CN117467746A - 一种基于多重实时荧光的环介导等温扩增检测方法及其应用 - Google Patents

一种基于多重实时荧光的环介导等温扩增检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于多重实时荧光的环介导等温扩增检测方法及应用。具体地，本发明提供了一种检测呼吸道病原体的多重实时荧光环介导等温扩增检测体系：(a)LAMP引物；(b)四氢呋喃探针；和(c)耐高温核酸内切酶IV，其中当所述四氢呋喃探针未被耐高温核酸内切酶IV切割时，所述荧光基团被所述淬灭基团所淬灭，从而不产生荧光信号；当所述四氢呋喃探针被耐高温核酸内切酶IV切割时，所述淬灭基团游离，所述荧光基团不被所述淬灭基团淬灭，从而产生荧光信号。本发明的检测方法和试剂盒可显著提高等温扩增方法的严谨性和特异性，增加特异性产物的得率，并且可以实现多重检测，可以扩大等温扩增技术的应用范围。

Description

一种基于多重实时荧光的环介导等温扩增检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于多重实时荧光的环介导等温扩增检测方法及其应用。
背景技术
等温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术。近年新发展起来的核酸等温扩增技术，无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比PCR技术更为简单方便，它摆脱了对精良设备的依赖，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景。在众多等温扩增技术中，环介导等温扩增目前已在一定范围内得到了应用，其他一些新发展起来的等温扩增技术，如链替代等温扩增、滚环等温扩增、依赖解旋酶等温扩增、依赖核酸序列等温扩增、单引物等温扩增和核酸快速等温检测放大等技术，也在不断发展与完善之中。
环介导等温扩增(LAMP)是Notomi等于2000年首先提出来的一种新的核酸扩增技术，其原理主要是基于靶基因3'和5'端的6个区域设计3对特异性引物，包括1对外引物、1对环状引物和1对内引物，3种特异引物依靠链置换BstDNA聚合酶，使得链置换DNA合成不停地自我循环，从而实现快速扩增，此反应先形成哑铃状模板，进入循环扩增阶段，再进行伸长、循环扩增，共3个阶段。传统的环介导等温扩增(LAMP)反应1h后可根据扩增副产物焦磷酸镁沉淀形成的浊度或者荧光染料进行判断扩增情况，但反应时间较长，特异性较差，常规肉眼判断结果易造成假阴或假阳性结果，需进一步提高反应时间并且有效解决非特异扩增，肉眼识别导致结果的误判等。
因此，本领域迫切需要开发出一种快速、灵敏、高特异、精确的多重实时荧光环介导等温扩增检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于多重实时荧光环介导等温扩增检测方法。
本发明的另一目的是提供一种呼吸道病原体检测试剂盒。
在本发明的第一方面，提供了一种基于多重实时荧光的环介导等温扩增检测体系，所述检测体系包括：
(a)LAMP引物；
(b)四氢呋喃探针，其中所述探针的结构从5’端到3’端依次包括：
Z0-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5
其中，
Z0为序列互补区；
Z1为荧光基团修饰的碱基；
Z2为N1个核苷酸，其中N1＝1-5；
Z3为THF修饰的碱基N，其中N表示A、T、C或G中任一核苷酸；
Z4为N2个核苷酸，其中N2＝1-5；
Z5为淬灭基团修饰的碱基，其中Z5被配制为淬灭荧光基团的基团；和
(c)耐高温核酸内切酶IV(Nfo)；
其中，当所述四氢呋喃探针未被耐高温核酸内切酶IV切割时，所述荧光基团被所述淬灭基团所淬灭，从而不产生荧光信号；当所述四氢呋喃探针被耐高温核酸内切酶IV切割时，所述淬灭基团游离，所述荧光基团不被所述淬灭基团淬灭，从而产生荧光信号。
在另一优选例中，所述的检测体系还含有(d)缓冲液。
在另一优选例中，所述的检测体系中还含有内参基因引物对。
在另一优选例中，所述的检测体系中还含有针对内参基因GAPDH的特异性引物对。
在另一优选例中，所述引物对包括：
(1)GAPDH基因的GAPDH-F3引物：序列如SEQ ID NO:7所示；
(2)GAPDH基因的GAPDH-B3引物：序列如SEQ ID NO:8所示；
(3)GAPDH基因的GAPDH-FIP引物：序列如SEQ ID NO:9所示；
(4)GAPDH基因的GAPDH-BIP引物：序列如SEQ ID NO:10所示；
(5)GAPDH基因的GAPDH-LF引物：序列如SEQ ID NO:11所示；
(6)GAPDH基因的GAPDH-LB引物：序列如SEQ ID NO:12所示。
在另一优选例中，所述的检测体系还含有待检测的靶标核酸分子。
在另一优选例中，当所述体系中不含有待检测的靶标核酸分子时，则所述四氢呋喃探针未被耐高温核酸内切酶IV切割，所述荧光基团被所述淬灭基团淬灭，从而不产生荧光信号；当所述体系中含有待检测的靶标核酸分子时，则所述四氢呋喃探针被耐高温核酸内切酶IV切割，所述淬灭基团游离，所述荧光基团不被所述淬灭基团淬灭，从而产生荧光信号。
在另一优选例中，所述的四氢呋喃探针为单链DNA或含有部分DNA序列的单链核酸探针。
在另一优选例中，所述的四氢呋喃探针为在5’端标记荧光基团FAM、VIC、CY5或ROX并在3’端标记淬灭基团BHQ或TAMARA后的荧光探针。
在另一优选例中，所述的四氢呋喃探针靶向靶基因的B1-B2反向互补区域(序列5’-3’方向进行反向互补)，较佳地F1-B1正向区域(序列5’-3’方向)，更佳地B1-B2正向区域(序列5’-3’方向)，最佳地F1-F2反向互补区域(序列5’-3’方向进行反向互补)。
在另一优选例中，所述的检测体系还含有：
(e1)用于扩增靶标DNA的聚合酶；
(e2)用于扩增靶标DNA的等温扩增酶；
(e3)任选的用于反转录的反转录酶；
(e4)用于扩增反应和/或反转录反应的dNTP。
在另一优选例中，所述的靶标核酸分子为DNA或RNA。
在另一优选例中，所述的靶标核酸分子选自下组：病原微生物的核酸分子、基因突变的核酸分子、和特异靶标核酸分子。
在另一优选例中，所述的可视化检测体系用于定量检测。
在另一优选例中，所述的检测体系用选自下组的检测平台进行观察：定量PCR仪、和/或等温扩增仪。
在本发明的第二方面，提供了一种用于检测呼吸道病原体的环介导等温扩增检测体系，所述体系包括：
(a)LAMP引物；
(b)四氢呋喃探针；和
(c)耐高温核酸内切酶IV(Nfo)；
其中，当所述四氢呋喃探针未被耐高温核酸内切酶IV切割时，所述荧光基团被所述淬灭基团所淬灭，从而不产生荧光信号；当所述四氢呋喃探针被耐高温核酸内切酶IV切割时，所述淬灭基团游离，所述荧光基团不被所述淬灭基团淬灭，从而产生荧光信号。
在另一优选例中，所述的呼吸道病原体包括病毒、真菌、细菌、衣原体、支原体。
在另一优选例中，所述的真菌为白色念珠菌。
在另一优选例中，所述的病毒包括：冠状病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒。
在另一优选例中，所述的LAMP引物为针对白色念珠菌的ITS2序列的引物对，所述引物对包括：
(1)ITS2序列的CA-F3引物：序列如SEQ ID NO:1所示；
(2)ITS2序列的CA-B3引物：序列如SEQ ID NO:2所示；
(3)ITS2序列的CA-FIP引物：序列如SEQ ID NO:3所示；
(4)ITS2序列的CA-BIP引物：序列如SEQ ID NO:4所示；
(5)ITS2序列的CA-LF引物：序列如SEQ ID NO:5所示；
(6)ITS2序列的CA-LB引物：序列如SEQ ID NO:6所示。
在另一优选例中，所述的针对白色念珠菌的ITS2序列的四氢呋喃探针的序列如SEQ ID NO:13～17。
在另一优选例中，所述的LAMP引物为针对新冠病毒N基因的引物对，所述引物对包括：
(1)N基因的SARS-CoV-2-F3引物：序列如SEQ ID NO:18所示；
(2)N基因的SARS-CoV-2-B3引物：序列如SEQ ID NO:19所示；
(3)N基因的SARS-CoV-2-FIP引物：序列如SEQ ID NO:20所示；
(4)N基因的SARS-CoV-2-BIP引物：序列如SEQ ID NO:21所示；
(5)N基因的SARS-CoV-2-LF引物：序列如SEQ ID NO:22所示；
(6)N基因的SARS-CoV-2-LB引物：序列如SEQ ID NO:23所示。
在另一优选例中，所述的针对新冠病毒N基因的四氢呋喃探针的序列如SEQ IDNO:24～27所示，较佳地SEQ ID NO:24。
在另一优选例中，所述的四氢呋喃探针修饰的碱基为T(SEQ ID NO:31)，更佳地，四氢呋喃修饰的碱基为C或A(SEQ ID NO:28～30)。
在另一优选例中，所述的四氢呋喃碱基修饰的位置在探针全长5/6位置后效果更佳。
在另一优选例中，所述的四氢呋喃探针序列的碱基序列为16-30bp。
在另一优选例中，所述的检测体系还含有待检测的靶标核酸分子。
在另一优选例中，所述的靶标核酸分子为DNA或RNA。
在另一优选例中，所述的检测体系还包括：(d)核酸扩增引物，所述核酸扩增引物为LAMP引物对。
在另一优选例中，所述的检测体系还含有用于核酸扩增反应的试剂。
在另一优选例中，所述的检测体系还含有：
(d1)用于扩增靶标DNA的聚合酶；或
(d2)用于扩增靶标DNA的等温扩增酶；
(d3)任选的用于反转录的反转录酶；
(d4)任选的用于转录的转录酶；
(d5)用于扩增反应和/或反转录反应的dNTPs；
(d6)用于转录反应的NTPs。
在本发明的第三方面，提供了一种呼吸道病原体的检测方法，所述检测方法包括：
(a)提供一反应体系，所述反应体系包括：本发明第二方面所述的检测体系、待测样品和核酸扩增引物，所述的核酸扩增引物用于扩增呼吸道病原体的核酸序列；
(b)对所述反应体系进行核酸扩增，从而获得含扩增产物的反应体系；和
(c)在扩增反应过程之中或之后，检测所述检测探针发出的可检测信号，所述可检测信号为荧光。
在另一优选例中，所述的核酸扩增为LAMP。
在另一优选例中，所述的等温扩增方法包括步骤：在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有针对呼吸道病原体的LAMP特异性引物对。
在另一优选例中，在步骤(d)中的检测包括荧光检测法。
在另一优选例中，所述荧光检测法采用等温扩增仪或者荧光分光光度计或者荧光定量PCR仪进行检测。
在另一优选例中，所述的方法是体外检测方法。
在另一优选例中，所述的样本是体外的或离体的样本。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断或非治疗的。
在另一优选例中，所述的待测样品(或相应的扩增产物)在所述检测体系中的浓度为50～500copies/mL，较佳地50～200copies/mL，更佳地50-100copies/mL。
在本发明的第四方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有以下组分：
(a)LAMP引物；
(b)四氢呋喃探针；和
(c)耐高温核酸内切酶IV；
其中，当所述四氢呋喃探针未被耐高温核酸内切酶IV切割时，所述荧光基团被所述淬灭基团所淬灭，从而不产生荧光信号；当所述四氢呋喃探针被耐高温核酸内切酶IV切割时，所述淬灭基团游离，所述荧光基团不被所述淬灭基团淬灭，从而产生荧光信号。
在另一优选例中，所述的组分(a)、(b)和(c)可位于相同或不同的容器中。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有：
(d)用于LAMP等温扩增的试剂(如引物、缓冲液等)；
(e)用于作为阳性对照的质粒。
如本发明第四方面所述的试剂盒的用途，用于制备检测呼吸道病原体的试剂盒。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为LAMP扩增示意图和四氢呋喃探针检测示意图。
图2为针对白色念珠菌(canidia Albicans)ITS2序列的不同探针区域及方向的探索效果图。
图3为针对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N基因的不同探针区域及方向的探索效果图。
图4为针对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N基因的不同四氢呋喃碱基修饰效果图。
图5为耐热核酸内切酶Ⅳ(Nfo)与大肠杆菌核酸内切酶Ⅳ对比结果图。
图6为新型冠状病毒核酸检测试剂盒检测不同浓度假病毒的效果图。
图7为新型冠状病毒核酸检测试剂盒检测最低检测限参考品的效果图。
图8为新型冠状病毒核酸检测试剂盒检测其它呼吸道病原体的效果图。
图9为新型冠状病毒核酸检测试剂盒检测单管反应液检测新型冠状病毒和内参的多重检测效果图。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，首次开发了一种多重实时荧光环介导等温扩增检测方法。发明人根据靶序列设计常规引物；根据各引物位置摸索探针区域；用四氢呋喃取代探针中部的一个核苷酸；本发明方法设计得到的探针可用于多重实时荧光环介导等温扩增中，能检测多种病原体。本发明的探针设计方法大大提高了等温扩增的严谨性和特异性，增加了特异性产物的得率，并且可以实现实时多重检测，可以扩大等温扩增技术的应用范围。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
在本文中，除非特别说明，各缩写均为本领域技术人员所理解的常规含义。
环介导等温扩增技术
环介导等温扩增技术，英文名称为LAMP(loop-mediated isothermalamplification)，能在等温(60-65℃)条件下，短时间(通常是一小时内)内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。
白色念球菌
白色念珠菌(canidia Albicans)，是一种真菌，通常存在于正常人口腔，上呼吸道，肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调，则本菌大量繁殖并改变生长形式(芽生菌丝相)侵入细胞引起疾病。
新冠病毒与N基因
冠状病毒属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，是一类具有囊膜，基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒，直径为80-120nm，新型冠状病毒(2019-nCoV)经确认为新的变种，可引起病毒性肺炎、呼吸困难等症状。
N基因：新冠病毒的核壳蛋白。
检测方法
常规环介导等温扩增法是一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物。在DNA合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色，通过肉眼识别产物量判断阴阳性。
本发明提供的一种基于多重实时荧光的环介导等温扩增检测体系如本文第一方面所述。
本发明的主要优点包括：
1.本发明采用修饰四氢呋喃探针，结合耐高温核酸内切酶Ⅳ(Nfo)，可实现探针特异性和靶标结合，提高检测特异性，耐高温核酸内切酶Ⅳ(Nfo)将探针序列切成带荧光基团部分和带淬灭基团部分，带淬灭基团部分游离产生荧光，从而实现荧光采集，实现了LAMP扩增和荧光发光检测的结合，可实时监测LAMP扩增情况。
2.本发明的四氢呋喃探针，在特异性与靶标结合后，被耐高温核酸内切酶Ⅳ切成带荧光基团的部分，亦可成为一条新的带荧光加速引物，加速扩增反应进行，缩短反应时间提高检测灵敏度。
3.采用特异性结合的四氢呋喃探针和耐高温核酸内切酶Ⅳ(Nfo)，能提高反应特异性，避免LAMP的假阳性，同时也提高检测效率，缩短了反应时间。
4.通过修饰探针不同的荧光信号，可实现1管内多重检测，实现不同靶标的特异性检测，仅用常规荧光检测装置即可对荧光信号值进行采集和结果显示、判定，减少常规显色法肉眼判断结果的误判。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1不同探针区域及方向的筛选
探索白色念珠菌四氢呋喃探针不同合成区域及位置的应用，优化出四氢呋喃探针最佳设计区域，其包括以下步骤：
(1)选择出能特异性地检测白色念珠菌的ITS2序列作为靶点，在该段靶序列上根据热力学特征和高级结构，设计常规的LAMP引物。上述引物CA-F3的碱基序列如SEQ ID NO:01所示，引物CA-B3的碱基序列如SEQ ID NO:02所示,引物CA-FIP的碱基序列如SEQ ID NO:03所示，引物CA-BIP的碱基序列如SEQ ID NO:04所示，引物CA-LF的碱基序列如SEQ ID NO:05所示，引物CA-LB的碱基序列如SEQ ID NO:06所示，具体如下表所示：
序列号 名称 序列(5’-3’)
SEQ ID NO.01 CA-F3 GGTTCTCGCATCGATGAAGA
SEQ ID NO.02 CA-B3 CGCCTTACCACTACCGTCT
SEQ ID NO.03 CA-FIP GGCGCAATGTGCGTTCAAAGATACGCAGCGAAATGCGATAC
SEQ ID NO.04 CA-BIP GGAGGGCATGCCTGTTTGAGCTCAAGCAAACCCAAGTCGTA
SEQ ID NO.05 CA-LF GATGATTCACGAATATCTGCAA
SEQ ID NO.06 CA-LB CCTCAAACCGCTGGGT
(2)选择人基因组保守的GAPDH基因作为内参靶点，在该段靶序列上根据热力学特征和高级结构，设计常规的LAMP引物。上述引物GAPDH-F3的碱基序列如SEQ ID NO:07所示，引物GAPDH-B3的碱基序列如SEQ ID NO:08所示,引物GAPDH-FIP的碱基序列如SEQ ID NO:09所示，引物GAPDH-BIP的碱基序列如SEQ ID NO:10所示，引物GAPDH-LF的碱基序列如SEQID NO:11所示，引物GAPDH-LB的碱基序列如SEQ ID NO:12所示，具体如下表所示：
序列号 名称 序列
SEQ ID NO.07 GAPDH-F3 GGACTCATGACCACAGTCCA
SEQ ID NO.08 GAPDH-B3 GCTTCCCGTTCAGCTCAG
SEQ ID NO.09 GAPDH-FIP CGGCCATCACGCCACAGTTT-CCATCACTGCCACCCAGA
SEQ ID NO.10 GAPDH-BIP CGGGGCTCTCCAGAACATCATC-GATGACCTTGCCCACAGC
SEQ ID NO.11 GAPDH-LF GAGGGGCCATCCACAGTC
SEQ ID NO.12 GAPDH-LB CTGCCTCTACTGGCGCTG
(3)根据白色念珠菌的保守区域，分别设计四氢呋喃探针，探针CA-P的碱基序列如SEQ ID NO:13所示，设计在B1-B2正向区域；探针CA-P2的碱基序列如SEQ ID NO:14所示，设计在F1-F2反向区域；探针CA-P3的碱基序列如SEQ ID NO:15所示，设计在B1-B2反向区域，探针CA-P4的碱基序列如SEQ ID NO:16所示，设计在F1-B1正向区域,内参GAPDH探针GAPDH-P碱基序列如SEQ ID NO:17所示，设计在F1-F2反向区域，具体如下表所示：
(4)将实施例1中设计得到的不同区域和位置的探针应用于白色念珠菌多重荧光检测中，步骤如下：
a.取少量白色念珠菌培养物，提取DNA或直接裂解得到DNA；
b.按表1配方顺序配制白色念珠菌多重荧光检测反应体系，分别配制添加不同探针的反应体系；
c.震荡混匀后，在宏石实时荧光定量PCR仪上设置61℃60s FAM通道和ROX通道采集荧光，30个循环进行检测。
表1反应体系
结果
检测结果如图2所示，应用实施例1设计得到的不同区域或位置探针检测白色念珠菌培养物，同一体系检测同一模板，不同探针检测出峰时间不同，设计在F1-F2反向区域探针检测出峰时间最短，检测效率最高，设计在F1-B1正向和B1-B2正向稍差，设计在B1-B2反向区域检测效果最差。
本发明涉及的四氢呋喃探针设计区域优选F1-F2反向，F1-B1正向和B1-B2正向，最优选为F1-F2反向。
(5)选择出能特异性地检测新型冠状病毒的N基因作为靶点，在该段靶序列上根据热力学特征和高级结构，设计常规的LAMP引物。上述引物SARS-CoV-2-F3的碱基序列如SEQID NO:18所示，引物SARS-CoV-2-B3的碱基序列如SEQ ID NO:19所示，引物SARS-CoV-2-FIP的碱基序列如SEQ ID NO:20所示，引物SARS-CoV-2-BIP的碱基序列如SEQ ID NO:21所示，引物SARS-CoV-2-LF的碱基序列如SEQ ID NO:22所示，引物SARS-CoV-2-LB的碱基序列如SEQ ID NO:23所示，具体如下表所示：
(6)根据新型冠状病毒N基因保守区域，分别设计引物序列与四氢呋喃探针，探针SARS-CoV-2-P的碱基序列如SEQ ID NO:24所示，设计在F1-F2反向区域；探针SARS-CoV-2-P2的碱基序列如SEQ ID NO:25所示，设计在B1-B2正向区域；探针SARS-CoV-2-P3的碱基序列如SEQ ID NO:26所示，设计在B1-B2反向区域，探针SARS-CoV-2-P4的碱基序列如SEQ IDNO:27所示，设计在F1-B1正向区域具体如下表所示：
结果
检测结果如图3所示，应用实施例1设计得到的不同区域或位置探针检测新型冠状病毒培养物，同一体系检测同一模板，不同探针检测出峰时间不同，设计在F1-F2反向区域探针检测出峰时间最短，检测效率最高，设计在F1-B1正向和B1-B2正向稍差，设计在B1-B2反向区域的探针检测效果最差。
本发明涉及的四氢呋喃探针设计区域优选F1-F2反向，F1-B1正向和B1-B2正向，最优选为F1-F2反向。
实施例2不同碱基修饰位置的四氢呋喃在环介导等温扩增(LAMP)实时荧光多重检测方法检测新型冠状病毒的应用
本实施例所用的不同四氢呋喃碱基修饰位置在环介导等温扩增(LAMP)实时荧光多重检测方法检测新型冠状病毒的应用，其包括以下步骤：
(1)选择出能特异性地检测新型冠状病毒的N基因作为靶点，在该段靶序列上根据热力学特征和高级结构，设计常规的LAMP引物。引物序列参考实施例1。
(2)根据探针序列SEQ NO.24分别设计不同四氢呋喃位置探针，具体如下表所示：
(3)分别配制不同四氢呋喃位置修饰的探针反应体系；
(4)将实施例2设计得到的探针应用于新型冠状病毒多重荧光检测中，检测过程同实施例1，反应体系分4组，反应体系如表2，步骤如下：
a.取少量新型冠状病毒培养物，提取RNA或直接裂解得到RNA；
b.按表2配方顺序配制新型冠状病毒多重荧光检测反应体系，分别配制加不同探针的反应体系：
c.震荡混匀后，在宏石实时荧光定量PCR仪上设置61℃60s FAM通道采集荧光,30个循环进行检测。
表2反应体系
结果
结果如图4所示，探针SARS-CoV-2-P5碱基修饰位置在全长1/2处，酶切后3’端序列不易游离导致无检测信号。
探针SARS-CoV-2-P6检测效果较差，Tt值约在16。
探针SARS-CoV-2-P7和探针SARS-CoV-2-P8检测效果相差不大，在Tt12左右起跳，检测效果较好。
由此可见，同样浓度的序列，靠近3’端进行四氢呋喃修饰，在酶切割时，带有淬灭基团的3’端容易游离，实现荧光发光，便于实时荧光检测；同时淬灭基团的游离，使作为探针的序列可作为又一引物，加速扩增，大大提高了扩增效率。在探针碱基数量为16-30碱基时，从3’端起始3-5个碱基处进行四氢呋喃的碱基修饰，可实现实时荧光检测，同时作为一加速引物，提高扩增效率。
实施例3耐热核酸内切酶Ⅳ(Nfo)在环介导等温扩增(LAMP)实时荧光多重检测方法检测新型冠状病毒的应用
本实施例所用的耐热核酸内切酶Ⅳ(Nfo)在环介导等温扩增(LAMP)实时荧光多重检测方法检测新型冠状病毒的应用，其包括以下步骤：
(1)选择出能特异性地检测新型冠状病毒的N基因作为靶点，在该段靶序列上根据热力学特征和高级结构，设计常规的LAMP引物。引物序列参考实施例1。
(2)选择人基因组保守的GAPDH基因作为内参靶点，在该段靶序列上根据热力学特征和高级结构，设计常规的LAMP引物。引物序列参考实施例1。
(3)根据新型冠状病毒和内参基因设计的引物区域，分别设计四氢呋喃探针。探针SARS-CoV-2-P的碱基序列如SEQ ID NO:24所示，设计在F1-F2反向区域，探针GAPDH-P的碱基序列如SEQ ID NO:17所示，设计在F1-F2反向区域，具体如下表所示：
(4)分别配置10U/μL的核酸内切酶Nfo和大肠杆菌核酸内切酶Ⅳ；
(5)将实施例2设计得到的引物探针应用于新型冠状病毒多重荧光检测中，检测过程同实施例1。反应体系分2组，分别加入配置好的10U/μL的核酸内切酶Nfo和大肠杆菌核酸内切酶Ⅳ，反应体系如表2，步骤如下：
a.取少量新型冠状病毒培养物，提取RNA或直接裂解得到RNA；
b.按表2配方顺序配制新型冠状病毒多重荧光检测反应体系，分别配制加耐热核酸内切酶Ⅳ(Nfo)与常规核酸内切酶Ⅳ的反应体系：
c.震荡混匀后，在宏石实时荧光定量PCR仪上设置61℃60s FAM通道和ROX通道采集荧光，30个循环进行检测。
结果
检测结果如图5所示。应用耐热核酸内切酶Nfo的反应体系，扩增效率更高(相差4-5个Tt)，检测出峰时间更靠前，表现出更高的检测效率。这源于核酸内切酶Nfo耐热效果更好85℃20min失活，而RPA检测中使用的大肠杆菌核酸内切酶Ⅳ80℃15min失活。
实施例4实时荧光多重检测方法在新型冠状病毒核酸检测试剂盒上的应用
一种利用LAMP实时荧光检测方法获得的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，包括：
(1)反应液：含有SARS-CoV-2引物SEQ NO.18-23，浓度分别为：0.6μM、0.6μM、0.4μM、0.4μM、0.12μM、0.12μM；含有GAPDH引物SEQ NO.07-12，浓度分别为：0.6μM、0.6μM、0.4μM、0.4μM、0.12μM、0.12μM；SARS-CoV-2探针SEQ NO.24，浓度为0.12μM；GAPDH探针SEQ NO.17，浓度为0.12μM。
SARS-CoV-2探针SEQ NO.24第17个碱基T标记FAM基团，21个碱基C进行THF修饰，3’末端进行BHQ1修饰；GAPDH探针SEQ NO.17第10个碱基T标记ROX基团，15个碱基A进行THF修饰，3’末端进行BHQ2修饰，均设计在F1-F2反向区域。
(2)酶：Bst xw 9.6U；MMLV 400U；RNasein 40U；核酸内切酶Nfo 10U。
反应体系采用耐热核酸内切酶Nfo，参考反应体系表2。
实验步骤如下：
a.取少量新型冠状病毒培养物，提取RNA或直接裂解得到RNA后定量梯度稀释至500copies/mL，103～108copies/mL；
b.按上述反应体系配制反应液，取20μL反应试剂+30μL检测模板进行检测，103～108copies/mL模板各检测1次，500copies/mL模板重复检测20次。
c.加入反应液和检测模板后震荡混匀，在宏石实时荧光定量PCR仪上设置61℃60sFAM通道和ROX通道采集荧光，30个循环进行检测。
结果
利用LAMP实时荧光检测方法的新型冠状病毒核酸检测试剂盒对假病毒RNA进行梯度浓度检测，发现103copies/mL假病毒RNA在15min起峰，整个反应30min结束。检测结果如图6所示，说明本发明所用新型冠状病毒核酸检测试剂盒检测灵敏度很高。
本实验最低检出下限在50-100copies/mL(未示出)，20次均能检测出的最低检出限在500copies/mL，如图7所示。
同时，检测其它呼吸道病原体如甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等发现均无扩增，结果如图8所示。
在同一管反应液可实现新型冠状病毒和人源内参GAPDH检测，可实现多重检测，如图9所示，说明本发明所用新型冠状病毒核酸检测试剂盒特异性很好，可应用于呼吸道病原体检测。
实施例5常规环介导等温扩增染料法与环介导等温扩增荧光探针法对比A.常规环介导等温扩增染料法新型冠状病毒核酸检测试剂盒，包括：
(1)反应液：含有SARS-CoV-2引物SEQ NO.18-23，浓度分别为：0.6μM、0.6μM、0.4μM、0.4μM、0.12μM、0.12μM；含有GAPDH引物SEQ NO.07-12，浓度分别为：0.6μM、0.6μM、0.4μM、0.4μM、0.12μM、0.12μM；SARS-CoV-2探针SEQ NO.24，浓度为0.12μM；GAPDH探针SEQ NO.17，浓度为0.12μM。
(2)酶：Bst xw 9.6U；MMLV 400U；RNasein 40U；EvaGreen 2.5μL。
反应体系如下表3所示。
表3反应体系
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B.环介导等温扩增荧光探针法新型冠状病毒核酸检测试剂盒，包括：
(1)反应液：含有SARS-CoV-2引物SEQ NO.18-23，浓度分别为：0.6μM、0.6μM、0.4μM、0.4μM、0.12μM、0.12μM；含有GAPDH引物SEQ NO.07-12，浓度分别为：0.6μM、0.6μM、0.4μM、0.4μM、0.12μM、0.12μM；SARS-CoV-2探针SEQ NO.24，浓度为0.12μM；GAPDH探针SEQ NO.17，浓度为0.12μM。
(2)SARS-CoV-2探针SEQ NO.24第17个碱基T标记FAM基团，21个碱基C进行THF修饰，3'末端进行BHQ1修饰；GAPDH探针SEQ NO.17第10个碱基T标记ROX基团，15个碱基A进行THF修饰，3'末端进行BHQ2修饰，均设计在F1-F2反向区域。
(3)酶：Bst xw 9.6U；MMLV 400U；RNasein 40U；核酸内切酶Nfo 10U。
实验步骤如下：
a.取少量新型冠状病毒培养物，提取RNA或直接裂解得到RNA后定量梯度稀释至200copies/mL；
b.按上述反应体系配制反应液，取20μL反应试剂+30μL检测模板进行检测，500copies/mL模板各重复检测10次并检测其它呼吸道病原体。
c.加入反应液和检测模板后震荡混匀，在宏石实时荧光定量PCR仪上设置61℃60sFAM通道采集荧光，30个循环进行检测。
检测结果如下：
上述检测结果显示，常规环介导等温扩增染料法不能很好检出检测新型冠状病毒200copies/mL假病毒，而环介导等温扩增荧光探针法有较高的灵敏度，能稳定检出新型冠状病毒200copies/mL假病毒；常规环介导等温扩增染料法通过EvaGreen与dsDNA结合后发出高亮度的荧光，只要是dsDNA都能结合，在检测其它呼吸道病原体如甲流H1N1、乙流Victoria、RSV(A型)都出现扩增值，存在非特异扩增，而环介导等温扩增荧光探针法通过探针特异性与靶标结合产生荧光，检测其它呼吸道病原体无非特异扩增。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种基于多重实时荧光的环介导等温扩增检测体系，其特征在于，所述检测体系包括：
(a)LAMP引物；
(b)四氢呋喃探针，其中所述探针的结构从5’端到3’端依次包括：
Z0-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5
其中，
Z0为序列互补区；
Z1为荧光基团修饰的碱基；
Z2为N1个核苷酸，其中N1＝1-5；
Z3为THF修饰的碱基N，其中N表示A、T、C或G中任一核苷酸；
Z4为N2个核苷酸，其中N2＝1-5；
Z5为淬灭基团修饰的碱基；和
(c)耐高温核酸内切酶IV(Nfo)；
其中，当所述四氢呋喃探针未被耐高温核酸内切酶IV切割时，所述荧光基团被所述淬灭基团所淬灭，从而不产生荧光信号；当所述四氢呋喃探针被耐高温核酸内切酶IV切割时，所述淬灭基团游离，所述荧光基团不被所述淬灭基团淬灭，从而产生荧光信号。
2.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的四氢呋喃探针为在5’端标记荧光基团FAM、VIC、CY5或ROX并在3’端标记淬灭基团BHQ或TAMARA后的荧光探针。
3.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的四氢呋喃探针靶向靶基因的B1-B2反向互补区域(序列5’-3’方向进行反向互补)，较佳地F1-B1正向区域(序列5’-3’方向)，更佳地B1-B2正向区域(序列5’-3’方向)，最佳地F1-F2反向互补区域(序列5’-3’方向进行反向互补)。
4.一种用于检测呼吸道病原体的环介导等温扩增检测体系，其特征在于，所述体系包括：
(a)LAMP引物；
(b)四氢呋喃探针；和
(c)耐高温核酸内切酶IV(Nfo)；
其中，当所述四氢呋喃探针未被耐高温核酸内切酶IV切割时，所述荧光基团被所述淬灭基团所淬灭，从而不产生荧光信号；当所述四氢呋喃探针被耐高温核酸内切酶IV切割时，所述淬灭基团游离，所述荧光基团不被所述淬灭基团淬灭，从而产生荧光信号。
5.如权利要求4所述的检测体系，其特征在于，所述的LAMP引物为针对新冠病毒N基因的引物对，所述引物对包括：
(1)N基因的SARS-CoV-2-F3引物：序列如SEQ ID NO:18所示；
(2)N基因的SARS-CoV-2-B3引物：序列如SEQ ID NO:19所示；
(3)N基因的SARS-CoV-2-FIP引物：序列如SEQ ID NO:20所示；
(4)N基因的SARS-CoV-2-BIP引物：序列如SEQ ID NO:21所示；
(5)N基因的SARS-CoV-2-LF引物：序列如SEQ ID NO:22所示；
(6)N基因的SARS-CoV-2-LB引物：序列如SEQ ID NO:23所示。
6.如权利要求4所述的检测体系，其特征在于，所述的四氢呋喃探针的序列如SEQ IDNO:24～27所示，较佳地SEQ ID NO:24。
7.一种呼吸道病原体的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
(a)提供一反应体系，所述反应体系包括：如权利要求4所述的检测体系、待测样品和核酸扩增引物，所述的核酸扩增引物用于扩增呼吸道病原体的核酸序列；
(b)对所述反应体系进行核酸扩增，从而获得含扩增产物的反应体系；和
(c)在扩增反应过程之中或之后，检测所述检测探针发出的可检测信号，所述可检测信号为荧光。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述的待测样品(或相应的扩增产物)在所述检测体系中的浓度为50～500copies/mL，较佳地50～200copies/mL，更佳地50-100copies/mL。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有以下组分：
(a)LAMP引物；
(b)四氢呋喃探针；和
(c)耐高温核酸内切酶IV；
其中，当所述四氢呋喃探针未被耐高温核酸内切酶IV切割时，所述荧光基团被所述淬灭基团所淬灭，从而不产生荧光信号；当所述四氢呋喃探针被耐高温核酸内切酶IV切割时，所述淬灭基团游离，所述荧光基团不被所述淬灭基团淬灭，从而产生荧光信号。
10.如权利要求9所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于制备检测呼吸道病原体的试剂盒。
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