も一般的な季節性インフルエンザ（例えば、IAVおよび/もしくはIBV）からSARS-CoV-2を鑑別するための手段および方法にさらに関する。
本発明のPCR法、キット、および使用は、PCR法、キット、または使用の多重化に関連していることが公知の、不均一な増幅/折り畳み、偽陰性、不十分な感度および特異度、ならびに/またはある特定の標的の優先的な増幅、プライマー二量体を克服し、さらに、偽陽性および偽陰性の読み出しを低下させる。
発明の背景
World Health Organization（WHO）によって報告されたように、2019年12月31日に、Wuhan City,Hubei Provinceにおける病因不明の肺炎の症例が、WHO China Country Officeに伝えられた。現在、2019-nCoVと呼ばれている新型コロナウイルスが、正式に発表された。そのゲノム配列は、2002/03年のヒトでのSARSの大流行の病原体によって定義された種である、重症急性呼吸器症候群（SARS）関連CoVと呼ばれるウイルス種のメンバーと近縁のウイルスの存在を示唆している。その大流行は、中国全体の複数の州での数千人の感染確認をもたらし、その後、ヨーロッパおよび米国に拡大した。無症候性感染例、軽症例、重症例、および死亡例が、報告されている。WHOは、2019-nCoVの大流行が、世界中に影響を与え、従って、何百万人もの人々に影響を与えるパンデミックであることを宣言した。
公衆衛生介入を容易にするための最優先事項のうちの1つは、信頼性のある検査診断である。2019-nCoVの診断のためのプロトコルを研究者および医師に提供するため、WHOは、ヨーロッパ、米国、日本、中国、香港、またはタイで適用されている種々のプロトコルを公開した（https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/whoinhouseassays.pdf?sfvrsn＝de3a76aa_2）。
それらは、全て、試料中に存在する場合、2019-nCoVを検出するための核酸増幅に基づいている。WHOによって公開されたプロトコルは、2019-nCoVの種々の遺伝子標的を使用している。例えば、中国CDCは、遺伝子標的としてORF1abおよびNを使用し；フランスのInstitut Pasteurは、RdRP内の2つの遺伝子標的を使用し；米国CDCは、ウイルスN遺伝子内の3つの標的の検出を使用し；日本のNational Institute of Infectious Diseasesは、汎コロナの複数の標的ならびにスパイクタンパク質をコードする遺伝子を使用し；香港SARのHKUは、ORF1b-nsp14およびN遺伝子を使用し；タイのNational Institute of Healthは、N遺伝子を使用し、ドイツのChariteは、RdRPおよびN遺伝子を使用している。これらのプロトコルは、全て、定量的/リアルタイムRT-PCRアッセイ（qRT-PCR）を適用する。
しかしながら、Vogels et al.(2020);Cold Spring Harbor Laboratory,BMJ Yale (https://doi.org/10.1101/2020.03.30.20048108)（非特許文献1）によって査定されたように、これらのアッセイのうちのいくつかは、限界を有し得る。さらに、比較研究により、qRT-PCRにおいて適用されているいくつかのプライマープローブセットがSARS-CoV-2陰性の鼻咽頭スワブと交差反応し得ること、やや非特異的であり得るものもあること等が観察されたため、Vogelsらは、SARS-CoV-2（Gorbalenya et al.(2020),Nat.Microbiol.(5)4,536-544,doi:10.1038/s41564-020-0695-z（非特許文献2））とも名付けられた2019-nCoVの検出のための適切なアッセイの選択において、他の研究所を支援することを目標とした。
網羅的なSARS-CoV-2検査戦略は、早期発見および適切な疫学的措置の実行を容易にすることによって、各国がコロナウイルス疾患2019（COVID-19）の拡大を抑制するための重要なツールである。SARS-CoV-2を同定するためのゴールドスタンダードは、生物学的検体中の1つまたは複数のウイルス遺伝子の存在を検出するためのRT-qPCRの使用を必要とする。この方法は、反応物中のウイルスRNAを単一コピーまで検出する無比の感度を有し、診断検査室において容易に配備され得る。最初のSARS-CoV-2ゲノム配列の公開の直後に、いくつかの基準研究所（reference laboratories）および公衆衛生当局が、最初の公に利用可能なRT-qPCRプロトコルを提供した。これらのプロトコルは、各国が網羅的な検査戦略を迅速に実行することを可能にするために役立ち、しばしば、付加的な革新による、より合理化された検査の商業的開発のための土台として用いられた。現在、SARS-CoV-2を検出するための数百のRT-qPCR検査が開発されており、これらの検査の有効性を比較する研究は、検体投入量、遺伝子標的、検査ワークフロー、特異度、および感度についての重要な違いを明らかにしている。
Charite Institute of Virology（Berlin）によって開発されたRT-qPCR検査は、最初に公開されたプロトコルのうちの1つであり（Corman et al.(2020),Euro Surveillance 25(3)（非特許文献3））、WHOによって共有され、パンデミックの初期にヨーロッパ全体で広く使用された。開発の時点で、公に利用可能なSARS-CoV-2配列はほとんどなく、ウイルス単離物および陽性患者試料が不足していたため、著者らは、（2003年の大流行に由来する）SARS-CoVウイルスRNAと意図的に交差反応する一次スクリーニングアッセイを設計した。RdRP遺伝子を標的とする第2の確認アッセイは、SARS-CoV-2をSARS-CoVから鑑別する2つのプローブを含有した。しかしながら、RdRPプライマーおよびSARS-CoV-2特異的プローブは、遺伝子可変性を示すと考えられる区域に、いくつかの縮重塩基を含有した。著者らは、RdRPリバースプライマーの設計が、その低い予測融解温度のため、反応効率を低下させ得ることも指摘した（Corman VM,Drosten C.Authors' response:SARS-CoV-2 detection by real-time RT-PCR.Euro Surveill.2020 May 28（非特許文献4））。このプロトコルは、診断検査の初期に明確な利益を提供したが、この検査の性能に関しては、多様な課題、主に、RdRPアッセイの感度の低下が現れた（Nalla AK et al.2020,Comparative Performance of SARS-CoV-2 Detection Assays Using Seven Different Primer-Probe Sets and One Assay Kit.Journal of Clinical Microbiology（非特許文献5）；Vogels CBF et al.2020,Analytical sensitivity and efficiency comparisons of SARS-CoV-2 RT-qPCR primer-probe sets.Nature Microbiology.2020 Oct;5(10):1299-305（非特許文献6）；Jung Y,et al.,2020 Comparative Analysis of Primer-Probe Sets for RT-qPCR of COVID-19 Causative Virus (SARS-CoV-2).ACS Infect Dis.2020 Aug 11（非特許文献7）；Pillonel T,et al.,2020.Letter to the editor:SARS-CoV-2 detection by real-time RT-PCR.Euro Surveill.2020 May 28（非特許文献8）；Etievant S,et al.,2020 Performance Assessment of SARS-CoV-2 PCR Assays Developed by WHO Referral Laboratories.J Clin Med [Internet].2020 Jun 16（非特許文献9））。
従って、WHOまたはその他、例えば、Corman et al.(2020),Euro Surveillance 25(3),doi:10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045（非特許文献10）によって公開されたプロトコルにも関わらず、臨床介入および公衆衛生介入を促すための、改善された、信頼性のある正確な診断アッセイが、依然として必要とされている。
従って、本願の根底にある技術的問題は、この必要性に応じることである。この技術的問題は、以下の特許請求の範囲に反映され、明細書に記載され、実施例および図面において例示される態様を提供することによって解決される。
簡単に説明すると、最初のChariteプロトコルに基づき、最初のプロトコルの限界に対処する、いくつかの改善されたRT-qPCRが、本発明において開発された。さらに、内部対照の組み込み、多重化による検査ワークフローの合理化、ならびにそれぞれのPCR法の感度および特異度の両方を増加させるための二重プローブなどの技術的革新の開発によって、アッセイの大幅な改善がなされた。最も一般的な季節性インフルエンザからSARS-CoV-2を鑑別するために有用な診断ツールを提供する、インフルエンザA型およびB型を検出するための付加的なアッセイが開発された。本発明の手段および方法のうちのいくつかは、最大1ヶ月間、室温で安定しており、輸送および保管のコールドチェーンの必要性を排除する数少ないRT-qPCR手段/方法のうちの1つを提供する。
Vogels et al.(2020);Cold Spring Harbor Laboratory,BMJ Yale (https://doi.org/10.1101/2020.03.30.20048108) Gorbalenya et al.(2020),Nat.Microbiol.(5)4,536-544,doi:10.1038/s41564-020-0695-z Corman et al.(2020),Euro Surveillance 25(3) Corman VM,Drosten C.Authors' response:SARS-CoV-2 detection by real-time RT-PCR.Euro Surveill.2020 May 28 Nalla AK et al.2020,Comparative Performance of SARS-CoV-2 Detection Assays Using Seven Different Primer-Probe Sets and One Assay Kit.Journal of Clinical Microbiology Vogels CBF et al.2020,Analytical sensitivity and efficiency comparisons of SARS-CoV-2 RT-qPCR primer-probe sets.Nature Microbiology.2020 Oct;5(10):1299-305 Jung Y,et al.,2020 Comparative Analysis of Primer-Probe Sets for RT-qPCR of COVID-19 Causative Virus (SARS-CoV-2).ACS Infect Dis.2020 Aug 11 Pillonel T,et al.,2020.Letter to the editor:SARS-CoV-2 detection by real-time RT-PCR.Euro Surveill.2020 May 28 Etievant S,et al.,2020 Performance Assessment of SARS-CoV-2 PCR Assays Developed by WHO Referral Laboratories.J Clin Med [Internet].2020 Jun 16 Corman et al.(2020),Euro Surveillance 25(3),doi:10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045
従って、1つの局面において、本発明は、少なくともSARS-CoV-2 RdRPのためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともSARS-CoV-2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を用いて同時増幅工程を実施する段階を含むPCR法に関する。
さらなる局面において、本発明は、
（i）少なくともSARS-CoV-2 RdRPのためのプライマーヌクレオチド配列および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を用いて同時増幅工程を実施する段階を含む、第1のPCR法；ならびに/または（「ならびに」が好ましい）、
（ii）少なくともSARS-CoV-2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を用いて同時増幅工程を実施する段階を含む、第2のPCR法
を含むPCR法であって、SARS-CoV-2核酸を含むことが疑われる同じ起源材料が（i）および（ii）のPCRのために使用される、PCR法に関する。
さらに、さらなる局面において、本発明は、
（i）少なくともSARS-CoV2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列および少なくとも固有スパイクRNAのためのプライマーヌクレオチド配列を用いて同時増幅工程を実施する段階を含む、第1のPCR法；
（ii）少なくともSARS-CoV-2 RdRP遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を用いて同時増幅工程を実施する段階を含む、第2のPCR法；ならびに
（iii）少なくともSARS-CoV-2 RdRP遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともSARS-CoV-2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列、および少なくとも固有スパイクRNAのためのプライマーヌクレオチド配列を用いて同時増幅工程を実施する段階を含み、さらに、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子についての固有RNA、SARS-CoV-2 E遺伝子についての固有RNA、ヒトRNase Pについての固有RNAを含む、第3のPCR法
を含むPCR法であって、SARS-CoV-2核酸を含むことが疑われる同じ起源材料が（i）および（ii）のPCR法のために使用され、
（iii）のPCR法が、陽性対照として、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子のリボ核酸、SARS-CoV-2 E遺伝子のリボ核酸、ヒトRNase Pのリボ核酸、および固有スパイクRNAのリボ核酸をさらに含む、PCR法に関する。
さらに、本発明は、少なくともSEQ ID NO:1および2に記載のプライマーヌクレオチド配列を用いて増幅工程を実施する段階を含むPCR法を提供する。
本発明は、少なくともSEQ ID NO:1および2に記載のプライマーヌクレオチド配列、任意で、SEQ ID NO:3に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、ならびに、任意で、PCR増幅工程を実施するための手段を含む、キットにも関する。
最後に、本発明は、
（i）試料中のSARS-CoV-2のインビトロ検出、
（ii）SARS-CoV-2による対象の感染のインビトロ検出、
（iii）SARS-CoV-2の血液試料への混入のインビトロ検出、または
（iv）SARS-CoV-2の治療のインビトロモニタリング
のための、SEQ ID NO:1および2に記載のプライマーヌクレオチド配列の使用に関する。
ヌクレオチド配列の簡単な説明
Figure 2023523850000001
SARS-CoV-2 RdRPのためのフォワードプライマーヌクレオチド配列
Figure 2023523850000002
SARS-CoV-2 RdRPのためのリバースプライマーヌクレオチド配列
Figure 2023523850000003
SARS-CoV-2 RdRPのためのプローブであって、好ましくは、5'末端にFAMまたはHEXまたはYYを含み、好ましくは、3'末端にBHQ1またはBHQ2を含む。
Figure 2023523850000004
SARS-CoV-2 E遺伝子のためのフォワードプライマーヌクレオチド配列
Figure 2023523850000005
SARS-CoV-2 E遺伝子のためのリバースプライマーヌクレオチド配列
Figure 2023523850000006
SARS-CoV-2 E遺伝子のためのプローブであって、好ましくは、5'末端にFAMまたはHEXまたはYYを含み、好ましくは、3'末端にBHQ1またはBHQ2を含む。
Figure 2023523850000007
ヒトRNase Pのためのフォワードプライマーヌクレオチド配列
Figure 2023523850000008
ヒトRNase Pのためのリバースプライマーヌクレオチド配列
Figure 2023523850000009
ヒトRNase Pのためのプローブであって、好ましくは、5'末端にHEXまたはYYまたはCy5を含み、好ましくは、3'末端にBHQ1またはBHQ2またはBHQ3を含む。
Figure 2023523850000010
SARS-CoV-2 RdRPのための陽性対照リボヌクレオチド（「r」は「リボヌクレオチド」を表す）
Figure 2023523850000011
SARS-CoV-2 E遺伝子のための陽性対照リボヌクレオチド（「r」は「リボヌクレオチド」を表す）
Figure 2023523850000012
ヒトRNase Pのための陽性対照リボヌクレオチド（「r」は「リボヌクレオチド」を表す）
Figure 2023523850000013
SARS-CoV-2 RdRPのためのリバースプライマーヌクレオチド配列
Figure 2023523850000014
SARS-CoV-2 RdRPのためのフォワードプライマーヌクレオチド配列（縮重ヌクレオチド「R」がヌクレオチド「A」に変換されたSEQ ID NO.1と比較すること）
Figure 2023523850000015
SARS-CoV-2 RdRPのためのリバースプライマーヌクレオチド配列（縮重ヌクレオチド「R」および「S」がヌクレオチド「A」に変換されたSEQ ID NO:13と比較すること）
Figure 2023523850000016
SARS-CoV-2 E遺伝子のためのプローブであって、好ましくは、5'末端にFAMを含み、好ましくは、3'末端にBHQ1を含む（縮重ヌクレオチド「W」がヌクレオチド「A」に変換され、縮重ヌクレオチド「R」がヌクレオチド「C」に変換され、縮重ヌクレオチド「M」がヌクレオチド「A」に変換されたSEQ ID NO:3と比較すること）
Figure 2023523850000017
固有スパイクRNAのためのフォワードプライマーヌクレオチド配列
Figure 2023523850000018
固有スパイクRNAのためのリバースプライマーヌクレオチド配列
Figure 2023523850000019
固有スパイクRNAのためのプローブであって、好ましくは、5'末端にHEXまたはYYまたはCy5を含み、好ましくは、3'末端にBHQ1またはBHQ2またはBHQ3を含む。
Figure 2023523850000020
（固有）スパイクRNA（「r」は「リボヌクレオチド」を表す）
Figure 2023523850000021
好ましくは、ヒトおよびSARS-CoV-2に存在しない、（固有）スパイクRNAのための鋳型として用いられる、合成の、例えば、生物情報学的に設計された核酸配列
Figure 2023523850000022
SARS-CoV-2 E遺伝子のためのフォワードプライマーヌクレオチド配列
Figure 2023523850000023
SARS-CoV-2 E遺伝子のための陽性対照リボヌクレオチド（「r」は「リボヌクレオチド」を表す）
Figure 2023523850000024
Figure 2023523850000025
Figure 2023523850000026
Figure 2023523850000027
Figure 2023523850000028
Figure 2023523850000029
Figure 2023523850000030
Figure 2023523850000031
Figure 2023523850000032
Figure 2023523850000033
SARS CoV-2遺伝子RdRP、E、およびヒトRNase Pの検出のためのRT-PCR。図は、リアルタイムRT-PCRによるSARS-CoV-2 E遺伝子およびSARS-CoV-2 RdRP遺伝子の検出を示す。黒丸付きの曲線は、SEQ ID NO:4および5のプライマーヌクレオチド配列ならびにSEQ ID NO:6を有するプローブを使用したSARS-CoV-2遺伝子の増幅反応を示す。黒四角付きの曲線は、SEQ ID NO:1および13のプライマーヌクレオチド配列をSEQ ID NO:3のプローブと共に使用したSARS-CoV-2遺伝子の増幅反応を示す。黒三角付きおよび黒菱形付きの曲線は、SEQ ID NO:1および2のプライマーヌクレオチド配列をSEQ ID NO:3のプローブと共に使用したSARS-CoV-2遺伝子の増幅反応を示す。黒星形付きの曲線は、SEQ ID NO:14および15のプライマーヌクレオチド配列ならびにSEQ ID NO:16のプローブを使用したSARS-CoV-2遺伝子の増幅反応を示す。白菱形付きの曲線は、SEQ ID NO:14および15のプライマーヌクレオチド配列ならびにSEQ ID NO:3のプローブを使用したSARS-CoV-2遺伝子の増幅反応を示す。白四角付きの曲線は、SEQ ID NO:1および2のプライマーヌクレオチド配列を使用し、プローブは使用しなかったSARS-CoV-2遺伝子の増幅反応を示す。 図１－１の説明を参照されたい。 SARS-CoV-2ゲノムならびにRT-qPCRプライマーおよびプローブが標的とする領域を例示する概略図。（A）概略図は、最初のChariteプロトコル、vDetect（v1およびv2）、ならびにrTest RT-qPCRアッセイのプライマーおよびプローブの位置を示すため、RdRP遺伝子およびE遺伝子の領域が拡大されている、SARS-CoV-2ゲノムを描写している。F、フォワードプライマー；P、プローブ；R、リバースプライマー。（B）図は、最初のChariteプロトコル、vDetect（v1およびv2）、ならびにrTest RT-qPCRアッセイのプライマーおよびプローブの配列を、Wuhan基準配列と比較している。赤紫色の線および文字は、vDetect v1において正しい塩基（青色の線および文字）に置換された、Chariteプロトコルのプライマーおよびプローブに見出される混合塩基を表す。 図２－１の説明を参照されたい。 図２－１の説明を参照されたい。 図２－１の説明を参照されたい。 ChariteのSARS-CoV-2 EおよびRdRPのためのプライマー/プローブセットの再設計および検証。（A）混合塩基の置換および融解温度の最適化によって再設計されたRdRP遺伝子リバースプライマーの性能。（B）ヒートマップは、LNA修飾チミン残基（LNA-T）を含む様々なE遺伝子フォワードプライマーおよび含まないプライマー、ならびにSARS-CoV-2鋳型またはE遺伝子合成陽性対照を混入させた試料を増幅するそれらの相対的な性能を示す。（C）E遺伝子アッセイ（左パネル）およびRdRP遺伝子アッセイ（右パネル）の両方の検出限界。Ct＝40の点線は、検出カットオフを示す。ND、検出されない。（D）2つの独立した研究所において実施されたvDetect v.1 E遺伝子アッセイ（左パネル）およびRdRP遺伝子アッセイ（右パネル）の両方の臨床評価。NDの点線および影付きの区域は、vDetect v.1アッセイ、インデックス検査アッセイのいずれか、または両方のアッセイについての検出カットオフおよび検出されなかった試料を示す。Ct、サイクル閾値；E、エンベロープ遺伝子；R、リバースプライマー；RdRP、RNA依存性RNAポリメラーゼ；NTC、鋳型対照なし。 図３－１の説明を参照されたい。 図３－１の説明を参照されたい。 rTEST COVID-19 qPCRの二重プローブ、分析感度、および臨床性能の評価。RdRP遺伝子（A、B）およびE遺伝子（C、D）の両方についての、分析感度（A、C）および蛍光強度（B、D）の、単一プローブと二重プローブとの間の比較。分析的検出限界は、所望の濃度に希釈されたSARS-CoV-2 Standard（Exact Diagnostics）を使用してトリプリケートで実施された。Ct 40の点線は、その後に増幅が無効と見なされる閾値として用いられる。NDは、検出されなかった試料を示す。*p＜0.05、**p＜0.01、****p＜0.001、****p＜0.0001。（E、F）ルーチンの臨床実務において使用されているインデックス検査（vDetect v.1）と比較された、rTEST COVID-19 qPCRキットのRdRP遺伝子アッセイ（E）およびE遺伝子アッセイ（F）の臨床性能。点線および影付きの区域は、評価検査、インデックス検査のいずれか、または両方の検査によって検出されなかった試料を示す。Ct、サイクル閾値；E、エンベロープ遺伝子；P、プローブ；RdRP、RNA依存性RNAポリメラーゼ；NTC、鋳型対照なし。 図４－１の説明を参照されたい。 図４－１の説明を参照されたい。 多重RT-qPCRアッセイの分析感度および臨床性能。（A、B）グラフは、rTEST Covid-19 qPCRマルチプレックス（Multiplex）キットにおける、EとRNase Pとの多重アッセイ（A）およびRdRPとRNase Pとの多重アッセイ（B）の分析感度を示す。（C）rTEST Covid-19 qPCRマルチプレックスキットの臨床性能。（D）rTEST Covid-19 qPCRオールプレックス（Allplex）キットにおける、EとRdRPとRNase Pとのトリプレックスアッセイの分析感度。（E）rTEST Covid-19 qPCRマルチプレックスキットの臨床性能。Ct 40の点線（A、B、およびD）は、その後に増幅が無効と見なされる閾値として用いられる。点線および影付きの区域（C、E）は、評価検査、インデックス検査のいずれか、または両方の検査によって検出されなかった試料を示す。Ct、サイクル閾値；E、エンベロープ遺伝子；RdRP、RNA依存性RNAポリメラーゼ；NTC、鋳型対照なし。NDは、検出されなかった試料を示す。 図５－１の説明を参照されたい。 図５－１の説明を参照されたい。 インフルエンザA型およびB型のゲノムならびにRT-qPCRプライマーおよびプローブが標的とする領域を例示する概略図。（A）概略図は、プライマーおよびプローブの位置を示すため、PB1遺伝子およびPA遺伝子の領域が拡大されている、インフルエンザA型およびB型のゲノムを描写している。赤色の文字で表されるヌクレオチドは、インフルエンザA型およびB型のコンセンサス配列における混合塩基を示す。BHQ2、ブラックホールクエンチャー2；F、フォワードプライマー；HA、赤血球凝集素；M、マトリックスタンパク質；NA、ノイラミニダーゼ；NP、核タンパク質；NS、非構造タンパク質；P、プローブ；PA、ポリメラーゼ酸性タンパク質；PB1、ポリメラーゼ塩基性1タンパク質；PB2、ポリメラーゼ塩基性2タンパク質；R、リバースプライマー；seg.、セグメント；YY、Yakima Yellow（登録商標）。 図６－１の説明を参照されたい。 図６－１の説明を参照されたい。 rTEST COVID-19/FLU qPCRキットの分析感度および臨床性能。（A、B）グラフは、rTEST COVID-19/FLU qPCRキットにおける、SARS-CoV-2 EとIAV PB1とRNase Pとの多重アッセイ（A）およびSARS-CoV-2 RdRPとIBV PAとRNase Pとの多重アッセイ（B）の分析感度を示す。（C）SARS-CoV-2 EおよびRdRP（両方ともFAMで標識）とIAV PB1およびIBV PA（両方ともYYで標識）とRNase Pとの多重アッセイの分析感度。（D）rTEST COVID-19/FLU qPCRキットの臨床性能。Ct 40の点線（A、B、およびC）は、その後に増幅が無効と見なされる閾値として用いられる。点線および影付きの区域（D）は、特定のアッセイによって検出されなかった試料を示す。Ct、サイクル閾値；E、エンベロープ遺伝子；IAV、インフルエンザA型；IBV、インフルエンザB型；PA、ポリメラーゼ酸性タンパク質；PB1、ポリメラーゼ塩基性1タンパク質；NTC、鋳型対照なし。RdRP、RNA依存性RNAポリメラーゼ。NDは、検出されなかった試料を示す。 図７－１の説明を参照されたい。 vDetect Covid-19 qPCRキットの最適化。（A）ヒートマップは、RT-qPCRを使用するHighQu 1Step qPCR Probe ROX Lキットの逆転写（RT）およびアニーリング温度の最適化を示す。（B）ヒートマップは、PCRおよびその後のゲル電気泳動を使用して、Agilent Brilliant III Ultra-Fast QRT-PCR Master Mixのために最適化されたパラメータを表示する。（C）RT-qPCRを使用したPCR/ゲル電気泳動（Bを参照すること）によって有益であると同定された3つの異なる温度プロファイルの比較。（D）より高いRT濃度の査定。（E）vDetect v.2 COVID-19 RT-qPCR検査のEアッセイおよびRdRPアッセイの分析感度（検出限界）の評価。A/E、アニーリング/伸長；Ct、サイクル閾値；E、エンベロープ遺伝子；D、変性；DTT、ジチオスレイトール；ID、初期変性；RdRP、RNA依存性RNAポリメラーゼ；NTC、鋳型対照なし。 図８－１の説明を参照されたい。 図８－１の説明を参照されたい。 室温安定型rTEST COVID-19 qPCRキットの最適化。（A）ヒートマップは、PCRおよびその後のゲル電気泳動を使用した、SOLIS BioDyne SOLIScript（登録商標）1-step CoVキットのサーモサイクルパラメータの最適化を示す。（B）RT-qPCRを使用した4つの異なる温度プロファイルの比較。（C、D）グラフは、1ヶ月間の、RdRP遺伝子（C）およびE遺伝子（D）のための凍結乾燥プライマー/プローブセットの安定性に対する、デコイ核酸（tRNAもしくはssDNA）または純粋なオリゴヌクレオチド（純粋）の効果を示す。（E）新鮮なrTEST COVID-19 qPCRキット、または室温で1か月間放置されたrTEST COVID-19 qPCRキットの、SARS-CoV-2 E遺伝子およびRdRP遺伝子ならびにヒトRNase Pの増幅に関する性能。A/E、アニーリング/伸長；Ct、サイクル閾値；E、エンベロープ遺伝子；D、変性；RdRP、RNA依存性RNAポリメラーゼ；ssDNA、サケ精子DNA；tRNA、パン酵母転移RNA。 図９－１の説明を参照されたい。 rTEST COVID-19 qPCRキットの最適化および検証。（A）プロットは、内部クエンチャーを含む（白色バー）、含まない（黒色バー）様々なRdRP遺伝子プローブの、増幅（左軸、ウィスカープロット）およびノーマライズされた蛍光（右軸、棒グラフ）に関する性能を示す。標準プローブ（P2）は、濃灰色で示され、最適プローブ（P8）は、青緑色で示され、他のプローブは、薄灰色で示される。（B）グラフは、増幅閾値に関するE遺伝子プローブの比較を図示する。標準プローブ（P1）は、黒色の記号として示され、最適プローブ（P1P2）は、赤紫色の記号として示され、他のプローブは、薄灰色の記号として示される。（C）rTEST Covid-19 qPCRキットにおけるE、RdRP、およびRNase Pのシングルプレックス（singleplex）アッセイの分析感度。（D）r rTEST Covid-19 qPCRキットの臨床性能評価前の、RNA分解を査定するための、解凍され、再抽出されたRNAを使用したvDetect v.1キットの臨床性能。 図１０－１の説明を参照されたい。
発明の詳細な説明
高感度かつ正確なRT-qPCR検査は、SARS-CoV-2感染患者を同定するための主要な診断ツールである。多くのSARS-CoV-2 RT-qPCR検査が利用可能であるが、検査感度、ワークフロー（例えば、ハンズオンタイム）、遺伝子標的、および使用者が考慮しなければならないその他の機能性については、相当の違いがある。基準研究所および公衆衛生当局によって共有されているいくつかの公に利用可能なプロトコルは、SARS-CoV-2診断のための有用なツールを提供するが、その多くが、感度および面倒なワークフローに関連する短所を有する。ここで、本発明者らは、Charite Institute of Virologyによって開発されたプロトコルに基づく、一連の改善されたSARS-CoV-2 RT-qPCR検査を記載する。注目すべきことに、WHOによって公開されたプロトコルの中に、SARS-CoV2に由来する少なくとも2つの異なる遺伝子を検出するため、同時PCR法（多重PCR法）を適用するものはない。しかしながら、多重PCR法に関する莫大な経験に基づき、本発明者らは、本発明の1つの局面において、SARS-CoV-2 E遺伝子およびRdRP遺伝子ならびに対照としてのヒトRNase Pを検出するための同時PCR法を適用し、多重化が良好に機能することを見出した。以下に説明されるように、多重化の原理は、本明細書に記載される本発明の様々な他のPCR法に適用される。
従って、本発明は、少なくともSARS-CoV-2 RdRP遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともSARS-CoV-2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、および少なくともヒトRNase P遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列を用いて同時増幅工程を実施する段階を含むPCR法に関する。
PCR法は、当業者に周知である。PCR技術においては、DNA二重鎖の各鎖の3'末端に相補的であるよう調製された、モル過剰の少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマー；モル過剰のヌクレオチド塩基（即ち、dNTP）；およびオリゴヌクレオチドプライマーおよびdNTPからのDNAの形成を触媒する熱安定DNAポリメラーゼ（好ましくは、Taqポリメラーゼ）と、DNAの試料を、溶液中で混合する。プライマーのうち、少なくとも1つは、変性したDNA分析物の一方の鎖の3'末端に5'から3'の方向に結合するフォワードプライマーであり、もう1つは、変性したDNA分析物の他方の鎖の5'末端に3'から5'の方向に結合するリバースプライマーである。二本鎖DNAを一本鎖DNAに変性させるため、溶液を94～96℃に加熱する。溶液が冷却され、いわゆるアニーリング温度に達した時、プライマーが、分離された鎖に結合し、DNAポリメラーゼが、dNTPをプライマーと接合することによって、分析物の新しい鎖を触媒する。この過程が繰り返され、プライマーから合成された伸長産物が、相補鎖から分離された時、各伸長産物は、他方のプライマーから合成される相補的な伸長産物のための鋳型として用いられる。増幅される配列は、各サイクル後に2倍になるため、この過程を数時間繰り返した後には、理論上、莫大なコピー数の増幅が達成され得；従って、PCRを使用すれば、極めて少量のDNAが、比較的短い期間で増幅され得る。
本発明の好ましいPCR法は、リアルタイム逆転写酵素PCRまたは「リアルタイムRT-PCR」である。それは、定量的RT-PCR（qRT-PCR）と呼ばれることもある。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）は、RNAのcDNAへの逆転写と、ポリメラーゼ連鎖反応（本明細書の他の箇所で定義されるPCR）を使用した特定のDNA標的の増幅とを組み合わせた公知の実験技術である。それは、主に、特定のRNAの量を測定するために使用される。これは、蛍光を使用した増幅反応のモニタリングによって達成され、この技術は、リアルタイムPCRまたは定量的PCR（qPCR）と呼ばれる。RT-PCRとqPCRとの組み合わせは、研究および臨床現場において、遺伝子発現の分析およびウイルスRNAの定量化のためにルーチンのために使用されている。該技術は当業者に公知である。簡単に説明すると、この方法は、プローブの一方の末端に蛍光レポーターを有し、反対側の末端に蛍光のクエンチャーを有する、DNAベースのプローブに頼る。本発明に関して、蛍光レポーターは、好ましくは、HEX（ヘキサクロロ-フルオレセイン）またはFAM（カルボキシフルオレセイン）またはYY（Yakima Yellow）またはCy5（シアニン5）またはATTO-647Nであり、クエンチャーは、好ましくは、BHQ1またはBHQ2またはBHQ3（Black Hole Quencher（登録商標）色素）である。レポーターとクエンチャーとの近接は、蛍光の検出を防止する；Taqポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性によるプローブの分解は、レポーターとクエンチャーとの近接を壊し、従って、蛍光の消光されない放出を可能にし、それが、レーザーによる励起後に検出され得る。従って、各PCRサイクルにおけるレポータープローブが標的とする産物の増加は、プローブの分解およびレポーターの放出による蛍光の比例的な増加を引き起こす。RT-qPCRの一般的な工程は、RNA単離、逆転写、およびそれに続くPCRである。RNA単離、逆転写、およびPCRのためのプロトコルは、一般的に公知であり、例えば、前記引用のCorman et al.(2020)に記載されているか、またはhttps://www.fda.gov/media/134922/download、https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn＝a9ef618c_2において入手可能である。
（i）PCRを（本明細書の他の箇所で定義されるように）通常通りに調製し、レポータープローブを添加する。（ii）反応が始まると、PCRのアニーリング段階で、プローブおよびプライマーの両方が核酸標的にアニーリングする。（iii）新しい核酸鎖の重合がプライマーから開始され、ポリメラーゼがプローブに到達すると、その5'-3'-エキソヌクレアーゼが、プローブを分解し、蛍光レポーターをクエンチャーから物理的に分離し、蛍光の増加をもたらす。（iv）蛍光がリアルタイムPCR機で検出され、測定され、各反応における定量化サイクル（quantification cycle）（Cq）を決定するため、産物の指数関数的増加に対応する、その幾何学的増加が使用される。
本発明のRT-PCR法は、例えば、Corman et al.2020（Corman VM,Landt O,Kaiser M Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR）またはhttps://www.who.int/docs/default source/coronaviruse/whoinhouseassays.pdf?sfvrsn=de3a76aa_2において入手可能なWHOインハウスプロトコルに記載されるように実施され得る。具体的には、生物学的試料に由来するRNAは、AMPIXTRACT（商標）SARS-CoV-2 ExtractionキットまたはKit Extraction NucleoSpin Dx VirusまたはQIAmp DSP Viral RNA MiniキットまたはEZ1 DSP VirusキットまたはbioMerieux NucliSENS（登録商標）easyMAG（登録商標） 等を使用することによって得られた。
好ましくは、PCR法は、RT-LAMPであり得る。逆転写ループ媒介等温増幅（RT-LAMP）は、RNAの増幅のための技術である。RT-LAMPは、典型的なPCRサイクルを必要とせず、60～65℃の一定温度で実施される。RT-PCRと同様に、RT-LAMPは、RNA配列から相補的DNA（cDNA）を合成するため、逆転写酵素を使用する。この方法は、RNAゲノムを有するウイルスの検出において極めて有効であり得る。
本発明のPCR法は、好ましくは、同時増幅工程を含み、換言すると、「多重PCR法」または「多重アッセイ」である。本明細書において使用されるように、多重アッセイは、SARS-CoV-2の異なる標的核酸を同時に増幅し、同定するために適当なアッセイであり得る。本発明によると、多重アッセイは、好ましくは、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子、SARS-CoV-2 E遺伝子、およびヒトRNase P遺伝子を同時にスクリーニングする。これに関して、ヒトRNase P遺伝子は、内部対照として使用される。
多重アッセイは、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子およびSARS-CoV-2 E遺伝子をスクリーニングすることも好ましい。多重アッセイは、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子およびヒトRNase P遺伝子をスクリーニングすることも好ましい。
多重アッセイは、SARS-CoV-2 E遺伝子およびヒトRNase P遺伝子をスクリーニングすることも好ましい。
多重アッセイは、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子および固有スパイクRNAをスクリーニングすることも好ましい。
多重アッセイは、SARS-CoV-2 E遺伝子および固有スパイクRNAをスクリーニングすることも好ましい。
多重アッセイは、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子、SARS-CoV-E遺伝子、ヒトRNase P遺伝子、および固有スパイクRNAをスクリーニングすることも好ましい。
いくつかの局面において、本発明は、本明細書に開示されるプライマーおよびプローブの改善されたヌクレオチド配列、具体的には、本明細書に開示される二重プローブ、ならびに本発明の手段および方法の感度および特異度を増強するための改善されたPCR反応条件に関する。RNase P内部対照を組み込み、SARS-CoV-2とインフルエンザA型およびB型とを区別するための多重アッセイを開発することによって、本発明は、より迅速な結果を提供し、消耗品のコストを低下させるため、PCRワークフローを合理化する。好ましくは、本発明の手段および方法は、室温安定型マスターミックスおよび凍結乾燥陽性対照を使用することができ、それによって、本発明のPCR法の機能性を増加させ、輸送および保管のコールドチェーンを排除することができる。本発明のRT-qPCR法は、任意の診断検査室において容易に実行され得、パンデミックのワクチン接種期に、SARS-CoV-2および最も一般的な季節性インフルエンザを検出するための強力なツールを提供することができる。
本明細書に記載されるように、UniProtKBアクセッション番号（例えば、2021年2月10日に公開されたUniProtリリース2021_01において入手可能な、http://www.uniprot.org/）を参照することができる。本明細書に記載されるように、NCBI GenBankアクセッション番号（例えば、2021年2月15日に公開されたリリース242.0において入手可能な、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/release/current/）を参照することができる。
「プライマーヌクレオチド配列」とは、本明細書において使用されるように、当技術分野において一般的に公知である、核酸鎖を合成するためのポリメラーゼのプライマーまたはスターターとして使用されるオリゴヌクレオチドを意味する。本明細書において、この用語は、フォワードプライマーまたはリバースプライマーのように「プライマー」と略記されることもある。プライマーおよびプローブは、当技術分野において公知の方法によって設計/合成された。本発明のPCR法において使用するためのプライマーおよびプローブは、例えば、OLIGO（Molecular Biology Insights,Inc.,Cascade,Colo.）などのコンピュータプログラムを使用して設計され得る。増幅プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを設計する時の重要な特色には、検出を容易にするための増幅産物の適切なサイズ、プライマー対のメンバーの類似した融解温度、および各プライマーの長さ（即ち、プライマーは、配列特異的にアニーリングし、合成を開始するために十分に長いが、オリゴヌクレオチド合成中のフィデリティが低下するほど長くはない必要がある）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーは、15～30ヌクレオチド長である。プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドの設計は、プライマーの設計と同様に実施され得るが、プローブ対のメンバーは、好ましくは、増幅産物にアニーリングする。オリゴヌクレオチドプライマーと同様に、オリゴヌクレオチドプローブは、通常、類似した融解温度を有し、各プローブの長さは、配列特異的ハイブリダイゼーションが起こるために十分に長いが、合成中のフィデリティが低下するほど長くはないものでなければならない。オリゴヌクレオチドプローブは、一般に、15～30ヌクレオチド長である。本発明に関して有用なプライマーには、SARS-CoV-2ウイルスに由来する核酸の増幅のためのPCR反応において適当なオリゴヌクレオチドが含まれる。具体的には、本発明に関して、SEQ ID NO:1および2のプライマーが、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子の増幅のために使用され、SEQ ID NO:4または22および5のプライマーが、SARS-CoV-2 E遺伝子の増幅のために使用され、SEQ ID NO:7および8のプライマーが、ヒトRNase Pの増幅のために使用される。また、本発明に関して、SEQ ID NO:3のヌクレオチド配列を含むプローブが、RdRP遺伝子の増幅のため、SEQ ID NO:1および2のプライマーと組み合わせて使用され、SEQ ID NO:6のヌクレオチド配列を含むプローブが、E遺伝子の増幅のため、SEQ ID NO:4または22および5のプライマーと組み合わせて使用され、SEQ ID NO:9のヌクレオチド配列を含むプローブが、ヒトRNase P遺伝子の増幅のため、SEQ ID NO:7および8のプライマーと組み合わせて使用され、SEQ ID NO:19のヌクレオチド配列を含むプローブが、固有スパイクRNAの増幅のため、SEQ ID NO:17および18のプライマーと組み合わせて使用される。
前記のように、繰り返しになるが、WHOによって公開されたプロトコルの中に、具体的には、SARS-CoVに由来する少なくとも1つの遺伝子および対照としてのヒト遺伝子を検出するための同時PCR法（多重PCR法）のため、多重化の原理を適用するものはない。
従って、さらなる局面において、本発明は、
（i）少なくともSARS-CoV-2 RdRPのためのプライマーヌクレオチド配列および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を用いて同時増幅工程を実施する段階を含む、第1のPCR法；ならびに/または（「ならびに」が好ましい）
（ii）少なくともSARS-CoV-2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を用いて同時増幅工程を実施する段階を含む、第2のPCR法
を含むPCR法であって、SARS-CoV-2核酸を含むことが疑われる同じ起源材料が（i）および（ii）のPCRのために使用される、PCR法に関する。
「起源材料」という用語は、本明細書において使用されるように、SARS-CoV-2の有無について検査され得る、任意の材料、好ましくは、例えば、哺乳動物、具体的には、ヒトまたは動物対象に由来する、生物学的材料を含む。疑いの回避のため、起源材料は、処理された後、試料をもたらす。従って、「起源材料」という用語は、「試料」という用語を包含する。試料には、非限定的に、任意の器官から得られる組織、例えば、肺組織；ならびに体液、例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、滑液、脳脊髄液、羊水、臍帯血、涙、咽頭または鼻腔のスワブ、唾液、口腔洗浄液（例えば、含嗽液）、および鼻咽頭洗浄液が含まれ得る。便、尿、または精子も、「起源材料」という用語に含まれる。本発明に関して、起源材料は、ウイルス輸送用培地を含む、または含まない、患者から得られた痰ならびに鼻および咽頭のスワブであり得る。起源材料は、本発明のPCR法に供される時、SARS-CoV-2核酸を含むと一応疑われる。従って、起源材料は、核酸、好ましくは、RNA、より好ましくは、ウイルスRNA、具体的には、SARS-CoV-2 RNAの単離を提供する工程に供されることが好ましい。
「同じ」起源材料とは、1つの同じ起源材料のアリコート、例えば、そこから単離されたRNAが、本明細書に記載されるPCR法のために使用されることを意味する。
第1および第2のPCR法は、並行して、即ち、同じ条件下で、例えば、同じ試薬、ツール、または装置等を使用して実施されることが好ましい。
これまで、SARS-CoV-2遺伝子の検出に加えて、RNA単離についての同時対照、スワブ対照、陽性対照等も含むアッセイを提供しているWHOプロトコルはない。理想的には、対照およびSARS-CoV-2遺伝子の検出は、1つの同じ方法で行われる。
従って、繰り返しになるが、同時（多重）PCR法を使用することによって、本発明は、
（i）少なくともSARS-CoV2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列および少なくとも固有スパイクRNAのためのプライマーヌクレオチド配列を用いて同時増幅工程を実施する段階を含む、第1のPCR法；
（ii）少なくともSARS-CoV-2 RdRP遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を用いて同時増幅工程を実施する段階を含む、第2のPCR法；ならびに
（iii）少なくともSARS-CoV-2 RdRP遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともSARS-CoV-2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列、および少なくとも固有スパイクRNAのためのプライマーヌクレオチド配列を用いて同時増幅工程を実施する段階を含み、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子についての固有RNA、SARS-CoV-2 E遺伝子についての固有RNA、ヒトRNase Pについての固有RNAをさらに含む、第3のPCR法
を含むPCR法であって、
SARS-CoV-2核酸を含むことが疑われる同じ起源材料が（i）および（ii）のPCR法のために使用され、
（iii）のPCR法が、陽性対照として、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子のリボ核酸、SARS-CoV-2 E遺伝子のリボ核酸、ヒトRNase Pのリボ核酸、および固有スパイクRNAのリボ核酸をさらに含む、PCR法をさらに企図する。
第1、第2、および第3のPCR法は、並行して、即ち、同じ条件下で、例えば、同じ試薬、ツール、または装置等を使用して実施されることが好ましい。
固有スパイクRNAとは、本明細書において使用されるように、既知の配列のRNAをさす。それは、好ましくは、ヒトおよびSARS-CoV-2には存在しない。それは、ヒトおよびSARS-CoV-2の核酸配列の生物情報学的データに基づき、設計され得る。それは、起源材料に追加（spiked）された場合、例えば、RNA単離が機能したか否か、PCR法に適用された反応条件が機能したか否か等の対照として、本発明のPCR法において使用され得る。
本発明に関して、具体的には、本発明のPCR法において使用される固有スパイクは、SEQ ID NO:20に記載の配列を有するリボ核酸である。それは、SEQ ID NO:21に示されるヌクレオチド配列から転写され得る。
最も広く使用される「陽性対照」という用語は、関心対象の（標的）遺伝子を保持する外的なDNAまたはRNA（RNAが好ましい）の使用をさす。これらの陽性対照は、実験試料とは別のウェル/チューブでアッセイされた場合、例えば、逆転写および/またはPCR反応が機能したか否か、適用された条件が適切であったか否かを決定するための対照として用いられる。さらに、外因性のDNAまたはRNA（RNAが好ましい）は、実験試料、スワブ等に追加され、例えば、関心対象の（標的）遺伝子と並行して、または、好ましくは、多重形式でアッセイされ得る。これらの対照反応は、例えば、試料もしくは起源材料が逆転写および/もしくはPCRを阻害する成分を含有するか否か、またはスワブからの核酸、例えば、RNAの単離が機能したか否かを査定することができる。
陽性対照は、SARS-CoV-2に由来する核酸配列、具体的には、RNAであり得る。これらは、例えば、合成によって得られたウイルスRNAとして入手可能であり、合成によって得られたウイルスRNAは、例えば、EDX SARS-CoV-2 Standard（http://www.exactdiagnostics.com/sars-cov-2-standard.html）のようなキットの形態で購入され得る。あるいは、SARS-CoV-2は、化学的方法、酵素的方法によって合成されてもよいし、または分子クローニングもしくはインビトロ転写によって生成されてもよい（https://www.twistbioscience.com/sites/default/files/resources/2020-03/Product%20Sheet%20_NGS_SyntheticSARS-CoV-2_RNAControls_17MAR20_Rev1.pdfを参照すること）。あるいは、ウイルス核酸は、当業者に公知の方法によって、SARS-CoV-2ウイルスから単離されてもよい。例えば、細胞を溶解し、ビーズまたはカラムを介してRNAを分離し、塩およびエタノールでRNAを洗浄し、次いで、精製されたRNAを水で溶出させる市販のキットが使用される。例えば、前記のSARS-CoV-2 RNAは、本発明のPCR法の反応条件の設定および/または試験のためにも使用され得る。
本発明に関して、陽性対照は、好ましくは、SEQ ID NO:10に記載の配列を有するリボ核酸、SEQ ID NO:11または23に記載の配列を有するリボ核酸、SEQ ID NO:12に記載の配列を有するリボ核酸であり得る。
本発明によると、具体的には、ドイツのChariteのアッセイ（例えば、前記引用のCorman et al.(2020)を参照すること）より高特異度の、生物学的試料中のSARS-CoV-2ウイルス核酸を検出するためのPCR法が、本明細書に記載される。具体的には、本発明者らは、ドイツのChariteのプロトコル（例えば、前記引用のCorman et al.(2020)を参照すること）を実施した時、具体的には、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子について、特異度が満足のいくものではないことを観察した。後述のように、本発明者らは、ドイツのChariteのプロトコルを改善することを試み、とりわけ、特異度を有意に改善する異なるプライマーヌクレオチド配列を使用することによって、それに成功した。
即ち、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子の検出に関して、本発明者らは、公開されたプライマーヌクレオチド配列（SEQ ID NO:14および15）ならびにプローブ（SEQ ID NO:16）（表1のウェル名「P1ユーロフィン」）を使用した時に、主要な特異度の課題を観察した。実際、Ct（dRn）は観察されなかった。従って、本発明者らは、この特異度の課題に種々の方式で取り組み、成功裏に解決することができた。
第1に、SEQ ID NO:16を有するプローブの全ての縮重ヌクレオチドを非縮重ヌクレオチド、即ち、特異的ヌクレオチドに変換し、それによって、SEQ ID NO:3を有するプローブを得た。プライマーヌクレオチド配列（SEQ ID NO:14および15）ならびにSEQ ID NO:3を有するプローブ（表1のウェル名「P2ユーロフィン」）を使用したところ、「P1ユーロフィン」（Ct（dRN）なし）とは対照的に、特異度（Ct（dRN）＝34.26）が改善された。
第2に、34.26という特異度は依然として満足のいくものではなかったため、本発明者らは、SEQ ID NO:14および15のプライマーヌクレオチドの縮重ヌクレオチドを非縮重ヌクレオチド、即ち、特異的ヌクレオチドに変換し、それによって、それぞれ、SEQ ID NO:1および13を有するプライマーヌクレオチド配列を得た。これらのプライマーヌクレオチド配列（SEQ ID NO:1および13）を、SEQ ID NO:3を有するプローブと共に使用したところ（表1のウェル名「R1 MDX」）、「P2ユーロフィン」（Ct（dRN）＝34.26）とは対照的に、特異度（Ct（dRN）＝32.89）がさらに改善された。
最後に、「R1 MDX」（表1を参照すること）の特異度をさらに改善することを試み、本発明者らは、SEQ ID NO:1および2を有するプライマーヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:3を有するプローブと共に使用された時（表1のウェル名「R2 MDX」および「R2新MDX」）、「R1 MDX」（Ct（dRN）＝32.89）とは対照的に、さらに改善された特異度（Ct（dRN）＝31.17および31.18）を付与することを観察した（表1を参照すること）。
陰性対照として、SEQ ID NO:1および2を有するプライマーヌクレオチド配列を使用し、プローブは使用しなかった（ウェル名「R2新MDX ntc」）。図1の対応する曲線は、白四角によって印付けされている。
従って、Chariteプロトコルによる縮重プライマーヌクレオチド配列および/または縮重プローブ（例えば、前記引用のCorman et al.(2020)を参照すること）を、非縮重プライマーヌクレオチド配列に変換するだけでは、SARS-CoV-RdRP遺伝子の検出を改善するために十分ではなかった。さらなる改善が必要であり、従って、本発明者らは、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子の増幅工程のための、新たに設計されたリバースプライマーヌクレオチド配列を提供する。
従って、本発明は、少なくともSEQ ID NO:1および2に記載のヌクレオチド配列を用いて増幅工程を実施する段階を含むPCR法を提供する。
前記説明のように、本発明者らは、任意で、SEQ ID NO:3を有するプローブと共に用いられる、SEQ ID NO:1および2を有するプライマーヌクレオチド配列が、一般的に使用されている、任意で、SEQ ID NO:3または16を有するプローブと共に用いられる、SEQ ID NO:14および15を有するプライマーヌクレオチド配列と比べて、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子の検出に関して、はるかに改善された特異度を提供することを見出した。実際、SARS-CoV-2 E遺伝子についての30.21というCtを、SARS-CoV-2 RdRPについての31.17および31.18というCtを比較すると、SARS-CoV-2 E遺伝子とSARS-CoV-2 RdRP遺伝子との間には、1Ct未満の差があることが明らかである。これは、本願において記載されるSARS-CoV-2の検出方法の大幅な改善である。
SARS-CoV-2を検出するためのプライマー、具体的には、SEQ ID NO:1および2に記載のプライマーヌクレオチド配列、ならびにプローブも提供され、そのようなプライマーおよび/またはプローブを含有するキットも提供される。
SARS-CoV-2の検出のためのPCR法の感度の増加およびPCRプライマーの特色の改善は、SARS-CoV-2感染の正確かつ信頼性のある診断のための、このテクノロジーの実行を実現可能にする。
本明細書において使用される時、「ポリヌクレオチド」、「核酸」、または「核酸分子」という用語は、同義的に解釈されるべきである。一般に、核酸分子には、とりわけ、DNA分子（例えば、cDNA、相補的DNA）、RNA分子（例えば、miRNA、mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、siRNA、scRNA、snoRNA、および当技術分野において公知のその他のもの）が含まれ得る。さらに、「核酸分子」という用語は、DNAもしくはRNAもしくはそれらのハイブリッド、または当技術分野において公知であるそれらの任意の修飾、例えば、ロックド核酸（LNA）をさし得る（修飾の例については、例えば、US 5525711、US 471 1955、US 5792608、またはEP 302175を参照すること）。ポリヌクレオチド配列は、一本鎖または二本鎖、直鎖状または環状、天然または合成であり得、サイズは限定されない。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ゲノムDNA、cDNA、ミトコンドリアDNA、mRNA、アンチセンスRNA、リボソームRNA、またはそのようなRNAをコードするDNA、またはキメロプラスト（chimeroplasts）（Gamper,Nucleic Acids Research,2000,28,4332-4339）であり得る。ポリヌクレオチド配列は、ベクター、プラスミド、またはウイルスのDNAもしくはRNAの形態であり得る。前記の核酸分子に相補的である核酸分子、および本明細書に記載の核酸分子にハイブリダイズすることができる核酸分子も、本明細書に記載される。本明細書に記載される核酸分子は、本発明に関して、核酸分子の断片であってもよい。具体的には、そのような断片は、機能性断片である。そのような機能性断片の例は、プライマーとして用いられ得る核酸分子である。
SARS-CoV-2由来の「遺伝子」とは、例えば、SARS-CoV-2 E遺伝子またはSARS-CoV-2 RdRP遺伝子に関して、本明細書において使用される時、それぞれ、SARS-CoV-2 Eタンパク質またはSARS-CoV-2 RdRPタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ORF）を含むヌクレオチド配列、好ましくは、RNA、例えば、SARS-CoV-2 E RNAまたはSARS-CoV-2 RdRP RNAを意味する。「E」は、エンベロープタンパク質を表し、「RdRP」は、「RNA依存性RNAポリメラーゼ」を表す。該用語には、SARS-CoV-2由来の遺伝子の断片、例えば、50、75、100、150ヌクレオチド長またはそれ以上のRNA断片も含まれる。本明細書において使用される時、「遺伝子」という用語は、「SARS-CoV-2 E」または「SARS-CoV-2 RdRP」に関して、省略されることもある。従って、「SARS-CoV-2 E」という用語は、本明細書において使用される時、「SARS-CoV-2 E遺伝子」と等価であり、その逆も同様であり、または「SARS-CoV-2 RdRP」という用語は、本明細書において使用される時、「SARS-CoV-2 RdRP遺伝子」と等価であり、その逆も同様である。
同様に、IBV（即ち、インフルエンザB型ウイルス）またはIAV（即ち、インフルエンザA型ウイルス）に由来する「遺伝子」は、例えば、IBV PA遺伝子またはIAV PB1遺伝子に関して、本明細書において使用される時、それぞれ、IBV PAタンパク質またはIAV PB1タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ORF）を含むヌクレオチド配列、好ましくは、RNA、例えば、IBV PA RNAまたはIAV PB1 RNAをさすことができる。「PB1」は、RNA依存性RNAポリメラーゼ触媒サブユニットを表し、「PA」は、「ポリメラーゼ酸性タンパク質」を表す。該用語には、IBV（即ち、インフルエンザB型ウイルス）またはIAV（即ち、インフルエンザA型ウイルス）に由来する遺伝子の断片、例えば、RNA断片、例えば、50、75、100、150ヌクレオチド長またはそれ以上のものも含まれる。本明細書において使用される時、「遺伝子」という用語は、「IBV PA」または「IAV PB1」に関して、省略されることもある。従って、「IBV PA」という用語は、本明細書において使用される時、「IBV PA遺伝子」と等価であり、その逆も同様であり、または「IAV PB1」という用語は、本明細書において使用される時、「IAV PB1遺伝子」と等価であり、その逆も同様である。
ヒト由来の「遺伝子」、例えば、RNase P遺伝子とは、本明細書において使用される時、ヒトRNase Pタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ORF）を含むヌクレオチド配列、好ましくは、RNA、例えば、ヒトRNase P RNAを意味する。該用語には、ヒトRNase P由来の遺伝子の断片、例えば、RNA断片、例えば、50、75、100、150ヌクレオチド長またはそれ以上のものも含まれる。本明細書において使用される時、「遺伝子」という用語は、「ヒトRNase P」に関して、省略されることもある。従って、「ヒトRNase P」という用語は、本明細書において使用される時、「ヒトRNase P遺伝子」と等価であり、その逆も同様である。
SARS-CoV-2ウイルスはRNAウイルスであるため、本発明によるPCR法は、逆転写工程と、増幅工程およびハイブリダイゼーション工程を含む少なくとも1つのサイクリング工程とを含み得る。SARS-CoV-2の場合のように、PCR反応の出発物質がRNAである場合には、逆転写を介して、RNAから相補的DNA（「cDNA」）が合成される。次いで、得られたcDNAが、PCRプロトコル、例えば、前記のものを使用して増幅される。逆転写酵素は、鋳型としてのmRNA配列から、DNAの相補的な一本鎖を合成することができる、レトロウイルスに見出される酵素として当業者に公知である。RNA産物を増幅するために使用されるPCRは、逆転写酵素PCRまたは「RT-PCR」と呼ばれる。「RT-PCR」は、本発明の好ましいPCR法である。
「アンプリコン」という用語は、本明細書において使用されるように、PCR増幅の起源および産物である核酸をさし得る。
従って、本発明のPCR法は、少なくとも固有スパイクRNAのためのプライマーヌクレオチド配列を用いて、増幅工程、好ましくは、同時増幅工程を実施する段階をさらに含み得る。好ましくは、固有スパイクRNAの増幅工程は、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子の増幅工程、またはSARS-CoV-2 E遺伝子の増幅工程、またはヒトRNase P遺伝子の増幅工程と同時に実施される。好ましくは、固有スパイクRNAの増幅工程は、SARS-CoV-2 E遺伝子およびヒトRNase P遺伝子の増幅工程、またはSARS-CoV-2 RdRP遺伝子およびヒトRNase P遺伝子の増幅工程と同時に実施される。好ましくは、固有スパイクRNAの増幅工程は、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子の増幅工程、SARS-CoV-2 E遺伝子の増幅工程、およびヒトRNase P遺伝子の増幅工程と同時に実施される。本明細書において説明されるように、固有スパイクRNAは、好ましくは、対照として用いられる。
具体的には、本発明のPCR法によると、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子の増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:1および2に記載のプライマーヌクレオチド配列が使用される。さらに、本発明のPCR法によると、SARS-CoV-2 E遺伝子の増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:4または22および5に記載のプライマーヌクレオチド配列が使用される。本発明のPCR法によると、ヒトRNase P遺伝子の増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:7および8に記載のプライマーヌクレオチド配列が使用される。さらに、本発明のPCR法によると、固有スパイクRNAの増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:17および18に記載のプライマーヌクレオチド配列が使用される。
前記のように、本発明は、少なくともSEQ ID NO:1および2に記載のプライマーヌクレオチド配列を用いて増幅工程を実施する段階を含むPCR法に関する。具体的には、SEQ ID NO:1および2のプライマーは、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子の増幅のために使用される。本発明者らは、より高い特異度を有するPCR法をもたらす、SARS-CoV-2ウイルス由来の核酸の増幅のためのPCR反応において適当なプライマーオリゴヌクレオチドを設計し、合成した。具体的には、本発明者らは、驚くべきことに、SEQ ID NO:1および2のプライマーの組み合わせを使用したSARS-CoV-2 RdRP遺伝子の増幅が、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子のためのより高い特異度を有するPCR法をもたらすことを見出した（図1および表1を参照すること）。具体的には、SEQ ID NO:1のプライマーは、SEQ ID NO:14のプライマーヌクレオチド配列の縮重ヌクレオチドを非縮重ヌクレオチド、即ち、特異的ヌクレオチドに変換し、それによって、SEQ ID NO:1を有するプライマーヌクレオチド配列を得ることによって生成されたフォワードプライマーである。このプライマーにおいては、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子を増幅するために一般的に使用されている混合塩基が、700の既知のSARS-CoV-2ゲノムのコンセンサス配列に基づき、ヌクレオチド「A」に置換された。SEQ ID NO:2のプライマーは、本発明者らが設計したSARS-CoV-2 RdRP遺伝子の増幅のためのリバースプライマーであり、SEQ ID NO:1のフォワードプライマーと共に使用した時、公知の一般的に適用されているドイツのChariteのPCR法の大幅な改善が観察された（例えば、前記引用のCorman et al.(2020)を参照すること）。本発明者らは、驚くべきことに、前記定義のSEQ ID NO:1および2のプライマーの組み合わせが、SARS-CoV-2核酸検出のための、より優れた特異度を有するPCR法をもたらすことを見出した。
本発明は、少なくともSEQ ID NO:4または22および5に記載のプライマーヌクレオチド配列を用いて増幅工程を実施する段階をさらに含むPCR法にも関する。SEQ ID NO:4または22および5のプライマーは、SARS-CoV-2 E遺伝子の増幅のために使用される。好ましくは、PCR法は、少なくともSEQ ID NO:1および2のプライマー、ならびに少なくともSEQ ID NO:7および8のプライマーを用いて増幅工程を同時に実施する段階を含む多重RT-PCRである。SEQ ID NO:7および8のプライマーは、ヒトRNase Pを増幅するために使用される。
好ましくは、PCR法は、少なくともSEQ ID NO:1および2のプライマー、ならびに少なくともSEQ ID NO:4または22および5のプライマー、ならびに少なくともSEQ ID NO:7および8のプライマーを用いて増幅工程を同時に実施する段階を含む多重RT-PCRである。
さらに、PCR法は、本明細書の他の箇所で定義される固有スパイクRNAの増幅のため、少なくともSEQ ID NO:17および18に記載のプライマーヌクレオチド配列を用いて増幅工程を実施する段階をさらに含み得る。
従って、PCR法は、少なくともSEQ ID NO:1および2のプライマー、ならびに少なくともSEQ ID NO:17および18のプライマーを用いて増幅工程を同時に実施する段階を含む多重RT-PCRであることも好ましい。PCR法は、少なくともSEQ ID NO:1および2のプライマー、少なくともSEQ ID NO:4または22および5のプライマー、ならびに少なくともSEQ ID NO:17および18のプライマーを用いて増幅工程を同時に実施する段階を含む多重RT-PCRであることも好ましい。PCR法は、少なくともSEQ ID NO:1および2のプライマー、少なくともSEQ ID NO:4または22および5のプライマー、少なくともSEQ ID NO:7および8のプライマー、ならびに少なくともSEQ ID NO:17および18のプライマーを用いて増幅工程を同時に実施する段階を含む多重RT-PCRであることも好ましい。
本発明のPCR法は、（RdRP遺伝子の増幅のため）SEQ ID NO:3に記載のヌクレオチド配列を含む、本明細書の他の箇所で定義されるプローブをさらに含む。具体的には、本発明者らは、SEQ ID NO:16を有するプローブの全ての縮重ヌクレオチドを非縮重ヌクレオチド、即ち、特異的ヌクレオチドに変換し、それによって、SEQ ID NO:3を有するプローブを得ることによって、SEQ ID NO:3のプローブを生成した。本発明のPCR法は、（E遺伝子の増幅のため）SEQ ID NO:6に記載のヌクレオチド配列を含むプローブをさらに含む。本発明のPCR法は、（ヒトRNase Pの増幅のため）SEQ ID NO:9に記載のヌクレオチド配列を含むプローブをさらに含む。本発明のPCR法は、（固有スパイクRNAの増幅のため）SEQ ID NO:19に記載のヌクレオチド配列を含むプローブをさらに含む。一般的に使用されているプローブの例は、TAQMAN（登録商標）プローブ、モレキュラービーコンプローブ、SCORPION（登録商標）プローブ、およびSYBR（登録商標）グリーンプローブである。本発明に関して、TaqMan（登録商標）プローブの使用が好ましい。TaqManプローブは、オリゴヌクレオチドプローブの5'末端に共有結合的に付着したフルオロフォアと、3'末端のクエンチャーとからなる。いくつかの異なるフルオロフォア（例えば、6-カルボキシフルオレセイン、頭字語：FAM、またはテトラクロロフルオレセイン、頭字語：TET）およびクエンチャー（例えば、テトラメチルローダミン、頭字語：TAMRA、またはBlack Hole Quencher（登録商標）色素）が利用可能である。具体的には、本発明に関して、SEQ ID NO:3および6のプローブは、FAMフルオロフォアによって標識され、SEQ ID NO:9および19のプローブは、HEXフルオロフォアによって標識される。
さらに、本発明のPCR法は、本明細書の他の箇所で定義される陽性対照をさらに含んでいてよく、具体的には、SEQ ID NO:10に記載の配列を有するリボ核酸が、RdRP遺伝子の陽性対照として使用され、SEQ ID NO:11または23に記載の配列を有するリボ核酸が、E遺伝子の陽性対照として使用され、SEQ ID NO:12に記載の配列を有するリボ核酸が、ヒトRNase P遺伝子の陽性対照として使用される。
本発明は、本明細書の他の箇所において定義される、例えば、試料中のSARS-CoV-2核酸を検出するための、キットにも関する。キットは、本発明の方法を実施するために必要な成分を含み得る。本発明のキットは、SARS-CoV-2核酸の増幅のための少なくとも1対の特異的プライマー、および増幅産物と特異的にハイブリダイズする少なくとも1つのプローブを含むことができる。キットは、プライマーもしくはプローブを標識するためのフルオロフォア部分を含んでいてもよいし、またはプライマーおよびプローブが、ドナーおよび対応するアクセプターの蛍光部分によって既に標識されている。キットは、試料中のSARS-CoV-2核酸の有無を検出するための、プライマー、プローブ、およびフルオロフォア部分の使用についての説明を有するパッケージインサートも含み得る。これに関して、キットは、少なくともSEQ ID NO:1および2に記載のプライマーヌクレオチド配列、任意で、SEQ ID NO:3に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、ならびに、任意で、PCR増幅工程を実施するための手段を含む。該手段は、当業者に公知であり、PCR法のための標準的な試薬、例えば、PCR緩衝液、DNAポリメラーゼ、マグネシウムMgCl2、および水を含み得る。キットは、さらに、少なくともSEQ ID NO:7および8に記載のプライマーヌクレオチド配列、ならびに、任意で、SEQ ID NO:9に記載のヌクレオチド配列を含むプローブを含んでいてもよい。キットは、少なくともSEQ ID NO:17および18に記載のプライマーヌクレオチド配列、ならびに、任意で、SEQ ID NO:19に記載のヌクレオチド配列を含むプローブを含んでいてもよい。最後に、キットは、SEQ ID NO:10、ならびにSEQ ID NO:11または23、SEQ ID NO:12およびSEQ ID NO:20に記載の配列を有するリボ核酸をさらに含んでいてもよい。
本発明のもう1つの局面は、
（i）試料中のSARS-CoV-2のインビトロ検出、
（ii）SARS-CoV-2による対象の感染のインビトロ検出、
（iii）SARS-CoV-2の血液試料への混入のインビトロ検出、または
（iv）SARS-CoV-2の治療のインビトロモニタリング
のための、SEQ ID NO:1および2に記載のプライマーヌクレオチド配列の使用である。従って、SEQ ID NO:3に記載のヌクレオチド配列を含むプローブは、SEQ ID NO:1および2に記載のプライマーと共に、インビトロ検出のために使用される。
本明細書において使用されるように、「インビトロ検出」という用語は、例えば、本明細書において定義されるPCR法を介した、哺乳動物対象の体外、即ち、エクスビボでの検出をさす。本明細書において使用されるように、「SARS-CoV-2の治療のインビトロモニタリング」とは、SARS-CoV-2感染の処置のための治療に付随するコンパニオン診断をさす。例えば、そのような治療を受ける患者に由来する試料は、治療の効果の指標となり得るSARS-CoV-2の有無についてコントロールされ得る。
いくつかの局面/態様において、本発明は、少なくともSARS-CoV-2 RdRPのためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともSARS-CoV-2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を用いて同時増幅工程を実施する段階を含むPCR法に関し、該PCR法は、多重PCRであり、好ましくは、多重リアルタイムRT-PCRであり、さらに好ましくは、SARS-CoV-2 RdRPアンプリコンに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブ、SARS-CoV-2 Eアンプリコンに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブ、およびヒトRNase Pアンプリコンに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブを用いて該同時増幅工程を実施する段階を含む多重リアルタイムRT-PCR法である。
いくつかの局面/態様において、本発明は、
（i）少なくともSARS-CoV-2 RdRPのためのプライマーヌクレオチド配列および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を、好ましくは、SARS-CoV-2 RdRPアンプリコンに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブおよびヒトRNase Pアンプリコンに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブと共に用いて、同時増幅工程を実施する段階を含む、第1のPCR法；ならびに/または
（ii）少なくともSARS-CoV-2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を、好ましくは、SARS-CoV-2 Eアンプリコンに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブおよびヒトRNase Pアンプリコンに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブと共に用いて、同時増幅工程を実施する段階を含む、第2のPCR法
を含むPCR法であって、SARS-CoV-2核酸を含むことが疑われる同じ起源材料が（i）および（ii）のPCRにおいて使用され、第1および第2のPCR法が多重PCR法であり、好ましくは、多重リアルタイムRT-PCR法である、PCR法に関する。
いくつかの局面/態様において、本発明は、
（i）少なくともSARS-CoV2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列および少なくとも固有スパイクRNAのためのプライマーヌクレオチド配列を、好ましくは、SARS-CoV-2 Eアンプリコンに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブおよび該固有スパイクRNAアンプリコンに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブと共に用いて、同時増幅工程を実施する段階を含む、第1のPCR法；
（ii）少なくともSARS-CoV-2 RdRP遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を、好ましくは、SARS-CoV-2 RdRPアンプリコンに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブおよびヒトRNase Pアンプリコンに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブと共に用いて、同時増幅工程を実施する段階を含む、第2のPCR法；ならびに
（iii）少なくともSARS-CoV-2 RdRP遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともSARS-CoV-2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列、および少なくとも固有スパイクRNAのためのプライマーヌクレオチド配列を、好ましくは、SARS-CoV-2 RdRPアンプリコンに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブ、SARS-CoV-2 Eアンプリコンに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブ、およびヒトRNase Pアンプリコンに特異的な少なくとも1つのプローブ、および該固有スパイクRNAアンプリコンに特異的な少なくとも1つのプローブと共に用いて、同時増幅工程を実施する段階を含む、第3のPCR法
を含むPCR法であって、SARS-CoV-2核酸を含むことが疑われる同じ起源材料が（i）および（ii）のPCR法のために使用され、（iii）のPCR法が、陽性対照として、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子のリボ核酸、SARS-CoV-2 E遺伝子のリボ核酸、ヒトRNase Pのリボ核酸、および固有スパイクRNAのリボ核酸をさらに含み、第1、第2、および第3のPCR法が多重PCR法であり、好ましくは、多重リアルタイムRT-PCR法である、PCR法に関する。
いくつかの局面/態様において、本発明のPCR法、キット、または使用は、少なくともSARS-CoV-2 RdRPのためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともSARS-CoV-2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を用いて同時増幅工程を実施する段階を含み、該PCR法は多重PCRである。
本発明のPCR法、キット、または使用のいくつかの局面/態様において、該同時増幅工程（例えば、1つまたは複数）は、少なくともインフルエンザウイルスA型のRNA依存性RNAポリメラーゼ触媒サブユニットタンパク質（即ち、PB1 IAV）のためのプライマーヌクレオチド配列および少なくともインフルエンザウイルスB型のポリメラーゼ酸性タンパク質（即ち、PA IBV）のためのプライマーヌクレオチド配列を用いてさらに実施され、好ましくは、該PCR法は多重PCR法であり、さらに好ましくは、該多重PCR法は多重リアルタイムRT-PCR法であり、最も好ましくは、該多重リアルタイムRT-PCR法は、PB1 IAVアンプリコンに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブおよびPA IBVアンプリコンに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブを用いて該同時増幅工程を実施する段階を含む。
本発明のPCR法、キット、または使用のいくつかの局面/態様において、IAVのPB1の増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:83～84または121～128、好ましくは、SEQ ID NO:83～84に記載のプライマーヌクレオチド配列が、さらに好ましくは、SEQ ID NO:85、129～131、好ましくは、SEQ ID NO:85からなる群より選択される少なくとも1つのプローブと共に使用される。
本発明のPCR法、キット、または使用のいくつかの局面/態様において、PA IBVの増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:86～87または132～144、好ましくは、SEQ ID NO:86～87に記載のプライマーヌクレオチド配列が、さらに好ましくは、SEQ ID NO:88、145～153、好ましくは、SEQ ID NO:88からなる群より選択される少なくとも1つのプローブと共に使用される。
本発明のPCR法、キット、または使用のいくつかの局面/態様において、SARS-CoV-2 RdRPの増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:1および2、SEQ ID NO:27および28、SEQ ID NO:33および34、SEQ ID NO:43および44、SEQ ID NO:54および55、SEQ ID NO:65および66、SEQ ID NO:76および77、SEQ ID NO:109および110、SEQ ID NO:109および111、またはSEQ ID NO:109および112に記載のプライマーヌクレオチド配列が、好ましくは、SEQ ID NO:29、35、45、46、56、57、67、68、78、79、および113～120からなる群より選択される少なくとも1つの（例えば、2つの）プローブと共に、さらに好ましくは、SEQ ID NO:45～46、SEQ ID NO:56～57、67～68、78～79からなる群より選択される、2つの部分的に重複する（例えば、同一配列を部分的に含むが同一ではない）プローブと共に、使用される。
本発明のPCR法、キット、または使用のいくつかの局面/態様において、SARS-CoV-2 E遺伝子の増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:4もしくは22および5、SEQ ID NO:24～25、SEQ ID NO:30～31、SEQ ID NO:39～40、50～51、61～62、72～73、または、89～101のうちのいずれか1つおよび102に記載のプライマーヌクレオチド配列が、好ましくは、SEQ ID NO:26、32、41、42、52、53、63、64、74、75、103～108からなる群より選択される少なくとも1つの（例えば、2つの）プローブと共に、さらに好ましくは、SEQ ID NO:41～42、SEQ ID NO:52～53、63～64、74～75からなる群より選択される2つのプローブと共に、使用される。
本発明のPCR法、キット、または使用のいくつかの局面/態様において、ヒトRNase Pの増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:7および8、またはSEQ ID NO:36～37、47～48、58～59、69～70、80～81、または154～155に記載のプライマーヌクレオチド配列が使用され、好ましくは、SEQ ID NO:38、49、60、71、82、または156からなる群より選択される少なくとも1つのプローブと共に使用される。
本発明のいくつかの局面/態様において、PCR法、キット、または使用は、（i）SEQ ID NO:3に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:6に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:9に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:19に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ；ならびに/または（ii）好ましくは、SEQ ID NO:24～25および27～28に記載のプライマーヌクレオチド配列と組み合わせた、SEQ ID NO:26に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:29に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ；ならびに/または（iii）好ましくは、SEQ ID NO:30～31、33～34、および36～37に記載のプライマーヌクレオチド配列と組み合わせた、SEQ ID NO:32に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:35に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:38に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ；ならびに/または（iv）好ましくは、SEQ ID NO:39～40、43～44、47～48に記載のプライマーヌクレオチド配列と組み合わせた、SEQ ID NO:41に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:42に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:45に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:46に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:49に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ；ならびに/または（v）好ましくは、SEQ ID NO:50～51、54～55、58～59に記載のプライマーヌクレオチド配列と組み合わせた、SEQ ID NO:52に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:53に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:56に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:57に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:60に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ；ならびに/または（vi）好ましくは、SEQ ID NO:61～62、65～66、および69～70に記載のプライマーヌクレオチド配列と組み合わせた、SEQ ID NO:63に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:64に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:67に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:68に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:71に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ；ならびに/または（vii）好ましくは、SEQ ID NO:72～73、76～77、80～81、83～84、および86～87に記載のプライマーヌクレオチド配列と組み合わせた、SEQ ID NO:74に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:75に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:78に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:79に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:82に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:85に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:88に記載のヌクレオチド配列を含むプローブを含む。
本発明のいくつかの局面/態様において、PCR法、キット、または使用は、少なくともSEQ ID NO:1および2、またはSEQ ID NO:27～28、SEQ ID NO:33～34、SEQ ID NO:43～44、SEQ ID NO:54～55、SEQ ID NO:65～66、SEQ ID NO:76～77、SEQ ID NO:109～110、SEQ ID NO:109および111、またはSEQ ID NO:109および112に記載のプライマーヌクレオチド配列、任意で、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:29、35、45、46、56、57、67、68、78、79、または113～120からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブであって、好ましくは、SEQ ID NO:45～46、SEQ ID NO:56～57、67～68、78～79からなる群より選択される2つの（例えば、部分的に重複するが同一ではない）プローブを含む、プローブ、ならびに、さらに任意で、PCR増幅工程を実施するための手段を含み、好ましくは、該キットは多重PCRキットであり、好ましくは、該多重PCRキットは多重リアルタイムRT-PCRキットである。
本発明のいくつかの局面/態様において、PCR法、キット、または使用は、少なくともSEQ ID NO:4もしくは22および5、または、SEQ ID NO:24～25、SEQ ID NO:30～31、SEQ ID NO:39～40、50～51、61～62、72～73、もしくは、89～101のうちのいずれか1つおよび102に記載のプライマーヌクレオチド配列、ならびに、任意で、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:26、32、41、42、52、53、63、64、74、75、103～108からなる群より選択される少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブであって、好ましくは、SEQ ID NO:41～42、SEQ ID NO:52～53、63～64、74～75からなる群より選択される2つの（例えば、異なる）プローブを含む、プローブを含む。
本発明のいくつかの局面/態様において、PCR法、キット、または使用は、少なくともSEQ ID NO:7および8、またはSEQ ID NO:36～37、47～48、58～59、69～70、80～81、もしくは154～155に記載のプライマーヌクレオチド配列、ならびに、任意で、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:38、49、60、71、82、または156からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの（例えば、2つの、例えば、2つの異なる）プローブを含む。
本発明のいくつかの局面/態様において、PCR法、キット、または使用は、少なくともSEQ ID NO:83～84または121～128、好ましくは、SEQ ID NO:83～84に記載のプライマーヌクレオチド配列、ならびに、任意で、SEQ ID NO:85、129～131、さらに好ましくは、SEQ ID NO:85からなる群より選択される少なくとも1つの（例えば、2つの、例えば、2つの異なる）プローブを含む。
本発明のいくつかの局面/態様において、PCR法、キット、または使用は、少なくともSEQ ID NO:86～87または132～144、好ましくは、SEQ ID NO:86～87に記載のプライマーヌクレオチド配列、ならびに、任意で、SEQ ID NO:88、145～153、さらに好ましくは、SEQ ID NO:88からなる群より選択される少なくとも1つの（例えば、2つの、例えば、2つの異なる）プローブを含む。
本発明のいくつかの局面/態様において、PCR法、キット、または使用は、少なくともSEQ ID NO:86～87または132～144、好ましくは、SEQ ID NO:86～87に記載のプライマーヌクレオチド配列、ならびに、任意で、SEQ ID NO:88、145～153、さらに好ましくは、SEQ ID NO:88からなる群より選択される少なくとも1つの（例えば、2つの、例えば、2つの異なる）プローブを含む。
本発明のいくつかの局面/態様において、PCR法、キット、または使用は、少なくとも、SARS-CoV-2のスパイク（S）遺伝子を標的とするプライマーヌクレオチド配列、好ましくは、SEQ ID NO:157～158を有するプライマーを用いて、好ましくは、SEQ ID NO:161または162を有するプローブと共に用いて、同時（例えば、多重化）増幅工程を実施する段階を含む。
本発明のいくつかの局面/態様において、PCR法、キット、または使用は、少なくとも、SARS-CoV-2のB.1.1.7バリアント/変異体に存在する2つの変異（欠失）を標的とするプライマーヌクレオチド配列、好ましくは、SEQ ID NO:159～160を有するプライマーを用いて、好ましくは、SEQ ID NO:161または162を有するプローブと共に用いて、同時（例えば、多重）増幅工程を実施する段階を含む。
本発明のPCR法、キット、または使用のいくつかの局面/態様において、プライマーおよび/またはプローブのヌクレオチド配列は、1つまたは複数（例えば、2つ、3つ、または4つ）のロックド核酸（LNA）修飾ヌクレオチド（例えば、LNAは、架橋された二環式糖部分、例えば、リボース環の2'酸素と4'炭素との間のメチレン結合を含有する合成核酸類似体である）を含み、好ましくは、該1つまたは複数（例えば、2つ、3つ、または4つ）のLNA修飾ヌクレオチドは、LNA修飾チミン残基（例えば、LNA-T）および/またはLNA修飾アデノシン残基（例えば、LNA-A）である。
いくつかの局面/態様において、本発明は、プライマーヌクレオチド配列の使用であって、該プライマー配列が、
（a）SEQ ID NO:1～2、またはSEQ ID NO:27～28、SEQ ID NO:33～34、SEQ ID NO:43～44、SEQ ID NO:54～55、SEQ ID NO:65～66、SEQ ID NO:76～77、SEQ ID NO:109～110、SEQ ID NO:109および111、SEQ ID NO:109および112に記載され、好ましくは、SEQ ID NO:29、35、45、46、56、57、67、68、78、79、および113～120からなる群より選択される少なくとも1つの（例えば、2つの）プローブを伴い、さらに好ましくは、SEQ ID NO:45～46、SEQ ID NO:56～57、67～68、78～79からなる群より選択される、2つの部分的に重複するプローブ（例えば、同一ではないプローブ）を伴い；かつ/または
（b）SEQ ID NO:4もしくは22および5、またはSEQ ID NO:24～25、SEQ ID NO:30～31、SEQ ID NO:39～40、50～51、61～62、72～73、89～101のうちのいずれか1つおよび102に記載され、好ましくは、SEQ ID NO:26、32、41、42、52、53、63、64、74、75、103～108からなる群より選択される少なくとも1つの（例えば、2つの）プローブを伴い、さらに好ましくは、SEQ ID NO:41～42、SEQ ID NO:52～53、63～64、74～75より選択される2つのプローブを伴い；かつ/または
（c）SEQ ID NO:83～84または121～128、好ましくは、SEQ ID NO:83～84に記載され、さらに好ましくは、SEQ ID NO:85、129～131、最も好ましくは、SEQ ID NO:85からなる群より選択される少なくとも1つのプローブを伴い；かつ/または
（d）SEQ ID NO:86～87または132～144、好ましくは、SEQ ID NO:86～87に記載され、さらに好ましくは、SEQ ID NO:88、145～153、好ましくは、SEQ ID NO:88からなる群より選択される少なくとも1つのプローブを伴い、
ここで、（a）、（b）、（c）、および（d）の配列が、
（i）試料中のSARS-CoV-2および/もしくはIAVおよび/もしくはIBVのインビトロ検出（例えば、同時、例えば、多重検出）、
（ii）SARS-CoV-2および/もしくはIAVおよび/もしくはIBVによる対象の感染のインビトロ検出（例えば、同時、例えば、多重検出）、
（iii）SARS-CoV-2および/もしくはIAVおよび/もしくはIBVの血液試料への混入のインビトロ検出（例えば、同時、例えば、多重検出）、または
（iv）SARS-CoV-2および/もしくはIAVおよび/もしくはIBVの療法のインビトロモニタリング（例えば、同時、例えば、多重モニタリング）
のうちの1つまたは複数のために、単独でまたは互いに組み合わされて使用され、ここで、該使用が多重PCR検出、好ましくは、多重リアルタイムRT-PCR検出のための使用であり；
（v）前記請求項のいずれか一項記載のPCR法のため/において、好ましくは、該方法がインビトロまたはエクスビボの方法である、
使用に関する。
いくつかの局面/態様において、本発明のPCR法、キット、または使用は、インビトロまたはエクスビボのPCR法、キット、または使用である。
本発明のいくつかの局面/態様において、本発明のPCR法、キット、または使用は、PCR法、キット、または使用の感度および特異度の両方を増加させることができる二重プローブ（例えば、組み合わせて使用される2つのプローブ、例えば、部分的に重複する同一ではないプローブ）に関する。
いくつかの局面/態様において、本発明のPCR法、キット、または使用は、SARS-CoV-2を最も一般的な季節性インフルエンザから鑑別するために有用な診断ツールであり得る。
いくつかの局面/態様において、本発明のPCR法、キット、または使用は、最大1ヶ月間、室温で安定しており、輸送および保管のコールドチェーンの必要性を排除する数少ないRT-qPCR検査のうちの1つを提供する。
いくつかの局面/態様において、本発明のPCR法、キット、または使用は、本明細書の実施例2に開示される適当なワンステップRT-qPCR条件に関する。
いくつかの局面/態様において、本発明のPCR法、キット、または使用は、本明細書の実施例2に記載される陽性対照に関する。
いくつかの局面/態様において、本発明のPCR法、キット、または使用は、本発明の態様を開示する表2に関する。
いくつかの局面/態様において、本発明のPCR法、キット、または使用は、本発明の態様を開示する表3に関する。
いくつかの局面/態様において、本発明のPCR法、キット、または使用は、本発明の態様を開示する表4に関する。
いくつかの局面/態様において、本発明のPCR法、キット、または使用は、本発明の態様を開示する表5に関する。
いくつかの局面/態様において、本発明のPCR法、キット、または使用は、PCR法、キット、または使用の多重化に関連していることが公知の、不均一な増幅/折り畳み、偽陰性、不十分な感度および特異度、ならびに/もしくはある特定の標的の優先的な増幅、プライマー二量体等を克服し、かつ/または偽陽性および偽陰性の読み出しを低下させる。
いくつかの局面/態様において、本発明のPCR法、キット、または使用は、例えば、ヌクレアーゼの担体およびデコイとして作用する、パン酵母tRNAもしくはサケ精子DNA（ssDNA）のいずれか、またはその両方が添加された陽性対照を含み、次いで、陽性対照と共に凍結乾燥される。
本発明のいくつかの局面/態様において、本発明のプローブは、加水分解プローブ、例えば、二重標識されたプローブである。
いくつかの局面/態様において、二重プローブ反応は、単一プローブ反応と比べて、本発明の方法およびキットの感度およびダイナミックレンジを増加させた。
いくつかの局面/態様において、本発明のPCR法、キット、または使用には、十分な融解温度を維持しながら、最初のChariteフォワードプライマーと重複しない、より短いプライマー（フォワードまたはリバース）の設計を可能にする、変動する数（例えば、1、2、3、4、5等）のLNAヌクレオチドが組み込まれる。
いくつかの局面/態様において、LNAヌクレオチドは、Madsen et al.,2010（Org Biomol Chem.2010 Nov 7;8(21):5012-6）によって開示されたように合成され得る。
いくつかの局面/態様において、本発明は、
（i）本明細書に開示されるSARS-CoV2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列を少なくとも（任意で、本明細書に開示されるプローブと共に）用いて、本明細書に開示されるIAV PB1遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列を少なくとも（任意で、本明細書に開示されるプローブと共に）用いて、RNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を少なくとも（任意で、本明細書に開示されるプローブと共に）用いて同時（多重化）増幅工程を実施する段階を含む、第1のPCR法；
（ii）本明細書に開示されるSARS-CoV-2 RdRP遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列を少なくとも（任意で、本明細書に開示されるプローブと共に）用いて、本明細書に開示されるIBV PA遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列を少なくとも（任意で、本明細書に開示されるプローブと共に）用いて、RNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を少なくとも（任意に、本明細書に開示されるプローブと共に）用いて同時（多重）増幅工程を実施する段階を含む、第2のPCR法
を含むPCR法に関する。有利には、該方法は、SARS-CoV-2とIAVとIBVとの鑑別を可能にする。
いくつかの局面/態様において、本発明は、本明細書に開示されるSARS-CoV2 E遺伝子およびSARS-CoV-2 RdRP遺伝子（両方ともFAMによって標識）、IAV PB1遺伝子およびIBV PA遺伝子（両方ともYYによって標識）、ならびにRNase P（Cy5）のためのプライマーおよびプローブのヌクレオチド配列を少なくとも用いて同時（多重化）増幅工程を実施する段階を含むPCR法に関する。これは、SARS-CoV-2とインフルエンザとの鑑別を可能にする（しかし、IAVとIBVとは見分けない）。
発明の項目
本発明は、以下の項目によっても要約され得る。
1. 少なくともSARS-CoV-2 RdRPのためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともSARS-CoV-2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を用いて同時増幅工程を実施する段階を含むPCR法であって、好ましくは、PCR法が多重PCR法であり、さらに好ましくは、該多重PCR法が多重リアルタイムRT-PCR法であり、最も好ましくは、該多重リアルタイムRT-PCR法が、SARS-CoV-2 RdRPアンプリコンに特異的（例えば、相補的）な少なくとも1つの（例えば、2つの、例えば、2つの部分的に重複しているが同一ではない）（例えば、色素/フルオロフォアおよび/またはクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブ、SARS-CoV-2Eアンプリコンに特異的（例えば、相補的）な少なくとも1つの（例えば、2つの、例えば、2つの重複する）（例えば、色素/フルオロフォアおよび/またはクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブ、ならびにヒトRNase Pアンプリコンに特異的（例えば、相補的）な少なくとも1つの（例えば、色素/フルオロフォアおよびクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブの存在下で/と共に該同時増幅工程を実施する段階を含む、PCR法。
2. （i）少なくともSARS-CoV-2 RdRPのためのプライマーヌクレオチド配列および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を、好ましくは、SARS-CoV-2 RdRPアンプリコンに特異的（例えば、相補的）な少なくとも1つの（例えば、2つの、例えば、2つの部分的に重複するが同一ではない）（例えば、色素/フルオロフォアおよび/もしくはクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブ、ならびにヒトRNase Pアンプリコンに特異的（例えば、相補的）な少なくとも1つの（例えば、色素/フルオロフォアおよびクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブの存在下で/と共に用いて、同時増幅工程を実施する段階を含む、第1のPCR法、ならびに/または
（ii）少なくともSARS-CoV-2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を、好ましくは、SARS-CoV-2 Eアンプリコンに特異的（例えば、相補的）な少なくとも1つの（例えば、2つの）（例えば、色素/フルオロフォアおよび/もしくはクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブ、ならびにヒトRNase Pアンプリコンに特異的（例えば、相補的）な少なくとも1つの（例えば、色素/フルオロフォアおよびクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブの存在下で/と共に用いて、同時増幅工程を実施する段階を含む、第2のPCR法
を含むPCR法であって、SARS-CoV-2核酸を含むことが疑われる同じ起源材料が（i）および（ii）のPCRのために使用され、好ましくは、第1および第2のPCR法が多重PCR法であり、さらに好ましくは、該第1および第2の多重PCR法が多重リアルタイムRT-PCR法である、PCR法。
3. （i）少なくともSARS-CoV2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列および少なくとも固有スパイクRNAのためのプライマーヌクレオチド配列を、好ましくは、SARS-CoV-2 Eアンプリコンに特異的（例えば、相補的）な少なくとも1つの（例えば、2つの）（例えば、色素/フルオロフォアおよび/またはクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブ、ならびに固有スパイクRNAに特異的（例えば、相補的）な少なくとも1つの（例えば、2つの）（例えば、色素/フルオロフォアおよびクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブの存在下で/と共に用いて、同時増幅工程を実施する段階を含む、第1のPCR法；
（ii）少なくともSARS-CoV-2 RdRP遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を、好ましくは、SARS-CoV-2 RdRPアンプリコンに特異的（例えば、相補的）な少なくとも1つの（例えば、2つの、例えば、2つの部分的に重複するが同一ではない）（例えば、色素/フルオロフォアおよび/またはクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブ、ならびにヒトRNase Pアンプリコンに特異的（例えば、相補的）な少なくとも1つの（例えば、色素/フルオロフォアおよびクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブの存在下で/と共に用いて、同時増幅工程を実施する段階を含む、第2のPCR法；ならびに
（iii）少なくともSARS-CoV-2 RdRP遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともSARS-CoV-2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列、および少なくとも固有スパイクRNAのためのプライマーヌクレオチド配列を、好ましくは、SARS-CoV-2 RdRPアンプリコンに特異的（例えば、相補的）な少なくとも1つの（例えば、2つの、例えば、2つの重複する）（例えば、色素/フルオロフォアおよび/またはクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブ、SARS-CoV-2 Eアンプリコンに特異的（例えば、相補的）な少なくとも1つの（例えば、2つの）（例えば、色素/フルオロフォアおよび/またはクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブ、ならびにヒトRNase Pアンプリコンに特異的（例えば、相補的）な少なくとも1つの（例えば、色素/フルオロフォアおよびクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブ、ならびに該固有スパイクRNAアンプリコンに特異的（例えば、相補的）な少なくとも1つの（例えば、色素/フルオロフォアおよびクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブの存在下で/と共に用いて、同時増幅工程を実施する段階を含む、第3のPCR法
を含むPCR法であって、
SARS-CoV-2核酸を含むことが疑われる同じ起源材料が（i）および（ii）のPCR法のために使用され、
（iii）のPCR法が、陽性対照として、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子のリボ核酸、SARS-CoV-2 E遺伝子のリボ核酸、ヒトRNase Pのリボ核酸、および固有スパイクRNAのリボ核酸をさらに含み、好ましくは、第1、第2、および第3のPCR法が多重PCR法であり、さらに好ましくは、該多重PCR法が多重リアルタイムRT-PCR法である、PCR法。
4. （i）少なくともSARS-CoV2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともIAV PB1遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を、好ましくは、SARS-CoV-2 Eアンプリコンに特異的な（例えば、相補的な）少なくとも1つの（例えば、2つの）（例えば、色素/フルオロフォアおよび/またはクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブ、IAV PB1アンプリコンに特異的な（例えば、相補的な）少なくとも1つの（例えば、2つの）（例えば、色素/フルオロフォアおよび/またはクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブ、ならびにヒトRNase Pアンプリコンに特異的な（例えば、相補的な）少なくとも1つの（例えば、色素/フルオロフォアおよびクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブの存在下で/と共に用いて、同時（多重）増幅工程を実施する段階を含む、第1のPCR法；
（ii）少なくともSARS-CoV-2 RdRP遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列、および少なくともIBV PAのためのプライマーヌクレオチド配列を、好ましくは、SARS-CoV-2 RdRPアンプリコンに特異的な（例えば、相補的な）少なくとも1つ（例えば、2つの、例えば、2つの部分的に重複するが同一ではない）（例えば、色素/フルオロフォアおよび/またはクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブ、ヒトRNase Pアンプリコンに特異的な（例えば、相補的な）少なくとも1つの（例えば、色素/フルオロフォアおよびクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブ、ならびにIBV PAアンプリコンに特異的な（例えば、相補的な）少なくとも1つの（例えば、色素/フルオロフォアおよびクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブの存在下で/と共に用いて、同時（多重）増幅工程を実施する段階を含む、第2のPCR法
を含むPCR法。
5. 少なくともSARS-CoV-2 RdRPのためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともSARS-CoV-2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともIBV PAのためのプライマーヌクレオチド配列、および少なくともIAV PB1のためのプライマーヌクレオチド配列を、好ましくは、SARS-CoV-2 Eアンプリコンに特異的な（例えば、相補的な）少なくとも1つの（例えば、2つの）（例えば、色素/フルオロフォアおよび/またはクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブ、IAV PB1アンプリコンに特異的な（例えば、相補的な）少なくとも1つの（例えば、2つの）（例えば、色素/フルオロフォアおよび/またはクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブ、ならびにヒトRNase Pアンプリコンに特異的な（例えば、相補的な）少なくとも1つの（例えば、色素/フルオロフォアおよびクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブ、SARS-CoV-2 RdRPアンプリコンに特異的な（例えば、相補的な）少なくとも1つの（例えば、2つの、例えば、2つの部分的に重複するが同一ではない）（例えば、色素/フルオロフォアおよび/またはクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブ、ならびにIBV PAアンプリコンに特異的な（例えば、相補的な）少なくとも1つの（例えば、色素/フルオロフォアおよびクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブの存在下で/と共に用いて、同時増幅工程を実施する段階を含むPCR法。
6. 少なくともインフルエンザウイルスA型（IAV）のRNA依存性RNAポリメラーゼ触媒サブユニットタンパク質（即ち、PB1、例えば、UniProtKB - Q7TGB8、例えば、GenBank：AJ564806.1）のためのプライマーヌクレオチド配列および少なくともインフルエンザウイルスB型（IBV）のポリメラーゼ酸性タンパク質（即ち、PA、例えば、UniProtKB - Q9QLI4、例えば、GenBank：AF102023.1）のためのプライマーヌクレオチド配列を用いて同時増幅工程（1つまたは複数）を実施する段階をさらに含む、前記項目のいずれかのPCR法であって、好ましくは、該PCR法が多重PCR法であり、さらに好ましくは、該多重PCR法が多重リアルタイムRT-PCR法であり、最も好ましくは、該多重リアルタイムRT-PCR法が、IAVのPB1アンプリコンに特異的な（例えば、相補的な）少なくとも1つの（例えば、2つの）（例えば、色素/フルオロフォアおよびクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブ、ならびにIBVのPAアンプリコンに特異的な（例えば、相補的な）少なくとも1つの（例えば、2つの）（例えば、色素/フルオロフォアおよびクエンチャーによって）二重標識されたヌクレオチド配列（例えば、DNA）加水分解プローブの存在下で/と共に該同時増幅工程を実施する段階を含む、PCR法。
7. 少なくとも固有スパイクRNAのためのプライマーヌクレオチド配列を用いて増幅工程、好ましくは、同時増幅工程を実施する段階をさらに含む、前記項目のいずれかのPCR法であって、好ましくは、該PCR法が多重PCRであり、さらに好ましくは、該多重PCRが多重リアルタイムRT-PCR法である、PCR法。
8. SARS-CoV-2 RdRPの増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:1および2、SEQ ID NO:27および28、SEQ ID NO:33および34、SEQ ID NO:43および44、SEQ ID NO:54および55、SEQ ID NO:65および66、SEQ ID NO:76および77、SEQ ID NO:109および110、SEQ ID NO:109および111、またはSEQ ID NO:109および112に記載のヌクレオチド配列が使用される、前記項目のいずれかのPCR法。
9. SARS-CoV-2 RdRPの増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:1および2、SEQ ID NO:27および28、SEQ ID NO:33および34、SEQ ID NO:43および44、SEQ ID NO:54および55、SEQ ID NO:65および66、SEQ ID NO:76および77、SEQ ID NO:109および110、SEQ ID NO:109および111、またはSEQ ID NO:109および112に記載のヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:29、35、45、46、56、57、67、68、78、79、および113～120からなる群より選択される少なくとも1つの加水分解プローブの存在下で、好ましくは、SEQ ID NO:45～46、SEQ ID NO:56～57、67～68、78～79からなる群より選択される2つの（例えば、重複する）加水分解プローブの存在下で使用される、前記項目のいずれかに記載のPCR法。
10. SARS-CoV-2 E遺伝子の増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:4または22および5、SEQ ID NO:24～25、SEQ ID NO:30～31、SEQ ID NO:39～40、50～51、61～62、72～73、89～101のうちのいずれか1つおよび102に記載のプライマーヌクレオチド配列が使用される、前記項目のいずれかのPCR法。
11. SARS-CoV-2 E遺伝子の増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:4または22および5、SEQ ID NO:24～25、SEQ ID NO:30～31、SEQ ID NO:39～40、50～51、61～62、72～73、89～101のうちのいずれか1つおよび102に記載のプライマーヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:26、32、41、42、52、53、63、64、74、75、103～108からなる群より選択される少なくとも1つの加水分解プローブの存在下で、好ましくは、SEQ ID NO:41～42、SEQ ID NO:52～53、63～64、74～75からなる群より選択される2つの（例えば、重複する）加水分解プローブの存在下で/と共に使用される、前記項目のいずれかのPCR法。
12. ヒトRNase Pの増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:7および8、SEQ ID NO:36～37、47～48、58～59、69～70、80～81、または154～155に記載のプライマーヌクレオチド配列が使用される、前記項目のいずれかのPCR法。
13. ヒトRNase Pの増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:7および8、SEQ ID NO:36～37、47～48、58～59、69～70、80～81、または154～155に記載のプライマーヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:38、49、60、71、82、または156からなる群より選択される少なくとも1つの加水分解プローブの存在下で使用される、前記項目のいずれかのPCR法。
14. IAVのPB1の増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:83～84または121～128、好ましくは、SEQ ID NO:83～84に記載のプライマーヌクレオチド配列が使用される、前記項目のいずれかのPCR法。
15. IAVのPB1の増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:83～84または121～128に記載のプライマーヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:85、129～131、好ましくは、SEQ ID NO:85からなる群より選択される少なくとも1つの加水分解プローブの存在下で使用される、前記項目のいずれかのPCR法。
16. PA IBVの増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:86～87または132～144、好ましくは、SEQ ID NO:86～87に記載のプライマーヌクレオチド配列が使用される、前記項目のいずれかのPCR法。
17. PA IBVの増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:86～87または132～144に記載のプライマーヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:88、145～153、好ましくは、SEQ ID NO:88からなる群より選択される少なくとも1つの加水分解プローブの存在下で使用される、前記項目のいずれかのPCR法。
18. 固有スパイクRNAの増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:17および18に記載のプライマーヌクレオチド配列が使用される、前記項目のいずれかに記載のPCR法。
19. 少なくともSEQ ID NO:1および2に記載のプライマーヌクレオチド配列を用いて増幅工程を実施する段階を含むPCR法であって、好ましくは、該PCR法が多重PCR法であり、さらに好ましくは、該多重PCR法が多重リアルタイムRT-PCR法である、PCR法。
20. 少なくともSEQ ID NO:4または22および5に記載のプライマーヌクレオチド配列を用いて増幅工程を実施する段階をさらに含む、項目9のPCR法。
21. 少なくともSEQ ID NO:7および8に記載のプライマーヌクレオチド配列を用いて増幅工程を同時に実施する段階を含む、項目17または18のPCR法。
22. 固有スパイクRNAの増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:17および18に記載のプライマーヌクレオチド配列が使用される、前記項目のいずれかのPCR法。
23. SEQ ID NO:3に記載のヌクレオチド配列を含むプローブをさらに含む、前記項目のいずれかのPCR法。
24. SEQ ID NO:6に記載のヌクレオチド配列を含むプローブをさらに含む、前記項目のいずれかのPCR法。
25. SEQ ID NO:9に記載のヌクレオチド配列を含むプローブをさらに含む、前記項目のいずれかのPCR法。
26. SEQ ID NO:19に記載のヌクレオチド配列を含むプローブをさらに含む、前記項目のいずれかのPCR法。
27. SEQ ID NO:10に記載の配列を有するリボ核酸が陽性対照として使用される、前記項目のいずれかのPCR法。
28. SEQ ID NO:11または23に記載の配列を有するリボ核酸が陽性対照として使用される、前記項目のいずれかのPCR法。
29. SEQ ID NO:12に記載の配列を有するリボ核酸が陽性対照として使用される、前記項目のいずれかのPCR法。
30. SEQ ID NO:20に記載の配列を有するリボ核酸がスパイクRNAとして使用される、前記項目のいずれかのPCR法。
31. リアルタイムRT-PCR（例えば、多重リアルタイムRT-PCR）である、前記項目のいずれかのPCR法であって、好ましくは、該リアルタイムRT-PCR法が、ワンステップリアルタイムRT-qPCR（RT-定量的PCR）法（例えば、多重ワンステップリアルタイムRT-qPCR法）であり、さらに好ましくは、該ワンステップリアルタイムRT-qPCR法が、
（i）試料を約50℃から約55℃の温度で約10～30分間（例えば、10、15、20、25、もしくは30分間）インキュベートする工程；
（ii）該試料を約95℃の温度で約3～10分間（例えば、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10分間）インキュベートする工程；ならびに/または
（iii）該試料を約40～45サイクルにわたってPCR増幅する工程であって、各サイクルが
（a）該試料を約95℃の温度で約5～15秒間（例えば、5、10、もしくは15秒間）インキュベートすること、および
（b）該試料を約58℃から約60℃の温度で約20～30秒間（例えば、20、25、もしくは30秒間）インキュベートすること
を含む（もしくはからなる）工程
を含む、PCR法。
32. 多重PCR、好ましくは、多重リアルタイムRT-PCRである、前記項目のいずれかのPCR法。
33. 少なくともSEQ ID NO:1および2、またはSEQ ID NO:27～28、SEQ ID NO:33～34、SEQ ID NO:43～44、SEQ ID NO:54～55、SEQ ID NO:65～66、SEQ ID NO:76～77、SEQ ID NO:109～110、SEQ ID NO:109および111、またはSEQ ID NO:109および112に記載のプライマーヌクレオチド配列、
任意で、SEQ ID NO:3、またはSEQ ID NO:29、35、45、46、56、57、67、68、78、79、および113～120に記載のヌクレオチド配列を含む少なくとも1つのプローブであって、好ましくは、SEQ ID NO:45～46、SEQ ID NO:56～57、67～68、78～79からなる群より選択される2つの（例えば、重複する）プローブを含む、プローブ、ならびに
任意で、PCR増幅工程を実施するための手段
を含むキットであって、好ましくは、該キットが多重PCRキットであり、好ましくは、該多重PCRキットが多重リアルタイムRT-PCRキットである、キット。
34. 少なくともSEQ ID NO:4または22および5、またはSEQ ID NO:24～25、SEQ ID NO:30～31、SEQ ID NO:39～40、50～51、61～62、72～73、89～101のいずれかおよび102に記載のプライマーヌクレオチド配列、ならびに、
任意で、SEQ ID NO:6、またはSEQ ID NO:26、32、41、42、52、53、63、64、74、75、103～108に記載のヌクレオチド配列を含む少なくとも1つのプローブであって、好ましくは、SEQ ID NO:41～42、SEQ ID NO:52～53、63～64、74～75からなる群より選択される2つの（例えば、重複する）プローブを含む、プローブ
を含む、項目31のキット。
35. さらに、SEQ ID NO:7および8、またはSEQ ID NO:36～37、47～48、58～59、69～70、80～81、もしくは154～155に記載のプライマーヌクレオチド配列を含み、任意で、SEQ ID NO:9、またはSEQ ID NO:38、49、60、71、82、もしくは156に記載のヌクレオチド配列を含む少なくとも1つのプローブを含む、前記項目のいずれかのキット。
36. 少なくともSEQ ID NO:83～84または121～128、好ましくは、SEQ ID NO:83～84に記載のプライマーヌクレオチド配列、ならびに、SEQ ID NO:85、129～131、さらに好ましくは、SEQ ID NO:85からなる群より選択される少なくとも1つのプローブをさらに含む、前記項目のいずれかのキット。
36. 少なくともSEQ ID NO:86～87または132～144、好ましくは、SEQ ID NO:86～87に記載のプライマーヌクレオチド配列、ならびに、任意で、SEQ ID NO:88、145～153、さらに好ましくは、SEQ ID NO:88からなる群より選択される少なくとも1つのプローブをさらに含む、前記項目のいずれかのキット。
37. 少なくともSEQ ID NO:17および18に記載のプライマーヌクレオチド配列、ならびに、任意で、SEQ ID NO:19に記載のヌクレオチド配列を含むプローブをさらに含む、前記項目のいずれかのキット。
38. さらに、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11または23、SEQ ID NO:12、およびSEQ ID NO:20に記載の配列を有するリボ核酸を含む、前記項目のいずれかのキット。
39. プライマーヌクレオチド配列の使用であって、該プライマー配列が、
（a）SEQ ID NO:1～2、またはSEQ ID NO:27～28、SEQ ID NO:33～34、SEQ ID NO:43～44、SEQ ID NO:54～55、SEQ ID NO:65～66、SEQ ID NO:76～77、SEQ ID NO:109～110、SEQ ID NO:109および111、SEQ ID NO:109および112に記載され、好ましくは、SEQ ID NO:29、35、45、46、56、57、67、68、78、79、および113～120からなる群より選択される少なくとも1つの（例えば、2つの）プローブを伴い、さらに好ましくは、SEQ ID NO:45～46、SEQ ID NO:56～57、67～68、78～79からなる群より選択される、2つの部分的に重複するプローブ（例えば、同一ではないプローブ）を伴い；かつ/または
（b）SEQ ID NO:4もしくは22および5、またはSEQ ID NO:24～25、SEQ ID NO:30～31、SEQ ID NO:39～40、50～51、61～62、72～73、89～101のうちのいずれか1つおよび102に記載され、好ましくは、SEQ ID NO:26、32、41、42、52、53、63、64、74、75、103～108からなる群より選択される少なくとも1つの（例えば、2つの）プローブを伴い、さらに好ましくは、SEQ ID NO:41～42、SEQ ID NO:52～53、63～64、74～75より選択される2つのプローブを伴い；かつ/または
（c）SEQ ID NO:83～84または121～128、好ましくは、SEQ ID NO:83～84に記載され、さらに好ましくは、SEQ ID NO:85、129～131、最も好ましくは、SEQ ID NO:85からなる群より選択される少なくとも1つのプローブを伴い；
（d）SEQ ID NO:86～87または132～144、好ましくは、SEQ ID NO:86～87に記載され、さらに好ましくは、SEQ ID NO:88、145～153、好ましくは、SEQ ID NO:88からなる群より選択される少なくとも1つのプローブを伴い、
ここで、（a）、（b）、（c）、および（d）の配列が、
（i）試料中のSARS-CoV-2および/もしくはIAVおよび/もしくはIBVのインビトロ検出（例えば、同時、例えば、多重検出）、
（ii）SARS-CoV-2および/もしくはIAVおよび/もしくはIBVによる対象の感染のインビトロ検出（例えば、同時、例えば、多重検出）、
（iii）SARS-CoV-2および/もしくはIAVおよび/もしくはIBVの血液試料への混入のインビトロ検出（例えば、同時、例えば、多重検出）、または
（iv）SARS-CoV-2および/もしくはIAVおよび/もしくはIBVの療法のインビトロモニタリング（例えば、同時、例えば、多重モニタリング）
のうちの1つまたは複数のために、単独でまたは互いに組み合わせて使用され、
ここで、該使用が、多重PCR検出、好ましくは、多重リアルタイムRT-PCR検出のための使用であり；
（v）前記項目のいずれかのPCR法について/において、好ましくは、該方法がインビトロまたはエクスビボの方法である、
使用。
40. さらに、SEQ ID NO:3に記載のヌクレオチド配列を含むプローブがインビトロ検出のために使用される、前記項目のいずれかの使用。
41. PCR法が、多重リアルタイムRT-PCR法であり、好ましくは、ワンステップ多重リアルタイムRT-qPCR（RT-定量的PCR）法であり、さらに好ましくは、
（i）試料を約50℃から約55℃の温度で約10～30分間（例えば、10、15、20、25、もしくは30分間）インキュベートする工程；
（ii）該試料を約95℃の温度で約3～10分間（例えば、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10分間）インキュベートする工程；ならびに/または
（iii）該試料を約40～45サイクルにわたってPCR増幅する工程であって、各サイクルが、
（a）該試料を約95℃の温度で約5～15秒間（例えば、5、10、もしくは15秒間）インキュベートすること、および
（b）該試料を約58℃から約60℃の温度で約20～30秒間（例えば、20、25、もしくは30秒間）インキュベートすること
を含む（もしくはからなる）工程
を含むワンステップ多重リアルタイムRT-qPCR法である、前記項目のいずれかのPCR法、キット、または使用。
42. 前記項目のいずれかのPCR法、キット、または使用において、プライマーおよび/またはプローブのヌクレオチド配列が1つまたは複数（例えば、2つ、3つ、または4つ）のロックド核酸（LNA）修飾ヌクレオチド（例えば、LNAは架橋された二環式糖部分、例えば、リボース環の2'酸素と4'炭素との間のメチレン結合を含む合成核酸類似体である）を含み、好ましくは、1つまたは複数（例えば、2つ、3つ、または4つ）のLNA修飾ヌクレオチドが、3'末端および/もしくは5'末端のいずれかを安定化することができ、対立遺伝子（例えば、SNP）識別のためにミスマッチ塩基を安定化することができ、かつ/またはプライマーおよび/もしくはプローブの融解温度を増加させることができ、さらに好ましくは、1つまたは複数（例えば、2つ、3つ、または4つ）のLNA修飾ヌクレオチドが、LNA修飾チミン残基（例えば、LNA-T）および/またはLNA修飾アデノシン残基（例えば、LNA-A）である、PCR法、キット、または使用。
43. 少なくとも1つのプローブを用いて同時（例えば、多重）増幅工程を実施する段階を含む、前記項目のいずれかのPCR法、キット、または使用であって、好ましくは、プローブが、5'末端のフルオロフォア（例えば、フルオレセイン（FAM）、Yakima Yellow（YY）、Cy5、HEX）、および蛍光が放射されないようエネルギーを吸収することができる3'末端のクエンチャー（例えば、Black Hole Quencher 1、2、3（BHQ1、BHQ2、BHQ3））によって誘導体化されている、PCR法、キット、または使用。
44. 2つのプローブを用いて同時（例えば、多重）増幅工程を実施する段階を含む、前記項目のいずれかのPCR法、キット、または使用であって、好ましくは、プローブが、5'末端のフルオロフォア（例えば、フルオレセイン（FAM）、Yakima Yellow（YY）、Cy5、HEX）、および蛍光が放射されないようエネルギーを吸収することができる3'末端のクエンチャー（例えば、Black Hole Quencher 1、2、3（BHQ1、BHQ2、BHQ3））によって誘導体化されている、PCR法、キット、または使用。
45. 前記項目のいずれかのPCR法、キット、または使用において、該PCR法、キット、または使用が、SEQ ID NO:1～156からなる群より選択される1つまたは複数のプライマーまたは/およびプローブのヌクレオチド配列を含み、好ましくは、プローブヌクレオチド配列が、5'末端のフルオロフォア（例えば、フルオレセイン（FAM）、Yakima Yellow（YY）、Cy5、HEX）、および蛍光が放射されないようエネルギーを吸収することができる3'末端のクエンチャー（例えば、Black Hole Quencher 1、2、3（BHQ1、BHQ2、BHQ3））によって誘導体化されている、PCR法、キット、または使用。
46. （例えば、PCR反応混合物、例えば、陽性対照PCR反応混合物、例えば、凍結乾燥陽性対照PCR反応混合物に）好ましくは、パン酵母tRNAおよび/またはサケ精子DNAの形態で、核酸デコイを添加することを含む、前記項目のいずれかのPCR法、キット、または使用。
47. 診断用のPCR法、キット、または使用である、前記項目のいずれかのPCR法、キット、または使用。
48. インビトロまたはエクスビボのPCR法、キット、または使用である、前記項目のいずれかのPCR法、キット、または使用。
49. ウイルス性疾患、好ましくは、SARS-CoV-2、インフルエンザウイルスA型（IAV）、およびインフルエンザウイルスB型（IBV）からなる群より選択されるウイルス性疾患の診断のためのものであり、さらに好ましくは、SARS-CoV-2、インフルエンザウイルスA型（IAV）、および/またはインフルエンザウイルスB型（IBV）の同時（例えば、多重）診断のためのものである、前記項目のいずれかのPCR法、キット、または使用。
50. プライマーおよび/またはプローブのヌクレオチド配列が1つまたは複数（例えば、2つ、3つ、または4つ）のロックド核酸（LNA）修飾ヌクレオチド（例えば、LNAは、架橋された二環式糖部分、例えば、リボース環の2'酸素と4'炭素との間のメチレン結合を含む合成核酸類似体である）を含み、好ましくは、1つまたは複数（例えば、2つ、3つ、または4つ）のLNA修飾ヌクレオチドが、LNA修飾チミン残基（例えば、LNA-T）および/またはLNA修飾アデノシン残基（例えば、LNA-A）である、前記項目のいずれかのPCR法、キット、または使用。
51. 少なくとも、SARS-CoV-2のスパイク（S）遺伝子を標的とするプライマーヌクレオチド配列、好ましくは、SEQ ID NO:157～158を有するプライマーを、好ましくは、SEQ ID NO:161または162を有するプローブと共に用いて、同時増幅工程を実施する段階をさらに含む、前記項目のいずれかのPCR法、キット、または使用。
52. 少なくとも、SARS-CoV-2のB.1.1.7バリアント/変異体に存在する2つの変異（欠失）を標的とするプライマーヌクレオチド配列、好ましくは、SEQ ID NO:159～160を有するプライマーを、好ましくは、SEQ ID NO:161または162を有するプローブと共に用いて、同時増幅工程を実施する段階をさらに含む、前記項目のいずれかのPCR法、キット、または使用。
53. SEQ ID NO:1～162からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、またはそれからなるプライマーおよび/またはプローブのヌクレオチド配列であって、好ましくは、プローブヌクレオチド配列が、5'末端のフルオロフォア（例えば、フルオレセイン（FAM）、Yakima Yellow（YY）、Cy5、HEX）、および蛍光が放射されないようエネルギーを吸収することができる3'末端のクエンチャー（例えば、Black Hole Quencher1、2、3（BHQ1、BHQ2、BHQ3））によって誘導体化されている、プライマーおよび/またはプローブのヌクレオチド配列。
54. 前記項目のいずれかのプライマーおよび/またはプローブのヌクレオチド配列であって、プライマーおよび/またはプローブのヌクレオチド配列が1つまたは複数（例えば、2つ、3つ、または4つ）のロックド核酸（LNA）修飾ヌクレオチド（例えば、LNAは架橋された二環式糖部分、例えば、リボース環の2'酸素と4'炭素との間のメチレン結合を含む合成核酸類似体である）を含み、好ましくは、1つまたは複数（例えば、2つ、3つ、または4つ）のLNA修飾ヌクレオチドが、3'末端および/もしくは5'末端のいずれかを安定化することができ、対立遺伝子（例えば、SNP）識別のためにミスマッチ塩基を安定化することができ、かつ/またはプライマーおよび/もしくはプローブの融解温度を増加させることができ、さらに好ましくは、1つまたは複数（例えば、2つ、3つ、または4つ）のLNA修飾ヌクレオチドが、LNA修飾チミン残基（例えば、LNA-T）および/またはLNA修飾アデノシン残基（例えば、LNA-A）である、プライマーおよび/またはプローブのヌクレオチド配列。
55. ウイルス性疾患を診断する方法において使用するための、前記項目のいずれかのプライマーおよび/またはプローブのヌクレオチド配列。
56. SARS-CoV-2、インフルエンザウイルスA型（IAV）、およびインフルエンザウイルスB型（IBV）からなる群より選択されるウイルス性疾患の診断の方法において、好ましくは、SARS-CoV-2、インフルエンザウイルスA型（IAV）、および/またはインフルエンザウイルスB型（IBV）の同時（例えば、多重）診断の方法において使用するための、前記項目のいずれかのプライマーおよび/またはプローブのヌクレオチド配列。
57. 前記項目のいずれかの方法において使用するための、前記項目のいずれかに記載のプライマーおよび/またはプローブのヌクレオチド配列であって、好ましくは、方法がウイルス性疾患の診断の方法であり、さらに好ましくは、ウイルス性疾患がSARS-CoV-2、インフルエンザウイルスA型（IAV）、およびインフルエンザウイルスB型（IBV）からなる群より選択され、最も好ましくは、方法がSARS-CoV-2、インフルエンザウイルスA型（IAV）、および/またはインフルエンザウイルスB型（IBV）の同時（例えば、多重）診断の方法である、プライマーおよび/またはプローブのヌクレオチド配列。
他に明記されない限り、明細書および特許請求の範囲を含む本書において使用される以下の用語は、以下に与えられる定義を有する。
当業者は、ルーチンの実験法のみを使用して、本明細書に記載される本発明の具体的な態様の多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような等価物は、本発明に包含されるものとする。
本明細書において使用されるように、単数形「a」、「an」、および「the」には、前後関係が明確に他のことを示さない限り、複数形の言及が含まれる。従って、例えば、「試薬」との言及には、そのような異なる試薬のうちの1つまたは複数が含まれ、「方法」との言及には、本明細書に記載の方法のために修飾され得る、または置換され得る、当業者に公知の等価な工程および方法の言及が含まれる。
他に示されない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の全ての要素をさすと理解されるべきである。当業者は、ルーチンの実験のみを使用して、本明細書に記載される本発明の具体的な態様の多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような等価物は、本発明に包含されるものとする。
「および/または」という用語は、本明細書において使用されるいかなる時にも、「および」、「または」、および「該用語によって連結された要素の全てのまたは任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
「約」または「およそ」という用語は、本明細書において使用されるように、所定の値または範囲の20％以内、好ましくは、10％以内、より好ましくは、5％以内を意味する。しかしながら、それには名数も含まれ、例えば、約20には20が含まれる。
本明細書および以下の特許請求の範囲の全体を通して、前後関係が他のことを要求しない限り、「含む（comprise）」という単語ならびに「含む（comprises）」および「含む（comprising）」などの変形は、明記された整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を含むことを意味するが、他の任意の整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を除外することを意味するものではないことが理解されるであろう。本明細書において使用される時、「含む（comprising）」という用語は、「含有する（containing）」もしくは「含む（including）」という用語と交換され得、または本明細書において使用される時、「有する」という用語と交換され得ることもある。
本明細書において使用される時、「からなる」は、特許請求の範囲の要素において指定されない任意の要素、工程、または成分を除外する。本明細書において使用される時、「から本質的になる」は、特許請求の範囲の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料または工程を除外しない。
本明細書中の各々の場合において、「含む」、「から本質的になる」、および「からなる」という用語のうちの任意のものが、他の2つの用語のいずれかと交換され得る。
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、材料、試薬、および物質等に限定されず、従って、変動し得ることが理解されるべきである。本明細書において使用される用語法は、具体的な態様を説明するためのものに過ぎず、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定するためのものではない。
（全ての特許、特許出願、科学的刊行物、製造業者の仕様書、説明書等を含む）本明細書の全体にわたって引用される全ての刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。先行発明のため、本発明がそのような開示に先行する権利を有しないことの承認として解釈されるものは、本明細書中に存在しない。参照により組み入れられる材料が、本明細書と矛盾するか、または一致しない場合、本明細書が、そのような材料より優先される。
以下の実施例は、本発明を例示するものである。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。実施例は、例示のために含まれ、本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
実施例1：SARS-CoV-2遺伝子を検出するためのリアルタイムRT-PCR
合成SARS-CoV-2 RNAを、Exact Diagnostics（http://www.exactdiagnostics.com/sars-cov-2-standard.html）から得た。リアルタイムRT-PCRを、Brilliant III Ultra-Fast qRT-PCR Master Mix（Agilent、カタログ番号600884）を使用して実施した。反応混合物を、製造業者の仕様書に従って調製した：1×qRT-PCR Master Mix、1mM DTT、30nM ROXリファレンス色素、1μlのRT/RNaseブロック（供給元によって指定されていない濃度）、2μlのオリゴミックス（E遺伝子のためのqRT-PCRマスターミックスにおける最終濃度：400nMフォワードプライマー、400nMリバースプライマー、200nMプローブ；RdRP遺伝子のためのqRT-PCRマスターミックスにおける最終濃度：600nMフォワードプライマー、800nMリバースプライマー、100nMプローブ）、5μlの合成RNA（SARS-CoV-2のE、N、S、ORF1ab、およびRdRPの転写物、各200,000コピー/ml）、ヌクレアーゼフリーPCRグレードH2O、最終体積20μl。反応をトリプリケートで実施し、ROXをパッシブリファレンス色素として使用した。その後、Agilent Stratagene Mx3005PリアルタイムPCR装置（Agilent Technologies）において、以下の条件でリアルタイムPCRを実施した：cDNA合成（逆転写）として、50℃で10分、初期変性として、95℃で3分、続いて、95℃で10秒および58℃で20秒を45サイクル、各アニーリング/伸長工程において蛍光検出を実施する。データは、Mx3005Pソフトウェア（Agilent Technologies）を使用して取得され、分析された。
（表1）表1を超えて示されるプライマーおよびプローブを使用することによって、本発明によるPCR法を実施した時の、検査および対応する結果を示す
Figure 2023523850000034
E＝SEQ ID NO:4および5に示されるSARS-CoV-2 E遺伝子プライマーヌクレオチド配列、SEQ ID NO:6に示されるプローブ（図1の曲線は黒丸によって印付けされている）
R1 MDX＝SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:13に示されるSARS-CoV-2 RdRPプライマーヌクレオチド配列、SEQ ID NO:3に示されるプローブ（図1の曲線は黒四角によって印付けされている）
R2 MDX＝SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2に示されるSARS-CoV-2 RdRPプライマーヌクレオチド配列、SEQ ID NO:3に示されるプローブ（図1の曲線は黒三角によって印付けされている）
R2新MDX＝SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2に示されるSARS-CoV-2 RdRPプライマーヌクレオチド配列、SEQ ID NO:3に示されるプローブ（合成されたプライマーヌクレオチド配列の新しいバッチの使用を除き「R2 MDX」と同じ）（図1の曲線は黒菱形によって印付けされている）
P1ユーロフィン＝SEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:15に示されるSARS-CoV-2 RdRPプライマーヌクレオチド配列、SEQ ID NO:16に示されるプローブ（図1の曲線は黒星形によって印付けされている）
P2ユーロフィン＝SEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:15に示されるSARS-CoV-2 RdRPプライマーヌクレオチド配列、SEQ ID NO:3に示されるプローブ（図1の曲線は白菱形によって印付けされている）
R2新MDX＝SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2に示されるSARS-CoV-2 RdRPプライマーヌクレオチド配列（図1の曲線は白四角によって印付けされている）
プライマーヌクレオチド配列（SEQ ID NO:4および5）ならびにSEQ ID NO:6を有するプローブ（表1のウェル名「E」）を使用したRT-PCRによるSARS-CoV-2 E遺伝子の検出は、適切に機能することが、図1から明らかである（Ct（dRN）＝30.21）（図1の曲線は黒丸によって印付けされている）。
SARS-CoV-2 RdRP遺伝子の検出に関して、本発明者らは、公開されたプライマーヌクレオチド配列（SEQ ID NO:14および15）ならびにプローブ（SEQ ID NO:16）（表1のウェル名「P1ユーロフィン」）を使用した時、主要な特異度の課題を観察した。実際、Ct（dRn）は観察されなかった。図1の対応する曲線は、黒星形によって印付けされている。
本発明者らは、この特異度課題に種々の方式で取り組み、成功裏に解決することができた。
第1に、SEQ ID NO:16を有するプローブの全ての縮重ヌクレオチドを非縮重ヌクレオチド、即ち、特異的ヌクレオチドに変換し、それによって、SEQ ID NO:3を有するプローブを得た。プライマーヌクレオチド配列（SEQ ID NO:14および15）ならびにSEQ ID NO:3を有するプローブ（表1のウェル名「P2ユーロフィン」）を使用したところ、「P1ユーロフィン」（Ct（dRN）なし）とは対照的に、特異度（Ct（dRN）＝34.26）が改善された。図1の対応する曲線は、白菱形によって印付けされている。
第2に、34.26という特異度は依然として満足のいくものではなかったため、本発明者らは、SEQ ID NO:14および15のプライマーヌクレオチドの縮重ヌクレオチドを非縮重ヌクレオチド、即ち、特異的ヌクレオチドに変換し、それによって、それぞれ、SEQ ID NO:1および13を有するプライマーヌクレオチド配列を得た。これらのプライマーヌクレオチド配列（SEQ ID NO:1および13）を、SEQ ID NO:3を有するプローブと共に使用したところ（表1のウェル名「R1 MDX」）、「P2ユーロフィン」（Ct（dRN）＝34.26）とは対照的に、特異度（Ct（dRN）＝32.89）がさらに改善された。図1の対応する曲線は、黒四角によって印付けされている。
第3に、「R1 MDX」（表1を参照すること）の特異度をさらに改善することを試み、本発明者らは、SEQ ID NO:1および2を有するプライマーヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:3を有するプローブと共に使用された時（表1のウェル名「R2 MDX」および「R2新MDX」）、「R1 MDX」（Ct（dRN）＝ 32.89）とは対照的に、さらに改善された特異度（Ct（dRN）＝31.17および31.18）を付与することを観察した（表1を参照すること）。図1の対応する曲線は、それぞれ、黒三角および黒菱形によって印付けされている。
陰性対照として、SEQ ID NO:1および2を有するプライマーヌクレオチド配列を使用し、プローブは使用しなかった（ウェル名「R2新MDX ntc」）。図1の対応する曲線は、白四角によって印付けされている。
従って、本発明者らは、任意で、SEQ ID NO:3を有するプローブと共に用いられる、SEQ ID NO:1および2を有するプライマーヌクレオチド配列が、任意で、SEQ ID NO:3または16を有するプローブと共に用いられる、SEQ ID NO:14および15を有する一般的に使用されているプライマーヌクレオチド配列と比べて、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子の検出に関して、はるかに改善された特異度を提供することを見出した。
SARS-CoV-2 E遺伝子についての30.21というCtを、SARS-CoV-2 RdRPについての31.17および31.18というCtと比較すると、1Ct未満の差があることが明らかである。これは、本願に記載されるSARS-CoV-2の検出方法の大幅な改善である。
注目すべきことに、SEQ ID NO:1および2のプライマーヌクレオチド配列は、RT-PCR、例えば、リアルタイムRT-PCRのみならず、周知の標準的なPCR、例えば、RT-LAMPのためにも使用され得ることが明らかである。
実施例2：SARS-CoV-2をインフルエンザA型およびB型から鑑別するための二重プローブテクノロジーを使用した室温安定型多重RT-qPCR検査の開発
材料および方法
vDetect v1
1Step RT qPCR Probe ROX Lキット（カタログ番号QOP0201、highQu、Germany）を使用して、CFX96（Bio-Rad）およびMx3005P（Agilent Technologies）リアルタイムPCR検出系において、RT-qPCR反応を最適化した。E遺伝子およびRdRP遺伝子の検出のため、製造業者の推奨に従って調製された反応混合物は、20μlの全体積で、10μlの2×HighQuマスターミックス、2μlのRT3ミックス、2μlのプライマー/プローブミックス、1μlのPCR水、および5μlの試料を含んでいた。ワンステップRT-qPCRアッセイは、逆転写のための50℃で10分、95℃で3分、95℃で5秒および60℃で20秒の45サイクルというサイクル条件で実施された。プライマー対およびプローブの配列は、表2および表3に示される。
vDetect v2
Brilliant III Ultra-Fast QRT-PCR Master Mix（カタログ番号600884；Agilent Technologies）を使用して、CFX96（Bio-Rad）、Mx3005P（Agilent Technologies）、およびAriaMx（Agilent Technologies）リアルタイムPCR検出系において、RT-qPCR反応を最適化した。E遺伝子、RdRP遺伝子、およびRNase P遺伝子の検出のため、製造業者の推奨に従って調製された反応混合物は、20μlの全体積で、10μlの2×Brilliant III Ultra-Fast QRT-PCR Master Mix、0.3μlの2μM ROX、0.2μlの100mM DTT、1μlのRT/RNaseブロック、2μlのプライマー/プローブミックス、1.5μlのPCR水、および5μlの試料を含んでいた。ワンステップRT-qPCRアッセイは、逆転写のための50℃で30分、95℃で3分、95℃で5秒および60℃で20秒の45サイクルというサイクル条件で実施された。プライマー対およびプローブの配列は、表2および表3に示される。
rTESTシングルプレックス、マルチプレックス、およびオールプレックス
SOLIScript（登録商標）1-step CoVキット（カタログ番号08-65-00250；SOLIS BioDyne、Estonia）を使用して、Mx3005P（Agilent Technologies）およびAriaMx（Agilent Technologies）のリアルタイムPCR検出系において、RT-qPCR反応を最適化した。検出された全ての遺伝子について、製造業者の推奨に従って調製された反応混合物は、20μlの全体積で、4μlの5×One-step Probe CoVミックス（ROX）、0.5μlの40×One-step SOLIScript（登録商標）CoVミックス、2μlのプライマー/プローブミックス、8.5μlのPCR水、および5μlの試料を含んでいた。One-step RT-qPCRアッセイは、逆転写のための55℃で10分、95℃で10分、95℃で15秒および60℃で30秒の45サイクルというサイクル条件で実施された。プライマー対およびプローブの配列は、表2および表3に示される。
（表２）SARS-CoV-2、IAV、およびIBVの検出のために使用されたプライマーおよびプローブ
Figure 2023523850000035
Figure 2023523850000036
Figure 2023523850000037
Figure 2023523850000038
Figure 2023523850000039
Figure 2023523850000040
（表３）SARS-CoV-2、IAV、およびIBVの検出の最適化において使用された全てのプライマーおよびプローブの配列。RdRP配列の混合塩基は、700の既知のSARS-CoV-2ゲノムに基づき、Aに置換された。ヒトRNase Pの検出は、プライマー配列のさらなる最適化および変化なしに、CDCプロトコルに従って実施された。
Figure 2023523850000041
Figure 2023523850000042
Figure 2023523850000043
Figure 2023523850000044
Figure 2023523850000045
ワンステップRT-qPCRの最適化
前記の最適なRT-qPCR条件は、温度プロファイルおよび反応混合物の組成を最適化した結果である。最適なRT-qPCR条件は、各キットについて別々に決定され、個々の最適化工程は表4に記載される。全ての代替的な温度プロファイルが、各添加剤/改変と組み合わせて試験されたわけではない。温度プロファイル最適化の過程においては、製造業者が推奨する反応混合物の組成が使用された。添加剤または反応混合物組成の改変は、（太字で印付けされる）最適化された温度プロファイルを使用して試験された。
（表４）ワンステップRT-qPCR温度プロファイルおよび反応混合物の最適化
Figure 2023523850000046
Figure 2023523850000047
陽性対照
EDX SARS-CoV-2 Standard（Exact Diagnostics）を、検査の最適化およびLoD実験のための陽性対照として使用した。EDX SARS-CoV-2 Standardは、200cp/μlの濃度で5つの遺伝子標的（SARS-CoV-2のE遺伝子、N遺伝子、ORF1ab遺伝子、RdRP遺伝子、およびS遺伝子）を含有する合成RNA転写物を用いて製造されている。この生成物は、抽出、増幅、および検出を含む分子アッセイの過程全体の検査を検証することを可能にするゲノムDNAを含有する。
200cp/μlに希釈された、完全なIAVゲノムを含有する「AMPLIRUN（登録商標）INFLUENZA A H3 RNA CONTROL」（Vircell Microbiologists）を、IAVアッセイ最適化およびLoD実験のための対照鋳型として使用した。インフルエンザB型17/381が感染したMDCK細胞株から単離されたウイルスRNAを、200cp/μlに希釈し、IBV検出のための鋳型として使用した。インフルエンザB型17/381の単離は、製造業者の推奨に従って、QIAamp Viral RNA Miniキット（Qiagen）を用いて実施された。
陽性対照材料を所望の濃度に希釈するため、75cp/μlの濃度のゲノムDNAを含有する合成マトリックス「SARS-CoV-2 Negative」（Exact Diagnostics）を使用した。
陽性対照PC BMC5は、ヒト細胞株A549から抽出されたヒトRNAが追加された、SARS-CoV-2ウイルスの単離された全ゲノムRNAの凍結乾燥物からなる。凍結乾燥陽性対照の、従って、診断キットの、室温での最小安定性を決定するため、PC BMC5の3つのバージョンを調製した：純粋な陽性対照、20μg/mlの最終濃度でのパン酵母tRNAの添加によって安定化された陽性対照、および100μg/mlの最終濃度でのサケ精子DNAの添加によって安定化された陽性対照。凍結乾燥後、0、XYZ、および33日間、室温で保管された陽性対照の安定性を、RT-qPCRによって試験し、非凍結乾燥陽性対照と比較した。
陽性対照PC4.01は、ヒト細胞株A549から抽出されたヒトRNA、および安定剤（パン酵母tRNAまたはサケ精子DNA）が追加された、SARS-CoV-2、IAV、およびIBVの単離された全ゲノムRNAの凍結乾燥物からなる。陽性対照PC BMC5は、ヒト細胞株A549から抽出されたヒトRNAが追加された、SARS-CoV-2ウイルスの単離された全ゲノムRNAの凍結乾燥物からなる。陽性対照PC BMC5およびPC4.01は、28～35の範囲のCt値を示すように希釈された。
分析感度（検出限界）
分析感度（検出限界）の評価は、複数の濃度で、8レプリケートを使用して実施され、95％検出によるレベルに及ぶ濃度で24の付加的なレプリケートが実施された。vDetect v1の場合、40コピー/μl（＝200コピー/反応）、8コピー/μl（＝40コピー/反応）、1.6コピー/μl（＝8コピー/反応）、および0.25コピー/μl（＝1.25コピー/反応）の濃度を有する試料をもたらす、ストック標準物質の段階希釈によって希釈液を調製した。
他の全てのキットの希釈液は、8コピー/μl（＝40コピー/反応）、2コピー/μl（＝10コピー/反応）、0.8コピー/μl（＝4コピー/反応）、および0.4コピー/μl（＝2コピー/反応）の濃度を有する試料をもたらす、ストック標準物質の段階希釈によって調製され、それが、分析感度試験において使用された。対照材料を希釈するため、75,000コピー/mlの濃度のゲノムDNAを含有する合成マトリックス「SARS-CoV-2 Negative」（Exact Diagnostics）が使用された。
検査特異度
特異度（他のコロナウイルスおよび呼吸器ウイルスとの可能性のある交差反応性）の評価は、RNAウイルス、HCoV-229E、HCoVOC43、HCoV-Nl63、SARS-CoV HKU39849、およびMERSCoVを別々のチューブに各々含有する対照材料「コロナウイルスRNA特異度パネル」（EVAg、European Virus Archive - Global）を使用して実施された。EDX SARS-CoV-2 Standard（Exact Diagnostics）が、この検査のための基準材料として使用された。別々のチューブに各々提供されたインフルエンザA型H1N1、新型インフルエンザA型H1N1、インフルエンザA型H3N2、インフルエンザA型H5N1、新型インフルエンザB型、ヒトパラインフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、およびヒトライノウイルスのRNAを含有する呼吸器ウイルスのセット（Vircell）が、呼吸器ウイルスとの交差反応性を査定するため、使用された。全てのアッセイが、示されたウイルスの各々についてトリプリケートで実施された。
臨床評価
E遺伝子スクリーニング検査、RdRP遺伝子およびヒトRNase Pの確認検査について、SARS-CoV-2についての臨床性能の評価を実施した。IAVおよびIBVに関しては、IAV PB1遺伝子およびIBV PA遺伝子について、評価を実施した。SARS-CoV-2については、患者の38の陽性臨床試料および54の陰性臨床試料の選択されたセットに対して評価を実施し、IAVおよびIBVを有する患者の、それぞれ、52および37の臨床試料の選択されたセットに対して、評価を実施した。1つの試料は、IAVおよびIBVの両方について陰性であった。RNAdvance ViralキットおよびBiomek i5 Automated Workstation（Beckman Coulter）を使用して、鼻咽頭試料からRNAを抽出した。試料を、RNA抽出の前に、1回の凍結-解凍サイクルに曝した。この選択された試料セットの検査は、盲検化された試料を用いて実施された。検証において使用された全ての試料が、スロバキアの地域公衆衛生当局によるルーチンの検査のために使用されている基準方法によって確認された。
結果
ChariteのSARS-CoV-2 EおよびRdRPのためのプライマー/プローブセットの再設計および最適化
SARS-CoV-2 RT-qPCR検査の出発点として、本発明者らは、Charite Institute of Virology（Berlin）が開発したEおよびRdRPのためのプライマー/プローブセットを、検査開発の土台として使用した。本発明者らは、700のSARS-CoV-2配列をWuhan基準ゲノムに対して整列化し、サルベコ（Sarbecco）のE遺伝子およびRdRP遺伝子のためのプライマー/プローブセットの特異度を検証するため、95％コンセンサス配列を使用した。整列化によって、コンセンサス配列とのミスマッチをもたらす、RdRPフォワードプライマーおよびリバースプライマーに配置されたいくつかの縮重塩基が同定されたため、本発明者らは、これらの縮重塩基を適切な相補塩基に置換した（図2）。融解温度および可能性のある二量体の形成および二次構造を査定するためのインシリコ分析によって、RdRPリバースプライマーが、フォワードプライマーと比べて有意に低いアニーリング温度を有することも見出された（8.5℃のTm差）。プライマー設計におけるこの欠陥は、RdRPアッセイの効率および感度を低下させ得る。これに対処するため、本発明者らは、Chariteのリバースプライマー（R1）の下流に位置する3つのプライマーを設計し、プライマーを1塩基だけ長くし、3'末端を安定化し、フォワードプライマーの融解温度を増加させるため、LNA修飾ヌクレオチドを組み込んだ（表2および表3）。全てのプライマーセットがSARS-CoV-2陽性対照を増幅したが、非修飾プライマー（R2）は、LNA修飾リバースプライマー（R3およびR4；B；図3A）より性能がよかった。このR2リバースプライマーは、フォワードプライマーにより近い融解温度（3.3℃のTm差）も有するため、本発明者らは、さらなる実験のためのリバースプライマーとして、R2を選択した。
パンデミックの初期に、世界中の研究所が、Chariteアッセイを含むWHO承認プロトコルに主に基づく、SARS-CoV-2を検出するためのRT-qPCRプロトコルを実行した。プライマー/プローブおよび合成陽性対照の過剰な需要のため、多くの研究所が、E遺伝子の合成陽性対照が混入したプライマー/プローブの受理を報告した（Fischer C et al.Variable sensitivity in molecular detection of SARS-CoV-2 in European Expert Laboratories:External Quality Assessment,June - July 2020.J Clin Microbiol.2020 Dec 9；Huggett JF,et al.Cautionary Note on Contamination of Reagents Used for Molecular Detection of SARS-CoV-2.Clinical Chemistry.2020 Nov 1;66(11):1369-72；Mogling R,et al.Delayed Laboratory Response to COVID-19 Caused by Molecular Diagnostic Contamination - Volume 26,Number 8-August 2020 - Emerging Infectious Diseases journal - CDC；Wernike K,et al.,2020,Pitfalls in SARS-CoV-2 PCR diagnostics.Transboundary and Emerging Diseases 14 June 2020）。本発明者らも、合成E遺伝子鋳型が混入したプライマー/プローブセットを経験したため、最も一般的なSARS-CoV-2 E遺伝子合成対照を増幅しないプライマー/プローブセットを生み出すため、E遺伝子フォワードプライマーを、その位置をより上流の位置にシフトすることによって、再設計した（図2）。E遺伝子は、わずか228塩基であるため、本発明者らは、十分な融解温度を維持しながら、最初のChariteフォワードプライマーと重複しない、より短いフォワードプライマーの設計を可能にする、変動する数のLNAヌクレオチドも組み込んだ。これらのプライマーは、F8を除き、全て、SARS-CoV-2鋳型を同等に増幅したが、最初のChariteフォワードプライマーと重複したフォワードプライマーの一部は、鋳型の非存在下で増幅を示し続けた（例えば、F1、F2、およびF4；図3B）。これらのデータ、および各プライマー/プローブセットによって生成された蛍光強度に基づき、最適なフォワードプライマーとして、F3を選択した（図2）。
最適な逆転写（RT）温度およびアニーリング温度についても検討した。標準的なRT（50℃）の上下に逸れた温度は、EまたはRdRPのいずれのアッセイにおいても、有害であるか、または増幅に対して効果を有しなかった。より低いアニーリング温度（58℃）は、E遺伝子の検出のわずかな改善を引き起こしたが、本発明者らは、製造業者の推奨を維持することを選択した（図8A）。vDetect v.1と呼ばれる、この最終的なプライマー/プローブセットを使用して、本発明者らは、EアッセイおよびRdRPアッセイの両方についてのLoDが、8コピー/反応であることを決定した（図3C）。vDetect v.1 COVID-19 RT-qPCR検査と呼ばれる、Chariteプロトコルのこの改良バージョンの臨床性能を査定するため、2つの独立した研究所が、92の臨床試料に対して検査を実施し、その結果を、公衆衛生当局によるルーチンのスクリーニングのために使用されているSARS-CoV-2のためのインデックスRT-qPCR検査と比較した。最初のChariteプロトコルと同様に、検査ワークフローは、E遺伝子の検出のための一次スクリーニング検査およびそれに続くRdRP遺伝子の検出のための確認検査からなっていた。本発明者らのvDetect v.1検査は、全ての陽性（38/38）試料および陰性（52）試料を正確に同定し、基準方法のE遺伝子アッセイによって誤分類された2つの偽陽性試料さえ同定した（図3D；表5）。
（表５）vDetect v.1 COVID-19 RT-qPCR検査の臨床性能
Figure 2023523850000048
vDetect v.1のLoDは、最初のChariteプロトコルで報告されたEおよびRdRPについてのLoD（それぞれ、5.2および3.8コピー/反応）よりわずかに低感度であったため、本発明者らは、内部試験において優れた結果を与えたAgilent Brilliant III Ultra-Fast QRT-PCR Master Mixに切り替え、反応パラメータおよび反応物組成の徹底的な最適化を実施した。最初に、本発明者らは、ゲル電気泳動を使用してPCR産物を分析することによって、多様なパラメータの性能を査定し、RT反応を30分に延長し、初期変性温度を97℃に増加させることが有益であることを見出した（図8B）。これらの有益な修飾を検証するため、RT-qPCRを使用して3つの温度プロファイルバリアントを試験し、RT反応の30分への延長がRdRPの検出を改善すること、初期変性温度の上昇が付加的な利益を提供しないことを決定した（図8C）。RT-qPCRを使用して、反応物中の逆転写酵素の濃度の増加が、効果を有しないか、または有害であることも観察した（図8D）。総合して、本発明者らは、RT工程におけるDTTの使用を排除し、RT時間を30分に増加させることに決定した。
本発明者らは、RdRP遺伝子およびE遺伝子のアッセイにおいて使用されるオリゴヌクレオチドも修飾した。第1に、RdRPプローブ（P2）を新しいTaqMan加水分解プローブ（P8）に交換したところ、蛍光強度が実質的に増加した（図2）。また、合成E遺伝子陽性対照の混入が原因であった、修飾E遺伝子アッセイによるNTCの散発的な増幅を経験した後、E遺伝子フォワードプライマー（F3）を、最初のフォワードプライマーと重複しない、より短いLNA修飾フォワードプライマー（F3）に交換し、従って、合成陽性対照の増幅を排除した。最適化された反応パラメータ、ならびに修飾されたRdRP遺伝子およびE遺伝子のためのプライマー/プローブセットと共に、この新しいマスターミックスを用いて、本発明者らは、RNA抽出およびアッセイ性能の内部対照として、US CDCヒトRNase Pプライマー/プローブを組み込んだ。この新しいバージョンvDetect v.2によって、感度の改善が観察され、EアッセイおよびRdRPアッセイの両方が、各反応につき2コピーまでのウイルスRNAを一貫して検出した（図8E）。
室温安定型SARS-CoV-2 RT-qPCRアッセイの最適化
SARS-CoV-2 RT-qPCRアッセイの大部分の主な限界は、反応成分を低温（-20℃）で輸送し、保管する必要があることである。この欠点に対処するため、本発明者らは、室温安定型マスターミックス（SOLIScript（登録商標）1-step CoVキット；SOLIS BioDyne）、プライマー/プローブミックスおよび陽性対照の凍結乾燥物と適合性であるようアッセイを最適化し、陽性対照およびキット全体について、1ヶ月間の安定性試験を実施した。PCR産物のゲル電気泳動およびリアルタイムRT-qPCRの両方を使用して、本発明者らは、標準的な温度サイクル手順に対する大部分の修飾が、変化を生じないか、または有害であることを見出し（図9AおよびB）、このことから、標準的な反応パラメータがアッセイに最適であることが示唆された。SOLIS BioDyneは、マスターミックスの室温安定性を既に検証しているため、本発明者らは、陽性対照（PC BMC 5）の安定化および凍結乾燥に注力した。本発明者らは、室温でのRNA分解の主な原因がヌクレアーゼ活性によるものであると推論し；従って、ヌクレアーゼの担体およびデコイとして作用するパン酵母tRNAまたはサケ精子DNA（ssDNA）のいずれかを陽性対照に追加し、次いで、陽性対照を凍結乾燥し、1ヶ月間の安定性を試験した。ssDNAのみが、陽性対照の凍結乾燥物の1ヶ月間の安定性を統計的に改善したが（図9C～D）、本発明者らは、最大限の保護のため、両方の担体を陽性対照に追加することに決定した。キット全体（マスターミックス、プライマー/プローブセットおよび陽性対照の凍結乾燥物）を室温で1ヶ月間放置し、新鮮に調製されたキットと性能を比較したところ、室温で少なくとも1ヶ月間の、全てのアッセイ標的に対する一貫した性能が証明された（図9E）。
二重プローブは特異度を増強し、蛍光シグナルを増加させる
SARS-CoV-2などのコロナウイルスは、他のRNAベースのウイルスと比べて低下した変異速度を示すが、新生のSARS-CoV-2変異は、伝染性、病原性の増加、および免疫応答からの逃避をもたらす可能性があるという相当の証拠がある。RT-qPCRアッセイの診断標的に変異が起こった場合、それは、プライマーおよびプローブの結合効率の低下をもたらし、その結果、感度の低下をもたらし、検査の失敗さえもたらし得る（Khan KA,Cheung P.Presence of mismatches between diagnostic PCR assays and coronavirus SARS-CoV-2 genome.Royal Society Open Science.7(6):200636）。この課題に対処するため、本発明者らは、EアッセイおよびRdRPアッセイの両方のため、第1のプローブと同じ蛍光レポーター色素を含有する、一連の付加的な加水分解プローブを設計し、相補配列における可能性のある変異に対して、本質的に、アッセイをよりロバストにした。並行して、バックグラウンド蛍光を低下させ、蛍光発生プローブのダイナミックレンジを増加させるため、内部に配置された第2のBHQ-1クエンチャーを含有するプローブも試験した。
内部クエンチャーを含む、または含まない、多様なRdRPプローブをスクリーニングしたところ、驚くべきことに、内部クエンチャーは、感度を低下させ（即ち、Ctを増加させ）、蛍光強度に対して可変性の効果を有することが見出された（図10A）。最も高性能のプローブ（P8、最低Ct、最高蛍光（ΔR））は、最初のプローブ（P2）と同じ反応物に含まれる時、反応の感度を増加させ（図4A）、アッセイのダイナミックレンジを劇的に改善した（図4B）。注目すべきことに、P2およびP8は、同じ鎖においてわずかに重複しているにも関わらず、感度および蛍光強度を有意に増加させ、このことは、これらの重複するプローブの間には、干渉が、もしあったとしても、ほとんどないことを示唆している。
E遺伝子アッセイのため、2つのLNA修飾バリアント（P3およびP4）と共に、最初のプローブP1の下流の付加的なプローブ（P2）を設計し、リバースプライマーの下流に配置されたリバースの鎖に結合するプローブ（P1の逆相補鎖、P1rev）も設計した。LNA修飾プローブは、非修飾プローブと同等の感度を示した（図10B）。反対側の鎖に相補的な第2のプローブは、単一プローブ反応および二重プローブ反応の両方において感度に対して有害であったが（図10B）、最初のプローブとタンデムに第2の重複しないプローブを含めると、アッセイの感度が増強された（図10B）。実際、二重プローブ反応は、単一プローブ反応と比べて、感度（図4C）およびダイナミックレンジ（図4D）を増加させた。
SARS-CoV-2 E遺伝子およびRdRP遺伝子のための最適化された室温安定型マスターミックスおよび二重プローブアッセイを用いて、本発明者らは、（rTEST COVID-19 qPCRと呼ばれる）この新しい検査のLoDを査定し、2コピー/反応というLoDを確認した（図10C）。本発明者らは、92の臨床試料のパネルを解凍し、それからRNAを再抽出し、最初の検査結果と比較するため、インデックス検査を再実施した。インデックス検査は、最初の検査（vDetect COVID-19 qPCR v2キット）と同じ方法であったにも関わらず、E遺伝子アッセイで3つの陽性試料、RdRPアッセイで7つの陽性試料を同定することができず、これは、凍結/解凍過程およびRNA抽出におけるRNAの損失が原因である可能性が高かった（図10D）。従って、本発明者らは、最も最近の検査結果を使用して、rTEST COVID-19 qPCRキットの臨床性能を評価することに決定した。分析は、インデックス検査との優れた一致を示し、rTEST COVID-19 qPCRキットのEアッセイおよびRdRPアッセイの両方が、最初の基準検査では陽性であったが、解凍試料から抽出されたRNAの再検査では陰性であった試料を含む、全ての陰性試料（54/54、100％の診断特異度）および陽性試料（38/38、100％の診断感度）を正確に同定した（図4EおよびF）。
検査ワークフローを合理化するためのE遺伝子アッセイおよびRdRP遺伝子アッセイの多重化
最初のChariteプロトコルと同様に、最適化された検査のワークフローは、E遺伝子を使用した第1のスクリーニング検査、RdRP遺伝子についての第2の確認検査、およびそれらと並行してのヒトRNase P内部対照についての第3のアッセイからなっていた。この長いワークフローという短所は、診断検査室が大量の検査未実施に直面する可能性があることを考えると、非生産的である。この限界に対処し、迅速でハイスループットな検査を可能にするため、本発明者らは、アッセイ標的を単一の反応に多重化することによって検査を合理化しようと試みた。本発明者らは、第1に、E遺伝子アッセイおよびRdRP遺伝子アッセイ（FAM色素）の各々を、ヒトRNase P（HEX色素）と多重化した。2つのプライマー/プローブセットが、単一反応物中の限定された試薬プールについて競合したため、本発明者らは、より多量のRNase Pアッセイのためのプライマーおよびプローブの濃度を低下させて、全ての試薬が消費される前に、この反応がプラトーに達することを確実にした。本発明者らは、このプライマー限定多重アッセイが、LoDを変化させないことを決定した（図5AおよびB）。実際、（rTEST Covid-19 qPCRマルチプレックスキットと呼ばれる）この多重検査は、シングルプレックスのカウンターパートと同様に、印象的な100％の診断特異度（30/30陰性試料）および感度（30/30陽性試料；図5C）を示した。
次に、3つ全ての標的を単一の反応に多重化し、さらに、RNase Pプライマー/プローブ濃度を50％低下させた。このトリプレックスアッセイの検出限界は、シングルプレックスバージョンおよびデュプレックスバージョンとほぼ同じ感度を有し、4コピー/反応でレプリケートの100％を検出した（図5D）。（rTEST Covid-19 qPCRオールプレックスキットと呼ばれる）このトリプレックスバージョンも、臨床性能評価において全ての陰性（30/30）およびSARS-CoV-2陽性（30/30）試料を正確に同定した（図5E）。
SARS-CoV-2のインフルエンザA型およびB型からの鑑別
季節性インフルエンザなどの他の呼吸器病原体は、SARS-CoV-2と重複する症状を生じるため、2つの呼吸器ウイルスを効果的に鑑別することができる分子診断を有することは重要である。SARS-CoV-2とインフルエンザA型およびB型とを区別することができるRT-qPCRアッセイを開発するため、本発明者らは、2018年1月1日から2020年6月24日までにGISAIDに寄託された27,000を超えるインフルエンザA型（H1N1およびH3N2）ならびに8,000を超えるインフルエンザB型（VictoriaおよびYamagata）の配列の広範な生物情報学的分析を実施した。これらの配列の整列化によって、IAVのPB1セグメントおよびIBVのPAセグメントにおいて、最小量の混合塩基を含む、いくつかの高度に保存された区域が明らかとなり、本発明者らは、それらを標的とするプライマー/プローブを設計した（図6）。
一連のプライマーおよびプローブをスクリーニングした後、本発明者らは、IAVおよびIBVのための最適なプライマー/プローブセットを、SARS-CoV-2 E遺伝子およびRdRP遺伝子（両方ともFAMによって標識）の両方と多重化し、分析感度を決定した。2つの多重フォーマットを試験した：（1）第1のフォーマットは、SARS-CoV-2とIAVとIBVとの鑑別を可能にし、IAV PB1遺伝子およびRNase Pと多重化されたSARS-CoV-2 E遺伝子、またはIBV PA遺伝子およびRNase Pと多重化されたSARS-CoV-2 RdRP遺伝子を含有する2つの多重アッセイからなり；（2）第2のフォーマットは、SARS-CoV-2とインフルエンザとの鑑別を可能にし（しかし、IAVとIBVとは見分けない）、SARS-CoV-2 E遺伝子およびRdRP遺伝子（両方ともFAMによって標識）の両方、IAV PB1遺伝子およびIBV PA遺伝子（両方ともYYによって標識）、ならびにRNase P（Cy5）を含有する単一の多重反応からなる。2つの多重反応を含む第1のフォーマットは、全ての多重化された標的に関して非常に高い感度を与え、わずか2コピー/反応で全てのレプリケートを検出し（図7A、B）；1つの多重反応を含む第2のフォーマットは、4コピー/反応というわずかに高い検出限界を有した（図7C）。
スロバキアの地域公衆衛生当局によるルーチンの検査のために使用されている基準方法によって、それぞれ、IAVおよびIBVを有すると診断された患者の52および37の臨床試料の選択されたセットに対して、rTEST COVID-19/FLU qPCRキットと呼ばれるこの検査の臨床性能を査定した。IAV PB1遺伝子アッセイおよびIBV PA遺伝子アッセイの両方が、全ての陽性試料を正確に同定した（IAV PB1＝52/52；IBV PA＝37/37；図7D）。IBVとして確認された1つの試料は、IAVアッセイによって後期増幅（Ct＝44.77）を示したが、これは臨床実務では陰性と見なされる。重要なことに、SARS-CoV-2とIAVまたはIBV試料のいずれかとの間に交差反応性はなく、このことから、検査が3つ全てのウイルスを正確に鑑別することが証明された。
考察
この実施例において、本発明者らは、ミスマッチ塩基を修正し、LNA修飾ヌクレオチドを使用することによってプライマー融解温度をノーマライズし、RNA抽出、RNA完全性、およびアッセイ性能を査定するためのヒトRNase P内部対照を組み込むことによって、最初のCharite SARS-CoV-2 RT-qPCRプロトコルを改善した。本発明者らの改良されたSARS-CoV-2アッセイは、特異度および感度を増強するための二重プローブ、室温安定型マスターミックス、および非常に高い感度を維持しながら、よりハイスループットの検査を可能にするプライマー限定多重アッセイなどの技術的新規性も含有する。重複する総合的症状を有する他の呼吸器病原体からのSARS-CoV-2の鑑別を助けるため、本発明者らは、最も一般的な季節性インフルエンザを標的とするプライマー/プローブセットと、SARS-CoV-2アッセイを多重化した。
再設計され改良されたRdRP遺伝子およびE遺伝子のためのプライマー/プローブのアッセイ
WHOによって公開され、承認されたSARS-CoV-2の最初のRT-qPCR検査のうちの1つであるChariteプロトコルは、SARS-CoV-2単離物または臨床検体が入手されず、ゲノム配列も不十分なまま、開発され；従って、そのアッセイ設計は、近縁のSARS-CoVおよびコウモリ関連コロナウイルスに由来する遺伝子配列に頼っており、そのため、RdRPのためのプライマーおよびプローブに、いくつかの縮重塩基が配置された。SARS-CoV-2ゲノムの生物情報学的分析は、RdRPのためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーのこれらの縮重塩基がミスマッチ塩基をもたらし、それが、RdRPアッセイの感度の低下の原因となり得ることを明らかにした。最初のCharite RdRPアッセイのもう1つの問題は、リバースプライマーの低い融解温度に起因する。フォワードプライマーとリバースプライマーとの間の融解温度の差（8.5℃のTm差）は、アニーリングのパターンの改変をもたらし、その結果、効率および感度の低下をもたらす可能性がある。Chariteプロトコルの著者らによって指摘されているように（Corman VM,Drosten C.Authors' response:SARS-CoV-2 detection by real-time RT-PCR.Euro Surveill.2020 May 28）、（この場合のように）PCRは、一般に、プライマーの中央および5'末端に存在するミスマッチに耐性があるため、プライマー設計におけるこの欠陥は、RdRPアッセイの感度の低下の原因である可能性がより高い。最適でないRdRPアッセイの根本原因を決定するための実験は実施されていないが、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの両方のミスマッチ塩基の修正、ならびにより高いTmを確実にするためのリバースプライマーの再設計は、このアッセイに関する性能の課題を救済し、E遺伝子アッセイと比較可能な性能をもたらすことを、本発明者らは見出した。
市販のプライマー/プローブにE遺伝子の合成陽性対照が混入していたとの報告のため、本発明者らは、この最も一般的な合成陽性対照を増幅しないよう、E遺伝子のフォワードプライマーも再設計した。E遺伝子の小さいサイズおよびATリッチなヌクレオチド含量は、最適なアニーリング温度を有する全長プライマーを設計するための選択肢をほとんど提供しないため、これは難題であった。これらの設計の限界を回避するため、本発明者らは、LNA修飾チミン塩基をフォワードプライマーの5'末端に組み込み、それによって、最適な二重鎖アニーリング温度を維持しながら、Charite E遺伝子フォワードプライマー（従って、E遺伝子合成陽性対照）との重複を排除するため、プライマーの長さを短縮することを可能にした。この新しいE遺伝子フォワードプライマー設計は、完全に新しい遺伝子標的に対するアッセイを開発する必要なしに、合成陽性対照の混入に関連する、可能性のある課題を排除するための革新的な解決策を提供する。
二重プローブはSARS-CoV-2 RT-qPCRアッセイの感度および特異度を増加させる
同じレポーター色素によって標識され、第1のプローブとタンデムに、または反対側に配置された、第2のTaqMan加水分解プローブを、RT-qPCR反応に導入することによって、蛍光強度の相加的な増加がもたらされ、アッセイの感度がさらに増強され得るという観察に基づき、本発明者らは、二重プローブが、最初のプローブとタンデムにハイブリッド化された時、蛍光強度をおよそ2倍にし、反応ごとの所定のコピー数における平均Ct値を低下させることによって、感度を増加させることを観察した。しかしながら、第1のプローブの反対鎖に配置された第2の加水分解プローブは、感度にとって有害であることが観察された。興味深いことに、本発明者らのRdRPアッセイにおいて使用される二重プローブは、重複しているが、それでも蛍光強度の付加的な増加および感度の増強を提供する。重複する二重プローブが、タンデムにハイブリッド化された二重プローブと類似の利益を提供するという新規の所見は、特に、短い鋳型、および混合塩基（例えば、ウイルス）または最適でないヌクレオチド含量（例えば、ATリッチの低複雑性の配列）を含有する鋳型などの難しい鋳型を標的とする時に、二重プローブアッセイを設計するための付加的な柔軟性を使用者に与える。
二重プローブ使用の関連のある利益は、アッセイの特異度の本質的な増加である。これは、自然変異の傾向を有するウイルスの検出のためのRT-qPCRアッセイを開発する時に、特に重要である。プライマーまたはプローブの結合領域においてミスマッチをもたらすウイルスゲノムの変異は、アッセイの性能にとって有害であり得、公衆衛生機関がSARS-CoV-2の検出のために多重遺伝子標的アッセイを推奨する理論的根拠の一部である。実際、SARS-CoV-2変異はRT-qPCRアッセイの性能に深刻な影響を与える可能性があり、時間の経過による変異の蓄積および地理的位置が、この問題を悪化させ得ることは、公知である。この現象の一例は、英国で最初に発見されたB.1.1.7系統の出現を含む。このバリアントは、RT-qPCRアッセイの失敗数の増加を引き起こしたスパイク遺伝子における欠失を含有するため、最初に同定された（いわゆる、スパイク遺伝子標的失敗）。付加的な二重加水分解プローブを利用することによって、本発明者らのSARS-CoV-2アッセイは、一方のプローブの結合領域においてミスマッチをもたらす可能性のある変異が、他方のプローブによって補償されるような、付加的な特異度の層を含有する。
SARS-CoV-2のインフルエンザA型およびB型からの鑑別
他の呼吸器病原体の循環は、しばしば、重複する総合的症候を有するため、医師が、SARS-CoV-2に感染した個体を、インフルエンザなどの他の病原体に感染した個体から正確に区別する際に、困難なシナリオを提供する。この問題は、もう1つの呼吸器病原体の検査陽性が、SARS-CoV-2感染の欠如を排除しないことを示唆する、SARS-CoV-2およびインフルエンザの両方に同時感染した人々の報告によって増悪される。従って、SARS-CoV-2を、他の呼吸器病原体、具体的には、インフルエンザなどの季節性病原体から正確に鑑別するための診断ツールが必要である。この課題に対処するため、本発明者らは、最近の症例を高度に提示することを確実にするため、過去2年間に発生した配列を強調して、35,000を超えるインフルエンザA型およびB型の配列の広範な生物情報学的分析を実施した。この分析によって、RT-qPCRのプライマーおよびプローブの理想的な標的である、高度に保存された標的が、PB1セグメント（IAV）およびPBセグメント（IBV）において同定された。本発明者らは、必要とされるスループットおよびIAVとIBVとを区別する必要性に応じて、独特の利益を提供する、2つの反応フォーマットを作成するため、これらのアッセイをSARS-CoV-2 EおよびRdRPのアッセイと多重化した。
結論
SARS-CoV-2パンデミックの初期に、いくつかのRT-qPCRプロトコルが、基準研究所および公衆衛生機関によって公開され、各国が、新型コロナウイルスを同定するために必要な診断ワークフローを迅速に設定することを可能にした。これらのプロトコルは疑いの余地のない利益を提供し、多くの市販のRT-qPCR検査のための基礎を形成したが、感度および特異度に関して、いくつかの課題が出現した。本明細書は、Charite Institute of Virologyによって開発されたプロトコルに基づく、一連のRT-qPCR検査の開発を概説した。本発明者らは、プライマーのミスマッチおよび最適でないアニーリング温度に関連する、この最初のアッセイの欠陥のうちのいくつかを救済し、感度、特異度、スループット、および機能性を増加させるための大幅な改善を行った。本発明者らは、蛍光シグナルおよび感度を高めるために二重プローブテクノロジーを組み込み、プローブ結合領域における変異によって生じるミスマッチに対する追加の保護層も提供した。RNase P内部対照も含有する本発明者らの多重アッセイは、感度を犠牲にすることなく、ハンズオンタイムを劇的に短縮し、検査供給源を保存する。検査のうちのいくつかは、デコイ核酸によって安定化された凍結乾燥プライマー/プローブと共に室温安定型マスターミックスを含有し、従って、輸送および保管のコールドチェーンを必要としない数少ないRT-qPCR検査のうちの1つになっている。さらに、本発明者らは、これらのSARS-CoV-2アッセイをインフルエンザA型およびB型アッセイと多重化して、医療従事者が同定するのが困難な、これらの呼吸器病原体の迅速な鑑別を容易にした。これらの新規の室温安定型RT-qPCR検査は、パンデミックの次の期に、SARS-CoV-2を迅速かつ正確に検出するための強力なツールを使用者に提供することができる。
本発明が、目的を果たし、言及された目標および利点ならびにそれらに内在するものを得るために、よく適合していることを、当業者は容易に理解するであろう。さらに、本発明の範囲および本旨から逸脱することなく、本明細書に開示される本発明に、様々な置換および修飾が施され得ることは、当業者には容易に明らかであろう。本明細書に記載の組成物、方法、手法、処理、分子、および具体的な化合物は、現在、ある特定の態様を代表するものであり、例示的なものであり、本発明の範囲を限定するためのものではない。それらの変化およびその他の使用が、当業者に想到されるであろうが、それらは、特許請求の範囲によって定義される本発明の本旨に包含される。本明細書における以前に公開された文書の記載または考察は、必ずしも、その文書が最新技術の一部であるか、または一般的な一般知識であることの承認として解釈されるべきではない。
本明細書に例示的に記載された本発明は、本明細書において具体的に開示されない、要素、限定の非存在下で、適当に実施され得る。従って、例えば、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含有する」等の用語は、広範に、非限定的に理解されるものとする。さらに、本明細書において利用される用語および表現は、限定的ではなく説明的な用語として使用されており、そのような用語および表現の使用には、示され、記載された特色またはそれらの一部分と等価なものを除外する意図はなく、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲内で様々な修飾が可能であることが認識される。従って、例示的な態様および任意選択の特色によって具体的に本発明を開示したが、当業者は、本明細書において具現化された本発明の修飾および変動を利用することもでき、そのような修飾および変動は、本発明の範囲内にあると見なされることが理解されるべきである。
本発明は、本明細書において広範に、包括的（generically）に記載された。包括的な開示に含まれるより狭い種（species）および亜属（sub-generic groupings）も、各々、本発明の一部を形成する。これには、削除される材料が本明細書に具体的に記されるか否かに関わらず、属（genus）から任意の主題を削除する条件または否定的な限定を伴う、本発明の包括的な記載が含まれる。
他の態様は、以下の特許請求の範囲に含まれる。さらに、本発明の特色または局面がマーカッシュ群に関して記載される場合、それによって、本発明が、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関しても記載されることを、当業者は認識するであろう。

Claims (20)

  1. 少なくともSARS-CoV-2 RdRPのためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともSARS-CoV-2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を用いて同時増幅工程を実施する段階を含む、PCR法であって、
    該PCR法が、多重PCRであり、好ましくは、多重リアルタイムRT-PCRであり、さらに好ましくは、SARS-CoV-2 RdRPに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブ、SARS-CoV-2 Eに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブ、およびヒトRNase Pに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブを用いて該同時増幅工程を実施する段階を含む多重リアルタイムRT-PCR法である、
    前記PCR法。
  2. （i）少なくともSARS-CoV-2 RdRPのためのプライマーヌクレオチド配列および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を、好ましくは、SARS-CoV-2 RdRPに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブおよびヒトRNase Pに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブと共に用いて、同時増幅工程を実施する段階を含む、第1のPCR法；ならびに/または
    （ii）少なくともSARS-CoV-2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を、好ましくは、SARS-CoV-2 Eに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブおよびヒトRNase Pに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブと共に用いて、同時増幅工程を実施する段階を含む、第2のPCR法
    を含むPCR法であって、
    SARS-CoV-2核酸を含むことが疑われる同じ起源材料が（i）および（ii）のPCRのために使用され、
    第1および第2のPCR法が、多重PCR法であり、好ましくは、多重リアルタイムRT-PCR法である、
    前記PCR法。
  3. （i）少なくともSARS-CoV2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列および少なくとも固有スパイクRNAのためのプライマーヌクレオチド配列を、好ましくは、SARS-CoV-2 Eに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブおよび該固有スパイクRNAに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブと共に用いて、同時増幅工程を実施する段階を含む、第1のPCR法；
    （ii）少なくともSARS-CoV-2 RdRP遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を、好ましくは、SARS-CoV-2 RdRPに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブおよびヒトRNase Pに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブと共に用いて、同時増幅工程を実施する段階を含む、第2のPCR法；ならびに
    （iii）少なくともSARS-CoV-2 RdRP遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともSARS-CoV-2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列、および少なくとも固有スパイクRNAのためのプライマーヌクレオチド配列を、好ましくは、SARS-CoV-2 RdRPに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブ、SARS-CoV-2 Eに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブ、およびヒトRNase Pに特異的な少なくとも1つのプローブ、および該固有スパイクRNAに特異的な少なくとも1つのプローブと共に用いて、同時増幅工程を実施する段階を含む、第3のPCR法
    を含むPCR法であって、
    SARS-CoV-2核酸を含むことが疑われる同じ起源材料が（i）および（ii）のPCR法のために使用され、
    （iii）のPCR法が、陽性対照として、SARS-CoV-2 RdRP遺伝子のリボ核酸、SARS-CoV-2 E遺伝子のリボ核酸、ヒトRNase Pのリボ核酸、および固有スパイクRNAのリボ核酸をさらに含み、
    第1、第2、および第3のPCR法が、多重PCR法であり、好ましくは、多重リアルタイムRT-PCR法である、
    前記PCR法。
  4. （i）少なくともSARS-CoV2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともIAV PB1遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列を、好ましくは、SARS-CoV-2 Eに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの）プローブ、IAV PB1遺伝子に特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの）プローブ、およびヒトRNase Pに特異的な少なくとも1つのプローブと共に用いて、同時増幅工程を実施する段階を含む、第1のPCR法；
    （ii）少なくともSARS-CoV-2 RdRP遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列、および少なくともIBV PA遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列を、好ましくは、SARS-CoV-2 RdRPに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの、例えば、2つの部分的に重複しているが同一ではない）プローブ、ヒトRNase Pに特異的な少なくとも1つのプローブ、およびIBV PA遺伝子に特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの）プローブと共に用いて、同時増幅工程を実施する段階を含む、第2のPCR法
    を含むPCR法であって、
    SARS-CoV-2核酸を含むことが疑われる同じ起源材料が（i）および（ii）のPCR法のために使用され、
    第1および第2のPCR法が、多重PCR法であり、好ましくは、多重リアルタイムRT-PCR法である、
    前記PCR法。
  5. 少なくともSARS-CoV-2 RdRPのためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともSARS-CoV-2 E遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、および少なくともヒトRNase Pのためのプライマーヌクレオチド配列、少なくともIBV PA遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列、および少なくともIAV PB1遺伝子のためのプライマーヌクレオチド配列を用いて、同時増幅工程を実施する段階を含むPCR法であって、
    該PCR法が、多重PCR法であり、好ましくは、多重リアルタイムRT-PCRであり、さらに好ましくは、SARS-CoV-2 Eに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの）プローブ、IAV PB1遺伝子に特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの）プローブ、ヒトRNase Pに特異的な少なくとも1つのプローブ、SARS-CoV-2 RdRPに特異的な少なくとも1つの（例えば、2つの、例えば、2つの部分的に重複しているが同一ではない）プローブ、およびIBV PA遺伝子に特異的な少なくとも1つのプローブを用いる、
    前記PCR法。
  6. （i）IAV PB1の増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:83～84もしくは121～128、好ましくは、SEQ ID NO:83～84に記載のプライマーヌクレオチド配列が、さらに好ましくは、SEQ ID NO:85、129～131、好ましくは、SEQ ID NO:85からなる群より選択される少なくとも1つのプローブと共に使用され；かつ/または
    （ii）IBV PAの増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:86～87もしくは132～144、好ましくは、SEQ ID NO:86～87に記載のプライマーヌクレオチド配列が、さらに好ましくは、SEQ ID NO:88、145～153、好ましくは、SEQ ID NO:88からなる群より選択される少なくとも1つのプローブと共に使用される、
    前記請求項のいずれか一項記載のPCR法。
  7. SARS-CoV-2 RdRPの増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:1および2、SEQ ID NO:27および28、SEQ ID NO:33および34、SEQ ID NO:43および44、SEQ ID NO:54および55、SEQ ID NO:65および66、SEQ ID NO:76および77、SEQ ID NO:109および110、SEQ ID NO:109および111、またはSEQ ID NO:109および112に記載のプライマーヌクレオチド配列が、好ましくは、SEQ ID NO:29、35、45、46、56、57、67、68、78、79、および113～120からなる群より選択される少なくとも1つの（例えば、2つの）プローブと共に、さらに好ましくは、SEQ ID NO:45～46、SEQ ID NO:56～57、67～68、78～79からなる群より選択される、2つの部分的に重複する（例えば、同一配列を部分的に含むが同一ではない）プローブと共に使用される、前記請求項のいずれか一項記載のPCR法。
  8. SARS-CoV-2 E遺伝子の増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:4もしくは22および5、SEQ ID NO:24～25、SEQ ID NO:30～31、SEQ ID NO:39～40、50～51、61～62、72～73、または、89～101のうちのいずれか1つおよび102に記載のプライマーヌクレオチド配列が、好ましくは、SEQ ID NO:26、32、41、42、52、53、63、64、74、75、103～108からなる群より選択される少なくとも1つの（例えば、2つの）プローブと共に、さらに好ましくは、SEQ ID NO:41～42、SEQ ID NO:52～53、63～64、74～75からなる群より選択される2つのプローブと共に使用される、前記請求項のいずれか一項記載のPCR法。
  9. ヒトRNase Pの増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:7および8、またはSEQ ID NO:36～37、47～48、58～59、69～70、80～81、もしくは154～155に記載のプライマーヌクレオチド配列が、好ましくは、SEQ ID NO:38、49、60、71、82、または156からなる群より選択される少なくとも1つのプローブと共に使用される、前記請求項のいずれか一項記載のPCR法。
  10. 固有スパイクRNAの増幅工程のため、少なくともSEQ ID NO:17および18に記載のプライマーヌクレオチド配列が使用される、前記請求項のいずれか一項記載のPCR法。
  11. （i）SEQ ID NO:3に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:6に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:9に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:19に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ；ならびに/または
    （ii）好ましくは、SEQ ID NO:24～25および27～28に記載のプライマーヌクレオチド配列と組み合わせた、SEQ ID NO:26に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:29に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ；ならびに/または
    （iii）好ましくは、SEQ ID NO:30～31、33～34、および36～37に記載のプライマーヌクレオチド配列と組み合わせた、SEQ ID NO:32に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:35に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:38に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ；ならびに/または
    （iv）好ましくは、SEQ ID NO:39～40、43～44、47～48に記載のプライマーヌクレオチド配列と組み合わせた、SEQ ID NO:41に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:42に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:45に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:46に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:49に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ；ならびに/または
    （v）好ましくは、SEQ ID NO:50～51、54～55、58～59に記載のプライマーヌクレオチド配列と組み合わせた、SEQ ID NO:52に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:53に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:56に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:57に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:60に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ；ならびに/または
    （vi）好ましくは、SEQ ID NO:61～62、65～66、および69～70に記載のプライマーヌクレオチド配列と組み合わせた、SEQ ID NO:63に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:64に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:67に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:68に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:71に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ；ならびに/または
    （vii）好ましくは、SEQ ID NO:72～73、76～77、80～81、83～84、および86～87に記載のプライマーヌクレオチド配列と組み合わせた、SEQ ID NO:74に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:75に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:78に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:79に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:82に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:85に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ、SEQ ID NO:88に記載のヌクレオチド配列を含むプローブ
    をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載のPCR法。
  12. SEQ ID NO:10に記載の配列を有するリボ核酸が陽性対照として使用され、
    SEQ ID NO:11または23に記載の配列を有するリボ核酸が陽性対照として使用され、
    SEQ ID NO:12に記載の配列を有するリボ核酸が陽性対照として使用され、任意で、該陽性対照が、パン酵母tRNAおよび/またはサケ精子DNAの形態の核酸デコイをさらに含む、
    前記請求項のいずれか一項記載のPCR法。
  13. SEQ ID NO:20に記載の配列を有するリボ核酸がスパイクRNAとして使用される、前記請求項のいずれか一項記載のPCR法。
  14. 少なくともSEQ ID NO:1および2、またはSEQ ID NO:27～28、SEQ ID NO:33～34、SEQ ID NO:43～44、SEQ ID NO:54～55、SEQ ID NO:65～66、SEQ ID NO:76～77、SEQ ID NO:109～110、SEQ ID NO:109および111、またはSEQ ID NO:109および112に記載のプライマーヌクレオチド配列、
    任意で、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:29、35、45、46、56、57、67、68、78、79、または113～120からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブであって、好ましくは、SEQ ID NO:45～46、SEQ ID NO:56～57、67～68、78～79からなる群より選択される2つの（例えば、部分的に重複するが同一ではない）プローブを含む、プローブ、ならびに
    さらに任意で、PCR増幅工程を実施するための手段
    を含むキットであって、好ましくは、該キットが多重PCRキットであり、好ましくは、該多重PCRキットが多重リアルタイムRT-PCRキットである、前記キット。
  15. 少なくともSEQ ID NO:4もしくは22および5、または、SEQ ID NO:24～25、SEQ ID NO:30～31、SEQ ID NO:39～40、50～51、61～62、72～73、もしくは、89～101のうちのいずれか1つと102との組み合わせに記載のプライマーヌクレオチド配列、ならびに
    任意で、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:26、32、41、42、52、53、63、64、74、75、103～108からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの（例えば、2つの異なる）プローブであって、好ましくは、SEQ ID NO:41～42、SEQ ID NO:52～53、63～64、74～75からなる群より選択される2つの（例えば、異なる）プローブを含む、プローブ
    をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載のキット。
  16. 少なくともSEQ ID NO:7および8、またはSEQ ID NO:36～37、47～48、58～59、69～70、80～81、もしくは154～155に記載のプライマーヌクレオチド配列、ならびに任意で、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:38、49、60、71、82、または156からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの（例えば、2つの、例えば、2つの異なる）プローブをさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載のキット。
  17. 少なくともSEQ ID NO:83～84または121～128、好ましくは、SEQ ID NO:83～84に記載のプライマーヌクレオチド配列、任意で、SEQ ID NO:85、129～131、さらに好ましくは、SEQ ID NO:85からなる群より選択される少なくとも1つの（例えば、2つの、例えば、2つの異なる）プローブをさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載のキット。
  18. 少なくともSEQ ID NO:86～87または132～144、好ましくは、SEQ ID NO:86～87に記載のプライマーヌクレオチド配列、任意で、SEQ ID NO:88、145～153、さらに好ましくは、SEQ ID NO:88からなる群より選択される少なくとも1つの（例えば、2つの、例えば、2つの異なる）プローブをさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載のキット。
  19. プライマーヌクレオチド配列の使用であって、該プライマー配列が、
    （a）SEQ ID NO:1～2、またはSEQ ID NO:27～28、SEQ ID NO:33～34、SEQ ID NO:43～44、SEQ ID NO:54～55、SEQ ID NO:65～66、SEQ ID NO:76～77、SEQ ID NO:109～110、SEQ ID NO:109および111、SEQ ID NO:109および112に記載され、好ましくは、SEQ ID NO:29、35、45、46、56、57、67、68、78、79、および113～120からなる群より選択される少なくとも1つの（例えば、2つの）プローブを伴い、さらに好ましくは、SEQ ID NO:45～46、SEQ ID NO:56～57、67～68、78～79からなる群より選択される、2つの部分的に重複するプローブ（例えば、同一ではないプローブ）を伴い；かつ/または
    （b）SEQ ID NO:4もしくは22および5、またはSEQ ID NO:24～25、SEQ ID NO:30～31、SEQ ID NO:39～40、50～51、61～62、72～73、89～101のうちのいずれか1つおよび102に記載され、好ましくは、SEQ ID NO:26、32、41、42、52、53、63、64、74、75、103～108からなる群より選択される少なくとも1つの（例えば、2つの）プローブを伴い、さらに好ましくは、SEQ ID NO:41～42、SEQ ID NO:52～53、63～64、74～75より選択される2つのプローブを伴い；かつ/または
    （c）SEQ ID NO:83～84または121～128、好ましくは、SEQ ID NO:83～84に記載され、さらに好ましくは、SEQ ID NO:85、129～131、最も好ましくは、SEQ ID NO:85からなる群より選択される少なくとも1つのプローブを伴い；
    （d）SEQ ID NO:86～87または132～144、好ましくは、SEQ ID NO:86～87に記載され、さらに好ましくは、SEQ ID NO:88、145～153、好ましくは、SEQ ID NO:88からなる群より選択される少なくとも1つのプローブを伴い、
    ここで、（a）、（b）、（c）、および（d）の配列が、
    （i）試料中のSARS-CoV-2および/もしくはIAVおよび/もしくはIBVのインビトロ検出（例えば、同時、例えば、多重検出）、
    （ii）SARS-CoV-2および/もしくはIAVおよび/もしくはIBVによる対象の感染のインビトロ検出（例えば、同時、例えば、多重検出）、
    （iii）SARS-CoV-2および/もしくはIAVおよび/もしくはIBVの血液試料への混入のインビトロ検出（例えば、同時、例えば、多重検出）、または
    （iv）SARS-CoV-2および/もしくはIAVおよび/もしくはIBVの療法のインビトロモニタリング（例えば、同時、例えば、多重モニタリング）
    のうちの1つまたは複数のために、単独でまたは互いに組み合わせて使用され、
    ここで、該使用が、多重PCR検出、好ましくは、多重リアルタイムRT-PCR検出のための使用であり；
    （v）前記請求項のいずれか一項記載のPCR法について/において、好ましくは、該方法がインビトロまたはエクスビボの方法である、
    前記使用。
  20. 前記プライマーおよび/またはプローブのヌクレオチド配列が、1つまたは複数（例えば、2つ、3つ、または4つ）のロックド核酸（LNA）修飾ヌクレオチド（例えば、LNAは、架橋された二環式糖部分、例えば、リボース環の2'酸素と4'炭素との間のメチレン結合を含有する合成核酸類似体である）を含み、好ましくは、該1つまたは複数（例えば、2つ、3つ、または4つ）のLNA修飾ヌクレオチドがLNA修飾チミン残基（例えば、LNA-T）および/またはLNA修飾アデノシン残基（例えば、LNA-A）である、前記請求項のいずれか一項記載のPCR法、キット、または使用。
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