TW201617458A - 用於檢測人乳頭瘤病毒的基因型的肽核酸探針、試劑盒以及方法 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及利用肽核酸檢測探針的人乳頭瘤病毒基因型檢測方法,更詳細地涉及能夠以基因型特異性的方式與人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)去氧核糖核酸(DNA,Deoxyribonucleic acid)相結合的檢測探針、包含其的檢測試劑盒及利用其的人乳頭瘤病毒基因型檢測方法。本發明可準確地檢測在子宮頸中發現的22種人乳頭瘤病毒的基因型,並且還可診斷一種以上的人乳頭瘤病毒基因型的多重感染,可檢測除了22種之外是否存在其他人乳頭瘤病毒的基因型,並且能夠以高的靈敏度和特異度檢測人乳頭瘤病毒基因型。
Description
本發明涉及利用包含螢光劑和猝滅劑的肽核酸(PNA)檢測探針的人乳頭瘤病毒基因型的檢測方法,更詳細地涉及可利用能夠以基因型特異性的方式與人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus)去氧核糖核酸相結合的一種以上的檢測探針(detection probe),來同時即時檢測多重人乳頭瘤病毒基因型的方法、熔解曲線分析方法、通過熔解曲線分析的人乳頭瘤病毒遺傳型分析試劑盒。
人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus)作為8kb的圓形雙重螺旋病毒,基因由E1、E2、E4、E5、E6、E7、L1及L2形成。人乳頭瘤病毒與感染包括人在內的哺乳動物的右上皮細胞而和痣疣引起多種惡性腫瘤的症狀有密切的關係,確認到實際上幾乎大部分的宮頸癌(cervical cancer)因人乳頭瘤病毒而發生(文獻[Howley PM.Virology,1996,2:2045-2109])。
宮頸癌作為在子宮頸發生的惡性腫瘤,占整個子宮癌發生頻度的95%,在全世界女性癌症中,僅次於乳腺癌發生頻度(韓國疾病管理中心,2004)。通常,宮頸癌在人乳頭瘤病毒感染子宮頸上皮基底細胞之後,經過低度鱗狀上皮內病變(low squamous intraepithelial lesion,LSIL)、高度
鱗狀上皮內病變(high squamous intraepithelia l lesion,HSIL)及原位癌等的長時間的前驅步驟而最終發展為浸潤癌。這種宮頸癌的發病需要很長時間,並按階段發生,因而若早期有效地診斷作為發病的中間階段的癌前階段病變,則可在完全發展為癌症之間進行治療,從而預防宮頸癌。因此,提供有效地檢測引起宮頸癌的人乳頭瘤病毒的方法在疾病的診斷、預防及治療方面非常重要。
根據人乳頭瘤病毒基因組堿基序列中的E6、E7及L1基因的可讀框(open reading frame)的差異確定基因型,而至今發現了120種以上的不同基因型。在這些基因型中,根據可引起宮頸癌的危險分為高危型和低危型,屬於高危組(high-risk group)的人乳頭瘤病毒16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型及68型、屬於低危組(low-risk group)的人乳頭瘤病毒6型、11型、26型、34型、40型、42型、44型、47型、53型、66型、69型及潛在高危組人乳頭瘤病毒26型、73型及82型等與引起宮頸癌具有密切的相關(文獻[Comparison of Seegene Anyplex II HPV 28 with the PGMY-CHUV Assay for Human papillomavirus Genotyping,C.Estrade et al.,J Clin Microbiol,2014,52(2):607])。如此被感染的人乳頭瘤病毒基因型的種類為對癌症往後發展產生重要的影響的因數,因而準確地識別樣品內的人乳頭瘤病毒的存在與否及存在的人乳頭瘤病毒基因型對宮頸癌患者的預後及診斷具有重要的意義。
人乳頭瘤病毒的存在及基因型的確認方法大致可分為細胞診斷法(巴氏塗片(Papanicolaou smear)或宮頸塗片(pap smear))、人乳頭瘤病毒去氧核糖核酸的直接確認法及利用人乳頭瘤病毒去氧核糖核酸的
擴增的方法。為了第一次篩選宮頸癌和前驅病變,細胞診斷法根據子宮頸細胞診斷的細胞學形態,從1940年代起作為標準檢查法施行,至今利用為人乳頭瘤病毒的診斷法。但是,據報告,這種方法因依賴于檢測人員的熟練度而存在檢查結果的準確度下降的缺點,從而仍然呈現達到30~40%的高的假陰性率(文獻[Ledger WJ et al.,Am J Obstet Gynecol,2000,182:860-865])。
人乳頭瘤病毒去氧核糖核酸的直接確認法有液相雜交(liquid hybridization,Hybrid Capture by Digene Diagnostics,Silver Spring,MD)、利用人乳頭瘤病毒型特異性探針(type-specific probe)的印跡雜交(southern blot)、斑點雜交(dot blot)、螢光原位雜交(filter in situ hybridization,FISH)等(文獻[Detection of high-risk HPV type by the hybrid Capture 2 test,George et al.,J Clin Microbiol,2001,65:155-162])。但是,這些方法由於不擴增人乳頭瘤病毒的去氧核糖核酸,因而存在降低檢查的靈敏度的缺點。
作為利用人乳頭瘤病毒去氧核糖核酸的擴增的方法有型-特異性聚合酶鏈式反應(type-specific polymerase chain reaction)、通用引物聚合酶鏈式反應(general primer PCR)等,尤其,通常,針對利用通用引物聚合酶鏈式反應(general primer set)(文獻[Leen-Jan et al.,J Clin Microbiol,2006,3292-3298])擴增的人乳頭瘤病毒去氧核糖核酸,通過斑點雜交(dot blot hybridization)、微量滴定板雜交(microtiter plate hybridization)或線性探針法(line probe assay)等(文獻[Evaluation of a Modified Reverse Line Blot Assay for Detection and Typing of Human Papillomavirus,Feray et al.,2005,
Am J clin Pathol.123:896-899])方法檢索基因型。但是,這些方法需要經過複雜的步驟,並且不僅在處理多的檢測體並分析時消耗很多時間和勞動力,而且內含檢測靈敏度和資料解釋上的問題(文獻[Gravitt PE et al.,J Clin Microbiol,1998,36:3020-3027])。
最近開發的利用去氧核糖核酸晶片(DNA chip)技術的人乳頭瘤病毒基因型分析試劑盒(韓國公開特許第2006-0015669號及第2004-0078506號)在載玻片上固定對人乳頭瘤病毒的多種基因型特異性的去氧核糖核酸探針,可同時分析與通過聚合酶鏈式反應擴增的產物雜交化來呈現的反應。人乳頭瘤病毒的上述去氧核糖核酸晶片在短時間內可迅速地檢測人乳頭瘤病毒的多種基因型,從而在商業上多用於人乳頭瘤病毒的診斷。
進而,最近開發了珠晶片(bead microarray)方式的人乳頭瘤病毒診斷法。這種方法作為將人乳頭瘤病毒基因型特異性探針固定於珠(beads),來在一個管內與靶核酸進行雜交化反應的方法,通過與靶核酸進行雜交化反應的探針的珠的篩選方法,檢測人乳頭瘤病毒的基因型,因而與使探針固定於載玻片等的通常的去氧核糖核酸晶片相比,在短時間內可處理大量的樣品,不僅能夠以高的特異度檢測人乳頭瘤病毒的基因型,而且費用非常低廉,從而在商業上非常有用(文獻[Facile,comprehensive,High-Throughput Genotyping of Human Genital Papillomaviruses using spectrally addressable Liquid Bead Microarrays,Jan Wallace et al.,2005,J.Mol. Diagn,7:72-80]及[Bead-based multiplex genotyping of Human Papillomaviruses,Markus et al.,2006,J.Clin. Microbiol,44:504-512])。
通常,主要使用利用發出特定波長的螢光的螢光體的光學方法確認在特定基因型的去氧核糖核酸和固定的去氧核糖核酸探針之間是否發生去氧核糖核酸/去氧核糖核酸的雜交化反應。除此之外,還可使用電化學方法等公知的其他方法。但是,上述的去氧核糖核酸晶片或珠晶片由於已固定的去氧核糖核酸探針本身對核酸酶(nuclease)的生物學及化學穩定性非常低,導致穩定性低,從而存在根據保管期間,去氧核糖核酸變質或反應力下降的問題(參照韓國公開特許第2006-0091708號)。
為了解決如上所述的去氧核糖核酸本身的不穩定性,正開發多種去氧核糖核酸類似物(analogues),其中,肽核酸(peptide nucleic acids)是1991年由尼爾森(Nielsen)開發的。肽核酸由肽鍵(peptide bond)代替去氧核糖核酸的磷酸二酯(phosphodiester)鍵,並具有去氧核糖核酸之類的腺嘌呤(adenine)、胸腺嘧啶(thymine)、鳥嘌呤(guanine)及胞嘧啶(cytosine),從而能夠以堿基特異性的方式與去氧核糖核酸或核糖核酸進行雜交化反應。尤其,改變為肽鍵形態的基本骨架(backbone)的結構差異將去氧核糖核酸或核糖核酸的磷酸酯(phosphate)骨架的陰離子性質改成中性性質。由這種陰離子性質的中性化導致的多個陰離子之間的靜電斥力的去除成為當進行雜交化反應時,其結合力變大的直接原因。最終,不僅雜交反應速度塊,而且特異度也非常高,從而具有提高信噪比(signal to noise ratio)的優點。並且,無法識別核酸酶之類的生物降解酶等,從而與去氧核糖核酸或核糖核酸相比,穩定性非常高(文獻[Peptide nucleic acid,PNA,sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide,P.E. Nielsen et al.,1991,Science,254,
1497-1500])。
如上所述,起到去氧核糖核酸或核糖核酸之類的作用且雜交化結合力和穩定性優秀的肽核酸作為可彌補當前去氧核糖核酸的缺點的代替物質,其高的潛在力被認可,因此正在廣泛研究利用肽核酸低聚物代替去氧核糖核酸低聚物來進行分析或診斷的方法(韓國登錄特許第91708號、第12544號及文獻[Peptide nucleic acids on microarrays an d other biosensors,Brandt O et al.,2004,Trends in Biotechnology,22,617-622],[Detection of target DNA using fluorescent cationic polymer and peptid e nucleic acid probes on solid support,Fredric R Raymond et al.,2005,BMC technology,5,1-5])。
作為其一例,本發明人針對利用這種雜交化結合力和穩定性優秀的肽核酸探針來可診斷人乳頭瘤病毒基因型的肽核酸晶片及方法被賦予了申請號第10-2007-0022201的申請專利。但是,肽核酸晶片雖然具有能夠以高的靈敏度及特異度準確地檢測人乳頭瘤病毒基因型的優點,但由於使用人員的便利性及反應時間等長,僅用即時聚合酶鏈式反應檢測人乳頭瘤病毒基因型的要求增大。
為了解決這種問題,需要在短時間內能夠以少的勞動力準確地分析多個試樣的實驗方法。在當前已開發的技術中,最符合這種條件的技術可以說是即時聚合酶鏈式反應(RT-PCR)。即時聚合酶鏈式反應方法作為按聚合酶鏈式反應的每週期即時觀察聚合酶鏈式反應擴增產物的增加的方法,是利用與聚合酶鏈式反應擴增產物進行反應的螢光物質的檢測和定量解釋的技術。這種方法與現有的聚合酶鏈式反應法在結束最終步驟之後,在凝膠中染色來電泳之後,確認聚合酶鏈式反應擴增產物的情況相比,
無需電泳的追加作業,且準確度及靈敏度優秀,再現性高。並且,作為可實現自動化,可數值化結果,對由溴化乙錠(EtBr,Ethidium Bromide)之類的染色劑引起的污染及紫外線照射的生物學安全性優秀,且可自動確認是否擴增特異基因的診斷方法,可準確地對所要檢測的去氧核糖核酸和核糖核酸進行定量([Real-time PCR in virology,Mackay I.M.,Arden K.E.and Nitsche A.,2002,Nucleic Acids Res.30(6):1292-1305])。
但是,如上所述的即時聚合酶鏈式反應方法以不同的方式設計螢光物質,從而只能檢測16型、18型的基因型,並僅使用螢光本身來檢測基因型,因而在一個管中只能區分四個基因型。對此,持續進行努力,以便在一個管(tube)中檢測多種基因變異,並使用利用去氧核糖核酸探針的熔解曲線分析法。為了分析熔解曲線而使用的去氧核糖核酸探針有小溝結合Taqman探針、分子信標(molecular beacon,MB)及雙面(binary)探針。這些方法具有呈現單一堿基序列變異區別能力的優點,相反,也存在由於去氧核糖核酸探針的最小長度長到20~40mer左右,而難以通過一種反應檢測相鄰的單一堿基序列變異的缺點(文獻[Hidefumi Sasaki et al.,2005,Clin Cancer Res.11:2924-2929],[Manna Zhang et al.,2002,HEPATOLOGY 36:3])。
本發明為了解決如上所述的現有技術的問題,利用具有上述的優點的肽核酸,來製備了能夠以特異性的方式與人乳頭瘤病毒的各個基因型相結合的肽核酸探針,本人乳頭瘤病毒基因型檢測肽核酸探針全部包含可檢測20種高危組(高危組16型、18型、26型、31型、33型、35型、39
型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型、68型、69型、70型、73型及82型)及兩種低危組(低危組6型及11型)的探針,還包含可檢測在韓國人中高頻度發生的其他18種(30型、32型、34型、40型、42型、43型、44型、54型、55型、61型、62型、67型、74型、81型、83型、84型、87型及90型)人乳頭瘤病毒基因型的探針。並且,為了確認是否感染人乳頭瘤病毒,製備了在人乳頭瘤病毒的各個基因型的共有(consensus)區域可進行雜交化的人乳頭瘤病毒陽性(positive)探針。
利用這些肽核酸探針,來製備了即時擴增反應聚合酶反應試劑盒,並且確認利用可使人乳頭瘤病毒的擴增靈敏度增加的人乳頭瘤病毒的共有引物組合,來能夠以高的特異度及靈敏度檢測各個基因型,並且達到完成本發明。
因此,本發明的目的在於,提供能夠以高的特異度及靈敏度準確地檢測人乳頭瘤病毒基因型的、對生物酶穩定的肽核酸探針。本發明的再一目的在於,提供包含上述探針的人乳頭瘤病毒基因型的檢測試劑盒。本發明的另一目的在於,提供利用上述檢測試劑盒的人乳頭瘤病毒基因型的檢測方法。
肽核酸與去氧核糖核酸相比,對熱穩定性及生物學穩定性和靶去氧核糖核酸的識別能力及結合能力優秀,從而可用作檢測單一堿基序列變異的即時聚合酶鏈式反應技術的探針。但是,即時聚合酶鏈式反應方法在檢測試樣內靶去氧核糖核酸的過程中,使用螢光物質,因而存在為了檢測多種基因型而需要具有互不相同的波長的兩個螢光物質的探針的問題。這在進行多重檢測(multiplex detection)的過程中,作為非常大的限制
事項來起到作用,並且在本發明中,通過螢光探針的熔解曲線分析可解決這種問題。
本發明提供結合有用於檢測22種人乳頭瘤病毒的各個基因因(reporter)及猝滅劑(quencher)的肽核酸探針。並且,提供結合有用於檢測除了22種人乳頭瘤病毒之外的其他基因型的報導基因及猝滅劑的肽核酸探針。
本發明提供熔解曲線分析方法,上述熔解曲線分析方法利用結合有用於檢測人乳頭瘤病毒基因型的報導基因及猝滅劑的肽核酸探針。
本發明提供包含上述人乳頭瘤病毒肽核酸探針的人乳頭瘤病毒基因型檢測用試劑盒。
在用於檢測上述人乳頭瘤病毒基因型的熔解曲線分析方法中利用的肽核酸探針可包含通常的肽核酸探針或負電荷分子,在利用包含負電荷的肽核酸探針的情況下,熔解曲線的解析度增加,從而在一個反應管中容易一次性分析多種基因型。
並且,上述肽核酸探針可包含螢光物質。螢光物質可以為報導基因及猝滅劑,並且可以為嵌入(intercalating)螢光物質。
若利用本發明的人乳頭瘤病毒的檢測方法,則針對人乳頭瘤病毒的20種高危組和2種低危組,可同時進行即時擴增曲線和熔解曲線的分析,從而可同時以多重的方式準確地判別人乳頭瘤病毒基因型。並且,除了可判別基因型的22種之外,可檢測其他人乳頭瘤病毒基因型,並確認是否感染人乳頭瘤病毒。並且,能夠以高的特異度及靈敏度檢測各個基因型,因而可有用地使用於人乳頭瘤病毒基因型判別。
圖1的1)為用於確認人乳頭瘤病毒基因型的多重檢測探針及人乳頭瘤病毒類型特異性引物混合體的示意圖。圖1的2)為利用用於區別是否感染人乳頭瘤病毒且區別其他類型的SYBR green或螢光肽核酸檢測探針的引物混合體的示意圖。圖1的3)為用於區別除了可判別基因型的22種人乳頭瘤病毒基因型(6型、11型、16型、18型、26型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型、68型、69型、70型、73型及82型)之外的18種人乳頭瘤病毒基因型(30型、32型、34型、40型、42型、43型、44型、54型、55型、61型、62型、67型、74型、81型、83型、84型、87型及90型)的螢光肽核酸探針的引物複合體的示意圖。
圖2為利用螢光肽核酸檢測探針及引物混合體來確認人乳頭瘤病毒基因型的檢測靈敏度及熔解峰值(melting peak)的資料。利用要檢測的人乳頭瘤病毒螢光肽核酸探針混合體及人乳頭瘤病毒類型特異性引物混合體,來確認人乳頭瘤病毒基因型的檢測靈敏度及特異性,最終,確認到通過各個類型螢光探針的熔解峰值的分析在人乳頭瘤病毒去氧核糖核酸中可檢測至1拷貝(copy)物質,並利用標記於檢測探針的螢光物質的Tm值來確認到各個基因型以特異性的方式區別。
圖3確認到利用螢光肽核酸檢測探針及引物混合體,從而利用螢光物質及Tm值來區分人乳頭瘤病毒基因型。確認到將各個螢光物質(羧基螢光素、六氯螢光素、羅紅黴素、花青素5)標記於11種人乳頭瘤病毒基因型的肽核酸,來根據Tm值區分基因型。標記有作為螢光物質的羧基螢光素的各個肽核酸
混合體可區分33型、11型及58型,並確認到47.0℃、58.5℃及66.0℃溫度的Tm。並且標記有六氯螢光素的各個肽核酸混合體可區分16型、73型,並確認到48.0℃、63℃溫度的探針Tm。標記有作為螢光物質的羅紅黴素的各個肽核酸混合體可區分45型、18型、69型,並確認到47.5℃、59.5℃、69.0℃溫度的Tm。標記有花青素5的各個肽核酸混合體可區分26型、6型、52型,Tm分別在44.0℃、53.0℃及62.5℃溫度下被檢測到。
圖4為了確定是否感染人乳頭瘤病毒,通過利用SYBR green螢光來進行即時聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)而產生的迴圈閾值(Ct,cycle threshold)曲線圖分析,區分了是否感染人乳頭瘤病毒,並確認到可通過熔解峰值的分析驗證人乳頭瘤病毒基因擴增的特異性。並且,確認到用於確定是否感染人乳頭瘤病毒的螢光探針檢測系統還可通過迴圈閾值曲線圖及熔解峰值的分析驗證是否感染人乳頭瘤病毒去氧核糖核酸及特異性。
圖5確認到通過利用用於檢測18種人乳頭瘤病毒基因型(30型、32型、34型、40型、42型、43型、44型、54型、55型、61型、62型、67型、74型、81型、83型、84型、87型及90型)的螢光肽核酸探針來進行即時聚合酶鏈式反應而產生的迴圈閾值曲線圖分析,可檢測人乳頭瘤病毒基因型。
在不以其他方式定義的情況下,在本說明書中使用的所有技術術語及科學術語與由本發明所屬技術領域的普通技術人員通常理解的術語具有相同的意義。通常,在本說明書中使用的命名法是在本技術領域中公知的、通常使用的命名法。
本發明涉及利用結合有報導基因(reporter)及猝滅劑
(quenching)的人乳頭瘤病毒基因型檢測探針來同時檢測人乳頭瘤病毒基因型的方法。
在本發明中,檢測探針作為互補性地與人乳頭瘤病毒特異性基因型相結合的所有核酸及核酸類似物,可分別選自由寡核苷酸(oligonucleotide)、肽核酸(peptide nucleic acids)及鎖核酸(LNA,Locked nucleic acid)組成的組中。用於聚合酶鏈式反應的聚合酶通常具有核酸酶(nuclease)活性,從而有可能使探針損傷,因而優選地,使用對核酸酶穩定的肽核酸之類的合成核酸。並且,檢測探針起到選擇性地檢測目的靶核酸基因的作用,因而可使用在本領域中公知的用於檢測核酸的探針。在本發明中,在檢測探針為除了肽核酸之外的其他核酸類似物的情況下,為了確認是否可檢測靶核酸,使用小溝結合-taqman檢測探針來進行分析,最終,通過即時擴增曲線分析可確認在互不相同的鏈中突變檢測用小溝結合-taqman探針和野生型鉗制肽核酸探針系統的工作。
在本發明中,優選地,使用肽核酸探針,肽核酸探針作為人工合成去氧核糖核酸,能夠以特異性的方式與靶人乳頭瘤病毒去氧核糖核酸或核糖核酸(RNA,ribonucleic acid)相結合,並對核酸酶穩定,因而可進行基於探針的熔解曲線分析。
並且,在本發明中,檢測探針使天然氨基酸及合成氨基酸的側鏈等特定官能團與探針的N末端、C末端或探針(合成核酸)骨架的阿爾法、貝塔、伽馬或接頭(linker)位置相結合,從而可提供立體結構變化,上述氨基酸的特徵在於,可不帶電荷或帶正電荷或負電荷,但並不局限於這些,可使用在本領域中公知的探針立體結構變化及電荷賦予方法。
本發明的人乳頭瘤病毒基因型檢測肽核酸探針全部包含可檢測20種高危組(高危組16型、18型、26型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型、68型、69型、70型、73型及82型)及2種低危組(低危組6型及11型)的探針,還包含可檢測在韓國人中高頻度發生的其他18種(30型、32型、34型、40型、42型、43型、44型、54型、55型、61型、62型、67型、74型、81型、83型、84型、87型及90型)的人乳頭瘤病毒基因型的探針。在本發明的一實施例中,肽核酸檢測探針由序列1至序列65、序列114至序列121及序列148至序列185中的一個堿基序列形成,可檢測選自由6型、11型、16型、18型、26型、30型、31型、32型、33型、34型、35型、39型、40型、42型、43型、44型、45型、51型、52型、53型、54型、55型、56型、58型、59型、61型、62型、66型、67型、68型、69型、70型、73型、74型、81型、82型、83型、84型、87型及90型組成的組中的人乳頭瘤病毒基因型。
本發明的人乳頭瘤病毒基因型檢測肽核酸探針可包含通常的肽核酸探針或負電荷分子,在利用包含負電荷的肽核酸探針的情況下,熔解曲線解析度增加,從而容易在一個反應管中一次性分析多種基因型。
本發明的包含負電荷分子的肽核酸探針可包含選自由磷酸(phosphoric acid)、羧酸(carboxylic acid)、磺酸(sulfonic acid)、硝酸(nitric acid)及硼酸(boric acid)系列的所有酸的組中的一種以上的負電荷分子。負電荷分子可與肽核酸探針的N末端、C末端或肽核酸骨架的阿爾法、貝塔或伽馬位置相結合,一個以上的負電荷分子可連續性、間歇性地與探針的堿基相結合。
本發明的肽核酸探針由於熔解曲線圖的半峰半寬(half width at half maximum)狹窄的特徵,可適用於多種人乳頭瘤病毒基因型檢測技術。並且,由於熔解曲線的解析度高,因而根據各個人乳頭瘤病毒基因型的堿基序列相互區分熔解曲線,由此根據各個人乳頭瘤病毒基因型,無需測序(sequencing)分析之類的額外的分析,也可簡便地得知基因型。
在本發明的上述檢測探針的兩末端可結合報導基因(reporter)和可猝滅(quenching)報導基因螢光的猝滅劑(quencher),可包含嵌入(intercalating)螢光物質。
上述“報導基因(reporter)”作為吸收並放出特定波長的光來發出螢光的物質,是指標記於探針來可確認靶核酸和探針之間是否進行雜交化的物質,上述報導基因可以為選自由螢光素(fluorescein)、螢光素氯三嗪(fluorescein chlorotriazinyl)、羅丹明綠(rhodamine green)、羅丹明紅(rhodamine red)、四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine)、異硫氰酸螢光素(FITC,fluorescein isothiocyanate)、俄勒岡綠(Oregon green)、Alexa Fluor、羧基螢光素(FAM,carboxy fluorescein)、羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基螢光素(JOE,carboxy-4’,5’-dichloro-2’,7’-dimethoxyfluorescein)、羅紅黴素(ROX)、六氯螢光素、德克薩斯紅(Texas Red)、四氯螢光素(TET,tetrachloro fluorescein)、四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC,tetramethyl rhodamin isothiocyanate)、四甲基羅丹明(TAMRA,tetramethyl rhodamine)、花菁(Cyanine)系列染料及硫雜二羰花菁(thiadicarbocyanine)染料組成的組中的一種以上。優選地,上述報導基因可以為選自由羧基螢光素(6-carboxyfluorescein)、德克薩斯紅、羧基-4’,5’-
二氯-2’,7’-二甲氧基螢光素、四甲基羅丹明、花青素5及花青素3組成的組中的一種以上。
上述“猝滅劑(quencher)”是指吸收報導基因產生的光來減少螢光強度的物質,上述猝滅劑可以為選自由4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(Dabcyl)、四甲基羅丹明、Eclipse、二氯二氰基苯醌(DDQ)、QSY、黑莓猝滅劑(Blackberry Quencher)、黑洞淬滅劑(Black Hole Quencher)、Qxl、Iowa black FQ、Iowa black RQ及IRDye QC-1組成的組中的一種以上。優選地,上述猝滅劑使用四甲基羅丹明(6-carboxytetramethyl-rhodamine)、BHQ1、BHQ2或4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸,但並不局限於這些,猝滅劑根據種類減少螢光強度的範圍不同,因而可考慮這一情況來使用。
在一實施例中,包含上述負電荷分子、報導基因及猝滅劑的肽核酸探針與靶去氧核糖核酸進行雜交化之後產生螢光信號,隨著溫度上升,借助負電荷效果,在探針的適當熔解溫度下,與靶去氧核糖核酸迅速熔解來猝滅螢光信號,包含上述負電荷的肽核酸探針與無負電荷的肽核酸探針相比,與靶去氧核糖核酸的解離快,從而增加熔解曲線的解析度。通過從基於這種溫度變化的上述螢光信號取得的高解析度的熔解曲線分析,可分析靶去氧核糖核酸的人乳頭瘤病毒基因型。
上述“嵌入(intercalating)螢光物質”可選自由吖啶同型二聚體(Acridine homodimer)及其衍生物、丫啶橙(Acridine Orange)及其衍生物、7-氨基放線菌素D(7-aminoactinomycin D,7-AAD)及其衍生物、放線菌素D(Actinomycin D)及其衍生物、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA,9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine)及其衍生物、4,6-聯脒-2-苯基吲哚
(DAPI,4’,6-diamidino-2-phenylindole)及其衍生物、二氫乙錠(Dihydroethidium)及其衍生物、溴化乙錠(Ethidium bromide)及其衍生物、乙錠同型二聚體-1(EthD-1)及其衍生物、乙錠同型二聚體-2(EthD-2)及其衍生物、乙錠單疊氮(Ethidium monoazide)及其衍生物、Hexidium碘化物及其衍生物、雙苯醯亞胺(bisbenzimide、Hoechst 33258)及其衍生物、赫希斯特(Hoechst)33342及其衍生物、赫希斯特34580及其衍生物、羥芪巴脒(hydroxystilbamidine)及其衍生物、LDS 751及其衍生物、碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)及其衍生物以及花青素染料(Cy-dyes)衍生物組成的組中。
在一實施例中,結合有負電荷分子和嵌入螢光物質的探針與靶去氧核糖核酸進行雜交化之後產生螢光信號,借助負電荷效果,在探針的適當熔解溫度下,迅速與靶去氧核糖核酸熔解來猝滅信號,通過基於上述螢光信號的溫度取得的高解析度的熔解曲線分析,可分析人乳頭瘤病毒基因型。
並且,在本發明的靶人乳頭瘤病毒基因型分析方法中,可無嵌入螢光物質與探針的直接結合,利用螢光信號檢測來分析取得的熔解曲線。
通常,為了同時檢測多個人乳頭瘤病毒基因型而利用以往的即時聚合酶鏈式反應的擴增曲線分析方法在檢測試樣內的靶核酸時不使用螢光物質,因而存在為了檢測兩種以上的靶核酸而需要靶數量的螢光物質的探針的問題,從而限制多重檢測,但是,本發明的同時以多重的方式檢測人乳頭瘤病毒基因型的方法可利用檢測探針來同時進行擴增曲線及熔解曲線分析,因而本發明的特徵在於,可利用一種螢光物質來實現多重人乳
頭瘤病毒基因型檢測。
並且,本發明的利用探針的同時以多重的方式檢測人乳頭瘤病毒基因型的方法並不局限於擴增曲線及熔解曲線的同時分析,可單獨分析或依次分析擴增曲線和熔解曲線,且可根據需要僅進行擴增曲線分析或熔解曲線分析來檢測靶核酸。尤其,在無需定量分析的情況下,省略擴增曲線分析,並且僅進行熔解曲線分析也可區別是否存在靶核酸或基因型。
具體地,本發明的同時以多重的方式檢測人乳頭瘤病毒基因型的方法包括:步驟(a),在包含靶核酸的檢測體試樣中混合檢測探針及引物並進行雜交化,從而取得即時擴增曲線;步驟(b),在上述擴增的過程之後,改變溫度,並取得擴增產物和檢測探針之間的熔解曲線;以及步驟(c),對取得的上述即時擴增曲線及熔解曲線進行單獨分析或依次分析或同時分析。
上述步驟(a)的檢測探針可根據所要檢測的人乳頭瘤病毒基因型多樣地進行調節。本發明的特徵在於,通過即時聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction)進行取得上述擴增曲線或熔解曲線的步驟,並測定迴圈閾值(Ct,cycle threshold)來分析擴增曲線。若在試樣記憶體在靶核酸或包含於試樣的靶核酸的量多,則達到閾值(threshold)的迴圈(cycle)數變少,導致所測定的迴圈閾值小,因而可確認是否存在靶核酸,還可測定初始靶核酸的量。
並且,熔解曲線(melting curve)分析作為通常在即時聚合酶鏈式反應的過程結束之後,最後進行的過程,將樣品的溫度降低至30至55℃左右之後,至95℃為止每秒鐘增加0.5至1℃,並測定螢光信號大小,若
隨著溫度上升,檢測探針和靶核酸(可互補地與檢測探針相結合的靶核酸的一側鏈)分離,則猝滅螢光來突然降低螢光信號,因而可通過熔解峰值(melting peak)確認是否存在靶核酸。
本發明的同時以多重的方式檢測人乳頭瘤病毒的方法的特徵在於,可在101拷貝以下的核酸樣品試樣中進行檢測。
通過本發明的方法分析人乳頭瘤病毒基因型16型、18型、52型的根據107至100拷貝濃度的即時擴增曲線及熔解曲線,最終確認到如圖2至圖5所示,不僅可檢測100拷貝的人乳頭瘤病毒基因型,還可同時以多重方式進行檢測。
本發明的試劑盒可選擇性地包含緩衝液、去氧核糖核酸聚合酶輔因數及去氧核糖核苷酸-5-三磷酸(deoxyribonucleotide-5-triphosphate)之類的、進行靶擴增聚合酶鏈式反應(例如,聚合酶鏈式反應)時所需的試劑。選擇性地,本發明的試劑盒還可包含多種多核苷酸(polynucleotide)分子、反轉錄酶、多種緩衝液、試劑及抑制去氧核糖核酸聚合酶活性的抗體。
並且,試劑盒在特定反應中所使用的試劑的最優量可由習得本說明書中公開的事項的本發明所屬技術領域的普通技術人員容易確定。典型地,本發明的試劑盒可製備成包含之前所涉及的多種結構成分的單獨包裝或區室(compartment)。
實施例
以下,通過實施例對本發明進行更詳細的說明。這些實施例只用於例示本發明,本發明的範圍不解釋為局限於這些實施例,這對於本發明所屬技術領域的普通技術人員來說是顯而易見的。
檢測探針和去氧核糖核酸低聚物的分析
用於檢測人乳頭瘤病毒的肽核酸探針及靶去氧核糖核酸低聚物的例示
1-1:肽核酸探針的製備
在本發明中利用的肽核酸探針在發生立體結構變化及發生通過賦予電荷的結構變化的檢測探針(detection probe)及通常的肽核酸探針標記螢光,來檢測多種靶。為了利用肽核酸低聚物來確認多種人乳頭瘤病毒基因型的檢測及特異性,如表1所示,合成了肽核酸探針。用於檢測人乳頭瘤病毒基因型的螢光肽核酸探針在未發生變形的探針及肽核酸探針骨架的伽馬位置結合帶負電荷的D-谷氨酸及L-谷氨酸的側鏈,來使用了對所要檢測的人乳頭瘤病毒基因型具有特異性的堿基序列的探針。
(在表1的肽核酸序列中,數位標記是指將肽核酸序列的一部分變形為D-穀氨醯胺和L-穀氨醯胺的。參照表2)
各個人乳頭瘤病毒基因型探針考慮在人乳頭瘤病毒L區中按基因型特異性高的堿基序列及Tm值來設計,在按基因型重複Tm值的情況下,通過標記於肽核酸探針的螢光物質的變更,在一個管中同時區分多種基因型。並且,為了調節螢光肽核酸的Tm值,對各個探針進行立體結構的變更、mer數變更及位置調節,從而調節螢光探針的Tm值。
肽核酸探針為根據在韓國登錄特許第464261號中記載的方法利用固相合成法(solid phase synthesis)叢由苯並噻唑磺醯基(Bts,Benzothiazolesulfonyl)保護的肽核酸單體和功能化的樹脂合成了肽核酸低聚物(Lee et al.,Org.Lett.、9:3291、2007)。除了這種方法之外,可利用公知的9-芴基甲氧基碳醯(Fmoc,9-flourenylmethloxycarbonyl)或叔丁氧基羰
基(t-Boc,t-butoxycarbonyl)合成法來合成肽核酸(Kim L.et al.,J.Org.Chem.,59:5767,1994;Stephen A.et al.,Tetrahedron,51:6179,1995),根據該領域中公知的方法在肽核酸探針標記了報導基因物質及猝滅物質。
1-2:去氧核糖核酸低聚物的製備
自製了在上述表1中製備的肽核酸探針,並且如表3所示,向韓國百歐尼仕(BIONICS)株式會社委託聚合酶鏈式反應中使用的多種低聚物的合成來使用。尤其,為了確認人乳頭瘤病毒檢測靈敏度的提高及是否因即時聚合酶鏈式反應而存在人乳頭瘤病毒基因型的多重感染,設計與所要檢測的基因型對立的特異性引物,來分析基於引物及螢光肽核酸探針之間的混合的人乳頭瘤病毒基因型的檢測靈敏度及特異性。
為了在一個反應管中區分11種人乳頭瘤病毒的基因型,分別以適當比率將表1的序列1至序列32的肽核酸螢光探針和表3的序列66至序列89的引物混合來進行即時聚合酶鏈式反應之後,通過熔解(Melt)測定確認了各個螢光探針的Tm值,並篩選了螢光信號及Tm值不重複的11種探針的組合。利用像這樣篩選的11種探針組合,來分析了聚合酶鏈式反應之後人乳頭瘤病毒基因型的檢測靈敏度及特異度。並且,在另一個反應管中,為了區分11種人乳頭瘤病毒基因型,分別以適當比率將表1的序列33至序列65的肽核酸螢光探針和表3的序列66、序列67及序列90至序列111的引物混合來進行即時聚合酶鏈式反應之後,通過熔解測定確認了各個螢光探針的Tm值,並篩選了螢光信號及Tm值不重複的11種探針組合,從而分析了人乳頭瘤病毒基因型的聚合酶鏈式反應之後的檢測靈敏度及特異度。
實施例2
基於肽核酸探針混合體和去氧核糖核酸低聚物的反應分析
2-1:靶核酸的準備
為了驗證探針及引物的組合特異性及靈敏度,用作靶核酸的去氧核糖核酸利用了22種人乳頭瘤病毒基因型,並以1010至100拷貝準備各個
22種人乳頭瘤病毒基因型去氧核糖核酸來準備了靶核酸。
2-2:肽核酸探針混合體和多種引物的反應分析
1)為了確認基於在實施例1-1中製備的靶特異性肽核酸螢光探針和在實施例1-2中製備的靶特異性引物種類的11種人乳頭瘤病毒(6型、11型、16型、18型、26型、33型、45型、52型、58型、69型及73型)基因型的檢測靈敏度及特異性,混合0.15μM的上述表1的序列1至序列32的各個肽核酸螢光探針、0.15μM的表3的序列66、序列67引物及1.2μM的序列68至序列89的各個引物,並添加了聚合酶鏈式反應擴增溶液(韓國Enzynomics公司)和各個已準備的靶核酸,並且,利用即時基因擴增儀(即時聚合酶鏈式反應器(Real-time PCR machine)、CFX96TM即時聚合酶鏈式反應系統(CFX96 TM Real-time PCR System),美國伯瑞(Bio-Rad)公司)來進行了反應。聚合酶鏈式反應迴圈在50℃反應2分鐘、在95℃反應15分鐘之後,將在95℃反應15秒鐘、在55℃反應45秒鐘、在72℃反應15秒鐘的反應過程進行了45次迴圈,並且,在55℃溫度下測定了肽核酸探針的螢光。之後,在95℃溫度下維持5分鐘之後,降低至35℃來使肽核酸探針與聚合酶鏈式反應產物雜交化5分鐘之後,從35℃至80℃為止以每次0.5℃的方式增加溫度,並測定螢光信號來進行了已檢測的熔解曲線的分析。
2)並且,為了確認在實施例1-1中製備的靶特異性的肽核酸螢光探針和在實施例1-2中製備的基於靶特異性引物種類的11種人乳頭瘤病毒(31型、35型、39型、51型、53型、56型、59型、66型、68型、70型及82型)基因型的檢測靈敏度及特異性,混合0.15μM的上述表1的序列33至序列65的各個肽核酸螢光探針、0.15μM的表3的序列66、序列67引物及1.2μM的
序列90至序列111的各個引物,並添加了聚合酶鏈式反應擴增溶液(韓國Enzynomics公司)和各個已準備的靶核酸,並且,利用即時基因擴增儀(即時聚合酶鏈式反應器、CFX96TM即時聚合酶鏈式反應系統,美國伯瑞公司)來進行了反應。並且,聚合酶鏈式反應迴圈在50℃反應2分鐘、在95℃反應15分鐘後,將在95℃反應15秒鐘、在55℃反應45秒鐘、在72℃反應15秒鐘的反應過程進行了45次迴圈,並且,在55℃溫度下測定了肽核酸探針的螢光。之後,在95℃溫度下維持5分鐘之後,降低至35℃來使肽核酸探針與聚合酶鏈式反應產物雜交化5分鐘之後,從35℃至80℃為止以每次0.5℃的方式增加溫度,並測定螢光信號來進行了已檢測的熔解曲線的分析。
2-3:已篩選的肽核酸探針混合體和引物的特異性及反應分析
為了確認在實施例2-2的1)中製備的靶特異性的11種探針的人乳頭瘤病毒(6型、11型、16型、18型、26型、33型、45型、52型、58型、69型及73型)基因型的檢測靈敏度及特異性,分別混合0.15μM的上述表1的序列1至序列32的各個肽核酸螢光探針中的序列3、序列6、序列9、序列12、序列15、序列20、序列23、序列26、序列29及序列32的探針混合體和表3的序列66、序列67引物及1.2μM的序列69、序列71、序列73、序列75、序列77、序列79、序列81、序列83、序列85、序列87及序列89的引物,並添加了聚合酶鏈式反應擴增溶液(韓國Enzynomics公司)和各個已準備的靶核酸(圖3)。
並且,為了確認在實施例2-2的2)中製備的靶特異性的引物種類及11種人乳頭瘤病毒(31型、35型、39型、51型、53型、56型、59型、
66型、68型、70型及82型)基因型的檢測靈敏度及特異性,分別混合1.2μM的上述表1的序列33至序列65的各個肽核酸螢光探針中的序列35、序列38、序列41、序列44、序列47、序列50、序列53、序列56、序列59、序列62、序列65的探針混合體和表3的序列66、序列67引物及1.2μM的序列91、序列93、序列95、序列97、序列99、序列101、序列103、序列105、序列107、序列109及序列111引物,並添加了聚合酶鏈式反應擴增溶液(韓國Enzynomics公司)和各個已準備的靶核酸,並且,利用即時基因擴增儀(即時聚合酶鏈式反應器、CFX96TM即時聚合酶鏈式反應系統,美國伯瑞公司)來進行了反應。聚合酶鏈式反應迴圈在50℃反應2分鐘、在95℃反應15分鐘後,將在95℃反應15秒鐘、在55℃反應45秒鐘、在72℃伐木用15秒鐘的反應過程進行了45次迴圈,並且,在55℃溫度下測定了肽核酸探針的螢光。之後,在95℃溫度下維持5分鐘之後,降低至35℃來使肽核酸探針與聚合酶鏈式反應產物雜交化5分鐘之後,從35℃至80℃為止以每次0.5℃的方式增加溫度,並測定螢光信號來進行了已檢測的熔解曲線的分析。
最終,確認到在利用對人乳頭瘤病毒基因型具有特異性的螢光肽核酸探針混合體及引物的混合體的聚合酶鏈式反應中,人乳頭瘤病毒基因型的檢測特異性高,並且以優秀的靈敏度可區分人乳頭瘤病毒基因型。
2-4:用於確認人乳頭瘤病毒基因型的檢測的引物及螢光系統
為了檢測在提出的上述引物及探針混合體系統中無法檢測的其他多個人乳頭瘤病毒基因型,如表4所示,利用至今公知的可檢測人乳頭瘤病毒基因型的引物系統的正向(Forward)引物MY11、正向引物MY12
和反向引物(Reverse Primer)GP6及PGMY09的堿基序列位置,來在可利用SYBR green螢光檢測系統檢測及可檢測多種人乳頭瘤病毒基因型的堿基序列部位設計螢光探針,從而通過聚合酶鏈式反應確認是否可檢測多種人乳頭瘤病毒基因型。
最終,確認到利用序列66、序列67、序列112及序列113引物的SYBR green檢測系統除了22種基因型(6型、11型、16型、18型、26型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型、68型、69型、70型、73型及82型)之外,18種人乳頭瘤病毒基因型(30型、32型、34型、40型、42型、43型、44型、54型、55型、61型、62型、67型、74型、81型、83型、84型、87型及90型)全部在進行聚合酶鏈式反應之後,可實現通過迴圈閾值的檢測(圖4)。並且,確認到利用探針檢測系統114至探針檢測系統121的螢光探針混合體來可檢測人乳頭瘤病毒的多種基因型。在利用SYBR green的檢測系統中,在樣品陽性、陰性及假陽性的情況下,可通過Tm值的分析進行特異性分析,在利用探針混合體的
檢測系統中,利用引物擴增的人乳頭瘤病毒聚合酶鏈式反應產物和特異性螢光肽核酸探針相結合,從而能夠以特異性的方式區分陽性樣品、陰性樣品。
2-5:用於檢測人乳頭瘤病毒基因型的引物及螢光探針系統
針對可檢測在提出的上述引物及探針混合體系統中無法檢測的18種人乳頭瘤病毒基因型(30型、32型、34型、40型、42型、43型、44型、54型、55型、61型、62型、67型、74型、81型、83型、84型、87型及90型)的引物系統正向引物MY11、正向引物MY12及18種人乳頭瘤病毒基因型,分別在利用可擴增的特異性反向引物來檢測及可檢測18種人乳頭瘤病毒基因型的堿基序列部位如表5及表6所示地設計螢光標記,從而通過聚合酶鏈式反應確認了是否可檢測18種人乳頭瘤病毒基因型。
最終,確認到利用序列66、序列67及序列122至序列147引物和探針檢測系統148至探針檢測系統185螢光探針混合體的檢測系統可實現18種人乳頭瘤病毒基因型全部進行聚合酶鏈式反應之後通過迴圈閾值進行檢測(圖5)。在利用螢光探針混合體的檢測系統中,利用引物擴增的人乳頭瘤病毒聚合酶鏈式反應產物與特異性的螢光肽核酸探針相結合,從而能夠以特異性的方式區分陽性樣品、陰性樣品。
Claims (10)
- 一種探針混合體,包含由序列1至序列65、序列114至序列121及序列148至序列185中的一個堿基序列形成的肽核酸(PNA,Peptide Nucleic Acid)探針,其中,上述肽核酸探針與報導基因(reporter)及猝滅劑(quenching)相結合,上述肽核酸探針能夠以基因型特異性的方式與人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)去氧核糖核酸(DNA,deoxyribonucleic acid)相結合。
- 如請求項1之探針混合體,其中,上述肽核酸探針檢測選自由6型、11型、16型、18型、26型、30型、31型、32型、33型、34型、35型、39型、40型、42型、43型、44型、45型、51型、52型、53型、54型、55型、56型、58型、59型、61型、62型、66型、67型、68型、69型、70型、73型、74型、81型、82型、83型、84型、87型及90型組成的組中的人乳頭瘤病毒基因型。
- 如請求項1之探針混合體,其中,上述肽核酸探針結合有氨基酸(amino acid)、氨基酸的側鏈或負電荷分子,以便於結構變形。
- 如請求項3之探針混合體,其中,上述氨基酸、氨基酸的側鏈或負電荷分子與探針的N末端或C末端位置相結合。
- 如請求項3之探針混合體,其中,上述氨基酸、氨基酸的側鏈或負電荷分子與探針骨架的阿爾法、貝塔或伽馬位置相結合。
- 如請求項1之探針混合體,其中,上述報導基因(reporter)為選自由螢光素(fluorescein)、螢光素氯三嗪(fluorescein chlorotriazinyl)、羅丹明綠(rhodamine green)、羅丹明紅(rhodamine red)、四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine)、異硫氰酸螢光素(FITC,fluorescein isothiocyanate)、俄勒岡綠(Oregon green)、Alexa Fluor、羧基螢光素(FAM,carboxy fluorescein)、羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基螢光素(JOE,carboxy-4’,5’-dichloro-2’,7’-dimethoxyfluorescein)、羅紅黴素(ROX)、六氯螢光素(HEX,hexachloro fluorescein)、德克薩斯紅(Texas Red)、花青素5(CY5)、花青素3(CY3)、四氯螢光素(TET,tetrachloro fluorescein)、四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC,tetramethyl rhodamin isothiocyanate)、四甲基羅丹明(TAMRA,tetramethyl rhodamine)、花菁(Cyanine)系列染料及硫雜二羰花菁(thiadicarbocyanine)染料組成的組中的一種以上的螢光物質。
- 如請求項1之探針混合體,其中,上述猝滅劑(quencher)為選自由4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(Dabcyl)、四甲基羅丹明、Eclipse、二氯二氰基苯醌(DDQ)、QSY、黑莓猝滅劑(Blackberry Quencher)、黑洞淬滅劑(Black Hole Quencher)、Qxl、Iowa black FQ、Iowa black RQ及IRDye QC-1組成的組中的一種以上。
- 一種人乳頭瘤病毒基因型檢測方法,利用用於即時檢測靶核酸的一個以上的檢測探針(detection probe),其中,上述檢測探針為由序列1至序列65、序列114至序列121及序列148至序列185中的一個堿基序列形成的、與報導基因及猝滅劑相結合且能夠以基因型特異性的方式與人乳頭瘤病毒的去氧核糖核酸相結合的肽核酸檢測探針。
- 如請求項8之人乳頭瘤病毒基因型檢測方法,其中,包括:步驟(a),在包含靶核酸的檢測體試樣中混合檢測探針及引物並進行雜交化,從而取得即時擴增曲線; 步驟(b),在上述擴增的過程之後,改變溫度,並取得擴增產物和檢測探針之間的熔解曲線;以及步驟(c),對取得的上述即時擴增曲線及熔解曲線進行單獨分析或依次分析或同時分析。
- 如請求項9之人乳頭瘤病毒基因型檢測方法,其中,上述擴增通過即時聚合酶鏈式反應(PCR,polymerase chain reaction)進行。
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