CN114807445A - 一种基于mb-lamp检测新型冠状病毒的引物组、试剂盒以及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测的技术领域，具体涉及一种基于MB‑LAMP检测新型冠状病毒的引物组、试剂盒以及检测方法。所述引物组包括外引物对F3和B3、内引物对BIP和FIP、以及分子信标探针LF‑MB；所述外引物对F3和B3的核酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：所述内引物对BIP和FIP的核酸序列分别如序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述分子信标探针LF‑MB的核酸序列分别如序列表SEQ ID NO.7所示。本发明建立了用于新型冠状病毒检测的MB‑LAMP方法，可实现实时监测反应，具有高特异性、高灵敏度和快速高效的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物检测的技术领域，具体涉及一种基于MB-LAMP检测新型冠状病毒的引物组、试剂盒以及检测方法。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的传播途径主要通过呼吸道飞沫和密切接触，人群普遍易感；该病毒感染具有潜伏期(1～14天)，潜伏期器件的病人一般无症状，但已经具备很强的传染性。目前SARS-CoV-2病毒感染的临床初步诊断主要依据流行病学史、发热、咳嗽、肺部毛玻璃样改变为主，确诊则需通过荧光实时定量PCR(RT-PCR)进行病毒核酸载量检测或通过二代测序进行病毒核酸序列分析。然而RT-PCR病毒核酸检测与二代测序存在检测时间和周期长、环境要求高、技术力量要求高、硬件设备要求高等一系列问题。
近年来，核酸等温扩增技术在物种鉴定中发挥着重要作用。与P CR技术相比，等温核酸扩增反应是一种无需反复升降温，在同一温度下即可完成对靶标指数扩增的技术，其中，环介导等温扩增技术(L oop-mediated isothermal amplification，LAMP)是目前研究最多、最成熟的一种等温扩增技术，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60-65℃恒温扩增，在一小时内即可实现核酸扩增。但是，LAMP产物易受气溶胶污染，造成假阳性结果。如反应后开盖时造成气溶胶的污染，其次，LAMP反应中使用的引物总浓度为3.6～4.4μM，而在P CR反应中仅为0.4～1.0μM。其中LAMP的FIP和BIP引物长度为40～50bp，比较容易形成引物二聚体或发夹结构，导致荧光染料与LA MP引物结合产生非特异性扩增。
分子信标(molecular beacon，MB)是1996年Tyagi等发明的一种有茎环结构的荧光探针。当没有靶序列存在时，分子信标探针低温时自身闭合，荧光基团和淬灭基团相互靠近而不发荧光；在有靶序列存在的情况下，分子信标低温时与互补的靶序列形成稳定的双链杂交体，使荧光基团和淬灭基团分离，发出荧光，随着循环次数的增加，与模板结合的分子信标的量亦增加，最终的荧光强度与扩增的模板量成正比。该技术具有极高的特异性，而且操作简便、灵敏度高，还可以进行实时检测。但分子信标必须在适合反应的等温温度下与其靶标杂交，可以通过选择合适的探针和臂序列长度来实现，环部序列较长可增加探针与靶标结合的特异性，但是会降低与靶标的结合效率，同时会有可能形成二级结构，不利于LAMP的扩增检测；而环部较短会降低检测灵敏度，荧光基团与猝灭基团之间的距离减小，会增加意外猝灭的可能性。
因此，在传统LAMP技术的基础上，开发出利用分子信标探针技术实现对LAMP扩增产物进行检测的方法用于新型冠状病毒的核酸检测尤为重要。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种基于MB-LAMP检测新型冠状病毒的引物组、试剂盒以及检测方法，建立了用于新型冠状病毒检测的MB-LAMP方法，可实现实时监测反应，具有高特异性、高灵敏度和快速高效的优点。
本发明的技术内容如下：
本发明提供了一种基于MB-LAMP检测新型冠状病毒的引物组，所述引物组包括外引物对F3和B3、内引物对BIP和FIP、以及分子信标探针LF-MB；
所述外引物对F3和B3、内引物对BIP和FIP、以及分子信标探针LF-MB以新型冠状病毒N基因为模板得到；
所述外引物对F3和B3的核酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：
SEQ ID NO.1(F3)：TGGCTATAAAGATAACAGAACAT；
SEQ ID NO.2(B3)：TGAATTGGATTTGTATTCCTCC；
所述内引物对BIP和FIP的核酸序列分别如序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示：
SEQ ID NO.3(BIP)：TCACATTAGTAACAAAGGCTGTCCAG AATGCTGATCTTTATAAGCTCA；
SEQ ID NO.4(FIP)：ATGCGTCATCATCTGAAGCATTTTTGC ATGCATGACATAACCAT。
所述分子信标探针LF-MB全长25bp，其包括中环状区域和茎干区，所述中环状区域选自环引物LF的13个碱基，在环引物LF的5’端修饰荧光基团，3’端修饰猝灭基团；
所述环引物LF、LB以及分子信标探针LF-MB的核酸序列分别如序列表SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示：
SEQ ID NO.5(LF)：CCATGCGAAGTGTCCCA；
SEQ ID NO.6(LB)：TTATCTTGGCAAACCACGCG；
SEQ ID NO.7(LF-MB)：5’荧光基团-CAGCAA-CCATGCGAA GTGT-TTGCTG-3’猝灭基团；
所采用的分子信标探针全长25bp，其中环结构长度13bp，茎结构长度6bp，分子信标探针环结构无二级结构，环结构的Tm值比茎结构高，分子信标探针的茎结构使得5’端荧光基团与3’端淬灭基团相抵，由于分子信标探针的环结构比茎结构Tm值高，分子信标探针优先特异地与目的片段相结合；
所述荧光基团包括FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Lluor escein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine 6G、Orengon Gre en 488、Orengon Green 500、Orengon Green514、Texas Red、TA MRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange、ROX的一种以上；
所述猝灭基团包括DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、B HQ-2、BHQ-3的一种以上；
本发明还提供了一种上述基于MB-LAMP检测新型冠状病毒的引物组在制备检测新型冠状病毒的试剂或试剂盒的应用。
本发明还提供了一种基于MB-LAMP检测新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述外引物对F3和B3、内引物对BIP和FIP、以及分子信标探针LF-MB；
所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照；
所述外引物对F3和B3、内引物对BIP和FIP、以及分子信标探针LF-MB的使用体积比为1:1:1:1:1。
本发明还提供了一种基于MB-LAMP检测新型冠状病毒的方法，包括如下步骤：
1)提取待测核酸：采用商品化RNA试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作，最后收集RNA溶液，直接进行检测或保存于-20℃；
所述商品化RNA试剂盒包括基于硅胶膜离心柱法的核酸提取试剂盒或基于磁珠法核酸提取的试剂盒；
2)设计引物和探针：
3)将步骤1)所提取的待测核酸以及步骤2)的引物探针置于L AMP反应体系内进行扩增反应，每60秒收集一次荧光信号进行实时荧光检测；
所述LAMP反应体系，以总体积为25μL计，包括10x Ther mopol反应缓冲液2.5μL、引物F3(5μM)1μL、引物B3(5μM)1μL、引物FIP(40μM)1μL、引物BIP(40μM)1μL、分子信标探针LF-MB(20μM)1μL、Bst 2.0DNA聚合酶(8000U/m L)1.5μL、d NTP MIX(10mmol/L each)5μL、MgSO4(100mmol/L)1.0μL、甜菜碱(5mol/L)0.5μL、核酸模板1μL，PCR级纯净水补足至25μL；
所述LAMP反应体系进行扩增反应的条件为65℃反应90min，80℃保温10min；
4)根据荧光检测得到的曲线图，所得曲线有“S”型则为阳性结果，所的曲线无“S”型则为阴性结果。
本发明的有益效果如下：
本发明的基于MB-LAMP检测新型冠状病毒的引物组，基于LA MP扩增技术，根据所设计的引物对中引入分子信标探针，建立了用于新型冠状病毒检测的MB-LAMP方法，可实现实时监测反应，只有当分子信标探针与靶标特异性结合才释放出荧光信号，从而避免检测到由引物二聚体、发夹结构等造成的假阳性信号；
本发明的引物组在制备检测新型冠状病毒的试剂或试剂盒的应用以及检测方法，不与其他冠状病毒发生交叉反应，具有高特异性；检测操作简单，反应时间短，40分钟即可完成反应，检测限度可达102copies/mL，具有灵敏度高和快速高效的优点，可以实现实时监控，便于根据需求进行调整。
附图说明
图1为MB-LAMP检测技术的原理示意图；
图2为MB-LAMP反应的实时荧光扩增曲线检测结果图；
图3为MB-LAMP特异性验证实时荧光扩增曲线检测结果图；
图4为MB-LAMP灵敏度验证实时荧光扩增曲线检测结果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。
若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
实施例
一种基于MB-LAMP检测新型冠状病毒的方法，包括如下步骤：
1)提取待测核酸：选取临床采集的深部咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血清、血浆进行核酸提取，采用基于硅胶膜离心柱法的核酸提取试剂盒或基于磁珠法核酸提取的试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作，最后收集RNA溶液，直接进行检测或保存于-20℃；
2)设计引物和探针：以新型冠状病毒N基因为模板，外引物对F3和B3、内引物对BIP和FIP，核酸序列如下所示：
所述外引物对F3和B3的核酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：
SEQ ID NO.1(F3)：TGGCTATAAAGATAACAGAACAT；
SEQ ID NO.2(B3)：TGAATTGGATTTGTATTCCTCC；
所述内引物对BIP和FIP的核酸序列分别如序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.3(BIP)：TCACATTAGTAACAAAGGCTGTCCAG AATGCTGATCTTTATAAGCTCA；
SEQ ID NO.4(FIP)：ATGCGTCATCATCTGAAGCATTTTTGC ATGCATGACATAACCAT。
以及分子信标探针LF-MB，全长25bp，其包括中环状区域和茎干区，所述中环状区域选自环引物LF的13个碱基，在环引物LF的5’端修饰荧光基团，3’端修饰猝灭基团；
通过在线引物设计软件Primer Explorer V5设计LAMP的引物，引物委托湖州河马生物科技有限公司合成。所述环引物LF、LB以及分子信标探针LF-MB的核酸序列分别如序列表SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示：
SEQ ID NO.5(LF)：CCATGCGAAGTGTCCCA；
SEQ ID NO.6(LB)：TTATCTTGGCAAACCACGCG；
SEQ ID NO.7(LF-MB)：5’荧光基团-CAGCAA-CCATGCGA AGTGT-TTGCTG-3’猝灭基团；
所述荧光基团包括FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Lluor escein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine 6G、Orengon Gre en 488、Orengon Green 500、Orengon Green514、Texas Red、TA MRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange、ROX的一种以上；
所述猝灭基团包括DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、B HQ-2、BHQ-3的一种以上；
3)将步骤1)所提取的待测核酸以及步骤2)的引物探针置于L AMP反应体系内进行扩增反应，每60秒收集一次荧光信号进行实时荧光检测；
所述LAMP反应体系，以总体积为25μL计，包括10x Ther mopol反应缓冲液2.5μL、引物F3(5μM)1μL、引物B3(5μM)1μL、引物FIP(40μM)1μL、引物BIP(40μM)1μL、分子信标探针LF-MB(20μM)1μL、Bst 2.0DNA聚合酶(8000U/m L)1.5μL、d NTP MIX(10mmol/L)5μL、MgSO4(100mmol/L)1.0μL、甜菜碱(5mol/L)0.5μL、核酸模板1μL，PCR级纯净水补足至25μL；
所述LAMP反应体系进行扩增反应的条件为65℃反应90min，80℃保温10min；
4)根据荧光检测得到的曲线图，所得曲线有“S”型则为阳性结果，所的曲线无“S”型则为阴性结果。
本发明的分子信标结合LAMP技术原理如图1所示，在环引物上设计分子信标，以荧光基团为FAM、猝灭基团为DABCYL为例(其它基团效果相同)，LAMP反应开始前，分子信标探针低温时自身闭合，荧光基团和淬灭基团相互靠近而不发荧光。LAMP反应开始后，分子信标探针与哑铃状DNA靶标结合，荧光基团被去猝灭，表现为强烈荧光。
如图2所示，为MB-LAMP反应的实时荧光扩增曲线检测结果图，表明本发明的检测方法所采用的引物、探针以及反应体系正确。
试验例1
特异性验证：
实验操作以及条件同实施例1，分别以新型冠状病毒核酸和其他核酸(人副流感1型病毒核糖核酸(PIV 1RNA)、呼吸道合胞病毒A型核糖核酸、呼吸道合胞病毒B型核糖核酸、腺病毒脱氧核糖核酸(ADV DNA)、登革热病毒I型核糖核酸、人冠状病毒HCoV-OC43核糖核酸、人冠状病毒HCoV-HKU1核糖核酸、人冠状病毒HCoV-229E核糖核酸、人冠状病毒HCoV-NL63核糖核酸、严重急性呼吸综合征冠状病毒核糖核酸(SARS-CoV RNA)、新型冠状病毒核糖核酸(2019-nCoV RNA)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS)核糖核酸、寨卡病毒核糖核酸、嗜肺军团菌脱氧核糖核酸、金黄色葡萄球菌脱氧核糖核酸(SA DNA)、白色念珠菌脱氧核糖核酸、肺炎链球菌脱氧核糖核酸、化脓性链球菌脱氧核糖核酸、流感嗜血杆菌脱氧核糖核酸、大肠杆菌脱氧核糖核酸、沙门氏菌脱氧核糖核酸、乙型肝炎病毒DN A核酸、丙型肝炎病毒RNA核酸、人类免疫缺陷病毒-1型核酸(HI V-1RNA)核酸、人乳头瘤病毒16型脱氧核糖核酸(HPV16 DNA)核酸、EB病毒脱氧核糖核酸(EBV DNA)核酸、人巨细胞病毒脱氧核糖核酸(HCMV DNA)核酸)的RNA为模板，无菌水作为阴性对照，进行LANP反应扩增；
如图3所示，其为MB-LAMP特异性验证实时荧光扩增曲线检测结果图，由结果可见，只有阳性对照新型冠状病毒具有特异性扩增曲线，且仅需40分钟即可检测到扩增曲线，其他标准品未检测到扩增曲线，说明本发明的检测方法以及所设计的分子信标探针LF-MB对新型冠状病毒具有特异性。
试验例2
实验操作以及条件同实施例1，将新型冠状病毒标准品的RNA进行倍比稀释，用探针法做梯度稀释，浓度设定为成106copies/mL、105copies/mL、104copies/mL、103copies/mL、0.5×103copies/mL、0.25×103copies/mL、102copies/mL、以PCR级无菌水作为阴性对照，进行灵敏度检测，作为反应模板进行扩增。
结果如图4所示，其为MB-LAMP灵敏度验证实时荧光扩增曲线检测结果图，由图可见，随着新型冠状病毒标准品核酸浓度的减低，扩增曲线出现延迟，检测限度可达102copies/mL，表明本发明的检测方法具有较高的灵敏度，且快速高效。
序列表
<110> 广州奕昕生物科技有限公司
<120> 一种基于MB-LAMP检测新型冠状病毒的引物组、试剂盒以及检测方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tggctataaa gataacagaa cat 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tgaattggat ttgtattcct cc 22
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tcacattagt aacaaaggct gtccagaatg ctgatcttta taagctca 48
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
atgcgtcatc atctgaagca tttttgcatg catgacataa ccat 44
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ccatgcgaag tgtccca 17
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ttatcttggc aaaccacgcg 20
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
cagcaaccat gcgaagtgtt tgctg 25
Claims (10)
1.一种基于MB-LAMP检测新型冠状病毒的引物组，其特征在于，
所述引物组包括外引物对F3和B3、内引物对BIP和FIP、以及分子信标探针LF-MB；
所述外引物对F3和B3的核酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：
所述内引物对BIP和FIP的核酸序列分别如序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的基于MB-LAMP检测新型冠状病毒的引物组，其特征在于，所述分子信标探针LF-MB全长25bp，其包括中环状区域和茎干区，所述中环状区域选自环引物LF的13个碱基，在环引物LF的5’端修饰荧光基团，3’端修饰猝灭基团；所述环引物LF、LB以及分子信标探针LF-MB的核酸序列分别如序列表SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
3.根据权利要求1或2的基于MB-LAMP检测新型冠状病毒的引物组，其特征在于，所述外引物对F3和B3、内引物对BIP和FIP、以及分子信标探针LF-MB的使用体积比为1:1:1:1:1。
4.根据权利要求1所述的基于MB-LAMP检测新型冠状病毒的引物组，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Lluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine 6G、Orengon Green 488、Orengon Green 500、Orengon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange、ROX的一种以上。
5.根据权利要求1所述的基于MB-LAMP检测新型冠状病毒的引物组，其特征在于，所述猝灭基团包括DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3的一种以上。
6.一种权利要求1～5任一项所述的基于MB-LAMP检测新型冠状病毒的引物组在制备检测新型冠状病毒的试剂或试剂盒的应用。
7.一种基于MB-LAMP检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的外引物对F3和B3、内引物对BIP和FIP、以及分子信标探针LF-MB；
所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
8.一种基于MB-LAMP检测新型冠状病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)提取待测核酸；
2)设计引物和探针：包括权利要求1所述序列表SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4以及权利要求2所述序列表SEQ ID NO.5SEQ ID NO.7的序列；
3)将步骤1)所提取的待测核酸以及步骤2)的引物和探针置于LAMP反应体系内进行扩增反应，每60秒收集一次荧光信号进行实时荧光检测；
4)根据荧光检测得到的曲线图，所得曲线有“S”型则为阳性结果，所的曲线无“S”型则为阴性结果。
9.根据权利要求8所述的基于MB-LAMP检测新型冠状病毒的方法，其特征在于，步骤3)所述LAMP反应体系，以总体积为25μL计，包括10x Thermopol反应缓冲液2.5μL、5μM引物F31μL、5μM引物B3 1μL、40μM引物FIP 1μL、40μM引物BIP 1μL、20μM分子信标探针LF-MB 1μL、8000U/mL Bst 2.0DNA聚合酶1.5μL、10mmol/L dNTP MIX 5μL、100mmol/L MgSO4 1.0μL、5mol/L甜菜碱0.5μL、核酸模板1μL，PCR级纯净水补足至25μL。
10.根据权利要求8所述的基于MB-LAMP检测新型冠状病毒的方法，其特征在于，步骤3)所述LAMP反应体系进行扩增反应的条件为65℃反应90min，80℃保温10min。
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-
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