CN110945140A - 通过聚合酶链式反应对目标dna进行检测和基因分型的分子指纹法 - Google Patents

通过聚合酶链式反应对目标dna进行检测和基因分型的分子指纹法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过聚合酶链式反应（PCR）检测样品中目标病原体DNA并对其进行基因分型的分子指纹法。该方法包含进行PCR扩增和随后的高分辨率熔解（HRM）分析。所用的PCR反应混合物包含两对或更多对扩增引物，其被设计来产生彼此具有不同熔解温度的扩增子，以便在HRM分析中通过观察每个扩增子的特异性的熔解温度来区分每个扩增子。该方法还包含监测在HRM分析过程中由于嵌入分子或化合物的释放，温度诱导的双链扩增子变性为两个单链DNA而产生的信号发射变化。通过读取器分析信号变化以确定样品中同一病原体的不同株、属于不同属和遗传变异的不同病原体的区分和基因分型，分析结果通过连接到读取器的图形界面获得。

Description

通过聚合酶链式反应对目标DNA进行检测和基因分型的分子 指纹法
技术领域
本公开的实施方式涉及用于能够在单个反应中对同一病原体的不同株（strain）、属于不同属和遗传变异的不同病原体进行区分和基因分型的多重聚合酶链式反应（PCR）分析的引物、寡核苷酸、化学组分和方法。特别地，本公开的实施方式涉及在一个多重测定中通过使用高分辨率熔解（HRM）技术的PCR来检测和表征与性传播疾病有关的病原体（例如，但不限于高危型人乳头瘤病毒（HPV））的不同株的引物、寡核苷酸、方法和条件。
背景技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种用于全世界诊断应用的可靠技术。PCR由在体外扩增特异性的核酸的引物延伸反应组成。该反应利用热稳定的DNA聚合酶，并且其是基于包括不同温度步骤在内的几个循环，可以进行DNA变性、引物退火和聚合酶介导的目标DNA的延伸。
PCR能够与能够嵌入双链DNA的荧光染料或荧光标记的DNA探针结合使用；用这种方法，新合成的扩增子产生的信号能够通过荧光采集被实时采集定量。
高分辨率熔解（HRM）是另外的PCR之后的分析步骤，其通过研究双链DNA的热变性进一步表征扩增子。这是通过分析升温范围通常在65℃至95℃内、荧光采集速率为0.1 ℃/sec或更小的扩增子解离（熔解）行为来实现的。这种方法可以区分不同扩增子之间的序列变异和特征，甚至可以观察到单核苷酸多态性（SNP）。
HRM已被用于诊断（例如能够在多态的等位基因中识别SNP的基因检测），并且其已被提议用于包括病原体检测在内的多种应用。
如今，HRM分析需要高纯度的提取的DNA：这将其应用主要限制在能够自动提取DNA提的高输入量（high-income）环境中。
此外，为了获得高特异性，HRM在需要目标专用引物和探针组的PCR反应中进行，而这些引物和探针组通常不是十分便宜的试剂。尽管如此，HRM对于低输入量环境中的有益应用（如人类病原体的表征）仍具有巨大的未开发潜力。
众所周知，人乳头瘤病毒（HPV）是宫颈癌的主要原因。该肿瘤是女性中第二常见肿瘤，全球超过500,000例1，并且其主要由高风险HPV（HR-HPV）基因型的持续感染决定；迄今为止，已发现大约有20种癌症相关HR-HPV，其中HPV16和HPV18最为常见（占所有浸润性宫颈癌的70%）2,3。有效的宫颈癌筛查项目降低了这种肿瘤的发病率和死亡率4；最初的筛查是通过Papanicolau试验（Pap试验）进行的，这是一种能够识别癌前细胞的细胞学试验，通过宫颈内刷收集宫颈标本后在显微镜载玻片上接种和染色后实现。该技术具有很高的阳性预测值，但平均灵敏度差5，且阴性预测值低。
鉴于HPV DNA试验的阴性预测值较高，目前的研究表明HPV DNA试验在预防浸润性宫颈癌方面比单独进行Pap试验筛查更为有效6-8。此外，鉴于不同的HR-HPV基因型之间癌症发展的阳性预测值的差异，HPV基因分型在宫颈癌和其他HPV相关的癌症（例如，肛门-生殖器的和口咽的肿瘤）中对HPV阳性患者进行分类是有用的9-13。它也可以区分暂时性感染与持续性感染，后者是癌症转化的真正危险因素。最后，基因分型试验可以是群体研究中用于疫苗监测和群体免疫的重要工具，用于评估接种疫苗和未接种疫苗群体中每种基因型的盛行率（prevalence）的变化14。
如今，最广泛的试验可以分为两类15：
1. 信号放大试验，如基于Hybrid Capture® 2（HC2，Qiagen）技术的Digene ®HPV测试，以及Cervista® HPVHR试验。HC2是基于13种标记的HR-HPV-特异性的RNA探针与目标HPV DNA的杂交的一种非放射性的信号放大方法；DNA-RNA杂合物被与碱性磷酸酶偶联的特异性抗体识别并被吸附至微孔底部。通过化学发光信号测量的酶活性与目标DNA的量成正比。Cervista® HPV-HR试验采用基于荧光共振能量转移（FRET）的技术，并且每种HPV类型有两个探针；其能够检测到14种HR-HPV。
这些技术是定量的且假阳性率较低，但其不提供任何HPV基因分型的信息，并且其需要专用的仪器。
2. 核酸扩增试验，基于实时PCR方法；在这些试验中，COBAS 4800 HPV试验（罗氏公司（Roche）开发）是最广泛的，并且在全自动系统中采用几个引物对和探针对并提供HPV16和HPV18的基因分型信息。该试验（如Qiagen）被认为是黄金标准，并且其具有非常高的灵敏度。
其他基于PCR的试验包括Papillocheck®（Greiner Bio-One），该试验能够通过DNA芯片上的28种探针对24种HPV进行检测和基因分型；PCR后，杂交在自动扫描和分析的微阵列芯片上进行。
线性阵列HPV基因分型（Roche）是一种基于PCR的试验，结合反向线点杂交，能够区分37种HPV；但是，该试验很耗时，而且由于容易交叉杂交，其提供的结果是模棱两可的。Cepheid HPV是市场上唯一能够在即用型盒中直接使用PreservCyt样品，然后在模块化机器中运行专用的PCR循环的试验。
所有这些试验需要专用的仪器，并且对于广泛应用不够便宜，尤其是在发展中国家。
PCR多重分析通常是一项棘手的分析，因为其使用了几种导致荧光非特异性扩增信号（例如来自引物二聚体的信号）的引物组。荧光标记的探针（例如Taqman探针，LifeTechnologies）能够限制这种情况，与不区分扩增子的嵌入染料相比，其确保更高的特异性。但是，荧光标记的探针会大大增加试验成本，影响试验的稳定性，并且需要一个以上的荧光通道；这意味着只能使用具有特殊特异性的专用的仪器进行试验。
因此，需要改进通过聚合酶链式反应（PCR）检测目标DNA的分子指纹法，克服本领域的至少一个缺点。
本公开的一个目的是提供通过PCR检测目标DNA或基因型的分子指纹法。
特别地，本公开的一个目的是在单个反应中通过特异性的HRM分析来区分病原体，特别是病毒性人乳头瘤病毒基因型。
本公开的另一个目的是仅增加特异性的PCR扩增子的扩增，减少非特异性信号发射，例如背景的荧光。
本公开的另一个目的是避免引物二聚体。
本公开的另一个目的是提供用于多重PCR的引物、寡核苷酸、化学组分和方法，其克服了如上所述的非特异性荧光信号问题。
本公开的另一个目的是设置每个用于对病原体进行基因分型所需的正确和精确的熔解分析的实时PCR机器。
发明内容
根据实施方式，本公开提供了一种通过聚合酶链式反应（PCR）对样品中的目标DNA进行检测和基因分型的分子指纹法。本公开的方法能够在单个反应中对相同病原体的不同株、属于不同属和遗传变异的不同病原体进行区分和基因分型。在一个实施方式中，该方法包括：
-提供包含扩增缓冲液的PCR反应混合物，该扩增缓冲液含有并入双链扩增子中并发射可检测信号的嵌入分子或化合物；
-使用所述PCR反应混合物和所述样品进行PCR扩增；
-在PCR扩增结束时，对PCR反应混合物和先前进行PCR扩增的样品进行高分辨率熔解（HRM）分析；
其中PCR反应混合物包含用于以多重方式扩增两种或更多种目标核酸的两对或更多对扩增引物，
其中所述扩增引物被设计以产生彼此具有不同熔解温度的扩增子，从而在HRM分析中通过观察每个扩增子的特异性熔解温度来区分每个扩增子，
其中该方法进一步包含在HRM分析过程中监测由于嵌入分子或化合物的释放，温度诱导的双链扩增子变性为两个单链DNA而产生的信号发射变化，
其中该方法进一步包含通过读取器分析信号变化确定样品中同一病原体的不同株、属于不同属和遗传变异的不同病原体的区别和基因型分型，并且通过连接至所述读取器的图形界面获得分析的结果。
根据另外的实施方式，本公开提供了一种对目标DNA进行检测和进行基因分型的诊断试剂盒，其包含能够被用于进行PCR扩增和随后的对先前进行实时PCR的PCR反应混合物进行HRM分析的PCR反应混合物。在一个实施方式中，所述PCR反应混合物包含两对或更多对扩增引物用于以多重方式扩增两种或更多种目标核酸，
其中所述引物被设计来产生彼此具有不同熔解温度的扩增子，以便在HRM分析中通过观察每个扩增子的特异性熔解温度来区分每个扩增子。
根据另外的实施方式，本公开提供了用于通过PCR对目标DNA进行检测和基因分型的分子指纹法的扩增引物，其中该方法能够在单个反应中对相同病原体的不同株、属于不同属和遗传变异的不同病原体进行区分和基因分型。在一个实施方式中，本公开提供了用于以多重方式在PCR扩增中扩增两种或更多种目标核酸的扩增引物，其中所述引物被设计来产生彼此具有不同熔解温度的扩增子，以便在PCR扩增后的HRM分析中，通过观察每个扩增子的特异性解链温度来区分每个扩增子。
根据另一个实施方式，本公开提供了一种用于通过PCR对样品中的目标DNA进行检测和基因分型的分子指纹法的仪器。该方法能够在单个反应中对相同病原体的不同株、属于不同属和遗传变异的不同病原体进行区分和基因分型。在一个实施方式中，该仪器包括：
-包含扩增缓冲液的PCR反应混合物，该扩增缓冲液含有并入双链扩增子中并发射可检测信号的嵌入分子或化合物；
-被配置为使用所述PCR反应混合物和所述样品的PCR扩增设备；
-用于对PCR反应混合物和先前进行PCR扩增的样品进行HRM分析的设备；
其中PCR反应混合物包含用于以多重方式扩增两种或更多种目标核酸的两对或更多对扩增引物，
其中所述引物被设计来产生彼此具有不同熔解温度的扩增子，以便在HRM分析中通过观察每个扩增子的特异性熔解温度来区分每个扩增子；
-监测装置，用于在HRM分析过程中监测由于嵌入分子或化合物的释放，温度诱导的双链扩增子变性为两个单链DNA而产生的信号发射变化，
-读取器，用于分析信号变化以确定样品中同一病原体的不同株、属于不同属和遗传变异的不同病原体的区别和基因分型，从而能够通过连接至所述读取器的图形界面获得分析的结果。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的实施方式，能够被检测和基因分型的目标DNA是病原体目标DNA。
有利地，所提出的技术利用了普通的DNA嵌入分子或化合物（例如嵌入染料），它们比荧光标记的探针便宜得多。
此外，根据本公开，PCR之后的HRM分析不需要专用的仪器，而是能够在HRM分辨率为至少0.1 ℃/秒或更小的任何热循环仪中进行。在这种情况下，引物设计是至关重要的，并且根据本公开设计的引物在确保多重试验形式下每个单个目标的最高特异性方面是完全成功的。
在有利的实施方式中，根据本公开的熔解指纹技术已经被成功应用于改善HPVDNA（宫颈癌的主要原因）的检测。
有利地，本文所描述的实施方式可以使用特异性的缓冲液和条件、特异性的DNA引物和创新的杂交引物。
本文所描述的实施方式允许通过特异性的HRM分析来区分例如病毒性HPV基因型。
有利地，本文描述的实施方式允许检测多达37种HPV类型，包括例如6、11、16、18、26、31、33、35、39、40、42、45、51、52、53、54、55、56、58、59、61、62、64、66、67、68、69、70、71、72、73（MM9）、81、82（MM4）、83（MM7）、84（MM8）、IS39、CP6108。病毒的基因组扩增反应能够与目标DNA上样对照（例如人β-珠蛋白基因）的扩增相偶联。
能够根据本公开检测的其他病原体包括例如除了HPV以外的与性传染疾病有关的其他病原体，例如与梅毒感染有关的细菌Treponema pallidum亚种苍白螺旋体、与淋病感染有关的细菌Neisseria gonorrhoeae、与衣原体感染有关的细菌Chlamydia Trachomatis、以及HIV病毒。
本文所描述的实施方式还提供了一种熔解校准物（melting calibrator），其用于设置每个实时PCR机器，以获得对病原体进行基因分型所需的正确和精确的熔解分析。
根据本公开所描述的实施方式完全解决了现有技术的试验和方法的上述问题，并且进一步提供了至少以下优点：
-能够使用新的样品类型：本公开的实施方式能够使用直接从不同样品类型提取的DNA，例如阴道和宫颈粘液（即，原始样品），它们是女性能够没有侵入性和痛苦即可容易地自我采集生物样品；
-可负担性：与前述现有技术的试验和方法相比，本公开的实施方式更便宜，因为它们不使用数十种昂贵的标记探针，而是使用独特的嵌入分子或化合物，例如可提供嵌入染料；此外，基因型分型不需要孵育和反向点杂交步骤，但其能够在单个短的PCR反应中进行（例如，在少于50分钟内）；
-开放可及性：本公开的实施方式能够由任何实时PCR机器执行，并且不需要专用的和特定的仪器；
-单通道：与使用超过一个通道的前述现有技术的试验和方法相反，本公开的实施方式的结果能够通过对单个信号（例如，荧光）通道的分析来提供。所选择的通道能够从嵌入在任何实时PCR机器中的那些通道中选择，并且这使得本发明的实施方式适合于任何实时PCR机器。
参考以下描述、附图和所附权利要求，将更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优点。并入且构成该说明书的一部分的附图被用于说明本发明的实施方式，与说明书一起用于解释本发明的原理。
在任何可能的情况下，可以单独地应用本公开中描述的各个方面和特征。这些单独的方面（例如所附从属权利要求中描述的方面和特征）能够成为分案专利申请的主题。
应当指出，在专利申请过程中如发现任何内容是已知的则应理解为不主张权利，而是放弃声明的主题。
附图说明
为了能够详细地理解本发明的上述特征的方式，可以通过参考实施方式对以上简要概述的本发明进行更具体的描述。附图涉及本公开的实施方式，并在下文中进行描述：
-图1是示出本发明提出的系统的性能的图，特别参见熔解曲线的质量。与使用标准PCR缓冲液获得的熔解曲线（灰色图）相比，黑色熔解图显示了具有较低初始荧光背景的更好性能；
-图2是示出了用特异性引物的导数荧光与温度曲线的图，所述特定引物被设计成对于每种HPV基因型具有不同的解链温度，从而可以同时精确鉴定最常见的高风险基因型；
-图3以示意图和3D结构示出了具有（A和B）和不具有（C和D）5'保真度尾部的杂交引物结构。
具体实施方式
现在将使用附图详细介绍本发明的各种实施方式。通常，仅描述关于各个实施方式的差异。每个实施例都是提供用来解释本发明，并不意味着对本发明的限制。例如，作为一个实施方式的一部分示出或描述的特征能够被用于其他实施方式或与其他实施方式结合以产生另一个实施方式。本发明旨在包括这样的修改和变化。
在描述这些实施方式之前，还应明确，本说明书的应用不限于如以下说明书中使用附图所描述的部分的构造和布置的细节。本描述能够提供其他实施方式并且能够以各种其他方式获得或执行。还应明确的是，本文使用的措词和术语仅出于描述目的，不能视为限制性的。
除非另有说明，否则所有示出的百分数和比例均指总组合物的重量（例如示出为％ w/w）。除非另有说明，否则所有测量均在25℃和大气压下进行。除非另有说明，否则所有温度均以摄氏度为单位。
本文报告的所有范围应理解为包括极限值，包括报告的两个值“之间”的间隔值。此外，本文报告的所有范围应理解为包括并描述其中包括的精确值，以及所有子间隔。此外，所有范围旨在使得最终组成中包含在其中的值的总和为100％，特别是考虑到本领域技术人员将知道如何选择范围的值使得总和不超过100％。
在提供数值范围的情况下，应理解为，在该范围的上限和下限之间的每个中间值以及该范围之内的任何其他所述值或中间值都包括在本发明内，除非上下文中另有明确规定，否则至下限单位的十分之一。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在较小范围内，并且也包括在本发明内，但要遵守所述范围内任何明确排除的限制。当所述范围包括一个或两个极限值时，排除那些所包括的极限值中的一个或两个的范围也包括在本发明中。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然与本文描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料也能够被用于本发明的实践或试验，现在描述具有代表性的说明性方法和材料。
对于本领域技术人员而言，在阅读本公开后将显而易见的是，本文描述和示出的每个单独的实施方式具有离散的组分和特征，这些组分和特征可以容易地与其他几个实施方式中的任何一个的特征分离或组合，而不脱离本发明的范围或精神。另外，对于本领域的普通技术人员而言将显而易见的是，在不脱离所附权利要求的精神和范围的情况下，根据本文的教导可以对其进行某些改变和修改。任何所述的方法可以按照所述的事件的顺序或在逻辑上可能的任何其他顺序进行。
如同每个单独的出版物或专利被明确地和单独地指出通过引用并入本文一样，本说明书中引用的所有出版物和专利通过引用并入本文，并通过引用并入本文来公开和描述与引用的出版物相关的方法和/或材料。当该出版物列出的术语的定义与本公开的明确的或暗含的定义相冲突时，以本公开的定义为准。任何出版物的引用是由于其在申请日之前公开，并且不应该被解释为承认本发明由于在先发明而无权早于该出版物。此外，提供的公开日期可能与实际公开日期有所不同，实际公开日期可能需要独立确认。
本公开的实施方式大体上涉及通过PCR对样品中的目标DNA进行检测和表征的分子指纹法。本公开的方法能够在单个反应中对相同病原体的不同株、属于不同属和遗传变异的不同病原体进行区分和基因分型。在一个实施方式中，该方法包括：
-提供包含扩增缓冲液的PCR反应混合物，该扩增缓冲液含有并入双链扩增子中并发射可检测信号的嵌入分子或化合物；
-使用所述PCR反应混合物和所述样品进行PCR扩增；
-在PCR扩增结束时，对所述PCR反应混合物和先前进行PCR扩增的所述样品进行HRM分析；
其中PCR反应混合物包含两对或更多对扩增引物，用于以多重方式扩增两种或更多种目标核酸，
其中所述扩增引物被设计来产生彼此具有不同熔解温度的扩增子，以便在HRM分析中通过观察每个扩增子的特定熔解温度来区分每个扩增子，
其中该方法进一步包含在HRM分析过程中监测由于嵌入分子或化合物的释放，温度诱导的双链扩增子变性为两个单链DNA而产生的信号发射变化，
其中该方法进一步包含通过读取器分析信号变化确定对样品中同一病原体的不同株、属于不同属和遗传变异的不同病原体的区别和基因型分型，并且通过连接至所述读取器的图形界面获得分析的结果。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的实施方式，能够被检测和基因分型的目标DNA是病原体目标DNA。
有利地，使用本文所描述的实施方式，可以检测和区分：
-特定病原体的不同类型（例如14种不同的高风险HPV菌株）；
-不同的病原体（例如与性传染疾病有关的不同病原体，例如HPV、梅毒感染、淋病感染、HIV）；
-细胞基因的不同等位基因（例如人BRCA基因的不同突变）；
-几种细胞基因的不同等位基因（例如BRCA基因的不同突变、K-RAS基因或其他基因的不同突变）。
有利地，样品可以是原始样品。原始样品可以是阴道或宫颈粘液、其他体液、唾液、血液、尿液、活检组织、福尔马林固定的石蜡包埋的（FFPE）组织、细胞、细针穿刺活检组织等。原始样品可在进行PCR扩增和HRM分析之前被稀释。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的可能的实施方式，可在读取器中包含的电路中检测输入信号和输出信号之间的信号变化，其中所述变化是样品中存在的同一病原体的不同株、属于不同属和遗传变异的不同病原体的存在、数量、基因型的函数。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的实施方式，使用所述PCR反应混合物进行PCR扩增包括使用所述PCR反应混合物扩增目标纯化的核酸以产生扩增子或扩增产物。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的实施方式，扩增引物与目标核酸充分互补以与其杂交并触发聚合酶介导的合成。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的一个具体的实施方式中，扩增引物被设计为特异性地扩增病原体目标DNA（例如HPV基因型），从而产生相应的扩增子，每个扩增子为38至1500个碱基对（bps）。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的另一具体实施方式中，扩增引物被设计为扩增熔解峰在68至95℃之间的扩增子。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的又一个实施方式中，每种扩增引物以50至1000纳摩尔（nM）的最终浓度范围存在于PCR反应混合物中。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的实施方式，PCR反应混合物包含扩增引物和扩增缓冲液。
根据实施方式，扩增缓冲液被包含在作为本公开的一部分的诊断试剂盒中。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的一个实施方式中，除上述两对或更多对扩增引物外，PCR反应混合物包含DNA聚合酶。DNA聚合酶被包含在所述扩增缓冲液中。DNA聚合酶是一种聚合新DNA链的酶。例如，能够使用耐热或热稳定的聚合酶，因为它更可能在高温DNA变性过程中保持完整。能够在本文所描述的实施方式中使用的耐热或热稳定的聚合酶的一个实施例是taq聚合酶。此外，能与本文所描述的实施方式结合使用的聚合酶是热启动聚合酶。在可能的实施方式中，热启动聚合酶可以是（Hot Start）@Taq DNA Euroclone、（Hot Start）Phire Thermo Scientific、（Hot Start）Phusion Thermo Scientific或（HotStart）Gold Taq聚合酶Sigma。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的另一个实施方式中，PCR反应混合物可以进一步包含脱氧核苷三磷酸（dNTP）或类似物。dNTP或类似物被包含在所述扩增缓冲液中。dNTP或类似物被用来为DNA聚合酶合成新的DNA链提供构建基础。dNTP可被功能类似物（如腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、酪氨酸、尿嘧啶、乳清苷、肌苷、黄苷酸）代替。
如上所述，PCR反应混合物包含并入双链扩增子或扩增产物中并发射荧光或任何可检测信号的所述嵌入分子或化合物。嵌入分子或化合物可被包含在所述扩增缓冲液中。
特别地，根据实施方式，嵌入分子可以是发射能够被读取器检测到信号的任何传感分子或报告分子，该读取器在电导测定的、电流测定的、伏安法的检测或特定波长的光存在的情况下、在荧光/化学发光检测或光散射和/或折射/衍射现象的情况下、在等离子体光学探测的情况下分析电感、电流、电势的电信号变化。
例如，在一些实施方式中，嵌入分子或化合物可以是发射荧光的嵌入染料。根据可能的实施方式，最终浓度为1至8 µM的特异性DNA嵌入染料是以下染料中的一种或多种：SYTO-9、SYTO-13、SYTO-16、SYTO-64、SYTO-82、YO-PRO-1、SYTO-60、SYTO-62、TOTO-3、POPO-3、BOBO-3、阿霉素缀合的量子点纳米粒子或类似物。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的另一个实施方式中，PCR反应混合物可以进一步包含缓冲溶液。缓冲溶液被包含在所述扩增缓冲液中。缓冲液溶液为DNA聚合酶的最佳活性和稳定性提供了合适的化学环境。例如，缓冲液溶液可以包含水（特别是去离子水）、TrisHCl和/或KCl、以及在某些情况下可能包含的MgCl2。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的一个实施方式中，PCR反应混合物可以进一步包含pH稳定剂。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的另一个实施方式中，PCR反应混合物可以进一步包含防腐剂。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的另一个实施方式中，PCR反应混合物可以进一步包含水。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的另一个实施方式中，PCR反应混合物可以进一步包含一价或二价阳离子的来源。一价或二价阳离子的来源被包含在所述扩增缓冲液中。例如，可使用含有一价离子或二价离子的氯化物。作为一价阳离子的来源，可使用钾离子。K+可从钾盐（如氯化钾，特别是浓度约为0.1 M的氯化钾）中获得。作为二价阳离子的来源，可使用镁或锰离子。Mg2+可从镁盐（例如氯化镁）中获得。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的另一个实施方式中，PCR反应混合物可以进一步包含牛血清白蛋白（BSA）。BSA被包含在所述扩增缓冲液中。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的另一个实施方式中，PCR反应混合物还包含一种或多种去污剂。在可能的实施方式中，所述去污剂可以是浓度约为0.5％的Nonidet-P40。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的另一个实施方式中，PCR反应混合物可以进一步包含添加剂。添加剂可被包含在上述扩增缓冲液的一些实施方式中。在可能的实施方式中，能够被使用的添加剂选自以下添加剂中的一种或多种：NP40、DMSO、TMAC（四甲基氯化铵）、乙酰胺、Triton、甲酰胺、甜菜碱、大肠杆菌ssDNA结合蛋白、甘油、左旋肉碱和明胶。有利地，在利用荧光检测的实施方式中，添加剂的存在对于避免高的基础荧光背景是重要的，从而可实现增加的诊断灵敏度、特异性和准确性（参见图1）。在一些可能的实施方式中，添加剂可以进一步包含明胶，例如浓度为约0.1％。在其他可能的实施方式中，添加剂可以进一步包含增强剂。例如，增强剂可以是浓度为约0.42 M的L-肉碱。在其他可能的实施方式中，添加剂可以进一步包含糖醇，例如浓度为约25 mM的山梨糖醇。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的实施方式，使用所述PCR反应混合物扩增目标纯化的核酸，以产生扩增子或扩增产物，所述扩增包括通过进行升温步骤而进行热循环。在一种可能的实施方式中，升温包括进行以下温度步骤：
l 在95-98 ℃变性1至30秒；
l 在50 ℃至70 ℃的范围内退火1至60秒；
l 在60 ℃至75 ℃的范围内延伸0秒到5分钟。
在可能的实施方式中，热循环的循环数为至少30个循环，例如在30至50个循环之间。一个可能的实施例是35个循环。
在一种可能的实施方式中，可使用热启动聚合酶。热启动PCR通过在较低温度下使聚合酶失活（例如通过抗体相互作用、化学修饰或适体技术）来避免DNA的非特异性扩增。通常，特异性抑制剂（例如基于适体的抑制剂或特异性抗体）可被用于在较低温度下阻断聚合酶。如果使用热启动聚合酶，则进行从95 ℃至98 ℃持续1秒到10分钟的初始孵育步骤。该初始孵育步骤对于激活聚合酶是必需的。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的实施方式，该方法包括在PCR扩增的热循环过程中，监测发射信号（例如荧光）的变化，该变化是由于嵌入分子或化合物（即嵌入染料）的释放，温度诱导的双链扩增子或扩增产物变性为两个单链DNA而产生的。嵌入分子或化合物与双链构型的DNA结合。扩增子在每个扩增循环中产生，其中嵌入分子或化合物在延伸步骤中结合，信号（例如荧光）在此过程中被获取。
有利地，PCR反应可在实时PCR机器中进行，该实时PCR机器可以监测PCR扩增中每个扩增循环发射的信号（例如荧光）的变化，进而可以定量扩增子的存在，因此可以定量扩增阶段的病毒DNA。
在其他实施方式中，PCR扩增可以在能够以每0.1℃/秒（或更低）获取所述信号发射的热循环机器中进行。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的实施方式，HRM分析包括对先前进行PCR扩增的PCR反应混合物进行升温。在一个可能的实施方式中，升温包括进行以下温度步骤：
l 在95 ℃孵育1秒至60秒
l 在60 ℃孵育1秒至2分钟
l 以0.1 ℃/秒或更低的速率升温至95 ℃，并进行所述发射信号（例如荧光）变化的监测，该变化是由于嵌入分子或化合物（即嵌入染料）的释放，温度诱导的双链扩增子或扩增产物变性为两个单链DNA产生的。
有利地，监测在HRM分析中信号（例如荧光）发射的变化（在此期间多次扩增热循环后产生大量病毒扩增子）允许分析此类扩增子在不同温度下的熔解特征。在低温（例如60℃）下时，扩增子均为双链，并检测到信号（例如荧光）的最大水平。然而，通过缓慢升高温度，扩增子开始变性直至完全分离成两个单链DNA，并在此时不再产生信号（例如荧光）。例如，可通过上述监测生成的图2中所示的导数荧光与温度曲线的形状和发展取决于序列。本公开采用该特征来区分病毒基因型，因为所使用的引物被设计成产生各自具有特定的且不同的解链温度的扩增子。换句话说，根据本公开设计的扩增引物允许扩增具有精确的且特异性的解链温度指纹的扩增子。
因此，根据使用实时PCR机器的有利实施方式，在实时PCR的每个扩增循环中监测信号（例如荧光）发射的变化之后，有可能知道所分析的样品是否被一种病原体或一组病原体（例如病毒）感染，并能够检测到是哪种可能的基因型。
此外，根据本公开，在HRM分析中监测信号（例如荧光）发射的变化之后，在样品被感染的情况下，还可能确切地知道感染样品的病原体的特定基因型或菌（毒）株或一组病原体中的确切病原体。
因此，总的结果是，在使用实时PCR的有利实施方式中，通过实时PCR可以知道患者对于特定病原体或一组病原体是否呈阳性，以及如果是阳性，则通过HRM分析知道正在感染患者的病原体的基因型或菌（毒）株，或者从所检测的病原体组中知道特定病原体。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的、用图3描述的其他实施方式中，如果引物二聚体的形成引起非特异性的荧光背景，则一种或多种上述扩增引物是被设计为用于减少引物二聚体形成的特异性的茎-环杂交引物。因此，这些特异性的茎-环杂交引物是上述扩增引物的特异性变体，并被用于PCR反应混合物中。有利地，所述特异性茎-环杂交引物被包括在扩增反应中，以避免引物二聚体和非特异性引物与脱靶模板序列的相互作用。这些茎-环杂交引物使得能够设计出具有非常特异的预测熔解温度的扩增子，以便扩增子温度的熔解依赖性设计，因为它们的化学成分既阻碍了DNA聚合酶添加辅助DNA碱基，又阻碍了引物异二聚体的形成。这些茎-环杂交引物是DNA寡核苷酸，其在结构和化学组成方面与标准引物不同。
根据本文所描述实施方式的茎-环杂交引物通过两种不同的机制起作用：保护引物不受非特异性相互作用和自我相互作用的竞争机制；以及仅允许生成具有预期熔解特征的所需扩增子的DNA聚合酶终止系统。茎-环杂交引物的寡核苷酸被构建成4个结构域：1）引物部分，2）环部分，3）竞争回文部分，以及4）5'保真度尾部（参见图3）。
根据实施方式，引物部分1）是实际引物序列中存在的与目标序列互补的序列，其范围可以为15至60个碱基。目标序列是存在于病原体基因组中的与引物部分具有至少50％的同一性DNA序列。
根据实施方式，环部分2）能够包含引物部分30％至90％的碱基，并且其形成稳定且独特的发夹结构。为了形成稳定的环结构，环部分含有许多核苷酸（腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶（timine）、鸟嘌呤、尿嘧啶、乳清苷、肌苷、黄苷酸）或DNA碱基类似物。与引物部分的5'并列，环部分的序列含有一个DNA聚合酶终止位点（持续合成能力阻断元件）。该终止位点能够通过至少一种1,2-二脱氧核糖或一种等效的脱碱基核苷酸的存在、或通过前置或后置至少一种1,2-二脱氧核糖或至少一种聚乙二醇来调节。即使仅由具有至少2个核苷酸的空间填充的结构的PEG（聚乙二醇）分子也可以形成终止位点。在该实施方式中，PEG家族的多个成员是合适的，但是优选的分子是三甘醇（TEG）。
根据实施方式，竞争回文部分3）与引物部分的序列互补。竞争回文部分比引物序列短至少一个核苷酸。竞争回文部分的5'端含有DNA聚合酶终止位点（持续合成能力阻断元件），该位点参考如上环部分2）所述。
根据实施方式，5'保真尾部长度在1至1000个核苷酸的范围内，其含有碱基或碱基类似物（腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、乳清苷、肌苷、黄苷酸），并且与目标序列的下游区域互补或部分互补。
在另外的实施方式中，在引物二聚体的形成引起非特异性荧光背景的情况下，如上所述，可在PCR反应混合物中采用诱饵寡核苷酸，以减少由于引物-二聚体形成而引起的非特异性信号。诱饵寡核苷酸通常是能够结合并阻断转录和各自的翻译因子的寡核苷酸片段。在这些实施方式中，诱饵寡核苷酸为10至100个核苷酸，并且与上述特异性扩增引物至少50％互补。诱饵寡核苷酸的一侧是3'突出端，另一侧是5'钝端。每个诱饵寡核苷酸与相对配对的引物的熔解温度之差不超过2 ℃。
诱饵寡核苷酸可能是有利的，因为它们能够防止扩增引物发生产生游离的3' OH基团（聚合酶可接近它）的非特异性相互作用，因为它们的序列与扩增引物互补，其熔解温度略低，并且它们不会产生暴露游离的3' OH基团的结构。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的实施方式， PCR扩增能在例如PCR热循环仪中进行。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的另外的实施方式，PCR扩增通常能在实时PCR机器（例如实时PCR热循环仪）中进行。
根据本公开，由于首先对同一样品进行PCR扩增然后进行HRM分析，所以整个方法能够在单个仪器（特别是实时PCR机器）中进行。
根据可能的实施方式，PCR扩增和检测可在本领域已知的任何设备中通过实时PCR同时进行，包括可以评估被感染的样品中的病原体量的定量实时PCR，然后在同一实时PCR机器中进行HRM分析。
然而，在其他实施方式中，这两个操作（即PCR扩增和HRM分析）也能够在彼此相连或相关的单独的且不同的仪器中进行，例如用于PCR扩增的典型的热循环仪和配置用于HRM分析的实时PCR。
例如，在可能的实施方式中，可使用也是便携式的专用PCR设备进行检测，该设备含有与荧光读取器或其他合适的读取设备相结合的特定的Peltier模块，能够进行HRM分析。
在另外的实施方式中，经由PCR扩增的所述检测可使用专用PCR设备进行进行，该专用的PCR设备含有例如与不同于荧光读出设备的读出设备相结合的特定Peltier模块，例如化学发光或电化学读出设备，电导测定的、电流测定的、伏安法的读出设备，等离子体光学红外设备或任何其他合适的读出设备。
本文描述的实施方式能够被用于诊断目的。具体地，在下文中，描述了存在于PCR反应混合物的两种可能的实施方式中的试剂的具体范围，其能够被用于诊断目的。随后，描述了能够被用于HPV DNA的特异性检测的具体范围。
特别地，根据本公开的含有上述PCR反应混合物的方法和诊断试剂盒能够被用于检测样品中存在的临床病原体，优选血源性病原体，包括其遗传序列。
在一个实施方式中，用于诊断目的的可能的第一扩增缓冲液包含dNTP、单价或二价阳离子的来源、缓冲溶液、BSA、热启动DNA聚合酶、嵌入分子或化合物。例如，第一扩增缓冲液的一种具体实施方式包含：
a) dNTP（最终浓度范围：0.05 mM至0.3 mM）
b) MgCl2（最终浓度范围：0.3 mM至4 mM）
c) TrisHCl缓冲溶液（最终浓度范围：10 mM至50 mM；pH：6.00至10.00）
d) KCl（最终浓度范围：10 mM至50 mM）
e) BSA（最终浓度范围：0.005至0.05 mg/ml）
f) 热启动聚合酶
g) SYTO-9（最终浓度范围：1 μM至8 μΜ）。
在另一个可能的实施方式中，提供了用于诊断目的的可能的替代性第二扩增缓冲液，其包括dNTP、单价或二价阳离子的来源、缓冲溶液、BSA、热启动DNA聚合酶、嵌入分子或化合物和上述添加剂。通过添加添加剂，第二扩增缓冲液能够被用作PCR增强缓冲液，如上所述，其提供增加的诊断灵敏度、特异性和准确性。例如，可选的第二扩增缓冲液的一种具体实施方式包含：
a) dNTP（最终浓度范围：0.05 mM至0.5 mM）
b) MgCl2（最终浓度范围：0.3 mM至4 mM）
c) TrisHCl缓冲液溶液（最终浓度范围：10 mM至50 mM；pH：6.00至10.00）
d) KCl（最终浓度范围：10 mM至50 mM）
e) BSA（最终浓度范围：0.005至0.05 mg/ml）
f) 热启动聚合酶
g) SYTO-9（最终浓度范围：1 μM至8 μΜ）
h) TMAC（四甲基氯化铵）（最终浓度范围：10 mM至100 mM）
i) 乙酰胺（最终浓度范围：0％至5％）
j) 甲酰胺（最终浓度范围：0％至5％）
k) 甜菜碱（最终浓度范围：0 µM至3 mM）
l) 明胶（最终浓度范围：0.01 mg/ml至1 mg/ml）。
在本文所述的用于诊断目的的方法和诊断试剂盒的实施方式中，由于不同的PCR机器（即不同的热循环仪模式）可能会产生不同的曲线（尤其是不同的熔解峰），因此提供了一种将每个实时PCR机器设置为对病原体进行基因分型所需的正确和精确的熔解分析的校准物。实际上，由于机器类型不同、因维护状态导致的效率不同、或采集设置不同，可能会发生一些变化，校准物允许在特定的机器中调整观察到的测量值。校准物能够由合成的寡核苷酸组成，所述合成的寡核苷酸对应于由根据本公开的PCR反应混合物的特异性引物产生的扩增子。有利地，机器特异性的校准物能够被定期放入PCR循环中来检查特定热循环仪机器的扩增子的有效熔解温度，并将其与预期的熔解温度进行比较。
本文所述用于诊断目的的其他实施方式提供了用于获得熔解温度的组合的多个引物，以增加在同一测定中可检测的目标的数量。通常，系统区分和分辨两个邻近的峰的能力决定了在PCR机器的单个孔中同时可检测到的目标数量的限值。然而，根据本文所述的实施方式，在同一测定中可检测的目标的数目有可能增加，从而提供对同一目标DNA具有特异性的两组或更多组引物。根据实施方式，第一组引物存在于一个孔中的PCR反应混合物中，至少第二组引物存在于另一个孔中。每组引物包含各自识别一种特定目标DNA的引物。第一组引物识别的目标DNA与第二组引物识别的目标DNA相同，并且通过一组识别特定目标DNA的引物中的一个引物产生的扩增子的熔解温度与通过另一组识别所述特定目标DNA的引物中的一个引物产生的扩增子的熔解温度不同。
如下表的例子所示，三个目标由两个引物组识别：目标#1被组A和B识别，目标#2被组C和D识别，目标#3被组E和F识别。等分在孔1中的PCR反应混合物含有引物组A、C和E；等分在孔2中的PCR反应混合物含有引物组B、D和F。
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对于每个目标DNA，将对每个孔收集HRM数据；因此对于每个孔，每个目标DNA不是由一个单一的熔解峰定义，而是由几个熔解峰定义，每个孔一个熔解峰，例如下表所示：
目标 T<sub>m</sub> 孔1 T<sub>m </sub>孔2
目标#1 70°C 71°C
目标#2 70°C 82°C
目标#3 74°C 70°C
由于两个或更多个熔解温度（它们各自代表一个变量）的可能组合的数量呈指数增加（如下所揭示），这些实施方式允许区别更多的目标DNA；因此，根据多个变量将精确定义每个目标DNA。
如果x是在单个孔中可区分的可能的峰的数量，则在该实施方式中可区分的目标的数目是x a ，其中a是用于每个目标的引物组的数量，因此是用于每个样品的孔的数量。
当本申请旨在区分大量不同的目标时（例如，它发生在HPV基因分型中，其中40个基因型能够通过本公开的实施方式同时被分析和定义），该变型（variant）特别有用。
在下文中，描述了根据本公开的方法和诊断试剂盒的实施方式，其使用特异性引物用于HPV诊断的特定用途。
在一个实施方式中，本公开的方法和诊断试剂盒被用于检测临床样品中的人乳头瘤病毒DNA，并通过HRM分析来区分不同的基因型。
根据一个实施方式，该方法和诊断试剂盒，除了通过PCR进行DNA扩增所需的任何上述试剂的组合之外，还包括在所附序列表中提供的SEQ ID No.20至SEQ ID No.616和SEQID No.655至SEQ ID No.706中包括的针对HPV的每种基因型的特异性引物。上述用于HPV诊断的特异性引物具有以下特征：
1）不同引物的熔解温度之差不超过30 ℃。
2）引物扩增HPV基因型产生40至1500 bps的扩增子。
3）引物扩增扩增子，其中扩增子的熔解峰在68至95℃之间。
4）每个引物以50至1000 nM的最终浓度存在于PCR反应混合物中。
在其他实施方式中，可提供另一组标准化引物用于人基因组DNA的扩增，人基因组DNA的所述扩增用作内部PCR验证对照和/或用于使根据本文所述的任何实施方式所获得的扩增的病原体（例如，HPV）DNA标准化的对照。所附序列表的SEQ ID No. 630和SEQ ID No.631中提供了靶向人β-珠蛋白基因片段的这种标准化的引物对的实施例。
在用于HPV诊断的诊断试剂盒的优选实施方式中，在本公开的PCR反应混合物中提供了针对13种最常见的高风险HPV血清型的特异性引物，其具有所附序列表的SEQ IDNo.591至SEQ ID No.616所示的序列。
在一个实施方式中，用于HPV诊断的特异性扩增缓冲液包含以下试剂，其浓度以范围表示：
a) dNTP（最终浓度范围：0.05 mM至0.5 mM）
b) MgCl2（最终浓度范围：0.3 mM至4 mM）
c) TrisHCl缓冲液溶液（最终浓度范围：10 mM至50 mM；pH：7.00至10.00）
d) KCl（最终浓度范围：10 mM至50 mM）
e) BSA（最终浓度范围：0.005 mg/ml至0.05 mg/ml）
f) 热启动聚合酶
g) SYTO-9（最终浓度范围：1 μM至8 μΜ）。
试剂的可能的具体浓度值的一个实施例如下：
a) dNTP（最终浓度0.2 mM）
b) MgCl2（最终浓度0.75 mM）
c) TrisHCl缓冲液溶液（最终浓度30 mM；并且pH为9.0）
d) KCl（最终浓度50 mM）
e) BSA（最终浓度10 µg/ml）
f) 热启动聚合酶
g) SYTO-9（最终浓度4 μM）。
在另一个可能的实施方式中，用于HPV诊断的另一种替代性的可能的具体扩增缓冲液提供更高的诊断灵敏度、特异性和准确性，包含以下试剂，其浓度以范围表示：
a) dNTP（最终浓度范围：0.05 mM至0.3 mM）
b) MgCl2（最终浓度范围：0.3 mM至4 mM）
c) TrisHCl缓冲液溶液（最终浓度范围：10 mM至50 mM；pH：7.00至10.00）
d) KCl（最终浓度范围：10 mM至50 mM）
e) BSA（最终浓度范围：0.005 mg/ml至0.05 mg/ml）
f) 热启动聚合酶
g) SYTO-9（最终浓度范围：1 μM至8 μΜ）。
h) TMAC（四甲基氯化铵）（最终浓度范围：10 mM至100 mM）
i) 乙酰胺（最终浓度范围：0.5％至5％）
j) 甲酰胺（最终浓度范围：0.5％至5％）
k) 甜菜碱（最终浓度范围：100 µM至3 mM）
l) 明胶（最终浓度范围：0.01 mg/ml至1 mg/ml）。
该替代性的扩增缓冲液的试剂的可能的特定浓度值的一个实施例如下：
a) dNTP（最终浓度0.15 mM）
b) MgCl2（最终浓度0.75 mM）
c) TrisHCl缓冲液溶液（最终浓度30 mM；pH为9）
d) KCl（最终浓度40 mM）
e) BSA（最终浓度10 µg/ml）
f) 热启动聚合酶
g) SYTO-9（最终浓度2 μΜ）
h) TMAC（四甲基氯化铵，最终浓度75 mM）
i) 乙酰胺（最终浓度3％）
j) 甲酰胺（最终浓度1.5％）
k) 甜菜碱（最终浓度0.5 M）
l) 明胶（最终浓度0.1 mg/ml）。
有利地，基于本文所描述的实施方式的诊断性HPV试验可提供关于HPV试验和筛查的至少两个重要信息：
1）诊断信息：通过PCR获得的扩增曲线允许检测前14种高风险基因型（HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、以及68 – Cit. IARC 2009），并提供诊断信息。当扩增曲线出现在35个PCR循环之前，且荧光阈值范围为250.000至400.000时，样品为阳性。本发明已在阳性样品（根据Mejer指导方针（2009）提取了150名具有CIN2+ 细胞学检查的女性的DNA）上进行了测试。临床数据显示，根据本文所描述的实施方式的诊断性HPV试验的灵敏度为98％，其旨在作为检测高度鳞状上皮内病变（HSIL或CIN2/3病变，其在HPV诊断中被认为是临床终点）的灵敏度。灵敏度是通过根据本文所描述的实施方式的HPV试验检测到的被诊断为HSIL的HPV感染者除以通过常规试验（例如，Pap试验）检测出的被诊断为HSIL的HPV感染者的总数所得的百分数。测试特异性几乎达到100％，测试准确度在0.93至0.98之间；
2）通过HRM分析获得的熔解指纹分析允许对上述14种高危HPV基因型进行基因分型。实际上，HPV疫苗的施用正在改变不同人群中HPV基因型的盛行率，一些曾经非常罕见的高风险HPV变得越来越普遍。除此之外，此信息在以后的可能的分类步骤中也很重要，因为不同的HPV基因型具有不同的诱导癌症发展的能力。基因分型还能够区分非常常见且自愈的短暂性感染和最终能导致癌症的某种高风险HPV类型的持续性感染。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的其他实施方式，通过在上述PCR反应混合物中使用根据所附序列表的SEQ ID No.1至SEQ ID No.19和SEQ ID No.636至SEQ IDNo.654的特异性扩增引物，根据本公开的方法和诊断试剂盒能够被用于检测和区分导致其他性传播疾病（例如衣原体感染、梅毒感染或淋病感染）的其他不同病原体。
* * *
尽管前述内容针对本发明的实施方式，但是在不脱离本发明的基本范围的情况下可以设计本发明的其他和进一步的实施方式，且本发明的范围由所附权利要求书确定。
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<213> 人乳头瘤病毒
<220>
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<212> DNA
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<211> 21
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<213> 人乳头瘤病毒
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<213> 人乳头瘤病毒
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<213> 人乳头瘤病毒
<400> 480
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<223> 6,16: n是以下核苷酸中的一个：a或g或c或t
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<213> 人乳头瘤病毒
<400> 495
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<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 496
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<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 497
gtatggccat acccactgtc 20
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<211> 20
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<213> 人乳头瘤病毒
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<212> DNA
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<213> 人乳头瘤病毒
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<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
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<213> 人乳头瘤病毒
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<213> 人乳头瘤病毒
<400> 565
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<213> 人乳头瘤病毒
<400> 566
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<213> 人乳头瘤病毒
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<213> 人乳头瘤病毒
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 580
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<213> 人乳头瘤病毒
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<213> 人乳头瘤病毒
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<213> 人乳头瘤病毒
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 592
ctcgttcact atgtgtcccg 20
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<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 593
cctgtaactg tggaaagtat accat 25
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<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 594
acaacttaca tctgaattac tagccc 26
<210> 595
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<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 595
aacagtagag atcagttgtc tctg 24
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 596
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<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
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ctgcttacat ctgaactagc cc 22
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<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 598
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
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acagcggata tggcaataca c 21
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<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 600
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<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 601
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 602
caacaacaca ctaccgcctt 20
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<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 603
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<211> 22
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<213> 人乳头瘤病毒
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cacagctttc tgttgtttcc ac 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 605
cacggtatcc gctactcagc t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 606
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 607
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
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<213> 人乳头瘤病毒
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<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
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ggcagtacta gtaggtgctt catctg 26
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<211> 21
<212> DNA
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gcctgtaggt gtagctgcac c 21
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<212> DNA
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catacagaca gacaacgata accg 24
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<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
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agcaacctag agctacctgc 20
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<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 614
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<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
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cgtgctgttc tattgtccaa g 21
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<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 616
actaggtcaa agcctgctgt 20
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<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 619
ttcctttcag ctctaacact ctg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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gctgcacgtg gatcctgaga a 21
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<212> DNA
<213> 智人
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gcgtcccata gactcaccct ga 22
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 624
gataactaga aatagaggat ccagtttct 29
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<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
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ctgcacgtgg atcctgagaa ctt 23
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<212> DNA
<213> 智人
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catcaagcgt cccatagact cacc 24
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<213> 智人
<400> 627
acactctgaa actacgatta caca 24
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<213> 智人
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gaagagccaa ggacaggtac 20
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<212> DNA
<213> 智人
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caacttcatc cacgttcacc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 631
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 634
ggtcctttgg gcgctaact 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 635
cccggttcaa acagcgacc 19
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<211> 23
<212> DNA
<213> Neisseria gonorrhoeae
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ttcaatggat cggtatcact cgc 23
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<212> DNA
<213> Neisseria gonorrhoeae
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gtcaaactca aacgcccgat aaac 24
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<211> 23
<212> DNA
<213> Neisseria gonorrhoeae
<400> 638
gaaacacctt cacgacttac cgg 23
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<212> DNA
<213> Neisseria gonorrhoeae
<400> 639
ctccgccgtg ttctttaatc ca 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> Neisseria gonorrhoeae
<400> 640
ccaactcgaa cagtagggac atg 23
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<211> 22
<212> DNA
<213> Neisseria gonorrhoeae
<400> 641
cagcggcagc attcaatttg tt 22
<210> 642
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<212> DNA
<213> Treponema pallidum
<400> 642
tcgcggcgct tgtatcg 17
<210> 643
<211> 18
<212> DNA
<213> Treponema pallidum
<400> 643
tcctccacct cacgctcc 18
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<213> Treponema pallidum
<400> 644
tacgtggagc cggcct 16
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<213> Treponema pallidum
<400> 645
ggttgtgccg agcacgg 17
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<213> Treponema pallidum
<400> 646
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<212> DNA
<213> Treponema pallidum
<400> 647
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<211> 22
<212> DNA
<213> Treponema pallidum
<400> 648
cgtctggtcg atgtgcaaat ga 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> Treponema pallidum
<400> 649
cgctcaagga aagcgagaag t 21
<210> 650
<211> 18
<212> DNA
<213> Treponema pallidum
<400> 650
cgcgtgtgcg aatggtgt 18
<210> 651
<211> 18
<212> DNA
<213> Treponema pallidum
<400> 651
cctcacgctc ccctcctt 18
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<212> DNA
<213> Treponema pallidum
<400> 652
ccgagtcaac tcagtgtaca tgtg 24
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caggcgtttt tgagcactgt g 21
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<212> DNA
<213> Treponema pallidum
<400> 654
actgaatgga gctgtgccc 19
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<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 655
aacacgtaga gaaacccagc tgtaatcatg catggagata cacctacatt gcatgaatat 60
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<210> 656
<211> 100
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 656
aacagtagag atcagttgtc tctggttgca aatctaacat atattcatgc aatgtaggtg 60
tatctccatg catgattaca gctgggtttc tctacgtgtt 100
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<211> 193
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 657
cacggtatcc gctactcagc ttgttaaaca gctacagcac accccctcac cgtattccag 60
caccgtgtcc gtgggcaccg caaagaccta cggccagacg tcggctgcta cacgacctgg 120
acactgtgga ctcgcggaga agcagcattg tggacctgtc aacccacttc tcggtgcagc 180
tacacctaca ggc 193
<210> 658
<211> 193
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 658
gcctgtaggt gtagctgcac cgagaagtgg gttgacaggt ccacaatgct gcttctccgc 60
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cacggacacg gtgctggaat acggtgaggg ggtgtgctgt agctgtttaa caagctgagt 180
agcggatacc gtg 193
<210> 659
<211> 109
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 659
gacagcgggt atggcaatac tgaagtggaa acgcagcaga tggtacaggt agaggagcaa 60
caaacaacat taagttgtaa tggtagtgac gggacacata gtgaacgag 109
<210> 660
<211> 109
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 660
ctcgttcact atgtgtcccg tcactaccat tacaacttaa tgttgtttgt tgctcctcta 60
cctgtaccat ctgctgcgtt tccacttcag tattgccata cccgctgtc 109
<210> 661
<211> 135
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 661
catacagaca gacaacgata accgaccacc acaagcagcg gccaaacgac gacgacctgc 60
agacaccaca gacaccgccc agccccttac aaagctgttc tgtgcagacc ccgccttgga 120
caatagaaca gcacg 135
<210> 662
<211> 135
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 662
cgtgctgttc tattgtccaa ggcggggtct gcacagaaca gctttgtaag gggctgggcg 60
gtgtctgtgg tgtctgcagg tcgtcgtcgt ttggccgctg cttgtggtgg tcggttatcg 120
ttgtctgtct gtatg 135
<210> 663
<211> 138
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 663
cctgtaactg tggaaagtat accattagac acaattggcc ctttagattc ttctatagtg 60
tcattagtag aggaaactag ttttattgag tctggtgccc ctgttgttac accaagggtc 120
ccacctacaa caggtttt 138
<210> 664
<211> 138
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 664
aaaacctgtt gtaggtggga cccttggtgt aacaacaggg gcaccagact caataaaact 60
agtttcctct actaatgaca ctatagaaga atctaaaggg ccaattgtgt ctaatggtat 120
actttccaca gttacagg 138
<210> 665
<211> 145
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 665
taggcaggaa taccagggga acactacagg aaatttcatt aaatgtaagc agtacgcagg 60
caacacaaac ggtgtattcc gtgccagaca gcggatatgg caatatggaa gtggaaacag 120
ctgaagtgga ggaggtaact gtagc 145
<210> 666
<211> 145
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 666
gctacagtta cctcctccac ttcagctgtt tccacttcca tattgccata tccgctgtct 60
ggcacggaat acaccgtttg tgttgcctgc gtactgctta catttaatga aatttcctgt 120
agtgttcccc tggtattcct gccta 145
<210> 667
<211> 121
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 667
gcatcttctg ggtcaggtac ggaacccatt agtagtaccc ccctccctac tgtgcggcgg 60
gtacggggtc cccgcctgta tagtagggct aatcaacagg tccgtgtgtc cacctcacag 120
t 121
<210> 668
<211> 121
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 668
actgtgaggt ggacacacgg acctgttgat tagccctact atacaggcgg ggaccccgta 60
cccgccgcac agtagggagg ggggtactac taatgggttc cgtacctgac ccagaagatg 120
c 121
<210> 669
<211> 138
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 669
acagcggata tggcaataca caagtggaaa ctgtggaagc aacgttgcag gtagatgggc 60
aacatggcgg ttcacagaac agtgtgtgta gtagcggggg gggcagtgtt atggatgtgg 120
aaacaacaga aagctgtg 138
<210> 670
<211> 138
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 670
cacagctttc tgttgtttcc acatccataa cactgccccc cccgctacta cacacactgt 60
tctgtgaacc gccatgttgc ccatctacct gcaacgttgc ttccacagtt tccacttgtg 120
tattgccata tccgctgt 138
<210> 671
<211> 159
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 671
cccgacctgt gacccaagtg taacgtcatg cgtggagaca aagcaactat aaaagattat 60
atattagatc tgcaacctga aacaactgac ctacactgct atgagcaatt aggtgacagc 120
tcagatgagg aggatacaga tggtgtggac cggccagat 159
<210> 672
<211> 159
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 672
atctggccgg tccacaccat ctgtatcctc ctcatctgag ctgtcaccta attgctcata 60
gcagtgtagg tcagttgttt caggttgcag atctaatata taatctttta tagttgcttt 120
gtctccacgc atgacgttac acttgggtca caggtcggg 159
<210> 673
<211> 99
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 673
cacaacaaca cactaccgcc ttttacgttt tgctggtgta gaggtggagg taggagcaga 60
tcgcttttta gaggtagcta cagcaggctt tgacctagt 99
<210> 674
<211> 99
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 674
actaggtcaa agcctgctgt agctacctct aaaaagcgat ctgctcctac ctccacctct 60
acaccagcaa aacgtaaaag gcggtagtgt gttgttgtg 99
<210> 675
<211> 127
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 675
acagcggata tggcaatact gaagtggaaa ctgagcagat ggcacaccag gtagaaagcc 60
aaaatggcga cgcagactta aatgactcgg agtctagtgg ggtgggggct agttcagatg 120
taagcag 127
<210> 676
<211> 127
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 676
ctgcttacat ctgaactagc ccccacccca ctagactccg agtcatttaa gtctgcgtcg 60
ccattttggc tttctacctg gtgtgccatc tgctcagttt ccacttcagt attgccatat 120
ccgctgt 127
<210> 677
<211> 83
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 677
ctcttgtttc ttcccaggct gctactgatg atatatatga tatatatgca gatattacag 60
atgaagcacc tactagtact gcc 83
<210> 678
<211> 83
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 678
ggcagtacta gtaggtgctt catctgtaat atctgcatat atatcatata tatcatcagt 60
agcagcctgg gaagaaacaa gag 83
<210> 679
<211> 74
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 679
tcaaaggttg tggcaacgga tacatatgta aaacgtacca gtatatttta tcatgcaggt 60
agctctaggt tgct 74
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<211> 74
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 680
agcaacctag agctacctgc atgataaaat atactggtac gttttacata tgtatccgtt 60
gccacaacct ttga 74
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<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
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<213> 人乳头瘤病毒
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agagacaact gatctctact gtt 23
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 683
gctgagtagc ggataccgtg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 684
gtgcagctac acctacaggc 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 685
tattgccata cccgctgtc 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 686
gggacacata gtgaacgag 19
<210> 687
<211> 18
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 687
cttgggtcac aggtcggg 18
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 688
gtgtggaccg gccagat 17
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<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 689
tggtatactt tccacagtta cagg 24
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
<400> 690
tcccacctac aacaggtttt 20
<210> 691
<211> 20
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒
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Claims (47)

1.一种通过聚合酶链式反应（PCR）对样品中的病原体目标DNA进行检测和基因分型的分子指纹法，所述方法能够对相同病原体的不同株、属于不同属和遗传变异的不同病原体进行区分和基因分型，所述方法包含：
-提供一种包含扩增缓冲液的PCR反应混合物，所述扩增缓冲液含有并入双链扩增子中并发射可检测信号的嵌入分子或化合物；
-使用所述PCR反应混合物和所述样品进行PCR扩增；
-在所述PCR扩增结束时，对所述PCR反应混合物和先前进行PCR扩增的所述样品进行高分辨率熔解（HRM）分析；
其中所述PCR反应混合物包含用于以多重方式扩增两种或更多种靶核酸的两对或更多对扩增引物，
其中所述扩增引物被设计以产生彼此具有不同熔解温度的扩增子，以便在HRM分析中通过观察每个扩增子的特异性熔解温度来区分每个扩增子，
其中所述方法进一步包含监测在所述HRM分析过程中由于嵌入分子或化合物的释放，温度诱导的双链扩增子变性为两个单链DNA而产生的信号发射变化，
其中所述方法进一步包含通过读取器分析信号变化确定样品中同一病原体的不同株、属于不同属和遗传变异的不同病原体的区别和基因型分型，并且通过连接至所述读取器的图形界面获得分析的结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增引物被设计来扩增病原体目标DNA以产生相应的扩增子，每个所述扩增子为38至1500 bps。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述扩增引物被设计以扩增扩增子，其中所述扩增子的熔解峰在68至95 ℃之间。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中每种扩增引物以50至1000纳摩尔（nM）的最终浓度存在于所述PCR反应混合物中。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的方法，其中所述PCR反应混合物的所述扩增缓冲液进一步包含DNA聚合酶、三磷酸脱氧核苷（dNTP）或类似物、缓冲溶液、水、一价或二价阳离子的来源、牛血清白蛋白（BSA）。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述PCR反应混合物的所述扩增缓冲液进一步包含一种、多种或所有选自以下的添加剂：NP40、DMSO、TMAC（四甲基氯化铵）、乙酰胺、Triton、甲酰胺、甜菜碱、大肠杆菌ssDNA结合蛋白、甘油、左旋肉碱和明胶。
7.根据权利要求1-6中的任一项所述的方法，其中使用所述PCR反应混合物进行PCR扩增包括使用所述PCR反应混合物扩增目标纯化的核酸以产生扩增子，其中扩增目标纯化的核酸包括通过重复进行升温来进行热循环，其中，在进行PCR扩增的热循环过程中，监测由于嵌入分子或化合物的释放，温度诱导的双链扩增子或扩增产物变性为两个单链DNA而引起的信号发射变化，其中所述升温包含进行以下温度步骤：
·在95-98 ℃变性1至30秒；
· 在50 ℃至70 ℃的范围内退火1至60秒；
·在60 ℃至75 ℃的范围内延伸0秒到5分钟。
8.根据权利要求1-7中的任一项所述的方法，其中进行HRM分析包括对先前进行过PCR扩增的PCR反应混合物进行用于HRM的升温，以及，在升温过程中，进行所述监测由于嵌入分子或化合物的释放，温度诱导的双链扩增子变性为两个单链DNA而引起的信号发射变化，其中所述升温包含进行以下温度步骤：
·在95 ℃孵育1秒至60秒
·在60 ℃孵育30秒至2分钟
·以0.1 ℃/秒或更低的速率升温至95 ℃。
9.根据权利要求1-8中的任一项所述的方法，其中所述PCR扩增在能够以每0.1℃/秒或更低速率获取所述信号发射的实时PCR机器或热循环机器中进行。
10.根据权利要求1-9中的任一项所述的方法，其中在引物二聚体的形成引起非特异性荧光背景的情况下，一种或多种所述扩增引物是被设计用来减少引物二聚体形成的茎-环杂交引物，每个所述茎-环杂交引物包括引物部分、环部分、竞争回文部分和5'保真度尾部，
其中所述引物部分是与目标序列互补的序列，并且具有15至60 bps，
其中所述环部分含有引物部分30％至90％的碱基，并且其形成稳定且独特的发夹结构，与引物部分的5'并列，所述环部分含有DNA聚合酶终止位点，其适合通过至少一种1,2-二脱氧核糖、一种等效的脱碱基核苷酸的存在、或通过前置或后置至少一种1,2-二脱氧核糖或至少一种聚乙二醇来调节，优选的分子是三甘醇（TEG），
其中所述竞争回文部分与引物部分互补，其比所述引物序列短至少一个核苷酸，并且其含有构成所述环部分的所述DNA聚合酶终止位点的DNA聚合酶终止位点，
其中所述5'保真度尾部长度为1至1000个核苷酸，其含有碱基或碱基类似物并且与目标序列的下游区域互补或部分互补。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述PCR扩增在热循环仪或实时PCR热循环仪中进行，其中，当所述PCR扩增在热循环仪中进行时，HRM分析在单独的仪器中进行，而当所述PCR扩增在实时PCR热循环仪中进行时，HRM分析在同一实时PCR热循环仪中进行。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述PCR反应混合物被定期加入熔解温度校准物来检查特定的热循环机器的扩增子的有效熔解温度，并将其与预期的熔解温度进行比较，其中所述校准物由合成的寡核苷酸组成，所述合成的寡核苷酸对应于由PCR反应混合物的特异性引物所产生的扩增子。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，还使用对同一目标DNA具有特异性的两组或更多组引物，其中第一组存在于一个孔中PCR的反应混合物中，至少第二组存在于另一孔中，其中每组引物包含各自识别一种特异性目标DNA的引物，其中第一组引物识别的目标DNA与第二组引物识别的目标DNA相同，其中通过一组识别特异性目标DNA的引物中的一个引物产生的扩增子的熔解温度与通过另一组识别所述特异性目标DNA的引物中的一个引物产生的扩增子的熔解温度不同，其中，对于每个目标DNA，对每个孔收集HRM的数据，因而每个目标DNA由几个熔解峰定义，每孔一个熔解峰。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中在引物二聚体的形成引起非特异性荧光背景的情况下，所述PCR反应混合物还包含10至100个核苷酸的诱饵寡核苷酸，并且与所述特异性扩增引物至少50％互补，其中每个诱饵寡核苷酸与相对配对的引物的熔解温度之差不超过2 ℃。
15.根据权利要求1-14中的任一项所述的方法，其中所述病原体是与性传播疾病或感染有关的病原体。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述病原体是人乳头瘤病毒（HPV）。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述扩增引物包括针对每种HPV基因型的一种或多种特异性引物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中针对每种HPV基因型的所述特异性引物产生的扩增子的熔解温度差异不超过30 ℃。
19.根据权利要求16、17或18所述的方法，其中所述扩增引物包括针对HPV的每种基因型的一种或多种以下特异性引物：SEQ ID No.20至SEQ ID No.616和SEQ ID No.655至SEQID No.706。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述病原体是选自导致以下感染的病原体：衣原体感染、梅毒感染或淋病感染。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述扩增引物包括一种或多种以下特异性引物：SEQ ID No.1至SEQ ID No.19和SEQ ID No.636至SEQ ID No.654，用于分别对所述衣原体感染、梅毒感染、淋病感染进行基因分型。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中进一步使用另一组标准化引物，人基因组DNA的所述扩增用作内部PCR验证对照和/或用于所获得的扩增的病原体DNA的标准化的对照。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中，所述病原体是HPV，并且一对所述标准化引物靶向来自人β-珠蛋白基因的片段并被提供在SEQ ID No.617至SEQ ID No.629中。
24.一种对目标DNA进行检测和基因分型的诊断试剂盒，所述试剂盒包含用于对先前进行实时PCR的PCR反应混合物进行PCR扩增和随后的高分辨率熔解（HRM）分析的聚合酶链式反应（PCR）反应混合物，其中所述PCR反应混合物包含两对或更多对扩增引物用于以多重方式扩增两个或更多个靶核酸，
其中所述引物被设计用来产生彼此具有不同熔解温度的扩增子，以便在HRM分析中通过观察每个扩增子的特定的熔解温度来区分每个扩增子。
25.根据权利要求24所述的诊断试剂盒，其中所述扩增引物被设计为扩增病原体目标DNA以产生相应的扩增子，每个扩增子为40至1500 bps。
26.根据权利要求24或25所述的诊断试剂盒，其中所述扩增引物被设计为扩增扩增子，其中所述扩增子的熔解峰在68至95 ℃之间。
27.根据权利要求24、25或26所述的诊断试剂盒，其中每种扩增引物以50至1000纳摩尔（nM）的最终浓度存在于所述PCR反应混合物中。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的诊断试剂盒，其中所述PCR反应混合物包含含有DNA聚合酶、三磷酸脱氧核苷（dNTP）或类似物、缓冲溶液、水、一价或二价阳离子的来源、牛血清白蛋白（BSA）的扩增缓冲液。
29.根据权利要求28所述的诊断试剂盒，其中所述扩增缓冲液进一步包含一种、多种或所有选自以下的添加剂：NP40、DMSO、TMAC（四甲基氯化铵）、乙酰胺、Triton、甲酰胺、甜菜碱、大肠杆菌ssDNA结合蛋白、甘油、左旋肉碱和明胶。
30.根据权利要求24至29中的任一项所述的诊断试剂盒，其中在引物二聚体的形成引起非特异性荧光背景的情况下，一种或多种所述扩增引物是被设计为用于减少引物二聚体形成的茎-环杂交引物，每个所述茎-环杂交引物包括引物部分、环部分、竞争回文部分和5'保真度尾部，
其中所述引物部分是与目标序列互补的序列，并且为15至60 bps，
其中所述环部分含有引物部分30％至90％的碱基，并且其形成稳定且独特的发夹结构，与引物部分的5'并列，所述环部分含有DNA聚合酶终止位点，其适合通过至少一种1,2-二脱氧核糖、一种等效的脱碱基核苷酸的存在、或通过前置或后置至少一种1,2-二脱氧核糖或至少一种聚乙二醇来调节，优选的分子是三甘醇（TEG），
其中所述竞争回文部分与引物部分互补，其比所述引物序列短至少一个核苷酸，并且含有构成所述环部分的所述DNA聚合酶终止位点的DNA聚合酶终止位点，
其中所述5'保真度尾部长度为1至1000个核苷酸，其含有碱基或碱基类似物并且与目标序列的下游区域互补或部分互补。
31.根据权利要求24至30中的任一项所述的诊断试剂盒，其中在引物二聚体的形成引起非特异性荧光背景的情况下，所述PCR反应混合物还包含10至100个核苷酸的诱饵寡核苷酸，并且与所述特异性扩增引物至少50％互补，其中每个诱饵寡核苷酸与相对配对的引物的熔解温度之差不超过2 ℃。
32.根据权利要求24至31中的任一项所述的诊断试剂盒，其中所述病原体是与性传播疾病或感染有关的病原体。
33.根据权利要求32所述的诊断试剂盒，其中所述病原体是人乳头瘤病毒（HPV）。
34.根据权利要求33所述的诊断试剂盒，其中所述扩增引物包括针对每种HPV基因型的一种或多种特异性引物。
35.根据权利要求34所述的诊断试剂盒，其中针对每种HPV基因型的所述特异性引物产生的扩增子的熔解温度差异不超过30 ℃。
36.根据权利要求33、34或35所述的诊断试剂盒，其中所述扩增引物包括针对HPV的每种基因型的一种或多种以下特异性引物：SEQ ID No.20至SEQ ID No.616和SEQ ID No.655至SEQ ID No.706。
37.根据权利要求32所述的诊断试剂盒，其中所述病原体是选自导致以下感染的病原体：衣原体感染、梅毒感染或淋病感染。
38.根据权利要求37所述的诊断试剂盒，其中所述扩增引物包括一种或多种以下特异性引物：SEQ ID No.1至SEQ ID No.19和SEQ ID No.636至SEQ ID No.654，用于分别对所述衣原体感染、梅毒感染、淋病感染进行基因分型。
39.用于通过聚合酶链式反应（PCR）对病原体目标DNA进行检测和基因分型的分子指纹法的扩增引物，其中该方法能够在单个反应中对相同病原体的不同株、属于不同属和遗传变异的不同病原体进行区分和基因分型，其中所述扩增引物被提供用于以多重方式在PCR扩增中扩增两种或更多种目标核酸，其中所述引物被设计来产生彼此具有不同熔解温度的扩增子，以便在PCR扩增后的HRM分析中，通过观察每个扩增子的特定的解链温度来区分每个扩增子。
40.根据权利要求39所述的扩增引物，其中所述病原体是与性传播疾病或感染有关的病原体。
41.根据权利要求40所述的扩增引物，其中所述病原体是人乳头瘤病毒（HPV）。
42.根据权利要求41所述的扩增引物，其中所述扩增引物包括针对每种HPV基因型的一种或多种特异性引物。
43.根据权利要求42所述的扩增引物，其中针对每种HPV基因型的所述特异性引物产生的扩增子的熔解温度差异不超过30 ℃。
44.根据权利要求41、42或43所述的扩增引物，其中所述扩增引物包括针对HPV的每种基因型的一种或多种以下特异性引物：SEQ ID No.20至SEQ ID No.616和SEQ ID No.655至SEQ ID No.706。
45.根据权利要求41所述的扩增引物，其中所述病原体是选自导致以下感染的病原体：衣原体感染、梅毒感染或淋病感染。
46.根据权利要求45所述的扩增引物，其中所述扩增引物包括一种或多种以下特异性引物：SEQ ID No.1至SEQ ID No.19和SEQ ID No.636至SEQ ID No.654，用于分别对所述衣原体感染、梅毒感染、淋病感染进行基因分型。
47.一种用于进行通过聚合酶链式反应（PCR）对目标病原体DNA进行检测和基因分型的分子指纹法的仪器，其中所述方法能够在单个反应中对相同病原体的不同株、属于不同属和遗传变异的不同病原体进行区分和基因分型，其中所述仪器包含：
-包含扩增缓冲液的PCR反应混合物，该扩增缓冲液含有并入双链扩增子中并发射可检测信号的嵌入分子或化合物；
-配置为使用所述PCR反应混合物和所述样品的PCR扩增的设备；
-用于对PCR反应混合物和先前进行PCR扩增的样品进行HRM分析的设备；
其中所述PCR反应混合物包含用于以多重方式扩增两种或更多种靶核酸的两对或更多对扩增引物，
其中所述引物被设计来产生彼此具有不同熔解温度的扩增子，以便在HRM分析中通过观察每个扩增子的特定的熔解温度来区分每个扩增子；
-监测装置，用于监测在HRM分析过程中由于嵌入分子或化合物的释放，温度诱导的双链扩增子变性为两个单链DNA而产生的信号发射变化，
-读取器，分析信号变化以确定样品中同一病原体的不同株、属于不同属和遗传变异的不同病原体的区别和基因型分型，从而能够通过连接至所述读取器的图形界面获得分析的结果。
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