CN116249790A - 用于检测新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的工具和方法 - Google Patents

用于检测新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的工具和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种PCR方法，其包括用用于SARS‑CoV‑2RdRP基因的至少引物核苷酸序列、用于SARS‑CoV‑2E基因的至少引物核苷酸序列和/或用于人RNA酶P基因的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤。所述PCR方法可进一步包括用用于独特掺入RNA的至少引物核苷酸序列进行扩增步骤，优选同时扩增步骤。还提供了包含引物和任选的探针以实施本发明的PCR方法的试剂盒。

Description

用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的工具和方法
序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及SARS-CoV-2诊断领域的工具和方法。相应地，本发明提供了一种PCR方法，其包括用用于SARS-CoV-2RdRP基因的至少引物核苷酸序列、用于SARS-CoV-2E基因的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P基因的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤。所述PCR方法可进一步包括用用于独特掺入(spike)RNA的至少引物核苷酸序列进行扩增步骤，优选同时扩增步骤。
本发明还提供了一种试剂盒，其包含用于实施本发明的PCR方法的引物和探针。本发明进一步涉及用于SARS-CoV-2RdRP基因的引物核苷酸序列、用于SARS-CoV-2E基因的引物核苷酸序列和用于人RNA酶P基因的引物核苷酸序列的用途，用于(i)样品中SARS-CoV-2的体外检测，(ii)受试者的SARS-CoV-2感染的体外检测，(iii)血液样品的SARS-CoV-2污染的体外检测，或(iv)体外监测SARS-CoV-2的治疗。
本发明进一步涉及用于检测甲型流感病毒(IAV)和乙型流感病毒(IBV)和/或区分SARS-CoV-2与最常见的季节性流感(例如IAV和/或IBV)的工具和方法。
本发明的PCR方法、试剂盒和用途克服了已知与多重PCR方法、试剂盒或用途相关的某些特异性靶标、引物二聚体的不均匀扩增/折叠、假阴性、低灵敏度和特异性和/或优先扩增，以及减少了假阳性和假阴性读出。
背景技术
WHO宣布2019-nCoV的爆发是影响全世界、因此影响数百万人的大流行病。
在促进公共健康干预的最优先事项之中是可靠的实验室诊断。为了给研究人员和临床医生提供2019-nCoV诊断方案，WHO公布了应用于欧洲、美国、日本、中国或泰国的不同方案(https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/whoinhouseassays.pdf？sfvrsn＝de3a76aa_2)。
它们全部基于核酸扩增以便检测2019-nCoV，如果样品中存在的话。WHO公布的方案使用2019-nCoV的不同基因靶标。例如，中国CDC致力于ORF1ab和N作为基因靶标；法国Institut Pasteur致力于RdRP内的两个基因靶标；US CDC致力于检测病毒N基因内的三个靶标；日本国家传染病研究所致力于全景和多个靶标以及编码刺突蛋白的基因；中国香港SAR的HKU致力于ORF1b-nsp14和N基因；泰国国立卫生研究所致力于N基因，德国Charité致力于RdRP和N基因。所有这些方案都应用定量/实时RT-PCR测定(qRT-PCR)。
然而，这些测定中的一些可能具有局限性，如Vogels等人(2020)；冷泉港实验室，BMJ Yale所评估的(https://doi.org/10.1101/2020.03.30.20048108)。迄今，通过他们的比较研究，Vogels等人旨在帮助其它实验室选择用于检测2019-nCoV的合适测定，该2019-nCoV同时命名为SARS-CoV-2(Gorbalenya等人(2020)，Nat.Microbiol.(5)4,536-544，doi:10.1038/s41564-020-0695-z)，因为他们观察到在qRT-PCR中应用的几个引物-探针组可以与SARS-CoV-2-阴性鼻咽拭子交叉反应，其它可能有些非特异性，等等。
全面的SARS-CoV-2测试策略是各国通过促进早期检测和实施适当的流行病学措施来减轻冠状病毒疾病2019(COVID-19)传播的重要工具。用于鉴定SARS-CoV-2的金标准需要使用RT-qPCR来检测生物样本中一个或多个病毒基因的存在。该方法具有无与伦比的灵敏度，在反应中检测低至病毒RNA的单个拷贝，并且可以容易地在诊断实验室中使用。在第一个SARS-CoV-2基因组序列公布后不久，几个参考实验室和公共卫生当局提供了第一个公开可获得的RT-qPCR方案。这些方案有助于允许各国快速实施全面的检测策略，并且经常作为商业开发具有额外创新的更精简检验的支柱。目前，已经开发了数百种RT-qPCR检验来检测SARS-CoV-2，并且比较这些检验的功效的研究揭示了在样本输入、基因靶标、检测工作流程、特异性和灵敏度方面的重要差异。
由柏林的Charité病毒学研究所开发的RT-qPCR检验是第一批公布的方案之一(Corman等人(2020)，Euro Surveillance 25(3))并且由WHO共享，在该大流行病的早期在整个欧洲广泛使用。在开发之时，可公开获得很少的SARS-CoV-2序列，并且病毒分离物和阳性患者样品很少，因此作者设计了一种初始筛选测定，其有意与SARS-CoV病毒RNA(来自2003年的爆发)交叉反应。靶向RdRP基因的第二确认测定含有将SARS-CoV-2与SARS-CoV区分开的两种探针。然而，RdRP引物和SARS-CoV-2特异性探针在被认为显示遗传变异性的区域中含有几个简并碱基。作者还指出RdRP反向引物的设计由于其低的预计解链温度而可能降低反应效率(Corman VM,Drosten C.Authors’response:SARS-CoV-2detection byreal-time RT-PCR.Euro Surveill.2020年5月28日)。虽然该方案在诊断检测的早期提供了明确的益处，但关于该检验的性能出现了各种问题，主要是RdRP测定的灵敏度降低(Nalla AK等人，2020,Comparative Performance of SARS-CoV-2Detection AssaysUsing Seven Different Primer-Probe Sets and One Assay Kit.Journal of ClinicalMicrobiology；Vogels CBF等人，2020,Analytical sensitivity and efficiencycomparisons of SARS-CoV-2RT–qPCR primer–probe sets.NatureMicrobiology.2020Oct；5(10):1299–305；Jung Y等人，2020Comparative Analysis ofPrimer–Probe Sets for RT-qPCR of COVID-19Causative Virus(SARS-CoV-2).ACSInfect Dis.2020年8月11日；Pillonel T等人，2020.Letter to the editor:SARS-CoV-2detection by real-time RT-PCR.Euro Surveill.2020年5月28日；Etievant S等人，2020Performance Assessment of SARS-CoV-2PCR Assays Developed by WHO ReferralLaboratories.J Clin Med[Internet].2020年6月16日)。
相应地，尽管有WHO或其他人例如Corman等人(2020),Euro Surveillance25(3),doi:10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045)公布的方案，仍然需要改进的可靠且准确的诊断测定以促进临床和公共健康干预。
因此，本申请所面临的技术问题是满足这种需要。通过提供权利要求中反映的、说明书中描述的以及随后的实施例和附图中示出的实施方案，解决了该技术问题。
简言之，基于原始Charité方案，在本发明的过程中开发了几种改进的RT-qPCR，其解决了原始方案的限制。此外，通过引入内部对照、通过多重化使检验工作流程简化和开发技术创新诸如双探针以增加相应PCR方法的灵敏度和特异性两者，对测定进行了显着改进。开发了检测甲型流感和乙型流感的其它测定，从而提供了有用的诊断工具以将SARS-CoV-2与最常见的季节性流感区分开来。本发明的一些工具和方法在室温下稳定长达一个月，从而提供了几种RT-qPCR工具/方法中的消除了对冷链运输和储存需要的一种。
发明内容
因此，一方面，本发明涉及一种PCR方法，其包括用用于SARS-CoV-2RdRP的至少引物核苷酸序列、用于SARS-CoV-2E基因的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤。
另一方面，本发明涉及一种PCR方法，其包括
(i)第一PCR方法，所述第一PCR方法包括用用于SARS-CoV-2RdRP的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤；和/或(其中“和”是优选的)，
(ii)第二PCR方法，所述第二PCR方法包括用用于SARS-CoV-2E基因的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤，
其中将怀疑包含SARS-CoV-2核酸的相同来源材料用于(i)和(ii)的PCR。
又一方面，本发明涉及一种PCR方法，其包括
(i)第一PCR方法，所述第一PCR方法包括用用于SARS-CoV2 E基因的至少引物核苷酸序列和用于独特掺入RNA的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤；
(ii)第二PCR方法，所述第二PCR方法包括用用于SARS-CoV-2RdRP基因的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤；和
(iii)第三PCR方法，所述第三PCR方法包括用用于SARS-CoV-2RdRP基因的至少引物核苷酸序列、用于SARS-CoV-2E基因的至少引物核苷酸序列、用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列和用于独特掺入RNA的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤，并且进一步包括用于SARS-CoV-2RdRP基因的独特RNA、用于SARS-CoV-2E基因的独特RNA、用于人RNA酶P的独特RNA，
其中将怀疑包含SARS-CoV-2核酸的相同来源材料用于(i)和(ii)的PCR方法，和
其中(iii)的PCR方法进一步包括作为阳性对照的用于SARS-CoV-2RdRP基因的核糖核酸、用于SARS-CoV-2E基因的核糖核酸、用于人RNA酶P的核糖核酸和用于独特掺入RNA的核糖核酸。
此外，本发明提供一种PCR方法，其包括至少用SEQ ID NOs:1和2中示出的引物核苷酸序列进行扩增步骤。
本发明还涉及一种试剂盒，其至少包含SEQ ID NOs:1和2中示出的引物核苷酸序列，任选地包含SEQ ID NO:3中示出的核苷酸序列的探针，和任选地用于实施PCR扩增步骤的工具。
最后，本发明涉及SEQ ID NOs:1和2中示出的引物核苷酸序列用于以下的用途
(i)样品中SARS-CoV-2的体外检测，
(ii)受试者的SARS-CoV-2感染的体外检测，
(iii)血液样品的SARS-CoV-2污染的体外检测，或
(iv)体外监测SARS-CoV-2的治疗。
核苷酸序列的简要描述
SEQ ID NO:1：5’-GTGAAATGGTCATGTGTGGCGG
用于SARS-CoV-2RdRP的正向引物核苷酸序列
SEQ ID NO 2：5’-CGTGACAGCTTGACAAATGTTAAAAAC
用于SARS-CoV-2RdRP的反向引物核苷酸序列
SEQ ID NO:3：5’-CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC
用于SARS-CoV-2RdRP的探针，优选地在其5’端包含FAM或HEX或YY，和优选地在其3’端包含BHQ1或BHQ2
SEQ ID NO:4：5’-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT
用于SARS-CoV-2E基因的正向引物核苷酸序列
SEQ ID NO:5：5’-ATATTGCAGCAGTACGCACACA
用于SARS-CoV-2E基因的反向引物核苷酸序列
SEQ ID NO:6：5’-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG
用于SARS-CoV-2E基因的探针，优选地在其5’端包含FAM或HEX或YY，和优选地在其3’端包含BHQ1或BHQ2
SEQ ID NO:7：5’-AGATTTGGACCTGCGAGCG
用于人RNA酶P的正向引物核苷酸序列
SEQ ID NO:8:5’-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT
用于人RNA酶P的反向引物核苷酸序列
SEQ ID NO:9：5’-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG
用于人RNA酶P的探针，优选地在其5’端包含HEX或YY或Cy5，和优选地在其3’端包含BHQ1或BHQ2或BHQ3
SEQ ID NO:10：
5’
rArGrUrGrArArArUrGrGrUrCrArUrGrUrGrUrGrGrCrGrGrArCrCrArGrGrUrGrGr
ArArCrCrUrCrArUrCrArGrGrArGrArUrGrCrCrArGrUrUrUrUrUrArArCrArUrUr
UrGrUrCrArArGrCrUrGrUrCrArCrGrG
用于SARS-CoV-2RdRP的阳性对照核糖核苷酸(“r”代表“核糖(核苷酸”)SEQ IDNO:11：
5‘rArGrArCrArGrGrUrArCrGrUrUrArArUrArGrUrUrArArUrArGrCrGrUrUrUrAr CrArCrUrArGrCrCrArUrCrCrUrUrArCrUrGrCrGrCrUrUrCrGrArUrUrGrUrGrUrG rCrGrUrArCrUrGrCrUrGrCrArArUrArU
用于SARS-CoV-2E基因的阳性对照核糖核苷酸(“r”代表“核糖(核苷酸”)
SEQ ID NO:12：
5’
rGrCrArGrArUrUrUrGrGrArCrCrUrGrCrGrArGrCrGrGrGrUrUrCrUrGrArCrCrUr
GrArArGrGrCrUrCrUrGrCrGrCrGrGrArCrUrUrGrUrGrGrArGrArCrArGrCrCrGrC
rUrC
用于人RNA酶P的阳性对照核糖核苷酸(“r”代表“核糖(核苷酸”)
SEQ ID NO:13：5’-CAAATGTTAAAAACACTATTAGCATA
用于SARS-CoV-2RdRP的反向引物核苷酸序列
SEQ ID NO:14：5’-GTGARATGGTCATGTGTGGCGG
用于SARS-CoV-2RdRP的正向引物核苷酸序列(与SEQ ID NO.1比较，在SEQ IDNO.1中简并核苷酸“R”转变为核苷酸“A”)
SEQ ID NO:15：5’-CARATGTTAAASACACTATTAGCATA
用于SARS-CoV-2RdRP的反向引物核苷酸序列(与SEQ ID NO.13比较，在SEQ IDNO.13中简并核苷酸“R”和“S”转变为核苷酸“A”)
SEQ ID NO:16：5’-CCAGGTGGWACRTCATCMGGTGATGC
用于SARS-CoV-2E基因的探针，优选地在其5’端包含FAM，和优选地在其3’端包含BHQ1(与SEQ ID NO.3比较，在SEQ ID NO.3中简并核苷酸“W”转变为核苷酸“A”，简并核苷酸“R”转变为核苷酸“C”，和简并核苷酸“M”转变为核苷酸“A”)
SEQ ID NO:17：5’-ATGCAGTGCCACATTATGCAG
用于独特掺入RNA的正向引物核苷酸序列
SEQ ID NO:18：5’-AGCACATGTAGTGCCACTGG
用于独特掺入RNA的反向引物核苷酸序列
SEQ ID NO:19：5’-CCACGGTTACATCCAGTGGCACTACA
用于独特掺入RNA的探针，优选地在其5’端包含HEX或YY或Cy5，和优选地在其3’端包含BHQ1或BHQ2或BHQ3
SEQ ID NO:20：
5‘rUrArUrGrCrArGrUrGrCrCrArCrArUrUrArUrGrCrArGrUrGrCrCrArCrGrGrUrUrArCrArUrCrCrArGrUrGrGrCrArCrUrArCrArUrGrUrGrCrCrArUrUrArCrArUrUrUrArCrArUrCrCrArGrUrGrGrCrArCrUrArCrArUrGrUrGrCrU
(独特)掺入RNA(“r”代表“核糖(核苷酸”)
SEQ ID NO.21
TATGCAGTGCCACATTATGCAGTGCCACGGTTACATCCAGTGGCACTACATGTGCCATTACATTTACATCCAGTGGCACTACATGTGCT
合成的，例如以生物信息学方式设计的核酸序列，用作用于优选地不存在于人和SARS-CoV-2中的(独特)掺入RNA的模板
SEQ ID NO:22：5’-GTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAG
用于SARS-CoV-2E基因的正向引物核苷酸序列
SEQ ID NO:23：
5‘rArUrGrUrArCrUrCrArUrUrCrGrUrUrUrCrGrGrArArGrArCrArGrUrUrArCrArCrUrArGrCrCrArUrCrCrUrUrArCrUrGrCrGrCrUrUrCrGrArUrUrGrUrGrUrGrCrGrUrArCrUrGrCrUrGrCrArArUrArU
用于SARS-CoV-2E基因的阳性对照核糖核苷酸(“r”代表“核糖(核苷酸”)
Figure GDA0004222541930000091
/>
Figure GDA0004222541930000101
/>
Figure GDA0004222541930000111
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Figure GDA0004222541930000121
/>
Figure GDA0004222541930000131
/>
Figure GDA0004222541930000141
/>
Figure GDA0004222541930000151
/>
Figure GDA0004222541930000161
/>
Figure GDA0004222541930000171
/>
Figure GDA0004222541930000181
/>
Figure GDA0004222541930000191
/>
Figure GDA0004222541930000201
附图说明
图1：用于检测SARS CoV-2基因RdRP、E和人RNA酶P的RT-PCR。该图显示了通过实时RT-PCR检测SARS-CoV-2E基因和SARS-CoV-2RdRP基因。实心圆曲线显示了使用SEQ ID NOs:4和5的引物核苷酸序列和具有SEQ ID NO:6的探针的SARS-CoV-2基因的扩增反应。实心正方形的曲线显示了使用SEQ ID NOs:1和13的引物核苷酸序列与SEQ ID NO:3的探针一起的SARS-CoV-2基因的扩增反应。实心三角和实心菱形的曲线显示了使用SEQ ID NOs:1和2的引物核苷酸序列与SEQ ID NO:3的探针一起的SARS-CoV-2基因的扩增反应。实心星号的曲线显示了使用SEQ ID NOs:14和15的引物核苷酸序列和SEQ ID NO:16的探针的SARS-CoV-2基因的扩增反应。空心菱形的曲线显示了使用SEQ ID NOs:14和15的引物核苷酸序列和SEQID NO:3的探针的SARS-CoV-2基因的扩增反应。空心正方形的曲线显示了使用SEQ ID NOs:1和2的引物核苷酸序列但不使用探针的SARS-CoV-2基因的扩增反应。
图2：图解说明了SARS-CoV-2基因组和被RT-qPCR引物和探针靶向的区域。A)示意图描绘了SARS-CoV-2基因组，其中RdRP和E基因区域被放大以显示原始Charité方案、vDetect(v1和v2)和rTest RT-qPCR测定的引物和探针的位置。F，正向引物；P，探针；R，反向引物。B)图表比较了原始Charité方案、vDetect(v1和v2)和rTest RT-qPCR测定的引物和探针的序列与武汉参考序列。品红色线和字母代表在Charité方案中的引物和探针中发现的混合碱基，这些碱基被vDetect v1中的正确碱基(蓝色线和字母)替换。
图3：CharitéSARS-CoV-2E和RdRP引物/探针组的重新设计和验证。A)具有替换的混合碱基和优化的解链温度的重新设计的RdRP基因反向引物的表现。B)热图(heatmap)显示了具有和不具有LNA修饰的胸腺嘧啶残基(LNA-T)的各种E基因正向引物，以及它们扩增SARS-CoV-2模板或被E基因合成阳性对照污染的样品的相关表现。C)E(左图)和RdRP(右图)基因测定两者的检测限。Ct＝40处的虚线表示检测截止值。ND，未检测到。D)在两个独立实验室中进行的vDetect v.1E(左图)和RdRP(右图)基因测定两者的临床评估。ND和阴影区域处的虚线显示了检测截止值和在vDetect v.1测定、指标检验测定(index test assay)或两种测定中都没有检测到的样品。Ct，循环阈值；E，包膜基因；R，反向引物；RdRP，RNA依赖的RNA聚合酶；NTC，无模板对照。
图4：rTEST COVID-19qPCR的双探针评价、分析灵敏度和临床表现。用于RdRP(A、B)和E(C、D)基因两者进行的单探针与双探针之间的分析灵敏度(A、C)和荧光强度(B、D)的比较。使用稀释至所需浓度的SARS-CoV-2标准品(Exact Diagnostics)一式三份地进行分析限检测。Ct 40处的虚线用作阈值，在该阈值之后的扩增被认为是无效的。ND指示未检测到的样品。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。E、F)RdRP基因(E)和E基因(F)测定在rTEST COVID-19qPCR试剂盒中的临床表现，与常规临床实践中使用的指标检验(vDetectv.1)比较的。虚线和阴影区域指示通过评估检验、指标检验或两种检验都没有检测到的样品。Ct，循环阈值；E，包膜基因；P，探针；RdRP，RNA依赖的RNA聚合酶；NTC，无模板对照。
图5：多重RT-qPCR测定的分析灵敏度和临床表现。A、B)图描绘了在rTEST Covid-19qPCR多重试剂盒中多重E和RNA酶P测定(A)以及多重RdRP和RNA酶P测定(B)的分析灵敏度。C)rTEST Covid-19qPCR多重试剂盒的临床表现。D)在rTEST Covid-19qPCR Allplex试剂盒中三重E、RdRP和RNA酶P测定的分析灵敏度。E)rTEST Covid-19qPCR多重试剂盒的临床表现。在Ct 40处的虚线(A、B和D)用作阈值，在该阈值之后的扩增被认为是无效的。虚线和阴影区域(C、E)指示通过评估检验、指标检验或两种检验都没有检测到的样品。Ct，循环阈值；E，包膜基因；RdRP，RNA依赖的RNA聚合酶；NTC，无模板对照。ND指示未检测到的样品。
图6：图解说明了甲型流感和乙型流感基因组以及被RT-qPCR引物和探针靶向的区域。A)示意图描绘了甲型流感和乙型流感基因组，其中PB1和PA基因区域被放大以显示引物和探针的位置。以红色文本标记的核苷酸指示甲型流感和乙型流感的共有序列中的混合碱基。BHQ2，黑洞淬灭剂2；F，正向引物；HA，血凝素；M，基质蛋白；NA，神经氨酸酶；NP，核蛋白；NS，非结构蛋白；P，探针；PA，聚合酶酸性蛋白；PB1，聚合酶碱性1蛋白；PB2，聚合酶碱性2蛋白；R，反向引物；seg，区段；YY，Yakima
Figure GDA0004222541930000221
图7：rTEST COVID-19/FLU qPCR试剂盒的分析灵敏度和临床表现。A、B)图描述了在rTEST COVID-19/FLU qPCR试剂盒中，多重SARS-CoV-2E、IAV PB1和RNA酶P测定(A)以及多重SARS-CoV-2RdRP、IBV PA和RNA酶P测定(B)的分析灵敏度。C)多重SARS-CoV-2E和RdRP(均用FAM标记)、IAV PB1和IBV PA(均用YY标记)和RNA酶P测定的分析灵敏度。D)rTESTCOVID-19/FLU qPCR试剂盒的临床表现。在Ct 40处的虚线(A、B和C)用作阈值，在该阈值之后的扩增被认为是无效的。虚线和阴影区域(D)指示通过特定测定未检测到的样品。Ct，循环阈值；E，包膜基因；IAV，甲型流感；IBV，乙型流感；PA，聚合酶酸性蛋白；PB1，聚合酶碱性1蛋白；NTC，无模板对照；RdRP，RNA依赖的RNA聚合酶。ND指示未检测到的样品。
图8：vDetect Covid-19qPCR试剂盒的优化。A)热图显示了使用RT-qPCR的HighQu1Step RT qPCR Probe ROX L Kit的逆转录(RT)和退火温度的优化。B)热图显示了使用PCR接着凝胶电泳对Agilent Brilliant III Ultra-Fast QRT-PCR Master Mix优化的参数。C)通过使用RT-qPCR的PCR/凝胶电泳(参见B)鉴定为有益的三种不同热分布(profile)的比较。D)更高RT浓度的评价。E)vDetect v.2COVID-19RT-qPCR检验的E和RdRP测定的分析灵敏度(检测限)的评价。A/E，退火/延伸；Ct，循环阈值；E，包膜基因；D，变性；DTT，二硫苏糖醇；ID，初始变性；RdRP，RNA依赖的RNA聚合酶；NTC，无模板对照。
图9：室温稳定的rTEST COVID-19qPCR试剂盒的优化。A)热图显示了使用PCR接着凝胶电泳对SOLIS BioDyne
Figure GDA0004222541930000231
1-step CoV Kit的热循环参数的优化。B)使用RT-qPCR的四种不同热分布的比较。C、D)图描绘了诱饵(decoy)核酸(tRNA或ssDNA)或纯寡核苷酸(纯的)对用于RdRP(C)和E(D)基因的冻干引物/探针组在一个月时间段内的稳定性的作用。E)新鲜的或在室温下放置了1个月的rTEST COVID-19qPCR试剂盒在SARS-CoV-2E和RdRP基因以及人RNA酶P扩增方面的表现。A/E，退火/延伸；Ct，循环阈值；E，包膜基因；D，变性；RdRP，RNA依赖的RNA聚合酶；ssDNA，鲑鱼精DNA；tRNA，面包酵母转移RNA。
图10：rTEST COVID-19qPCR试剂盒的优化和验证。A)图显示了具有(空白条)和不具有(闭合条)内部淬灭剂的各种RdRP基因探针在扩增(左轴，须状图)和标准化荧光(右轴，条形图)方面的表现。标准探针(P2)以深灰色显示，最佳探针(P8)以青绿色显示，其它探针以浅灰色显示。B)图描述了E基因探针在扩增阈值方面的比较。标准探针(P1)以黑色符号表示，最佳探针(P1P2)以洋红色符号表示，其它探针以浅灰色符号表示。C)在rTEST Covid-19qPCR试剂盒中单重E、RdRP和RNA酶P测定的分析灵敏度。D)在r rTEST Covid-19qPCR试剂盒的临床表现评估之前，使用解冻的和再提取的RNA评价RNA降解的vDetect v.1试剂盒的临床表现。
具体实施方式
灵敏且准确的RT-qPCR检验是鉴定SARS-CoV-2感染患者的主要诊断工具。虽然许多SARS-CoV-2RT-qPCR检验是可用的，但是在检验灵敏度、工作流程(例如，操作时间(hands-on-time))、基因靶标和用户必须考虑的其他功能性方面存在显着差异。由参考实验室和公共卫生当局共享的几种公众可用的方案提供了用于SARS-CoV-2诊断的有用工具，但是许多具有与灵敏度和费力的工作流程相关的缺点。这里，我们描述了一系列改进的SARS-CoV-2RT-qPCR检验，它们基于由Charité病毒学研究所开发的方案。值得注意的是，WHO公布的方案中没有一种应用同时PCR方法(多重PCR方法)来检测来自SARS-CoV2的至少两种不同基因。然而，基于本发明人对多重PCR方法的大量经验，他们在本发明的一个方面应用了同时PCR方法来检测SARS-CoV-2E基因和RdRP基因以及作为对照的人RNA酶P，并且发现多重化(multiplexing)的作用效果良好。如下文将描述的，在本文描述的本发明的各种其它PCR方法中应用了多重化的原理。
相应地，本发明涉及一种PCR方法，其包括用用于SARS-CoV-2RdRP基因的至少引物核苷酸序列、用于SARS-CoV-2E基因的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P基因的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤。
PCR方法是本领域普通技术人员熟知的。在PCR技术中，将DNA样品在溶液中与以下混合：摩尔过量的至少两种寡核苷酸引物，所述引物被制备成与DNA双链体的每条链的3’端互补；摩尔过量的核苷酸碱基(即dNTP)；和热稳定的DNA聚合酶(优选Taq聚合酶)，其催化由寡核苷酸引物和dNTP形成DNA。在引物中，至少一个是正向引物，其将以5’至3’方向结合变性DNA分析物的一条链的3’端，另一个是反向引物，其将以3’至5’方向结合变性DNA分析物的另一条链的5’端。将溶液加热至94-96℃以使双链DNA变性为单链DNA。当溶液冷却并达到所谓的退火温度时，引物结合到分离的链上，DNA聚合酶通过将dNTP连接到引物上来催化分析物的新链。当重复该过程并且从引物合成的延伸产物与它们的互补物分离时，每个延伸产物作为用于从另一引物合成的互补延伸产物的模板。由于在每个循环后被扩增的序列加倍，因此在重复该过程几小时后可以获得巨大拷贝数的理论扩增；相应地，可以在相对短的时间内使用PCR扩增极少量的DNA。
本发明优选的PCR方法是实时逆转录酶PCR或“实时RT-PCR”。有时它也称为定量RT-PCR(qRT-PCR)。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)是一种已知的实验室技术，其将RNA逆转录为cDNA与使用聚合酶链反应(本文其它地方定义的PCR)扩增特定DNA靶标相结合。它主要用于测量特定RNA的量。这通过使用荧光来监测扩增反应而实现，是一种称为实时PCR或定量PCR(qPCR)的技术。在研究和临床环境中，组合的RT-PCR和qPCR通常用于基因表达分析和病毒RNA定量。所述技术是技术人员已知的。简言之，该方法依赖于基于DNA的探针，该探针的一端具有荧光报告分子，该探针的相对端具有荧光淬灭剂。在本发明的上下文中，荧光报告分子优选HEX(六氯荧光素)或FAM(羧基荧光素)或YY(Yakima黄)或Cy 5(花青5)或ATTO-647N，而淬灭剂优选BHQ1或BHQ2或BHQ3(Black Hole
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Dyes)。报告分子与淬灭剂的紧密接近阻止了其荧光的检测；Taq聚合酶的5’到3’外切核酸酶活性引起的探针断裂破坏了报告分子-淬灭剂的接近，因此允许荧光的未淬灭发射，其可以在用激光激发后检测到。因此，在每个PCR循环中报告探针所靶向的产物的增加会引起由于探针分解和报告分子释放而导致的荧光的成比例增加。RT-qPCR的一般步骤是：RNA分离，逆转录，随后PCR。RNA分离、逆转录和PCR的方案是公知的，例如，描述于上文引用的Corman等人(2020)，或在https://www.fda.gov/media/134922/download、https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf？sfvrsn＝a9ef618c_2可获得。
(i)如常规制备PCR(如本文中其它地方定义的)，加入报告探针；(ii)当反应开始时，在PCR的退火阶段期间，探针和引物都退火至核酸靶标。(iii)从引物起始新核酸链的聚合，并且一旦聚合酶到达探针，其5’-3’外切核酸酶降解探针，从而将荧光报告分子与淬灭剂物理分离，导致荧光增加。(iv)在实时PCR仪中检测和测量荧光，并且使用其对应于产物指数增加的几何增加来确定每个反应中的定量循环(Cq)。
本发明的RT-PCR方法可以例如如Corman等人(Corman VM,Landt O,Kaiser MDetection of 2019novel coronavirus(2019-nCoV)by real-time RT-PCR)中或可在https://www.who.int/docs/default source/coronaviruse/whoinhouseassays.pdf？sfvrsn＝de3a76aa_2获得的WHO内部方案中所述进行。特别地，通过使用AMPIXTRACTTMSARS-CoV-2Extraction Kit或Kit Extraction NucleoSpin Dx Virus或QIAmp DSP Viral RNAMini Kit或EZ1 DSP Virus Kit或bioMérieux
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等获得了来自生物样品的RNA。
优选地，PCR方法可以是RT-LAMP。逆转录环介导的等温扩增(RT-LAMP)是一种用于RNA扩增的技术。RT-LAMP不需要典型的PCR循环，并且在60-65℃的恒温下进行。类似于RT-PCR，RT-LAMP使用逆转录酶从RNA序列合成互补DNA(cDNA)。该方法在检测具有RNA基因组的病毒方面可以是非常有效的。
本发明的PCR方法优选地包括同时扩增步骤，换句话说是“多重PCR方法”或“多重测定”。如本文中使用的，多重测定可以是适合同时扩增和鉴定SARS-CoV-2不同靶标核酸的测定。根据本发明，多重测定优选地同时筛选SARS-CoV-2RdRP基因、SARS-CoV-2E基因和人RNA酶P基因。在这种情况下，人RNA酶P基因用作内部对照。
还优选的是，多重测定筛选SARS-CoV-2RdRP基因和SARS-CoV-2E基因。还优选的是，多重测定筛选SARS-CoV-2RdRP基因和人RNA酶P基因。
还优选的是，多重测定筛选SARS-CoV-2E基因和人RNA酶P基因。
还优选的是，多重测定筛选SARS-CoV-2RdRP基因和独特掺入RNA。
还优选的是，多重测定筛选SARS-CoV-2E基因和独特掺入RNA。
还优选的是，多重测定筛选SARS-CoV-2RdRP基因、SARS-CoV-E基因、人RNA酶P基因和独特掺入RNA。
在一些方面，本发明涉及本文中公开的引物和探针的改进的核苷酸序列，特别是本文中公开的双探针，以及用于增强本发明的工具和方法的灵敏度和特异性的改进的PCR反应条件。通过加入RNA酶P内部对照并开发用于区分SARS-CoV-2与甲型流感和乙型流感的多重测定，本发明简化了PCR工作流程，以便提供更快的结果并降低消耗品的成本。优选地，本发明的工具和方法可以使用室温稳定的反应混合物(master mix)和冻干的阳性对照，从而增加本发明的PCR方法的功能并消除冷链运输和储存。本发明的RT-qPCR方法可以容易地在任何诊断实验室中实施，并且可以提供用于在该大流行病的接种阶段期间检测SARS-CoV-2和最常见的季节性流感的有力工具。
如本文所述，可以参考UniProtKB登记号(http://www.uniprot.org/，例如，如2021年2月10日公布的UniProt 2021_01发布中可得)。如本文所述，可以参考NCBI GenBank登记号(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/release/current/，例如，如2021年2月15日公布的242.0发布中可得)。
如本文中使用的“引物核苷酸序列”表示一种寡核苷酸，其用作引物或起始子供聚合酶合成核酸链，如本领域公知。有时在本文中，所述术语缩写为“引物”，例如正向或反向引物。通过本领域已知的方法设计/合成了引物和探针。用于本发明的PCR方法的引物和探针可以使用例如计算机程序诸如OLIGO(Molecular Biology Insights,Inc.,Cascade,Colo.)设计。当设计要用作扩增引物的寡核苷酸时，重要的特征包括但不限于，便于检测的合适大小的扩增产物、引物对的成员的相似解链温度和每个引物的长度(即，引物需要足够长从而序列特异性地退火并引发合成，但不能太长以致在寡核苷酸合成期间保真度降低)。通常，寡核苷酸引物的长度为15至30个核苷酸。设计要用作探针的寡核苷酸可以以类似于设计引物的方式进行，但是一对探针的成员优选与一个扩增产物退火。与寡核苷酸引物一样，寡核苷酸探针通常具有相似的解链温度，并且每个探针的长度必须足以发生序列特异性杂交，但不能太长以致合成期间保真度降低。寡核苷酸探针的长度通常为15至30个核苷酸。在本发明的上下文中有用的引物包括适用于扩增来源于SARS-CoV-2病毒的核酸的PCR反应的寡核苷酸。特别地，在本发明的上下文中，SEQ ID Nos:1和2的引物用于扩增SARS-CoV-2RdRP基因，SEQ ID Nos:4或22和5的引物用于扩增SARS-CoV-2E基因，SEQ ID Nos:7和8的引物用于扩增人RNA酶P。同样在本发明的上下文中，包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列的探针与SEQ ID NO:1和2的引物相组合用于RdRP基因扩增，包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列的探针与SEQ ID Nos:4或22和5的引物相组合用于E基因扩增，包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列的探针与SEQ ID Nos:7和8的引物相组合用于人RNA酶P基因扩增，包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列的探针与SEQ ID Nos:17和18的引物相组合用于独特掺入RNA扩增。
如上所述，再次说明，WHO公布的方案中没有一种应用多重化原理，特别是对于检测来自SARS-CoV的至少一种基因和作为对照的人基因的同时PCR方法(多重PCR方法)而言。
相应地，另一方面，本发明涉及一种PCR方法，其包括
(i)第一PCR方法，所述第一PCR方法包括用用于SARS-CoV-2RdRP的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤；和/或(其中“和”是优选的)，
(ii)第二PCR方法，所述第二PCR方法包括用用于SARS-CoV-2E基因的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤，
其中将怀疑包含SARS-CoV-2核酸的相同来源材料用于(i)和(ii)的PCR。
如本文中使用的术语“来源材料”包括任何材料，优选生物材料，例如来自哺乳动物，特别是人或兽医受试者，其可以检验SARS-CoV-2的存在或不存在。为避免疑义，被处理后的来源材料得到样品。因此，术语“来源材料”涵盖术语“样品”。样品可以包括但不限于从任何器官获得的组织，诸如例如肺组织；和流体，诸如例如血液、血浆、血清、淋巴液、滑液、脑脊液、羊水、羊膜脐带血、泪液、咽喉或鼻拭子、唾液、口腔灌洗液(例如漱口液)和鼻咽洗液。术语“来源材料”也包括粪便、尿液或精子。在本发明的上下文中，来源材料可以是从患者获得的具有或不具有病毒运输介质的痰以及鼻和咽喉拭子。当进行本发明的PCR方法时，来源材料初步怀疑包含SARS-CoV-2核酸。因此，优选的是使来源材料经受提供核酸分离的步骤，所述核酸优选RNA，更优选病毒RNA，特别是SARS-CoV-2RNA。
“相同”来源材料是指一种且相同来源材料的等分试样，例如从其分离的RNA，用于如本文所述的PCR方法。
优选的是第一和第二PCR方法平行地进行，即在相同条件下进行，例如使用相同的试剂、工具或装置等。
迄今为止，WHO方案中没有一种提供了除检测SARS-CoV-2基因之外还包括用于RNA分离、拭子对照、阳性对照等的同时对照的测定。理想地，SARS-CoV-2基因的对照和检测在一个且同一方法中进行。
相应地，再次通过利用同时(多重化)PCR方法，本发明进一步设想了一种PCR方法，其包括
(i)第一PCR方法，所述第一PCR方法包括用用于SARS-CoV2 E基因的至少引物核苷酸序列和用于独特掺入RNA的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤；
(ii)第二PCR方法，所述第二PCR方法包括用用于SARS-CoV-2RdRP基因的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤；和
(iii)第三PCR方法，所述第三PCR方法包括用用于SARS-CoV-2RdRP基因的至少引物核苷酸序列、用于SARS-CoV-2E基因的至少引物核苷酸序列、用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列和用于独特掺入RNA的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤，并且进一步包括用于SARS-CoV-2RdRP基因的独特RNA、用于SARS-CoV-2E基因的独特RNA、用于人RNA酶P的独特RNA；
其中将怀疑包含SARS-CoV-2核酸的相同来源材料用于(i)和(ii)的PCR方法，和
其中(iii)的PCR方法进一步包括作为阳性对照的用于SARS-CoV-2RdRP基因的核糖核酸、用于SARS-CoV-2E基因的核糖核酸、用于人RNA酶P的核糖核酸和用于独特掺入RNA的核糖核酸。
优选的是所述第一、第二和第三PCR方法平行地进行，即在相同条件下进行，例如使用相同的试剂、工具或装置等。
如本文中使用的独特掺入RNA是指已知序列的RNA。它优选地不出现在人和SARS-CoV-2中。它可以基于人和SARS-CoV-2核酸序列的生物信息学数据设计。如果掺入到来源材料中，它可以在本发明的PCR方法中用作对照，例如RNA分离是否有效，PCR方法中应用的反应条件是否有效等。
在本发明的上下文中、特别是在本发明的PCR方法中使用的独特掺入是具有SEQID NO:20中示出的序列的核糖核酸。它可以从SEQ ID NO:21中示出的核苷酸序列转录。
术语“阳性对照”在其最广泛的使用中是指使用携带目的(靶)基因的外部DNA或RNA，优选RNA。如果在来自实验样品的单独的孔/管中测定这些阳性对照，它们用作例如对照以确定逆转录和/或PCR反应是否有效，并且可能确定所应用的条件是否适当。另外，外源DNA或RNA(优选RNA)可以被掺入到实验样品、拭子等中，并且例如与目的(靶)基因平行地或优选以多重形式进行测定。这些对照反应可以评价，例如，样品或来源材料是否含有抑制逆转录和/或PCR的任何组分，或从例如拭子分离核酸例如RNA是否有效。
阳性对照可以是核酸序列，特别是来自SARS-CoV-2的RNA。这些可以例如作为合成衍生的病毒RNA获得，所述合成衍生的病毒RNA可以例如以试剂盒的形式购买，如EDX SARS-CoV-2Standard(http://www.exactdiagnostics.com/sars-cov-2-standard.html)。或者，可以通过化学方法、酶方法合成或者通过分子克隆或体外转录产生SARS-CoV-2，参见(https://www.twistbioscience.com/sites/default/files/resources/2020-03/Product％20Sheet％20_NGS_SyntheticSARS-CoV-2_RNAControls_17MAR20_Rev1.pdf。或者，可以通过技术人员已知的方法从SARS-CoV-2病毒分离病毒核酸。例如，人们可以使用商业上可获得的试剂盒，其裂解细胞，通过珠子或柱分离RNA，用盐和乙醇洗涤RNA，然后在水中洗脱纯化的RNA。例如，如前所述的SARS-CoV-2RNA也可以用于建立和/或测试本发明PCR方法的反应条件。
在本发明的上下文中，所述阳性对照可以优选是具有SEQ ID NO:10中示出的序列的核糖核酸、具有SEQ ID NO:11或23中示出的序列的核糖核酸、具有SEQ ID NO:12中示出的序列的核糖核酸。
根据本发明，本文描述了用于检测生物样品中的SARS-CoV-2病毒核酸的PCR方法，其比特别是来自德国Charite的测定(参见例如上文引用的Corman等人(2020))更特异。具体地，本发明人观察到当进行来自德国Charite的方案(参见上文引用的Corman等人(2020))时，特异性、特别是对SARS-CoV-2RdRP基因的特异性并不令人满意。如下文所述，本发明人尝试改进来自德国Charite的方案，并且他们成功了，尤其是由于使用了显着改进特异性的不同引物核苷酸序列。
即，关于SARS-CoV-2RdRP基因的检测，当使用表1中公开的引物核苷酸序列(SEQID NOs:14和15)和探针(SEQ ID NO:16)——孔名“P1eurofins”时，本发明人观察到重大的特异性问题。事实上，他们没有观察到Ct(dRn)。相应地，本发明人以不同的方式处理了这个特异性问题，并可以成功地解决它。
首先，他们将具有SEQ ID NO:16的探针的所有简并核苷酸转变为非简并的，即特异性核苷酸，由此获得具有SEQ ID NO:3的探针。使用引物核苷酸序列(SEQ ID NOs:14和15)和具有SEQ ID NO:3的探针——表1中孔名“P2 eurofins”——与“P1 eurofins”(完全没有Ct(dRn))相比，特异性(Ct(dRn)＝34.26)得到提高。
第二，由于34.26的特异性仍然不令人满意，本发明人将SEQ ID NOs:14和15的引物核苷酸序列的简并核苷酸转变为非简并的，即特异性核苷酸，由此获得分别具有SEQ IDNOs:1和13的引物核苷酸序列。使用这些引物核苷酸序列(SEQ ID NOs:1和13)与具有SEQID NO:3的探针一起——表1中孔名“R1 MDX”——与“P2 eurofins”(Ct(dRn)＝34.26)相比，特异性(Ct(dRn)＝32.89)进一步提高。
最后，为了尽力进一步提高“R1 MDX”的特异性(参见表1)，本发明人观察到具有SEQ ID NOs:1和2的引物核苷酸序列，在与具有SEQ ID NO:3的探针一起使用时——表1中孔名“R2 MDX”和“R2 new MDX”——与“R1 MDX”(Ct(dRn)＝32.89)相比，赋予更为提高的特异性(Ct(dRn)＝31.17和31.18)(参见表1)。
作为阴性对照，使用具有SEQ ID NOs:1和2的引物核苷酸序列，但不使用探针——孔名“R2 new MDX ntc”。图1中的相应曲线用空心正方形标记。
因此，仅从Charite方案(参见例如上文引用的Corman等人(2020))将简并引物核苷酸序列和/或简并探针转变为非简并引物核苷酸序列不足以改进SARS-CoV-RdRP基因的检测。还需要更多，因此本发明人提供一种新设计的用于SARS-CoV-2RdRP基因扩增步骤的反向引物核苷酸序列。
相应地，本发明提供了一种PCR方法，其包括至少用SEQ ID NOs:1和2中示出的引物核苷酸序列进行扩增步骤。
如上所述，本发明人发现，相对于通常使用的具有SEQ ID NOs:14和15的引物核苷酸序列、任选地与具有SEQ ID NO:3或16的探针一起，具有SEQ ID NOs:1和2的引物核苷酸序列、任选地与具有SEQ ID NO:3的探针一起，就检测SARS-CoV-2RdRP基因提供了改进得多的特异性。实际上，比较SARS-CoV-2E基因的30.21的Ct与SARS-CoV-2RdRP的31.17和31.18的Ct，显然，SARS-CoV-2E基因与SARS-CoV-2RdRP基因之间有小于一个Ct的差异。这是如本申请中描述的用于检测SARS-CoV-2的方法的显着改进。
还提供了引物，特别是SEQ ID NOs:1和2中示出的引物核苷酸序列，和用于检测SARS-CoV-2的探针，以及含有这些引物和/或探针的试剂盒。
PCR方法检测SARS-CoV-2的灵敏度增加以及PCR引物的特征改进，使得实施这种技术来准确且可靠地诊断SARS-CoV-2感染成为可能。
当在本文中使用时，术语“多核苷酸”、“核酸”或“核酸分子”应该被同义地解释。通常，核酸分子可尤其包括DNA分子(包括cDNA、互补DNA)、RNA分子(例如miRNA、mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、siRNA、scRNA、snoRNA和如本领域已知的其它)。此外，术语“核酸分子”可以是指DNA或RNA或其杂交体或本领域已知的其任何修饰，例如锁核酸(LNA)(例如参见US5525711、US 471 1955、US 5792608或EP 302175中的修饰实例)。多核苷酸序列可以是单链或双链的、线性或环状的、天然的或合成的，并且没有任何大小限制。例如，多核苷酸序列可以是基因组DNA、cDNA、线粒体DNA、mRNA、反义RNA、核糖体RNA或编码这些RNA或嵌合体(chimeroplast)的DNA(Gamper,Nucleic Acids Research,2000,28,4332-4339)。所述多核苷酸序列可以是载体、质粒或者病毒DNA或RNA的形式。本文还描述了与上述核酸分子互补的核酸分子和能够与本文所述核酸分子杂交的核酸分子。本文所述的核酸分子也可以是本发明上下文中的核酸分子的片段。特别地，这样的片段是功能片段。这种功能片段的实例是核酸分子，其可以用作引物。
当在本文中使用时，来自SARS-CoV-2的“基因”，例如在SARS-CoV-2E基因或SARS-CoV-2RdRP基因的上下文中，是指核苷酸序列，优选RNA，例如SARS-CoV-2E RNA或SARS-CoV-2RdRP RNA，其分别包含编码SARS-CoV-2E蛋白或SARS-CoV-2RdRP蛋白的开放阅读框(ORF)。“E”代表包膜蛋白，“RdRP”代表“RNA依赖的RNA聚合酶”。所述术语还包括来自SARS-CoV-2的基因的片段，例如长度为例如50、75、100、150或更多个核苷酸的RNA片段。有时，当在本文中使用时，术语“基因”在“SARS-CoV-2E”或“SARS-CoV-2RdRP”的上下文中省略。相应地，术语“SARS-CoV-2E”当在本文中使用时等同于“SARS-CoV-2E基因”，反之亦然，或者术语“SARS-CoV-2RdRP”当在本文中使用时等同于“SARS-CoV-2RdRP基因”，反之亦然。
类似地，当在本文中使用时，来自IBV(即乙型流感病毒)或IAV(即甲型流感病毒)的“基因”，例如在IBV PA基因或IAV PB1基因的上下文中，可以是指核苷酸序列，优选RNA，例如IBV PA RNA或IAV PB1 RNA，其分别包含编码IBV PA蛋白或IAV PB1蛋白的开放阅读框(ORF)。“PB1”代表RNA指导的RNA聚合酶催化亚基，“PA”代表“聚合酶酸性蛋白”。所述术语还包括来自IBV(即乙型流感病毒)或IAV(即甲型流感病毒)的基因的片段，例如长度为例如50、75、100、150或更多个核苷酸的RNA片段。有时，当在本文中使用时，术语“基因”在“IBVPA”或“IAV PB1”的上下文中省略。相应地，术语“IBV PA”当在本文中使用时等同于“IBV PA基因”，反之亦然，或者术语“IAV PB1”当在本文中使用时等同于“IAV PB1基因”，反之亦然。
当在本文中使用时，来自人的“基因”，例如RNA酶P基因，是指核苷酸序列，优选RNA，例如人RNA酶P RNA，其包含编码人RNA酶P蛋白的开放阅读框(ORF)。所述术语还包括来自人RNA酶P的基因的片段，例如长度为例如50、75、100、150或更多个核苷酸的RNA片段。有时，当在本文中使用时，术语“基因”在“人RNA酶P”的上下文中省略。因此，术语“人RNA酶P”当在本文中使用时等同于“人RNA酶P基因”，反之亦然。
由于SARS-CoV-2病毒是RNA病毒，根据本发明的PCR方法可以包括逆转录步骤，至少一个循环步骤，其包括扩增步骤和杂交步骤。当PCR反应的起始材料是RNA时，如在SARS-CoV-2的情况下，互补DNA(“cDNA”)经由反转录从RNA合成。然后使用PCR方案，例如如上文所述的一种，扩增所得cDNA。逆转录酶是本领域普通技术人员已知的，作为在逆转录病毒中发现的酶，其可以从作为模板的mRNA序列合成互补的DNA单链。用于扩增RNA产物的PCR被称为逆转录酶PCR或“RT-PCR”。“RT-PCR”是本发明的优选的PCR方法。
如本文中使用的术语“扩增子”可以是指作为PCR扩增的来源和产物的核酸。
相应地，本发明的PCR方法可以进一步包括用用于独特掺入RNA的至少引物核苷酸序列进行扩增步骤，优选同时扩增步骤。优选地，对于独特掺入RNA的扩增步骤与对于SARS-CoV-2RdRP基因的扩增步骤或对于SARS-CoV-2E基因的扩增步骤或对于人RNA酶P基因的扩增步骤同时进行。优选地，对于独特掺入RNA的扩增步骤与对于SARS-CoV-2E基因和人RNA酶P基因的扩增步骤或对于SARS-CoV-2RdRP基因和人RNA酶P基因的扩增步骤同时进行。优选地，对于独特掺入RNA的扩增步骤与对于SARS-CoV-2RdRP基因的扩增步骤、对于SARS-CoV-2E基因的扩增步骤和对于人RNA酶P基因的扩增步骤同时进行。如本文所解释的，独特掺入RNA优选地作为对照。
特别地，根据本发明的PCR方法，对于SARS-CoV-2RdRP基因的扩增步骤，至少使用SEQ ID NOs:1和2中示出的引物核苷酸序列。此外，根据本发明的PCR方法，对于SARS-CoV-2E基因的扩增步骤，至少使用SEQ ID Nos:4或22和5中示出的引物核苷酸序列。根据本发明的PCR方法，对于人RNA酶P基因的扩增步骤，至少使用SEQ ID NOs:7和8中示出的引物核苷酸序列。此外，根据本发明的PCR方法，对于独特掺入RNA的扩增步骤，至少使用SEQ ID NOs:17和18中示出的引物核苷酸序列。
如上所述，本发明涉及一种PCR方法，其包括至少用SEQ ID NOs:1和2中示出的引物核苷酸序列进行扩增步骤。特别地，使用SEQ ID Nos:1和2的引物扩增SARS-CoV-2RdRP基因。本发明的发明人设计并合成了适用于扩增来源于SARS-CoV-2病毒的核酸的PCR反应的引物寡核苷酸，得到了具有更高特异性的PCR方法。特别地，本发明人惊奇地发现，使用SEQID Nos:1和2的引物组合扩增SARS-CoV-2RdRP基因，得到对于SARS-CoV-2RdRP基因具有更高特异性的PCR方法(参见图1和表1)。特别地，SEQ ID NO:1的引物是正向引物，其通过将SEQ ID NO:14的引物核苷酸序列的简并核苷酸转变为非简并的即特异性核苷酸而生成，由此获得具有SEQ ID NO:1的引物核苷酸序列。在该引物中，基于700个已知的SARS-CoV-2基因组的共有序列，用核苷酸“A”置换了为扩增SARS-CoV-2RdRP基因而通常使用的混合碱基。SEQ ID NO:2的引物是用于扩增SARS-CoV-2RdRP基因的反向引物，本发明人设计了该引物，并且当与SEQ ID NO:1的正向引物一起使用时，他们观察到对德国Charite的已知且常用的PCR方法(参见例如上文引用的Corman等人(2020))的显着改进。本发明人惊奇地发现，以上定义的SEQ ID NO:1和2的引物组合得到了对于SARS-CoV-2核酸检测具有更好特异性的PCR方法。
本发明还涉及一种PCR方法，其进一步包括至少用SEQ ID NOs:4或22和5中示出的引物核苷酸序列进行扩增步骤。SEQ ID NOs:4或22和5的引物用于扩增SARS-CoV-2E基因。优选地，所述PCR方法是多重RT-PCR，其包括用至少SEQ ID Nos:1和2的引物以及至少SEQID NOs:7和8的引物同时进行扩增步骤。SEQ ID Nos:7和8的引物用于扩增人RNA酶P。
优选地，所述PCR方法是多重RT-PCR，其包括用至少SEQ ID Nos:1和2的引物、至少SEQ ID NO:4或22和5的引物以及至少SEQ ID NOs:7和8的引物同时进行扩增步骤。
此外，所述PCR方法可进一步包括至少用SEQ ID Nos:17和18中示出的引物核苷酸序列进行扩增步骤，以扩增本文其它地方定义的独特掺入RNA。
因此，还优选的是所述PCR方法是多重RT-PCR，其包括用至少SEQ ID Nos:1和2的引物以及至少SEQ ID NOs:17和18的引物同时进行扩增步骤。还优选的是所述PCR方法是多重RT-PCR，其包括用至少SEQ ID Nos:1和2的引物、至少SEQ ID Nos:4或22和5的引物以及至少SEQ ID NOs:17和18的引物同时进行扩增步骤。还优选的是所述PCR方法是多重RT-PCR，其包括用至少SEQ ID Nos:1和2的引物、至少SEQ ID Nos:4或22和5的引物、至少SEQID NOs:7和8的引物以及至少SEQ ID NOs:17和18的引物同时进行扩增步骤。
本发明的PCR方法进一步包括如本文中其它地方定义的探针，其包含SEQ ID NO:3中示出的核苷酸序列(用于扩增RdRP基因)。特别地，本发明人通过将具有SEQ ID NO:16的探针的所有简并核苷酸转变为非简并的即特异性核苷酸而生成了SEQ ID NO:3的探针，由此获得具有SEQ ID NO:3的探针。本发明的PCR方法进一步包括包含SEQ ID NO:6中示出的核苷酸序列的探针(用于扩增E基因)。本发明的PCR方法进一步包括包含SEQ ID NO:9中示出的核苷酸序列的探针(用于扩增人RNA酶P)。本发明的PCR方法进一步包括包含SEQ IDNO:19中示出的核苷酸序列的探针(用于扩增独特掺入RNA)。常用探针的实例是
Figure GDA0004222541930000361
探针、Molecular Beacon探针、/>
Figure GDA0004222541930000362
探针和/>
Figure GDA0004222541930000363
Green探针。在本发明的上下文中，优选使用/>
Figure GDA0004222541930000364
探针。TaqMan探针由共价连接到寡核苷酸探针5’端的荧光团和在3’端处的淬灭剂组成。几种不同的荧光团(例如6-羧基荧光素，首字母缩写：FAM，或四氯荧光素，首字母缩写：TET)和淬灭剂(例如四甲基罗丹明，首字母缩写：TAMRA，或Black Hole/>
Figure GDA0004222541930000365
Dyes)是可用的。特别地，在本发明的上下文中，SEQ IDNos:3和6的探针用FAM荧光团标记，SEQ ID Nos:9和19的探针用HEX荧光团标记。
此外，本发明的PCR方法还可进一步包括阳性对照，如本文中其它地方定义的，特别是具有SEQ ID NO:10中示出的序列的核糖核酸用作RdRP基因的阳性对照；具有SEQ IDNO:11或23中示出的序列的核糖核酸用作E基因的阳性对照；具有SEQ ID NO:12中示出的序列的核糖核酸用作人RNA酶P基因的阳性对照。
本发明还涉及一种试剂盒，例如，用于检测在本文其它地方定义的样品中的SARS-CoV-2核酸。所述试剂盒可以包含实施本发明方法所必需的组分。本发明的试剂盒可以包括至少一对用于扩增SARS-CoV-2核酸的特异性引物和至少一种与扩增产物特异性杂交的探针。试剂盒可以包括用于标记引物或探针的荧光部分，或者引物和探针已经用供体和相应的受体荧光部分标记。试剂盒还可以包括包装插页，其上具有使用引物、探针和荧光部分来检测样品中SARS-CoV-2核酸存在与不存在的说明书。在此上下文中，所述试剂盒至少包含SEQ ID NOs:1和2中示出的引物核苷酸序列，任选地包含SEQ ID NO:3中示出的核苷酸序列的探针，和任选地用于实施PCR扩增步骤的工具。所述工具是技术人员已知的，并且可以包括用于PCR方法的标准试剂，如PCR缓冲液、DNA聚合酶、镁MgCl2和水。所述试剂盒可进一步至少包含SEQ ID NOs:7和8中示出的引物核苷酸序列，和任选地包含SEQ ID NO:9中示出的核苷酸序列的探针。此外，所述试剂盒可以至少包含SEQ ID NOs:17和18中示出的引物核苷酸序列，和任选地包含SEQ ID NO:19中示出的核苷酸序列的探针。最后，所述试剂盒可进一步包含具有SEQ ID NO:10、和SEQ ID NO:11或23、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:20中示出的序列的核糖核酸。
本发明的另一方面是SEQ ID NOs:1和2中示出的引物核苷酸序列用于以下的用途：
(i)样品中SARS-CoV-2的体外检测，
(ii)受试者的SARS-CoV-2感染的体外检测，
(iii)血液样品的SARS-CoV-2污染的体外检测，或
(iv)体外监测SARS-CoV-2的治疗。
相应地，将包含SEQ ID NO:3中示出的核苷酸序列的探针与SEQ ID NOs:1和2中示出的引物一起用于所述体外检测。
如本文中使用的，术语“体外检测”是指在哺乳动物受试者的外部、即离体的检测，例如经由如本文中定义的PCR方法。如本文中使用的“体外监测SARS-CoV-2的治疗”是指伴随用于治疗SARS-CoV-2感染的疗法的伴随诊断。例如，可以控制来自接受这种疗法的患者的样品中SARS-CoV-2的存在或不存在，这可以指示该疗法的效果。
在一些方面/实施方案中，本发明涉及一种PCR方法，其包括用用于SARS-CoV-2RdRP的至少引物核苷酸序列、用于SARS-CoV-2E基因的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤，其中所述PCR方法是多重PCR，优选多重实时RT-PCR，进一步优选地，所述多重实时RT-PCR方法包括用对于SARS-CoV-2RdRP扩增子特异性的至少一种(例如两种不同的)探针、对于SARS-CoV-2E扩增子特异性的至少一种(例如两种不同的)探针和对于人RNA酶P扩增子特异性的至少一种(例如两种不同的)探针进行所述同时扩增步骤。
在一些方面/实施方案中，本发明涉及一种PCR方法，其包括：(i)第一PCR方法，所述第一PCR方法包括用用于SARS-CoV-2RdRP的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列，优选地用对于SARS-CoV-2RdRP扩增子特异性的至少一种(例如两种不同的)探针和对于人RNA酶P扩增子特异性的至少一种(例如两种不同的)探针，进行同时扩增步骤；和/或(ii)第二PCR方法，所述第二PCR方法包括用用于SARS-CoV-2E基因的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列，优选地用对于SARS-CoV-2E扩增子特异性的至少一种(例如两种不同的)探针和对于人RNA酶P扩增子特异性的至少一种(例如两种不同的)探针，进行同时扩增步骤，其中将怀疑包含SARS-CoV-2核酸的相同来源材料用于(i)和(ii)的PCR，其中所述第一和第二PCR方法是多重PCR方法，优选多重实时RT-PCR方法。
在一些方面/实施方案中，本发明涉及一种PCR方法，其包括：(i)第一PCR方法，所述第一PCR方法包括用用于SARS-CoV2 E基因的至少引物核苷酸序列和用于独特掺入RNA的至少引物核苷酸序列，优选地用对于SARS-CoV-2E扩增子特异性的至少一种(例如两种不同的)探针和对于独特掺入RNA扩增子特异性的至少一种(例如两种不同的)的探针，进行同时扩增步骤；(ii)第二PCR方法，所述第二PCR方法包括用用于SARS-CoV-2RdRP基因的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列，优选地用对于SARS-CoV-2RdRP扩增子特异性的至少一种(例如两种不同的)探针和对于人RNA酶P扩增子特异性的至少一种(例如两种不同的)探针，进行同时扩增步骤；和(iii)第三PCR方法，所述第三PCR方法包括用用于SARS-CoV-2RdRP基因的至少引物核苷酸序列、用于SARS-CoV-2E基因的至少引物核苷酸序列、用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列和用于独特掺入RNA的至少引物核苷酸序列，优选地用对于SARS-CoV-2RdRP扩增子特异性的至少一种(例如两种不同的)探针、对于SARS-CoV-2E扩增子特异性的至少一种(例如两种不同的)探针和对于人RNA酶P扩增子特异性的至少一种探针和对于独特掺入RNA扩增子特异性的至少一种探针，进行同时扩增步骤；其中将怀疑包含SARS-CoV-2核酸的相同来源材料用于(i)和(ii)的PCR方法，并且其中(iii)的PCR方法进一步包括作为阳性对照的用于SARS-CoV-2RdRP基因的核糖核酸、用于SARS-CoV-2E基因的核糖核酸、用于人RNA酶P的核糖核酸和用于独特掺入RNA的核糖核酸，其中所述第一、第二和第三PCR方法是多重PCR方法，优选多重实时RT-PCR方法。
在一些方面/实施方案中，本发明的PCR方法、试剂盒或用途包括用用于SARS-CoV-2RdRP的至少引物核苷酸序列、用于SARS-CoV-2E基因的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤，其中所述PCR方法是多重PCR。
在本发明的PCR方法、试剂盒或用途的一些方面/实施方案中，所述同时扩增步骤(例如一个或多个)进一步用用于甲型流感病毒的RNA指导的RNA聚合酶催化亚基蛋白(即PB1 IAV)的至少引物核苷酸序列和用用于乙型流感病毒的聚合酶酸性蛋白(即PA IBV)的至少引物核苷酸序列进行，优选地，所述PCR方法是多重PCR方法，进一步优选地，所述多重PCR方法是多重实时RT-PCR方法，最优选地，所述多重实时RT-PCR方法包括用对于所述PB1IAV扩增子特异性的至少一种(例如两种不同的)探针和对于PA IBV扩增子特异性的至少一种(例如两种不同的)探针进行所述同时扩增步骤。
在本发明的PCR方法、试剂盒或用途的一些方面/实施方案中，对于IAV PB1的扩增步骤，至少使用SEQ ID NOs:83-84或121-128、优选SEQ ID NOs:83-84中示出的引物核苷酸序列；进一步优选地，与选自SEQ ID NOs:85、129-131、优选SEQ ID NO:85的至少一种探针一起。
在本发明的PCR方法、试剂盒或用途的一些方面/实施方案中，对于PA IBV的扩增步骤，至少使用SEQ ID NOs:86-87或132-144、优选SEQ ID NOs:86-87中示出的引物核苷酸序列；进一步优选地，与选自SEQ ID NOs:88、145-153、优选SEQ ID NO:88的至少一种探针一起。
在本发明的PCR方法、试剂盒或用途的一些方面/实施方案中，对于SARS-CoV-2RdRP的扩增步骤，至少使用SEQ ID NOs:1和2、SEQ ID NOs:27和28、SEQ ID NOs:33和34、SEQ ID NOs:43和44、SEQ ID NOs:54和55、SEQ ID NOs:65和66、SEQ ID NOs:76和77、SEQID NOs:109和110、SEQ ID NOs:109和111或SEQ ID NOs:109和112中示出的引物核苷酸序列，优选地与选自SEQ ID NOs:29、35、45、46、56、57、67、68、78、79和113-120的至少一种(例如两种)探针、进一步优选地与选自SEQ ID NOs:45-46、SEQ ID NOs:56-57、67-68、78-79的两种部分重叠的(例如部分地包含相同的序列，但不相同的)探针一起。
在本发明的PCR方法、试剂盒或用途的一些方面/实施方案中，对于SARS-CoV-2E基因的扩增步骤，至少使用SEQ ID NOs:4或22和5、SEQ ID NOs:24-25、SEQ ID NOs:30-31、SEQ ID NO:39-40、50-51、61-62、72-73、或89-101中任一个与102中示出的引物核苷酸序列，优选地与选自SEQ ID NOs:26、32、41、42、52、53、63、64、74、75、103-108的至少一种(例如两种)探针、进一步优选地与选自SEQ ID NOs:41-42、SEQ ID NOs:52-53、63-64、74-75的两种探针一起。
在本发明的PCR方法、试剂盒或用途的一些方面/实施方案中，对于人RNA酶P的扩增步骤，至少使用SEQ ID NOs:7和8、或SEQ ID NOs:36-37、47-48、58-59、69-70、80-81或154-155中示出的引物核苷酸序列，优选地与选自SEQ ID NOs:38、49、60、71、82或156的至少一种探针一起。
在本发明的一些方面/实施方案中，所述PCR方法、试剂盒或用途包括：(i)包含SEQID NO:3中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:6中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:9中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:19中示出的核苷酸序列的探针；和/或(ii)包含SEQ ID NO:26中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:29中示出的核苷酸序列的探针，优选地与SEQ ID NOs:24-25和27-28中示出的引物核苷酸序列相组合；和/或(iii)包含SEQ ID NO:32中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:35中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:38中示出的核苷酸序列的探针，优选地与SEQ ID NOs:30-31、33-34和36-37中示出的引物核苷酸序列相组合；和/或(iv)包含SEQ ID NO:41中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:42中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:45中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:46中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQID NO:49中示出的核苷酸序列的探针，优选地与SEQ ID NOs:39-40、43-44、47-48中示出的引物核苷酸序列相组合；和/或(v)包含SEQ ID NO:52中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQID NO:53中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:56中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:57中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:60中示出的核苷酸序列的探针，优选地与SEQ ID NOs:50-51、54-55、58-59中示出的引物核苷酸序列相组合；和/或(vi)包含SEQ ID NO:63中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:64中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:67中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:68中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:71中示出的核苷酸序列的探针，优选地与SEQ ID NOs:61-62、65-66和69-70中示出的引物核苷酸序列相组合；和/或(vii)包含SEQ ID NO:74中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:75中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:78中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:79中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:82中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:85中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQID NO:88中示出的核苷酸序列的探针，优选地与SEQ ID NOs:72-73、76-77、80-81、83-84和86-87中示出的引物核苷酸序列相组合。
在本发明的一些方面/实施方案中，所述PCR方法、试剂盒或用途至少包含SEQ IDNOs:1和2或SEQ ID NOs:27-28、SEQ ID NOs:33-34、SEQ ID NOs:43-44、SEQ ID NOs:54-55、SEQ ID NOs:65-66、SEQ ID NOs:76-77、SEQ ID NOs:109-110、SEQ ID NOs:109和111或SEQ ID NOs:109和112中示出的引物核苷酸序列，任选地包含选自SEQ ID NO:3、SEQ IDNOs:29、35、45、46、56、57、67、68、78、79或113-120的核苷酸序列的至少一种(例如两种不同的)探针，优选地包含选自SEQ ID NOs:45-46、SEQ ID NOs:56-57、67-68、78-79的两种(例如部分重叠但不相同的)探针，以及进一步任选地用于实施PCR扩增步骤的工具，优选地，所述试剂盒是多重PCR试剂盒，优选地，所述多重PCR试剂盒是多重实时RT-PCR试剂盒。
在本发明的一些方面/实施方案中，所述PCR方法、试剂盒或用途至少包含SEQ IDNOs:4或22和5或SEQ ID NOs:24-25、SEQ ID NOs:30-31、SEQ ID NOs:39-40、50-51、61-62、72-73、或89-101中任一个与102的组合中示出的引物核苷酸序列，和任选地包含选自SEQID NO:6、SEQ ID NOs:26、32、41、42、52、53、63、64、74、75、103-108的核苷酸序列的至少一种(例如两种不同的)探针，优选地包含选自SEQ ID NOs:41-42、SEQ ID NOs:52-53、63-64、74-75的两种(例如不同的)探针。
在本发明的一些方面/实施方案中，所述PCR方法、试剂盒或用途至少包含SEQ IDNOs:7和8或SEQ ID NOs:36-37、47-48、58-59、69-70、80-81或154-155中示出的引物核苷酸序列，和任选地包含选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NOs:38、49、60、71、82或156的核苷酸序列的至少一种(例如两种，例如两种不同的)探针。
在本发明的一些方面/实施方案中，所述PCR方法、试剂盒或用途至少包含SEQ IDNOs:83-84或121-128、优选SEQ ID NOs:83-84中示出的引物核苷酸序列，任选地选自SEQID NOs:85、129-131、进一步优选SEQ ID NO:85的至少一种(例如两种，例如两种不同的)探针。
在本发明的一些方面/实施方案中，所述PCR方法、试剂盒或用途至少包括使用SEQID NOs:86-87或132-144、优选SEQ ID NOs:86-87中示出的引物核苷酸序列，任选地选自SEQ ID NOs:88、145-153、进一步优选SEQ ID NO:88的至少一种(例如两种，例如两种不同的)探针。
在本发明的一些方面/实施方案中，所述PCR方法、试剂盒或用途至少包括使用SEQID NOs:86-87或132-144、优选SEQ ID NOs:86-87中示出的引物核苷酸序列，任选地选自SEQ ID NOs:88、145-153、进一步优选SEQ ID NO:88的至少一种(例如两种，例如两种不同的)探针。
在本发明的一些方面/实施方案中，所述PCR方法、试剂盒或用途包括用靶向SARS-CoV-2的刺突(S)基因的至少引物核苷酸序列，优选地用具有SEQ ID NOs:157-158的引物，优选地用具有SEQ ID NO:161或162的探针，进行同时(例如多重)扩增步骤。
在本发明的一些方面/实施方案中，所述PCR方法、试剂盒或用途包括用靶向存在于SARS-CoV-2的B.1.1.7变异体/突变体中的两个突变(缺失)的至少引物核苷酸序列、优选地用具有SEQ ID NOs:159-160的引物，优选地用具有SEQ ID NO:161或162的探针，进行同时(例如多重)扩增步骤。
在本发明的PCR方法、试剂盒或用途的一些方面/实施方案中，所述引物和/或探针核苷酸序列包含一个或多个(例如2、3或4个)锁核酸(LNA)修饰的核苷酸(例如LNA是合成核酸类似物，其含有桥连的双环糖部分，例如核糖环的2’氧与4’碳之间的亚甲基键)，优选地，所述一个或多个(例如2、3或4个)LNA修饰的核苷酸是LNA修饰的胸腺嘧啶残基(例如LNA-T)和/或LNA修饰的腺苷残基(例如LNA-A)。
在一些方面/实施方案中，本发明涉及引物核苷酸序列的用途，其中所述引物序列：(a)在SEQ ID NOs:1-2或SEQ ID NOs:27-28、SEQ ID NOs:33-34、SEQ ID NOs:43-44、SEQ ID NOs:54-55、SEQ ID NOs:65-66、SEQ ID NOs:76-77、SEQ ID NOs:109-110、SEQ IDNOs:109和111、SEQ ID NOs:109和112中示出，优选地与选自SEQ ID NOs:29、35、45、46、56、57、67、68、78、79和113-120的至少一种(例如两种)探针一起，进一步优选地与选自SEQ IDNOs:45-46、SEQ ID NOs:56-57、67-68、78-79的两种部分重叠的探针(例如不相同的探针)一起；和/或(b)在SEQ ID NO:4或22和5、或SEQ ID NOs:24-25、SEQ ID NOs:30-31、SEQ IDNOs:39-40、50-51、61-62、72-73、89-101中任一个与102中示出，优选地与选自SEQ ID NOs:26、32、41、42、52、53、63、64、74、75、103-108的至少一种(例如两种)探针一起，进一步优选地与选自SEQ ID NOs:41-42、SEQ ID NOs:52-53、63-64、74-75的两种探针一起；和/或(c)在SEQ ID NOs:83-84或121-128、优选SEQ ID NOs:83-84中示出，进一步优选地与选自SEQID NOs:85、129-131、最优选SEQ ID NO:85的至少一种探针一起；和/或(d)在SEQ ID NOs:86-87或132-144、优选SEQ ID NOs:86-87中示出，进一步优选地与选自SEQ ID NOs:SEQ IDNOs:88、145-153、优选SEQ ID NO:88的至少一种探针一起；其中(a)、(b)、(c)和(d)的所述序列单独使用或彼此组合使用以用于以下中的一种或多种：(i)样品中SARS-CoV-2和/或IAV和/或IBV的体外检测(例如同时，例如多重检测)，(ii)受试者的SARS-CoV-2和/或IAV和/或IBV感染的体外检测(例如同时，例如多重检测)，(iii)血液样品的SARS-CoV-2和/或IAV和/或IBV污染的体外检测(例如同时，例如多重检测)，或(iv)体外监测(例如同时，例如多重监测)SARS-CoV-2和/或IAV和/或IBV的治疗，其中所述用途是用于多重PCR检测、优选多重实时RT-PCR检测的用途；(v)用于根据前述权利要求中任一项所述的PCR方法/在根据前述权利要求中任一项所述的PCR方法中使用，优选地，所述方法是体外或离体方法。
在本发明的PCR方法、试剂盒或用途的一些方面/实施方案中，是体外或离体PCR方法、试剂盒或用途。
在本发明的一些方面/实施方案中，本发明的PCR方法、试剂盒或用途涉及能够提高所述PCR方法、试剂盒或用途的灵敏度和特异性两者的双探针(例如组合使用的两种探针，例如，部分重叠的不相同的探针)。
在一些方面/实施方案中，本发明的PCR方法、试剂盒或用途可以是用于区分SARS-CoV-2与最常见的季节性流感的有用的诊断工具。
在一些方面/实施方案中，本发明的PCR方法、试剂盒或用途在室温下稳定长达一个月，从而提供了几种RT-qPCR检验中的消除了对冷链运输和储存需要的一种。
在一些方面/实施方案中，本发明的PCR方法、试剂盒或用途涉及本文实施例2中公开的合适的一步RT-qPCR条件。
在一些方面/实施方案中，本发明的PCR方法、试剂盒或用途涉及如本文实施例2中所述的阳性对照。
在一些方面/实施方案中，本发明的PCR方法、试剂盒或用途涉及表2，其公开了本发明的实施方案。
在一些方面/实施方案中，本发明的PCR方法、试剂盒或用途涉及表3，其公开了本发明的实施方案。
在一些方面/实施方案中，本发明的PCR方法、试剂盒或用途涉及表4，其公开了本发明的实施方案。
在一些方面/实施方案中，本发明的PCR方法、试剂盒或用途涉及表5，其公开了本发明的实施方案。
在一些方面/实施方案中，本发明的PCR方法、试剂盒或用途克服了不均匀的扩增/折叠、假阴性、某些特定靶标的低灵敏度和特异性和/或优先扩增、引物二聚体等，以及减少了已知与多重化PCR方法、试剂盒或用途相关的假阳性和假阴性读出。
在一些方面/实施方案中，本发明的PCR方法、试剂盒或用途包括阳性对照，其掺入面包酵母tRNA或鲑鱼精DNA(ssDNA)或两者，例如以作为用于核酸酶的诱饵并且然后与阳性对照一起冻干。
在本发明的一些方面/实施方案中，本发明的探针是水解探针，例如双重标记的探针。
在一些方面/实施方案中，双探针相对于单探针反应提高了本发明的方法和试剂盒的灵敏度和动态范围。
在一些方面/实施方案中，本发明的PCR方法、试剂盒或用途引入不同数量的LNA核苷酸(例如1、2、3、4、5等)，从而使得能够设计不与原始Charité正向引物重叠、同时保持足够的解链温度的较短引物(例如正向或反向的)。
在一些方面/实施方案中，LNA核苷酸可以如Madsen等人，2010(Org BiomolChem.2010Nov 7；8(21):5012-6)公开的合成。
在一些方面/实施方案中，本发明涉及一种PCR方法，其包括：(i)第一PCR方法，所述第一PCR方法包括用本文中公开的用于SARS-CoV2 E基因的至少引物核苷酸序列(任选地用本文中公开的探针)和本文中公开的用于IAV PB1基因的至少引物核苷酸序列(任选地用本文中公开的探针)和用于RNA酶P的至少引物核苷酸序列(任选地用本文中公开的探针)进行同时(多重)扩增步骤；(ii)第二PCR方法，所述第二PCR方法包括用本文中公开的用于SARS-CoV-2RdRP基因的至少引物核苷酸序列(任选地用本文中公开的探针)和本文中公开的用于IBV PA基因的至少引物核苷酸序列(任选地用本文中公开的探针)和用于RNA酶P的至少引物核苷酸序列(任选地用本文中公开的探针)进行同时(多重)扩增步骤。有利地，所述方法允许区分SARS-CoV-2、IAV和IBV。
在一些方面/实施方案中，本发明涉及一种PCR方法，其包括用本文中公开的用于SARS-CoV2 E基因和SARS-CoV-2RdRP基因(均用FAM标记)、IAV PB1和IBV PA基因(均用YY标记)和RNA酶P(Cy5)的至少引物和探针核苷酸序列进行同时(多重)扩增步骤。这允许区分SARS-CoV-2和流感(但不区分IAV和IBV)。
本发明的项目
本发明还可以通过以下项目来概括：
1.一种PCR方法，其包括用用于SARS-CoV-2RdRP的至少引物核苷酸序列、用于SARS-CoV-2E基因的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤，优选地，所述PCR方法是多重PCR方法，进一步优选地，所述多重PCR方法是多重实时RT-PCR方法，最优选地，所述多重实时RT-PCR方法包括在以下的存在下/用以下进行所述同时扩增步骤：对于SARS-CoV-2RdRP扩增子特异性的(例如互补的)至少一种(例如两种，例如两种部分重叠但不相同的探针)双重标记的(例如用染料/荧光团和/或淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针、对于SARS-CoV-2E扩增子特异性的(例如互补的)至少一种(例如两种，例如两种重叠探针)双重标记的(例如用染料/荧光团和/或淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针和对于人RNA酶P扩增子特异性的(例如互补的)至少一种双重标记的(例如用染料/荧光团和淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针。
2.一种PCR方法，其包括
(i)第一PCR方法，所述第一PCR方法包括用用于SARS-CoV-2RdRP的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列，优选地在以下的存在下/用以下，进行同时扩增步骤：对于SARS-CoV-2RdRP扩增子特异性的(例如互补的)至少一种(例如两种，例如两种部分重叠但不相同的探针)双重标记的(例如用染料/荧光团和/或淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针和对于人RNA酶P扩增子特异性的(例如互补的)至少一种双重标记的(例如用染料/荧光团和淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针，和/或
(ii)第二PCR方法，所述第二PCR方法包括用用于SARS-CoV-2E基因的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列，优选地在以下的存在下/用以下，进行同时扩增步骤：对于SARS-
CoV-2E扩增子特异性的(例如互补的)至少一种(例如两种)双重标记的(例如用染料/荧光团和/或淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)
水解探针和对于人RNA酶P扩增子特异性的(例如互补的)至少一种双重标记的(例如用染料/荧光团和淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针；
其中将怀疑包含SARS-CoV-2核酸的相同来源材料用于(i)和(ii)的所述PCR，优选地，其中所述第一和第二PCR方法是多重PCR方法，进一步优选地，所述第一和第二多重PCR方法是多重实时RT-PCR方法。
3.一种PCR方法，其包括
(i)第一PCR方法，所述第一PCR方法包括用用于SARS-CoV2 E基因的至少引物核苷酸序列和用于独特掺入RNA的至少引物核苷酸序列，优选地在以下的存在下/用以下，进行同时扩增步骤：对于SARS-
CoV-2E扩增子特异性的(例如互补的)至少一种(例如两种)双重标记的(例如用染料/荧光团和/或淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)
水解探针和对于所述独特掺入RNA特异性的(例如互补的)至少一种(例如两种)双重标记的(例如用染料/荧光团和淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针；
(ii)第二PCR方法，所述第二PCR方法包括用用于SARS-CoV-2RdRP基因的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列，优选地在以下的存在下/用以下，进行同时扩增步骤：对于SARS-
CoV-2RdRP扩增子特异性的(例如互补的)至少一种(例如两种，例如两种部分重叠但不相同的探针)双重标记的(例如用染料/荧光团和/或淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针和对于人RNA酶P扩增子特异性的(例如互补的)至少一种双重标记的(例如用染料/荧光团和淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针；和
(iii)第三PCR方法，所述第三PCR方法包括用用于SARS-CoV-2RdRP基因的至少引物核苷酸序列、用于SARS-CoV-2E基因的至少引物核苷酸序列、用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列和用于独特掺入RNA的至少引物核苷酸序列，优选地在以下的存在下/用以下，进行同时扩增步骤：对于SARS-CoV-2RdRP扩增子特异性的(例如互补的)至少一种(例如两种，例如两种重叠的探针)双重标记的(例如用染料/荧光团和/或淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针、对于SARS-CoV-2E扩增子特异性的(例如互补的)至少一种(例如两种)双重标记的(例如用染料/荧光团和/或淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针和对于人RNA酶P扩增子特异性的(例如互补的)至少一种双重标记的(例如用染料/荧光团和淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针和对于所述独特掺入RNA扩增子特异性的(例如互补的)至少一种双重标记的(例如用染料/荧光团和淬灭剂)
核苷酸序列(例如DNA)水解探针；
其中将怀疑包含SARS-CoV-2核酸的相同来源材料用于(i)和(ii)的所述PCR方法，和
其中(iii)中的所述PCR方法进一步包括作为阳性对照的用于SARS-CoV-2RdRP基因的核糖核酸、用于SARS-CoV-2E基因的核糖核酸、用于人RNA酶P的核糖核酸和用于独特掺入RNA的核糖核酸，优选地，其中所述第一、第二和第三PCR方法是多重PCR方法，进一步优选地，所述多重PCR方法是多重实时RT-PCR方法。
4.一种PCR方法，其包括
(i)第一PCR方法，所述第一PCR方法包括用用于SARS-CoV2 E基因的至少引物核苷酸序列、用于IAV PB1基因的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列，优选地在以下的存在下/用以下，进行同时(多重)扩增步骤：对于SARS-CoV-2E扩增子特异性的(例如互补的)至少一种(例如两种)双重标记的(例如用染料/荧光团和/或淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针、对于IAVPB1扩增子特异性的(例如互补的)至少一种(例如两种)双重标记的(例如用染料/荧光团和/或淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针和对于人RNA酶P扩增子特异性的(例如互补的)至少一种双重标记的(例如用染料/荧光团和淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)
水解探针；
(ii)第二PCR方法，所述第二PCR方法包括用用于SARS-CoV-2RdRP基因的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列和用于IBV PA的至少引物核苷酸序列，优选地在以下的存在下/用以下，进行同时(多重)扩增步骤：对于SARS-CoV-2RdRP扩增子特异性的(例如互补的)至少一种(例如两种，例如两种部分重叠但不相同的探针)双重标记的(例如用染料/荧光团和/或淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针和对于人RNA酶P扩增子特异性的(例如互补的)至少一种双重标记的(例如用染料/荧光团和淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针和对于IBV PA扩增子特异性的(例如互补的)至少一种双重标记的(例如用染料/荧光团和淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针。
5.一种PCR方法，其包括用用于SARS-CoV-2RdRP的至少引物核苷酸序列、用于SARS-CoV-2E基因的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列、用于IBVPA的至少引物核苷酸序列和用于IAV PB1的至少引物核苷酸序列，优选地在以下的存在下/用以下，进行同时扩增步骤：对于SARS-CoV-2E扩增子特异性的(例如互补的)至少一种(例如两种)双重标记的(例如用染料/荧光团和/或淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针、对于IAV PB1扩增子特异性的(例如互补的)至少一种(例如两种)双重标记的(例如用染料/荧光团和/或淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针和对于人RNA酶P扩增子特异性的(例如互补的)至少一种双重标记的(例如用染料/荧光团和淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针、对于SARS-CoV-2RdRP扩增子特异性的(例如互补的)至少一种(例如两种，例如两种部分重叠但不相同的探针)双重标记的(例如用染料/荧光团和/或淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针和对于IBV PA扩增子特异性的(例如互补的)至少一种双重标记的(例如用染料/荧光团和淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针。
6.前述项目中任一项所述的PCR方法，其进一步包括用用于甲型流感病毒(IAV)的RNA指导的RNA聚合酶催化亚基蛋白(即PB1，例如具有UniProtKB-Q7TGB8，例如GenBank：AJ564806.1)的至少引物核苷酸序列和用用于乙型流感病毒(IBV)的聚合酶酸性蛋白(即PA，例如UniProtKB-Q9QLI4，例如GenBank：AF102023.1)的至少引物核苷酸序列进行所述同时扩增步骤(一个或多个)，优选地，所述PCR方法是多重PCR方法，进一步优选地，所述多重PCR方法是多重实时RT-PCR方法，最优选地，所述多重实时RT-PCR方法包括在以下的存在下/用以下，进行所述同时扩增步骤：对于所述IAV的PB1扩增子特异性的(例如互补的)至少一种(例如两种)双重标记的(例如用染料/荧光团和淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针和对于所述IBV的PA扩增子特异性的(例如互补的)至少一种(例如两种)双重标记的(例如用染料/荧光团和淬灭剂)核苷酸序列(例如DNA)水解探针。
7.前述项目中任一项所述的PCR方法，其进一步包括用用于独特掺入RNA的至少引物核苷酸序列进行扩增步骤，优选同时扩增步骤，优选地，其中所述PCR方法是多重PCR，进一步优选地，所述多重PCR是多重实时RT-PCR方法。
8.前述项目中任一项所述的PCR方法，其中对于SARS-CoV-2RdRP的扩增步骤，至少使用SEQ ID NOs:1和2、SEQ ID NOs:27和28、SEQ ID NOs:33和34、SEQ ID NOs:43和44、SEQID NOs:54和55、SEQ ID NOs:65和66、SEQ ID NOs:76和77、SEQ ID NOs:109和110、SEQ IDNOs:109和111或SEQ ID NOs:109和112中示出的引物核苷酸序列。
9.前述项目中任一项所述的PCR方法，其中对于SARS-CoV-2RdRP的扩增步骤，在选自SEQ ID NOs:29、35、45、46、56、57、67、68、78、79和113-120的至少一种水解探针的存在下，优选地在选自SEQ ID NOs:45-46、SEQ ID NOs:56-57、67-68、78-79的两种(例如重叠的)水解探针的存在下，至少使用SEQ ID NOs:1和2、SEQ ID NOs:27和28、SEQ ID NOs:33和34、SEQ ID NOs:43和44、SEQ ID NOs:54和55、SEQ ID NOs:65和66、SEQ ID NOs:76和77、SEQ ID NOs:109和110、SEQ ID NOs:109和111或SEQ ID NOs:109和112中示出的引物核苷酸序列。
10.前述项目中任一项所述的PCR方法，其中对于SARS-CoV-2E基因的扩增步骤，至少使用SEQ ID NOs:4或22和5、SEQ ID NOs:24-25、SEQ ID NOs:30-31、SEQ ID NO:39-40、50-51、61-62、72-73、或89-101中任一个与102中示出的引物核苷酸序列。
11.前述项目中任一项所述的PCR方法，其中对于SARS-CoV-2E基因的扩增步骤，在选自SEQ ID NOs:26、32、41、42、52、53、63、64、74、75、103-108的至少一种水解探针的存在下，优选地在选自SEQ ID NOs:41-42、SEQ ID NOs:52-53、63-64、74-75的两种(例如重叠的)水解探针的存在下/与选自SEQ ID NOs:41-42、SEQ ID NOs:52-53、63-64、74-75的两种(例如重叠的)水解探针一起，至少使用SEQ ID NOs:4或22和5、SEQ ID NOs:24-25、SEQ IDNOs:30-31、SEQ ID NO:39-40、50-51、61-62、72-73、或89-101中任一个与102中示出的引物核苷酸序列。
12.前述项目中任一项所述的PCR方法，其中对于人RNA酶P的扩增步骤，至少使用SEQ ID NOs:7和8、SEQ ID NOs:36-37、47-48、58-59、69-70、80-81或154-155中示出的引物核苷酸序列。
13.前述项目中任一项所述的PCR方法，其中对于人RNA酶P的扩增步骤，在选自SEQID NOs:38、49、60、71、82或156的至少一种水解探针的存在下，至少使用SEQ ID NOs:7和8、SEQ ID NOs:36-37、47-48、58-59、69-70、80-81或154-155中示出的引物核苷酸序列。
14.前述项目中任一项所述的PCR方法，其中对于IAV的PB1的扩增步骤，至少使用SEQ ID NOs:83-84或121-128、优选SEQ ID NOs:83-84中示出的引物核苷酸序列。
15.前述项目中任一项所述的PCR方法，其中对于IAV的PB1的扩增步骤，在选自SEQID NOs:85、129-131、优选SEQ ID NO:85的至少一种水解探针的存在下，至少使用SEQ IDNOs:83-84或121-128中示出的引物核苷酸序列。
16.前述项目中任一项所述的PCR方法，其中对于PA IBV的扩增步骤，至少使用SEQID NOs:86-87或132-144、优选SEQ ID NOs:86-87中示出的引物核苷酸序列。
17.前述项目中任一项所述的PCR方法，其中对于PA IBV的扩增步骤，在选自SEQID NOs:88、145-153、优选SEQ ID NO:88的至少一种探针的存在下，至少使用SEQ ID NOs:86-87或132-144中示出的引物核苷酸序列。
18.前述项目中任一项所述的PCR方法，其中对于独特掺入RNA的扩增步骤，至少使用SEQ ID NOs:17和18中示出的引物核苷酸序列。
19.一种PCR方法，其包括至少用SEQ ID NOs:1和2中示出的引物核苷酸序列进行扩增步骤，优选地，所述PCR方法是多重PCR方法，进一步优选地，所述多重PCR方法是多重实时RT-PCR方法。
20.项目9所述的PCR方法，其进一步包括至少用SEQ ID NOs:4或22和5中示出的引物核苷酸序列进行扩增步骤。
21.项目17或18所述的PCR方法，其包括至少用SEQ ID NOs:7和8中示出的引物核苷酸序列同时进行扩增步骤。
22.前述项目中任一项所述的PCR方法，其中对于独特掺入RNA的扩增步骤，至少使用SEQ ID NOs:17和18中示出的引物核苷酸序列。
23.前述项目中任一项所述的PCR方法，其进一步包括包含SEQ ID NO:3中示出的核苷酸序列的探针。
24.前述项目中任一项所述的PCR方法，其进一步包括包含SEQ ID NO:6中示出的核苷酸序列的探针。
25.前述项目中任一项所述的PCR方法，其进一步包括包含SEQ ID NO:9中示出的核苷酸序列的探针。
26.前述项目中任一项所述的PCR方法，其进一步包括包含SEQ ID NO:19中示出的核苷酸序列的探针。
27.前述项目中任一项所述的PCR方法，其中使用具有SEQ ID NO:10中示出的序列的核糖核酸作为阳性对照。
28.前述项目中任一项所述的PCR方法，其中使用具有SEQ ID NO:11或23中示出的序列的核糖核酸作为阳性对照。
29.前述项目中任一项所述的PCR方法，其中使用具有SEQ ID NO:12中示出的序列的核糖核酸作为阳性对照。
30.前述项目中任一项所述的PCR方法，其中使用具有SEQ ID NO:20中示出的序列的核糖核酸作为掺入RNA。
31.前述项目中任一项所述的PCR方法，其为实时RT-PCR(例如多重实时RT-PCR)，优选地，所述实时RT-PCR方法为一步实时RT-qPCR(RT-定量PCR)方法(例如多重一步实时RT-qPCR方法)，进一步优选地，所述一步实时RT-qPCR方法包括以下步骤：
(i)在约50℃至约55℃的温度下孵育样品约10-30分钟(例如10、15、
20、25或30分钟)；
(ii)在约95℃的温度下孵育所述样品约3-10分钟(例如3、4、5、6、7、
8、9或10分钟)；和/或
(iii)PCR扩增所述样品约40-45个循环，其中每个循环包括(或由以下组成)：
(a)在约95℃的温度下孵育所述样品约5-15秒(例如5、10或15秒)，和
(b)在约58℃至约60℃的温度下孵育所述样品约20-30秒(例如20、25或30秒)。
32.前述项目中任一项所述的PCR方法，其是多重PCR，优选是多重实时RT-PCR。
33.一种试剂盒，其至少包含SEQ ID NOs:1和2或SEQ ID NOs:27-28、SEQ ID NOs:33-34、SEQ ID NOs:43-44、SEQ ID NOs:54-55、SEQ ID NOs:65-66、SEQ ID NOs:76-77、SEQID NOs:109-110、SEQ ID NOs:109和111或SEQ ID NOs:109和112中示出的引物核苷酸序列，任选地包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NOs:29、35、45、46、56、57、67、68、78、79或113-120中示出的核苷酸序列的至少一种探针，优选地包含选自SEQ ID NOs:45-46、SEQ ID NOs:56-57、67-68，78-79的两种(例如部分重叠的)探针，以及任选地用于实施PCR扩增步骤的工具，优选地，所述试剂盒是多重PCR试剂盒，优选地，所述多重PCR试剂盒是多重实时RT-PCR试剂盒。
34.项目31所述的试剂盒，其进一步至少包含SEQ ID NOs:4或22和5或SEQ IDNOs:24-25、SEQ ID NOs:30-31、SEQ ID NOs:39-40、50-51、61-62、72-73、或89-101中任一个与102中示出的引物核苷酸序列，和任选地包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NOs:26、32、41、42、52、53、63、64、74、75、103-108中示出的核苷酸序列的至少一种探针，优选地包含选自SEQ ID NOs:41-42、SEQ ID NOs:52-53、63-64、74-75的两种(例如重叠的)探针。
35.前述项目中任一项所述的试剂盒，其进一步至少包含SEQ ID NOs:7和8或SEQID NOs:36-37、47-48、58-59、69-70、80-81或154-155中示出的引物核苷酸序列，和任选地包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NOs:38、49、60、71、82或156中示出的核苷酸序列的至少一种探针。
36.前述项目中任一项所述的试剂盒，其进一步至少包含SEQ ID NOs:83-84或121-128、优选SEQ ID NOs:83-84中示出的引物核苷酸序列，任选地选自SEQ ID NOs:85、129-121、进一步优选SEQ ID NO:85的至少一种探针。
36.前述项目中任一项所述的试剂盒，其进一步至少包括使用SEQ ID NOs:86-87或132-144、优选SEQ ID NOs:86-87中示出的引物核苷酸序列，任选地选自SEQ ID NOs:88、145-153、进一步优选SEQ ID NO:88的至少一种探针。
37.前述项目中任一项所述的试剂盒，其进一步至少包含SEQ ID NOs:17和18中示出的引物核苷酸序列，和任选地包含SEQ ID NO:19中示出的核苷酸序列的探针。
38.前述项目中任一项所述的试剂盒，其进一步包含具有SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11或23、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:20中示出的序列的核糖核酸。
39.引物核苷酸序列的用途，其中所述引物序列：
(a)在SEQ ID NOs:1-2或SEQ ID NOs:27-28、SEQ ID NOs:33-34、SEQID NOs:43-44、SEQ ID NOs:54-55、SEQ ID NOs:65-66、SEQ IDNOs:76-77、SEQ ID NOs:109-110、SEQID NOs:109和111、SEQ ID NOs:109和112中示出，优选地与选自SEQ ID NOs:29、35、45、46、56、57、67、68、78、79和113-120的至少一种(例如两种)探针一起，进一步优选地与选自SEQID NOs:45-46、SEQ ID NOs:56-57、67-68、78-79的两种部分重叠的探针(例如不相同的探针)一起；和/或
(b)在SEQ ID NO:4或22和5、或SEQ ID NOs:24-25、SEQ ID NOs:30-31、SEQ IDNOs:39-40、50-51、61-62、72-73、89-101中任一个与102中示出，优选地与选自SEQ ID NOs:26、32、41、42、52、53、63、64、74、75、103-108的至少一种(例如两种)探针一起，进一步优选地与选自SEQ ID NOs:41-42、SEQ ID NOs:52-53、63-64、74-75的两种探针一起；和/或
(c)在SEQ ID NOs:83-84或121-128、优选SEQ ID NOs:83-84中示出，进一步优选地与选自SEQ ID NOs:85、129-131、最优选SEQ ID NO:85的至少一种探针一起；
(d)在SEQ ID NOs:86-87或132-144、优选SEQ ID NOs:86-87中示出，进一步优选地与选自SEQ ID NOs:SEQ ID NOs:88、145-153、优选SEQ ID NO:88的至少一种探针一起；
其中(a)、(b)、(c)和(d)的所述序列单独使用或彼此组合使用以用于以下中的一种或多种：
(i)样品中SARS-CoV-2和/或IAV和/或IBV的体外检测(例如同时，例如多重检测)，
(ii)受试者的SARS-CoV-2和/或IAV和/或IBV感染的体外检测(例如同时，例如多重检测)，
(iii)血液样品的SARS-CoV-2和/或IAV和/或IBV污染的体外检测(例如同时，例如多重检测)，或
(iv)体外监测(例如同时，例如多重监测)SARS-CoV-2和/或IAV和/或IBV的治疗，
其中所述用途是用于多重PCR检测、优选多重实时RT-PCR检测的用途；
(v)用于根据前述权利要求中任一项所述的PCR方法/在根据前述权利要求中任一项所述的PCR方法中使用，优选地，所述方法是体外或离体方法。
40.前述项目中任一项所述的的用途，其中进一步使用包含SEQ ID NO:3中示出的核苷酸序列的探针进行所述体外检测。
41.前述项目中任一项所述的PCR方法、试剂盒或用途，其中所述PCR方法是多重实时RT-PCR方法，优选一步多重实时RT-qPCR(RT-定量PCR)方法，进一步优选地，所述一步多重实时RT-qPCR方法包括以下步骤：
(i)在约50℃至约55℃的温度下孵育样品约10-30分钟(例如10、15、20、25或30分钟)；
(ii)在约95℃的温度下孵育所述样品约3-10分钟(例如3、4、5、6、7、8、9或10分钟)；和/或
(iii)PCR扩增所述样品约40-45个循环，其中每个循环包括(或由以下组成)：
(a)在约95℃的温度下孵育所述样品约5-15秒(例如5、10或15秒)，和
(b)在约58℃至约60℃的温度下孵育所述样品约20-30秒(例如20、25或30秒)。
42.前述项目中任一项所述的PCR方法、试剂盒或用途，其中所述引物和/或探针核苷酸序列包含一个或多个(例如2、3或4个)锁核酸(LNA)修饰的核苷酸(例如LNA是合成核酸类似物，其含有桥连的双环糖部分，例如核糖环的2’氧与4’碳之间的亚甲基键)，优选地，所述一个或多个(例如2、3或4个)LNA修饰的核苷酸能够使3’端和/或5’端稳定、使错配碱基稳定以进行等位基因(例如SNP)分型和/或提高所述引物和/或探针的解链温度，进一步优选地，所述一个或多个(例如2、3或4个)LNA修饰的核苷酸是LNA修饰的胸腺嘧啶残基(例如LNA-T)和/或LNA修饰的腺苷残基(例如LNA-A)。
43.根据前述项目中任一项所述的PCR方法、试剂盒或用途，其包括用至少一种探针进行同时(例如多重)扩增步骤，优选地，所述探针在5’端衍生有荧光团(例如荧光素(FAM)、Yakima黄(YY)、Cy5、HEX)和在3’端衍生有能够吸收能量而不发射荧光的淬灭剂(例如Black Hole Quencher 1、2、3(BHQ1、BHQ2、BHQ3)。
44.根据前述项目中任一项所述的PCR方法、试剂盒或用途，其包括用两种探针进行同时(例如多重)扩增步骤，优选地，所述探针在5’端衍生有荧光团(例如荧光素(FAM)、Yakima黄(YY)、Cy5、HEX)和在3’端衍生有能够吸收能量而不发射荧光的淬灭剂(例如BlackHole Quencher 1、2、3(BHQ1、BHQ2、BHQ3)。
45.根据前述项目中任一项所述的PCR方法、试剂盒或用途，其中所述PCR方法、试剂盒或用途包含选自SEQ ID NOs:1-156的一种或多种引物或/和探针核苷酸序列，优选地，所述探针核苷酸序列在5’端衍生有荧光团(例如荧光素(FAM)、Yakima黄(YY)、Cy5、HEX)和在3’端衍生有能够吸收能量而不发射荧光的淬灭剂(例如Black Hole Quencher 1、2、3(BHQ1、BHQ2、BHQ3)。
46.根据前述项目中任一项所述的PCR方法、试剂盒或用途，其包括添加核酸诱饵(例如添加至PCR反应混合物，例如阳性对照PCR反应混合物，例如冻干的阳性对照PCR反应混合物)，优选地以面包酵母tRNA和/或鲑鱼精DNA的形式。
47.根据前述项目中任一项所述的PCR方法、试剂盒或用途，其中所述PCR方法、试剂盒或用途是诊断性PCR方法、试剂盒或用途。
48.根据前述项目中任一项所述的PCR方法、试剂盒或用途，其中所述PCR方法、试剂盒或用途是体外或离体PCR方法、试剂盒或用途。
49.根据前述项目中任一项所述的PCR方法、试剂盒或用途，其中所述PCR方法、试剂盒或用途用于诊断病毒性疾病，优选地，所述病毒性疾病选自：SARS-CoV-2、甲型流感病毒(IAV)和乙型流感病毒(IBV)，进一步优选用于同时(例如多重)诊断SARS-CoV-2、甲型流感病毒(IAV)和/或乙型流感病毒(IBV)。
50.根据前述项目中任一项所述的PCR方法、试剂盒或用途，其中所述引物和/或探针核苷酸序列包含一个或多个(例如2、3或4个)锁核酸(LNA)修饰的核苷酸(例如LNA是合成核酸类似物，其含有桥连的双环糖部分，例如核糖环的2’氧与4’碳之间的亚甲基键)，优选地，所述一个或多个(例如2、3或4个)LNA修饰的核苷酸是LNA修饰的胸腺嘧啶残基(例如LNA-T)和/或LNA修饰的腺苷残基(例如LNA-A)。
51.根据前述项目中任一项所述的PCR方法、试剂盒或用途，其进一步包括用靶向SARS-CoV-2的刺突(S)基因的至少引物核苷酸序列、优选用具有SEQ ID NOs:157-158的引物，优选地用具有SEQ ID NO:161或162的探针，进行同时扩增步骤。
52.根据前述项目中任一项所述的PCR方法、试剂盒或用途，其进一步包括用靶向存在于SARS-CoV-2的B.1.1.7变异体/突变体中的两个突变(缺失)的至少引物核苷酸序列、优选用具有SEQ ID NOs:159-160的引物，优选地用具有SEQ ID NO:161或162的探针，进行同时扩增步骤。
53.一种引物和/或探针核苷酸序列，其包含选自以下的核苷酸序列或由选自以下的核苷酸序列组成：SEQ ID NOs:1-162，优选地，所述探针核苷酸序列在5’端衍生有荧光团(例如荧光素(FAM)、Yakima黄(YY)、Cy5、HEX)和在3’端衍生有能够吸收能量而不发射荧光的淬灭剂(例如Black Hole Quencher 1、2、3(BHQ1、BHQ2、BHQ3)。
54.根据前述项目中任一项所述的引物和/或探针核苷酸序列，其中所述引物和/或探针核苷酸序列包含一个或多个(例如2、3或4个)锁核酸(LNA)修饰的核苷酸(例如LNA是合成核酸类似物，其含有桥连的双环糖部分，例如核糖环的2’氧与4’碳之间的亚甲基键)，优选地，所述一个或多个(例如2、3或4个)LNA修饰的核苷酸能够使3’端和/或5’端稳定、使错配碱基稳定以进行等位基因(例如SNP)分型和/或提高所述引物和/或探针的解链温度，进一步优选地，所述一个或多个(例如2、3或4个)LNA修饰的核苷酸是LNA修饰的胸腺嘧啶残基(例如LNA-T)和/或LNA修饰的腺苷残基(例如LNA-A)。
55.根据前述项目中任一项所述的引物和/或探针核苷酸序列，其用于诊断病毒性疾病的方法中。
56.根据前述项目中任一项所述的引物和/或探针核苷酸序列，其用于诊断病毒性疾病的方法中，其中所述病毒性疾病选自：SARS-CoV-2、甲型流感病毒(IAV)和乙型流感病毒(IBV)，进一步优选用于同时(例如多重)诊断SARS-CoV-2、甲型流感病毒(IAV)和/或乙型流感病毒(IBV)的方法中。
57.根据前述项目中任一项所述的引物和/或探针核苷酸序列，其用于根据前述项目中任一项所述的方法中，优选地，其中所述方法是诊断病毒性疾病的方法，进一步优选地，所述病毒性疾病选自：SARS-CoV-2、甲型流感病毒(IAV)和乙型流感病毒(IBV)，最优选地，所述方法是同时(例如多重)诊断SARS-CoV-2、甲型流感病毒(IAV)和/或乙型流感病毒(IBV)的方法。
***
除非另外说明，否则本文件、包括说明书和权利要求书中使用的以下术语具有以下给出的定义。
本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。这些等同方案也意图被本发明涵盖。
应当注意，如本文中使用，单数形式“一个”、“一种”和“所述/该”包括复数指代，除非上下文另外清楚地指明。因此，例如，提及“一种试剂”包括一种或多种这样的不同试剂，并且提及“该方法”包括提及本领域普通技术人员已知的等同步骤和方法，其可以被修改或替代本文所述的方法。
除非另外说明，否则在一系列要素之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每个要素。本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。这些等同方案也意图被本发明涵盖。
术语“和/或”无论在本文何处使用，都包括“和”、“或”和“由所述术语连接的要素的全部或任何其它组合”的含义。
如本文中使用，术语“约”或“大约”是指在给定值或范围的20％内，优选10％内，并且更优选5％内。然而，它也包括具体的数字，例如约20包括20。
在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另外要求，词语“包括”及变体例如“包含”和“含有”应理解为暗示包括所述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其它整数或步骤或者整数或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含”可以用术语“含有”或“包括”代替，或者有时当在本文中使用时用术语“具有”代替。
当在本文中使用时，“由……组成”排除权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由……组成”不排除实质上不影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。
在本文的每种情况下，术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任一个可以用其它两个术语中的任一个来代替。
应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案、材料、试剂和物质等，并且本身可以变化。本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。
本说明书全文中引用的所有出版物(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、使用说明等)均以其全文通过引用并入本文。本文中没有任何内容被解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于这些公开。在通过引用并入的材料与本说明书矛盾或不一致的程度上，本说明书将取代任何这样的材料。
实施例
以下实施例说明本发明。这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。包括这些实施例是为了说明的目的，本发明仅由权利要求书限定。
实施例1：用于检测SARS-CoV-2基因的实时RT-PCR
从Exact Diagnostics(http://www.exactdiagnostics.com/sars-cov-2-standard.html)获得了合成的SARS-CoV-2RNA。使用Brilliant III Ultra-Fast qRT-PCRMaster Mix(Agilent,Catalog#600884)进行了实时RT-PCR。根据制造商的说明书制备反应混合物：1x qRT-PCR反应混合物，1mM DTT，30nM ROX参考染料，1μl RT/RNA酶抑制剂(block)(浓度不是供应商规定的)，2μl寡聚物混合物(在用于E基因的qRT-PCR反应混合物中的终浓度：400nM正向引物，400nM反向引物，200nM探针；在用于RdRP基因的qRT-PCR反应混合物中的终浓度：600nM正向引物，800nM反向引物，100nM探针)，5μl合成的RNA(SARS-CoV-2的E、N、S、ORF1ab、和RdRP转录物，每种200,000个拷贝/ml)，无核酸酶的PCR级H2O至20μl的终体积。反应一式三份地进行，ROX用作被动(passive)参考染料。随后在AgilentStratagene Mx3005P实时PCR仪(Agilent Technologies)上在以下条件下进行实时RT-PCR：cDNA合成(逆转录)为50℃10分钟，初始变性为95℃3分钟，然后是95℃10秒和58℃20秒的45个循环，在每个退火/延伸步骤中进行荧光检测。获得数据并使用Mx3005P软件(Agilent Technologies)分析。
表1显示了当通过使用表1之外所示的引物和探针进行根据本发明的PCR方法时的检验和相应结果。
阈值
Figure GDA0004222541930000601
Figure GDA0004222541930000611
E＝SEQ ID NO:4和5中示出的SARS-CoV-2 E基因引物核苷酸序列，SEQ ID NO:6中示出的探针(图1中用实心圆标记的曲线)
R1 MDX＝SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:13中示出的SARS-CoV-2 RdRP引物核苷酸序列，SEQ ID NO:3中示出的探针(图1中用实心正方形标记的曲线)
R2 MDX＝SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中示出的SARS-CoV-2RdRP引物核苷酸序列，SEQ ID NO:3中示出的探针(图1中用实心三角形标记的曲线)
R2 new MDX＝SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中示出的SARS-CoV-2 RdRP引物核苷酸序列，SEQ ID NO:3中示出的探针(除了使用新一批合成的引物核苷酸序列外，与“R2 MDX”相同)(图1中用实心菱形标记的曲线)
P1 eurofins＝SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15中示出的SARS-CoV-2 RdRP引物核苷酸序列，SEQ ID NO:16中示出的探针(图1中用实心星号标记的曲线)
P2 eurofins＝SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15中示出的SARS-CoV-2 RdRP引物核苷酸序列，SEQ ID NO:3中示出的探针(图1中用空心菱形标记的曲线)
R2 new MDX＝SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中示出的SARS-CoV-2 RdRP引物核苷酸序列(图1中用空心正方形标记的曲线)
从图1中可以明显看出，通过RT-PCR使用引物核苷酸序列(SEQ ID NOs:4和5)和具有SEQ ID NO:6的探针——表1中孔名“E”——检测SARS-CoV-2E基因工作适当(Ct(dRN)＝30.21)(图1中的曲线用实心圆标记)。
关于SARS-CoV-2 RdRP基因的检测，当使用公开的引物核苷酸序列(SEQ ID NOs:14和15)和探针(SEQ ID NO:16)时——表1中孔名“P1eurofins”，本发明人观察到了重大的特异性问题。实际上，他们没有观察到Ct(dRn)。图1中的相应曲线用实心星号标记。
本发明人以不同的方式处理了这个特异性问题，并可以成功地解决它。
首先，他们将具有SEQ ID NO:16的探针的所有简并核苷酸转变为非简并的，即特异性核苷酸，由此获得具有SEQ ID NO:3的探针。使用引物核苷酸序列(SEQ ID NOs:14和15)和具有SEQ ID NO:3的探针——表1中孔名“P2 eurofins”——与“P1 eurofins”(完全没有Ct(dRn))相比，特异性(Ct(dRn)＝34.26)得到提高。图1中的相应曲线用空心菱形标记。
第二，由于34.26的特异性仍然不令人满意，本发明人将SEQ ID NOs:14和15的引物核苷酸序列的简并核苷酸转变为非简并的，即特异性核苷酸，由此获得分别具有SEQ IDNOs:1和13的引物核苷酸序列。使用这些引物核苷酸序列(SEQ ID NOs:1和13)与具有SEQID NO:3的探针一起——表1中孔名“R1 MDX”——与“P2 eurofins”(Ct(dRn)＝34.26)相比，特异性(Ct(dRn)＝32.89)进一步提高。图1中的相应曲线由实心正方形标记。
第三，为了尽力进一步提高“R1 MDX”的特异性(参见表1)，本发明人观察到具有SEQ ID NOs:1和2的引物核苷酸序列，在与具有SEQ ID NO:3的探针一起使用时——表1中孔名“R2 MDX”和“R2 new MDX”——与“R1 MDX”(Ct(dRn)＝32.89)相比，赋予更为提高的特异性(Ct(dRn)＝31.17和31.18)(参见表1)。图1中的相应曲线分别由实心三角形和实心菱形标记。
作为阴性对照，使用具有SEQ ID NOs:1和2的引物核苷酸序列，但不使用探针——孔名“R2 new MDX ntc”。图1中的相应曲线用空心正方形标记。
因此，本发明人发现，相对于通常使用的具有SEQ ID NOs:14和15的引物核苷酸序列、任选地与具有SEQ ID NO:3或16的探针一起，具有SEQ ID NOs:1和2的引物核苷酸序列、任选地与具有SEQ ID NO:3的探针一起，就SARS-CoV-2E基因的检测提供了改进得多的特异性。
比较SARS-CoV-2E基因的30.21的Ct与SARS-CoV-2RdRP的31.17和31.18的Ct，显然，有小于一个Ct的差异。这是如本申请中描述的用于检测SARS-CoV-2的方法的显着改进。
值得注意的是，显然SEQ ID NOs:1和2的引物核苷酸序列不仅能够用于RT-PCR，例如实时RT-PCR，而且能够用于公知的标准PCR，例如RT-LAMP。
实施例2：开发使用双探针技术以区分SARS-CoV-2与甲型和乙型流感病毒的室温稳定的多重RT-qPCR检验
材料和方法
vDetect v1
使用1Step RT qPCR Probe ROX L Kit(Cat.No.QOP0201,highQu,德国)，在CFX96(Bio-Rad)和Mx3005P(Agilent Technologies)实时PCR检测系统上优化RT-qPCR反应。对于E基因和RdRP基因检测，根据制造商的建议制备的反应混合物包含：在20μl总体积中，10μl2x HighQu Master Mix，2μl RT3 Mix，2μl引物/探针混合物，1μl PCR水、和5μl样品。用以下循环条件进行一步RT-qPCR测定：逆转录为50℃10分钟，95℃3分钟，以及95℃5秒和60℃20秒的45个循环。引物对和探针序列在表2和表3中示出。
vDetect v2
使用Brilliant III Ultra-Fast QRT-PCR Master Mix(Cat.No.600884；AgilentTechnologies)在CFX96(Bio-Rad)、Mx3005P(Agilent Technologies)和AriaMx(AgilentTechnologies)实时PCR检测系统上优化了RT-qPCR反应。对于E基因、RdRP基因和RNA酶P基因检测，根据制造商的建议制备的反应混合物包含：在20μl总体积中，10μl 2x BrilliantIII Ultra-Fast QRT-PCR Master Mix，0.3μl 2μM ROX，0.2μl 100mM DTT，1μlRT/RNaseBlock，2μl引物/探针混合物，1.5μl PCR水，和5μl样品。用以下循环条件进行一步RT-qPCR测定：逆转录为50℃30分钟，95℃3分钟，以及95℃5秒和60℃20秒的45个循环。引物对和探针序列在表2和表3中示出。
rTEST单重、多重和allplex
使用
Figure GDA0004222541930000631
1-step CoV Kit(Cat.No.08-65-00250；SOLIS BioDyne,爱沙尼亚)在Mx3005P(Agilent,CA,USA)和AriaMx(Agilent,CA,USA)实时PCR检测系统上优化了RT-qPCR反应。对于所有检测的基因，根据制造商的建议制备的反应混合物包含：在20μl总体积中，4μl 5X5X One-step Probe CoV Mix(ROX)，0.5μl 40X One-step/>
Figure GDA0004222541930000632
CoV Mix，2μl引物/探针混合物，8.5μl PCR水，和5μl样品。用以下循环条件进行一步RT-qPCR测定：逆转录为50℃10分钟，95℃10分钟，以及95℃15秒和60℃30秒的45个循环。引物对和探针序列在表2和表3中示出。
表2.用于SARS-CoV-2、IAV和IBV检测的引物和探针
Figure GDA0004222541930000641
/>
Figure GDA0004222541930000651
/>
Figure GDA0004222541930000661
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Figure GDA0004222541930000671
/>
Figure GDA0004222541930000681
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Figure GDA0004222541930000691
/>
Figure GDA0004222541930000701
/>
Figure GDA0004222541930000711
/>
Figure GDA0004222541930000721
表3.在SARS-CoV-2、IAV和IBV检测的优化期间使用的所有引物和探针的序列。基于700个已知的SARS-CoV-2基因组，RdRP序列中的混合碱基已经被核苷酸“A”代替。根据CDC方案且在引物序列中不进行进一步的优化和改变，进行人RNA酶P的检测。
Figure GDA0004222541930000731
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Figure GDA0004222541930000741
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Figure GDA0004222541930000751
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Figure GDA0004222541930000761
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Figure GDA0004222541930000771
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Figure GDA0004222541930000781
一步RT-qPCR优化
上文描述的最佳RT-qPCR条件是优化反应混合物的热分布和组成的结果。分别确定每个试剂盒的最佳RT-qPCR条件，并且表4中描述了各个最佳步骤。不是所有的备选热分布均与每种添加剂/改变相组合进行了检测。在热分布优化的过程中，使用了制造商推荐的反应混合物的组成。使用优化的热曲线(以粗体标记)检测了反应混合物组成中的添加剂或变化。
表4.一步RT-qPCR热分布和反应混合物的优化。
Figure GDA0004222541930000782
/>
Figure GDA0004222541930000791
/>
Figure GDA0004222541930000801
阳性对照
将EDX SARS-CoV-2标准品(Exact Diagnostics)用作检验优化和LoD实验的阳性对照。EDX SARS-CoV-2标准品是用合成的RNA转录物制备的，所述合成的RNA转录物含有浓度为200cp/μl的五个基因靶标(SARS-CoV-2的E、N、ORF1ab、RdRP和S基因)。该产物含有基因组DNA，从而允许验证包括提取、扩增和检测的分子测定的整个过程的检测。
将稀释至200cp/μl的含有完整IAV基因组的“
Figure GDA0004222541930000811
INFLUENZA A H3RNA CONTROL”(Vircell Microbiologists)用作IAV测定优化和LoD实验的对照模板。将从感染了乙型流感病毒17/381的MDCK细胞系分离的病毒RNA稀释至200cp/μl，并用作IBV检测的模板。根据制造商的推荐，用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen)进行乙型流感病毒17/381的分离。/>
使用含有浓度为75cp/μl的基因组DNA的合成基质(matrix)“SARS-CoV-2Negative”(Exact Diagnostics)将阳性对照材料稀释到期望的浓度。
阳性对照PC BMC5由SARS-CoV-2病毒的冻干的分离的全基因组RNA并掺入从人细胞系A549提取的人RNA组成。为了测定冻干阳性对照的最低稳定性，并因此测定诊断试剂盒在室温下的最低稳定性，制备了三个版本的PC BMC5：纯阳性对照，通过添加终浓度为20μg/ml的面包酵母tRNA来稳定的阳性对照，和通过添加终浓度为100μg/ml的鲑鱼精DNA来稳定的阳性对照。冻干后，通过RT-qPCR检测在室温下储存0、XYZ和33天的阳性对照的稳定性，并与非冻干的阳性对照进行比较。
阳性对照PC4.01由SARS-CoV-2、IAV和IBV的冻干的分离的全基因组RNA并掺入从人细胞系A549提取的人RNA以及稳定剂(面包酵母tRNA或鲑鱼精DNA)组成。阳性对照PCBMC5由SARS-CoV-2病毒的冻干的分离的全基因组RNA并掺入从人细胞系A549提取的人RNA组成。将PC BMC5和PC4.01阳性对照稀释成显示在28-35范围内的Ct值。
分析灵敏度(检测限)
使用8个重复在多个浓度上进行分析灵敏度(检测限)的评估，并且在跨越95％检测水平的浓度下进行24个另外的重复。在vDetect v1的情况下，通过连续稀释储备标准品制备了稀释液，得到浓度为40个拷贝/μl(＝200个拷贝/反应)、8个拷贝/μl(＝40个拷贝/反应)、1.6个拷贝/μl(＝8个拷贝/反应)和0.25个拷贝/μl(＝1.25个拷贝/反应)的样品。
通过连续稀释储备标准品制备了所有其它试剂盒的稀释液，得到浓度为8个拷贝/μl(＝40个拷贝/反应)、2个拷贝/μl(＝10个拷贝/反应)、0.8个拷贝/μl(＝4个拷贝/反应)和0.4个拷贝/μl(＝2个拷贝/反应)的样品，它们用于分析灵敏度检验。使用含有浓度为75,000个拷贝/ml的基因组DNA的合成基质“SARS-CoV-2Negative”(Exact Diagnostics)稀释对照材料。
检验特异性
使用对照材料“冠状病毒RNA特异性组”(EVAg，欧洲病毒档案——全球)进行特异性(对其它冠状病毒和呼吸道病毒的潜在交叉反应性)评估，所述“冠状病毒RNA特异性组”含有RNA病毒HCoV-229E、HCoVOC43、HCoV-Nl63、SARS-CoV HKU39849和MERSCOV，各自在单独的管中。将EDX SARS-CoV-2标准品(Exact Diagnostics)用作该检验的参考材料。使用一组呼吸道病毒(Vircell)来评价与呼吸道病毒的交叉反应性，所述一组呼吸道病毒含有甲型流感病毒H1N1、新甲型流感病毒H1N1、甲型流感病毒H3N2、甲型流感病毒H5N1、新乙型流感病毒、人副流感病毒、呼吸道合胞病毒和人鼻病毒的RNA，各自在单独的管中提供。对于每种所示病毒，所有测定一式三份地进行。
临床评估
对SARS-CoV-2的临床表现进行E基因筛选检验、RdRP基因以及人RNA酶P的验证检验的评估。关于IAV和IBV，对IAV PB1基因和IBV PA基因进行评估。对于SARS-CoV-2，分别对IAV和IAB患者的38个阳性和54个阴性临床样品的选定组进行评估，对IAV和IBV患者的52个和37个临床样品的选定组进行评估。一个样品是IAV和IBV都阴性的。使用RNAdvance ViralKit和Biomek i5 Automated Workstation(Beckman Coulter)从鼻咽样品中提取RNA。在RNA提取之前，样品暴露于一个冻融循环。用盲法样品进行该样品选定组的检测。所有用于验证的样品都通过Slovak Republic的地方公共卫生当局用于常规检测的参考方法进行了确认。
结果
CharitéSARS-CoV-2E和RdRP引物/探针组的重新设计和优化
作为我们的SARS-CoV-2RT-qPCR检验的起点，我们使用了由Charité病毒学研究所(柏林)开发的E和RdRP引物/探针组作为我们检验开发的支柱。我们将700个SARS-CoV-2序列与武汉参考基因组进行了比对，并使用95％共有序列来验证Sarbecco E基因和RdRP基因引物/探针组的特异性。由于比对鉴定出RdRP正向和反向引物中的几个简并碱基导致与共有序列错配，我们用合适的互补碱基代替了这些简并碱基(图2)。用于评估解链温度以及二聚体和二级结构的潜在形成的计算机分析也发现了RdRP反向引物相对于正向引物具有显着更低的退火温度(8.5℃Tm差异)。引物设计的这种缺陷会降低RdRP测定的效率和灵敏度。为了解决这个问题，我们设计了位于Charité反向引物(R1)下游的三个引物，将这些引物延长一个碱基，并掺入LNA修饰的核苷酸以稳定3’端并增加正向引物的解链温度(表2和表3)。尽管所有的引物组都扩增了SARS-CoV-2阳性对照，但是未修饰的引物(R2)的表现优于LNA修饰的反向引物(R3和R4；B；图3A)。该R2反向引物也具有与正向引物更接近的解链温度(3.3℃Tm差异)，因此我们选择R2作为反向引物用于进一步实验。
在该大流行病开始时，全世界实验室实施RT-qPCR方案以检测SARS-CoV-2，这些方案主要基于WHO批准的方案，包括Charité测定。由于对引物/探针和合成阳性对照的过量需求，许多实验室报告了收到被E基因的合成阳性对照污染的引物/探针(Fischer C等人，Variable sensitivity in molecular detection of SARS-CoV-2in European ExpertLaboratories:External Quality Assessment,2020年6月–7月.J Clin Microbiol.2020年12月9日；Huggett JF等人，Cautionary Note on Contamination of Reagents Usedfor Molecular Detection of SARS-CoV-2.Clinical Chemistry.2020年11月1日；66(11):1369–72；
Figure GDA0004222541930000831
R等人，Delayed Laboratory Response to COVID-19Caused byMolecular Diagnostic Contamination-Volume 26,Number 8-2020年8月-EmergingInfectious Diseases journal–CDC；Wernike K等人，2020,Pitfalls in SARS-CoV-2PCRdiagnostics.Transboundary and Emerging Diseases 2020年6月14日)。我们也经历了被合成的E基因模板污染的引物/探针组，因此我们通过将其位置移到更上游的位置重新设计了E基因正向引物，以产生不会扩增最常见的SARS-CoV-2E基因合成对照的引物/探针组(图2)。由于E基因仅228个碱基，我们还掺入了不同数量的LNA核苷酸，从而使得能够设计不与原始Charité正向引物重叠、同时保持足够的解链温度的较短正向引物。尽管所有这些引物同样很好地扩增了SARS-CoV-2模板(除了F8)，但是与原始Charité正向引物重叠的一些正向引物在不存在模板的情况下继续显示扩增(例如F1、F2和F4；图3B)。基于这些数据以及由各个引物/探针组产生的荧光强度，我们选择了F3作为最佳正向引物(图2)。
我们还研究了最佳逆转录(RT)和退火温度。标准RT(50℃)以上或以下偏离的温度对于E或RdRP测定的扩增是有害的或对该扩增没有影响。尽管较低的退火温度(58℃)引起E基因检测的微小改进，但我们选择了保持制造商的推荐(图8A)。用这种称为vDetect v.1的最终引物/探针组，我们确定了E和RdRP测定二者的LoD为8个拷贝/反应(图3C)。为了评价Charité方案的这个改进版本(称为vDetect v.1COVID-19RT-qPCR检验)的临床表现，两个独立实验室对92个临床样品进行了测试，并将结果与用于公共卫生官员常规筛选的SARS-CoV-2的指标RT-qPCR检验进行了比较。与最初的Charité方案相似，检验工作流程由检测E基因的初始筛选检验和随后检测RdRP基因的确认检验组成。我们的vDetect v.1检验正确地鉴定了所有阳性(38/38)和阴性(52)样品，甚至鉴定了被参考方法的E基因测定错误分类的两个假阳性样品(图3D；表5)。
表5.vDetect v.1COVID-19RT-qPCR检验的临床表现。
Figure GDA0004222541930000841
由于vDetect v.1的LoD比在原始Charité方案中所报告的E和RdRP的LoD(分别为5.2和3.8个拷贝/反应)稍微更不敏感，我们转换到Agilent Brilliant III Ultra-FastQRT-PCR Master Mix，其在我们的内部检测中产生了非常好的结果，并进行了反应参数和反应组成的彻底优化。最初，我们通过使用凝胶电泳分析PCR产物评价了多种参数的表现，并发现将RT反应延长至30分钟和将初始变性温度提高至97℃是有益的(图8B)。为了验证这些有益的修改，我们使用RT-qPCR检测了三种热分布变体，并确定了将RT反应延长至30分钟改善了RdRP的检测，并且升高初始变性温度没有提供额外的益处(图8C)。使用RT-qPCR，我们还观察到提高反应中逆转录酶的浓度没有作用或是有害的(图8D)。总之，我们决定在RT步骤中不使用DTT，并将RT时间增加到30分钟。
我们还修改了RdRP和E基因测定中使用的寡核苷酸。首先，我们用新的TaqMan水解探针(P8)代替了RdRP探针(P2)，导致荧光强度的显着增加(图2)。同样，在用我们修改的E基因测定经历了由合成的E基因阳性对照污染导致的NTC散发性扩增之后，我们用较短的LNA修饰的正向引物(F3)代替了E基因正向引物(F3)，该较短的LNA修饰的正向引物不与原始正向引物重叠，因此消除了合成阳性对照的扩增。用这种具有优化的反应参数和修改的RdRP和E基因引物/探针组的新反应混合物，我们并入US CDC人RNA酶P引物/探针作为RNA提取和测定表现的内部对照。用这种新的版本即vDetect v.2，我们观察到E和RdRP测定两者都一致地检测低至每个反应仅2个拷贝的病毒RNA的灵敏度提高(图8E)。
室温稳定的SARS-CoV-2RT-qPCR测定的优化
大多数SARS-CoV-2RT-qPCR测定的主要限制是需要在低温(-20°)下运输和储存反应组分。为了解决这个缺点，我们优化了我们的测定以与室温稳定的反应混合物(
Figure GDA0004222541930000851
1-step CoV Kit；SOLIS BioDyne)、冻干的引物/探针混合物和阳性对照兼容，并且在一个月的时期内对阳性对照和整个试剂盒进行了稳定性检验。使用PCR产物的凝胶电泳和实时RT-qPCR，我们发现对标准热循环程序的大多数修改没有产生变化或是有害的(图9A和B)，这表明标准反应参数对于我们的测定是最佳的。由于SOLIS BioDyne已经证实了反应混合物的室温稳定性，我们将我们的努力集中在稳定和冻干我们的阳性对照(PCBMC 5)上。我们推理认为，在室温下RNA降解的主要来源是由于核酸酶活性；因此，我们将我们的阳性对照掺入了面包酵母tRNA或鲑鱼精DNA(ssDNA)，以作为用于核酸酶的载体和诱饵，然后冻干阳性对照并检测了其在一个月的时期内的稳定性。尽管只有ssDNA在统计学上改进了冻干阳性对照在一个月的时期内的稳定性(图9C-D)，我们决定用两种载体对我们的阳性对照进行掺入以获得最大保护。将整个试剂盒(反应混合物、冻干的引物/探针组和阳性对照)在室温下放置一个月并与新制备的试剂盒进行表现比较，证明了所有测定靶标在室温下达至少一个月的一致表现(图9E)。
双探针增强特异性并增加荧光信号
尽管冠状病毒例如SARS-CoV-2相对于其它基于RNA的病毒表现出降低的突变率，但是有相当多的证据表明，出现SARS-CoV-2突变可以导致传播性、毒力增加，并逃避免疫应答。如果在RT-qPCR测定的诊断靶标中发生突变，它们可能导致引物和探针的结合效率降低，从而灵敏度降低，甚至检验失败(Khan KA,Cheung P.Presence of mismatchesbetween diagnostic PCR assays and coronavirus SARS-CoV-2genome.Royal SocietyOpen Science.7(6):200636)。为了解决这个问题，我们设计了一系列另外的水解探针用于E和RdRP测定二者，所述测定含有与第一探针相同的荧光报告染料，基本上使得该测定对于互补序列中的潜在突变更稳健。平行地，我们还检测了含有位于内部的第二BHQ-1淬灭剂的探针，以便减少背景荧光并增加荧光发生探针的动态范围。
我们筛选了各种具有或不具有内部淬灭剂的RdRP探针，并令人惊讶地发现内部淬灭剂降低了灵敏度(即增加了Ct)并对荧光强度具有可变的影响(图10A)。当包括在与我们的原始探针(P2)相同的反应中时，表现最好的探针(P8，Ct最低和荧光最高(ΔR))增加了反应的灵敏度(图4A)并显着改善了测定的动态范围(图4B)。值得注意的是，P2和P8在同一条链上略微重叠，但仍在灵敏度和荧光强度上产生显着增加，这提示这些重叠探针之间的干扰很小(如果有的话)。
对于E基因测定，我们设计了在原始探针P1下游的另外的探针(P2)，其具有两个LNA修饰的变体(P3和P4)，以及探针(P1的反向互补体，P1rev)，其将结合位于反向引物下游的反向链。LNA修饰的探针显示了与未修饰的探针相当的灵敏度(图10B)。而与相反链互补的第二探针对单和双探针反应的灵敏度都是有害的(图10B)，包含与原始探针串联的第二非重叠探针增强了测定的灵敏度(图10B)。实际上，双探针相对于单探针反应增加了灵敏度(图4C)和动态范围(图4D)。
用我们优化的用于SARS-CoV-2E和RdRP基因的室温稳定的反应混合物和双探针测定，我们评估了这个新检验(称为rTEST COVID-19qPCR)的LoD，并证实了2个拷贝/反应的LoD(图10C)。我们从一组92个临床样品解冻并再提取RNA，重新运行指标检验以与原始检测结果进行比较。指标检验，即使是与原始检验(vDetect COVID-19qPCR v2试剂盒)相同的方法，也未能用E基因测定鉴定出三个阳性样品，未能用RdRP测定鉴定出七个阳性样品，这可能是由于在冷冻/解冻过程和RNA提取期间RNA的损失(图10D)。因此，我们决定使用最近的检测结果来评估rTEST COVID-19qPCR试剂盒的临床表现。分析显示了与指标检验的极好一致性，rTEST COVID-19qPCR试剂盒的E和RdRP测定均正确鉴定了所有阴性(54/54，100％诊断特异性)和阳性(38/38，100％诊断灵敏度)样品，包括在原始参考检验中为阳性、但在从解冻样品提取的RNA的再次检验中为阴性的样品(图4E和F)。
多重化E和RdRP基因测定以简化测试工作流程
如同原始Charité方案，我们的优化检验的工作流程由使用E基因的初始筛选检验、RdRP基因的第二确认检验和平行的人RNA酶P内部对照的第三测定组成。这种冗长的工作流程的缺点是适得其反，因为诊断实验室可能面临检测的大量积压工作。为了解决这种限制并实现快速、高通量检测，我们尝试了通过将测定靶标多重化到单个反应中来简化我们的检验。我们首先用人RNA酶P(HEX染料)多重化E和RdRP基因测定(FAM染料)中的每一个。假定两个引物/探针组在单个反应中竞争有限的试剂库，我们降低了用于更丰富的RNA酶P测定的引物和探针的浓度，以确保该反应在消耗完所有试剂之前达到平台期。我们确定该引物受限的多重测定未改变LoD(图5A和B)。实际上，这种多重检验(称为rTEST Covid-19qPCR Multiplex试剂盒)如同其单重对应物一样，显示出令人印象深刻的100％诊断特异性(30/30个阴性样品)和灵敏度(30/30个阳性样品；图5C)。
接着，我们在单个反应中多重了所有三个靶标，并进一步将RNA酶P引物/探针浓度降低了50％。该三重测定的检测限几乎与单重和双重版本一样灵敏，在4个拷贝/反应下检测100％的重复(图5D)。这种三重版本(称为rTEST Covid-19qPCR Allplex试剂盒)在临床表现评估期间也正确地鉴定了所有阴性(30/30)和SARS-CoV-2阳性(30/30)样品(图5E)。
区分SARS-CoV-2与甲型和乙型流感病毒
由于其它呼吸道病原体例如季节性流感产生与SARS-CoV-2重叠的症状，因此具有能够有效区分两种呼吸道病毒的分子诊断学是重要的。为了开发可以区分SARS-CoV-2与甲型和乙型流感病毒的RT-qPCR测定，我们对GISAID中从2018年1月1日到2020年6月24日保藏的超过27,000个甲型流感病毒(H1N1和H3N2)和超过8,000个乙型流感病毒(Victoria和Yamagata)序列进行了广泛的生物信息学分析。这些序列比对揭示了几个高度保守的区域，这些区域在IAV的PB1区段和IBV的PA区段中具有最少量的混合碱基，我们设计了靶向这些地方的引物/探针(图6)。
在筛选一系列引物和探针后，我们将IAV和IBV的最佳引物/探针组与SARS-CoV-2E和RdRP基因(均用FAM标记)二者进行多重化，并测定了分析灵敏度。我们检测了两种多重形式：1)第一种形式允许区分SARS-CoV-2、IAV和IBV，并且由两个多重测定组成，所述多重测定包含SARS-CoV-2E基因与IAV PB1基因和RNA酶P的多重组合，或者SARS-CoV-2RdRP基因与IBV PA基因和RNA酶P的多重组合；和2)第二种形式允许区分SARS-CoV-2和流感(但不区分IAV和IBV)，其由含有SARS-CoV-2E和RdRP基因(均用FAM标记)二者、IAV PB1和IBV PA基因(均用YY标记)和RNA酶P(Cy5)的单一多重反应组成。具有两个多重反应的第一种形式产生了卓越的灵敏度，其中所有多重靶标以仅2个拷贝/反应检测到每一个重复(图7A，B)；而具有一个多重反应的第二种形式具有稍高的4个拷贝/反应的检测限(图7C)。
我们通过斯洛伐克共和国地方公共卫生当局用于常规检测的参考方法，分别对经诊断患有IAV和IBV的患者的52和37个临床样品的选定组，评价了这种称为rTEST COVID-19/FLU qPCR试剂盒的检验的临床表现。IAV PB1和IBV PA基因测定二者均正确鉴定了所有阳性样品(IAV PB1＝52/52；IBV PA＝37/37；图7D)。用IAV测定证实为IBV的一个样品显示扩增晚(Ct＝44.77)；然而，这在临床实践中会被认为是阴性的。重要的是，SARS-CoV-2与IAV或IBV样品之间没有交叉反应性，这表明该检验准确地区分了所有三种病毒。
讨论
在本实施例中，我们通过校正错配碱基，通过使用LNA修饰的核苷酸使引物解链温度标准化和掺入人RNA酶P内部对照以评价RNA提取、RNA完整性和测定表现，改进了原始CharitéSARS-CoV-2RT-qPCR方案。我们的改进的SARS-CoV-2测定也包含技术上的新颖性，例如增强特异性和灵敏度的双探针、室温稳定的反应混合物和引物受限的多重测定，其能够进行更高通量的检测，同时保持卓越的灵敏度。为了帮助区分SARS-CoV-2与其它具有重叠症状的呼吸道病原体，我们用靶向最常见季节性流感的引物/探针组多重化了我们的SARS-CoV-2测定。
重新设计和改进的RdRP和E基因引物/探针测定
作为将被WHO公布并批准的用于SARS-CoV-2的第一个RT-qPCR检验之一，在没有获得SARS-CoV-2分离物或临床样本以及缺乏基因组序列的情况下，开发了Charité方案；因此，该测定设计依赖于来自密切相关的SARS-CoV和bat相关的冠状病毒的遗传序列，这导致RdRP引物和探针中几个简并碱基的放置。我们对SARS-CoV-2基因组的生物信息学分析揭示了RdRP正向和反向引物中的这些简并碱基导致错配碱基，这可能是RdRP测定灵敏度降低的原因。原始CharitéRdRP测定的另一个问题源于反向引物的低解链温度。正向与反向引物之间的解链温度的这一差异(8.5℃Tm差异)可导致退火模式改变，并因此降低效率和灵敏度。如Charité方案的作者指出的(Corman VM,Drosten C.Authors’response:SARS-CoV-2detection by real-time RT-PCR.Euro Surveill.2020年5月28日)，引物设计中的这种缺陷是造成RdRP测定的灵敏度降低的更可能的原因，因为PCR通常耐受在引物的中间和5’端发生的错配(如本文的情况)。尽管我们没有进行实验来确定该次优RdRP测定的根本原因，但是我们发现，校正正向和反向引物二者中的错配碱基和重新设计反向引物以确保更高的Tm弥补了该测定的表现问题，并得到与E基因测定相当的表现。
由于商业上提供的引物/探针被用于E基因的合成阳性对照污染的报告，我们还重新设计了E基因的正向引物，以便它不会扩增最常见的合成阳性对照。这提出了挑战，因为E基因的小尺寸和富含AT的核苷酸含量提供了用于设计具有最佳退火温度的全长引物的极少选择。为了规避这些设计限制，我们将LNA修饰的胸腺嘧啶碱基掺入到正向引物的5’端，这允许我们缩短引物的长度以消除与CharitéE基因正向引物(以及因此的E基因合成阳性对照)的任何重叠，同时仍然保持最佳双链体退火温度。这种新的E基因正向引物设计提供了一种创新的解决方案，以消除与合成阳性对照污染相关的潜在问题，而不必开发针对全新基因靶标的测定。
双探针增加SARS-CoV-2RT-qPCR测定的灵敏度和特异性
将第二TaqMan水解探针引入RT-qPCR反应、用相同的报告染料标记、并且与第一探针串联或相对放置，可以导致荧光强度的附加增加，甚至可以增强测定的灵敏度，基于前述观察结果，我们观察到当与原始探针串联杂交时，双探针使荧光强度大致加倍，并且通过在每个反应的给定拷贝数下降低平均Ct值而增加灵敏度。然而，观察到置于第一探针的相反链上的第二水解探针对灵敏度有害。有趣的是，我们的RdRP测定中使用的双探针重叠，但仍然提供荧光强度的附加增益和增强的灵敏度。重叠双探针提供与串联杂交的双探针类似的益处的这一新发现为使用者提供了设计双探针测定的额外灵活性，特别是当靶向困难模板例如短模板和含有混合碱基(例如病毒)或次优核苷酸含量(例如富含AT、低复杂性序列)的那些时。
使用双探针的相关益处是测定特异性的固有提高。当开发用于检测具有天然突变倾向的病毒的RT-qPCR测定时，这是特别重要的。病毒基因组中在引物或探针结合区中导致错配的突变可能对测定的表现有害，并且是公共卫生机构推荐多基因靶标测定来检测SARS-CoV-2的基本原理的一部分。实际上，已知SARS-CoV-2突变可以严重影响RT-qPCR测定的表现，并且突变随时间和地理位置的积累可以加剧这个问题。这种现象的一个例子包括在英国首次发现的B.1.1.7谱系的出现。这种变体是首次鉴定的，因为它在刺突基因中含有缺失，这导致越来越多的RT-qPCR测定失败——即所谓的刺突基因靶标失败。通过使用另外的双重水解探针，我们的SARS-CoV-2测定含有另外一层特异性，使得在一个探针结合区域中导致错配的任何潜在突变被另一个探针补偿。
区分SARS-CoV-2与甲型和乙型流感
其它呼吸道病原体的流传为医生正确区分SARS-CoV-2感染个体与其它病原体例如流感感染个体提供了挑战性情况，因为它们通常具有重叠的症状。这个问题被同时感染SARS-CoV-2和流感的人的报告放大，这表明对另一种呼吸道病原体的检测阳性不排除SARS-CoV-2感染的不存在。因此，需要诊断工具来准确区分SARS-CoV-2与其它呼吸道病原体，尤其是季节性病原体如流感。为了解决这一挑战，我们对超过35,000个甲型和乙型流感序列进行了广泛的生物信息学分析，着重在过去两年中出现的序列以确保最近病例的高度呈现。该分析鉴定了PB1(IAV)和PB(IBV)区段中高度保守的靶标，它们是RT-qPCR引物和探针的理想靶标。我们还将这些测定与我们的SARS-CoV-2E和RdRP测定进行了多重化，以产生两种反应形式，这两种反应形式根据所需的通量和区分IAV与IBV的必要性而提供了独特的益处。
结论
在SARS-CoV-2大流行病早期，参考实验室和公共卫生机构公布了几种RT-qPCR方案，从而使得各国能够快速建立鉴定新型冠状病毒所必需的诊断工作流程。尽管这些方案提供了毫无疑问的益处，并形成了许多商业RT-qPCR检验的基础，但出现了关于灵敏度和特异性的几个问题。该论文概述了基于由Charité病毒学研究所开发的方案的一系列RT-qPCR检验的开发。我们弥补了这种原始测定的与引物中错配和次优退火温度有关的一些缺陷，并进行了显着改进以提高灵敏度、特异性、通量和功能性。我们引入了双探针技术以增强荧光信号和灵敏度，同时还提供了额外的保护层以防止由探针结合区中的突变产生的错配。我们的多重测定还含有RNA酶P内部对照，大大减少了操作时间并节约了实验室资源，而没有牺牲灵敏度。所述检验中的一些含有室温稳定的反应混合物，其具有用诱饵核酸稳定的冻干的引物/探针，从而将它们置于不需要冷链运输和储存的仅少数RT-qPCR检验中。此外，我们将这些SARS-CoV-2测定与甲型和乙型流感测定多重化，以促进这些对健康护理从业者鉴定提出挑战的呼吸道病原体的快速区分。这些新的、室温稳定的RT-qPCR检验可以为使用者提供强有力的工具，以在该大流行病的下一阶段中快速且准确地检测SARS-CoV-2。
本领域技术人员将容易地理解，本发明非常适于实现所述目的并获得所述结果和优点，以及其中固有的那些。此外，对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不背离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文所公开的发明进行各种替换和修改。本文所述的组合物、方法、程序、治疗、分子和具体化合物目前代表了示例性的某些实施方案，并且不旨在作为对本发明范围的限制。本领域技术人员可以想到其中的变化和其它用途，这些变化和用途包含在由权利要求的范围限定的本发明的精神内。本说明书中对先前公开的文件的列举或讨论不应必然地被认为是承认该文件是现有技术的一部分或是公知常识。
在没有任何一种或多种要素、一种或多种限制的情况下，可以适当地实施本文示例性描述的本发明，所述要素或限制没有在本文中具体公开。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应被广义地而非限制性地理解。另外，本文所采用的术语和表达方式已经用作描述性术语而非限制性术语，并且在使用这些术语和表达方式时，无意排除所示和所述特征或其部分的任何等同物，而是应认识到，在所要求保护的本发明的范围内，各种修改是可能的。因此，应当理解，尽管已通过示例性实施方案和任选的特征具体公开了本发明，但本领域技术人员可以采用本文实施的本发明的修改和变化，并且这样的修改和变化被认为是在本发明的范围内。
本发明在此已经被广泛和一般地描述。落入一般性公开的较窄种类和亚属分组中的每一个也形成本发明的一部分。这包括本发明的一般性描述，附带条件或负面限制从该属中除去任何主题，而不管所去除的材料是否在本文中具体叙述。
其它实施例在以下权利要求书内。另外，在本发明的特征或方面以马库什组的形式描述的情况下，本领域技术人员将认识到本发明也因此以马库什组的任何单独成员或成员的亚组的形式描述。
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<400> 1
gtgaaatggt catgtgtggc gg 22
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于SARS-CoV-2 RdRP的反向引物核苷酸序列
<400> 2
cgtgacagct tgacaaatgt taaaaac 27
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于SARS-CoV-2 RdRP的探针
<400> 3
caggtggaac ctcatcagga gatgc 25
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于SARS-CoV-2 E基因的正向引物核苷酸序列
<400> 4
acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于SARS-CoV-2 E基因的反向引物核苷酸序列
<400> 5
atattgcagc agtacgcaca ca 22
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG
<400> 6
acactagcca tccttactgc gcttcg 26
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于人RNA酶P的正向引物核苷酸序列
<400> 7
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于人RNA酶P的反向引物核苷酸序列
<400> 8
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于人RNA酶P的探针
<400> 9
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23
<210> 10
<211> 80
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于SARS-CoV-2 RdRP的阳性对照核糖核苷酸
<400> 10
agugaaaugg ucaugugugg cggaccaggu ggaaccucau caggagaugc caguuuuuaa 60
cauuugucaa gcugucacgg 80
<210> 11
<211> 80
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于SARS-CoV-2 E基因的阳性对照核糖核苷酸
<400> 11
agacagguac guuaauaguu aauagcguuu acacuagcca uccuuacugc gcuucgauug 60
ugugcguacu gcugcaauau 80
<210> 12
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于人RNA酶P的阳性对照核糖核苷酸
<400> 12
gcagauuugg accugcgagc ggguucugac cugaaggcuc ugcgcggacu uguggagaca 60
gccgcuc 67
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于SARS-CoV-2 RdRP的反向引物核苷酸序列
<400> 13
caaatgttaa aaacactatt agcata 26
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于SARS-CoV-2 RdRP的正向引物核苷酸序列
<220>
<221> misc
<222> (5)..(5)
<223> R是A或T
<400> 14
gtgaratggt catgtgtggc gg 22
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于SARS-CoV-2 RdRP的反向引物核苷酸序列
<220>
<221> misc
<222> (3)..(3)
<223> R是G或A
<220>
<221> misc
<222> (12)..(12)
<223> S是G或C
<400> 15
caratgttaa asacactatt agcata 26
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于SARS-CoV-2 E基因的探针
<220>
<221> misc
<222> (9)..(9)
<223> W是A或T
<220>
<221> misc
<222> (12)..(12)
<223> R是G或A
<220>
<221> misc
<222> (18)..(18)
<223> M是A或C
<400> 16
ccaggtggwa crtcatcmgg tgatgc 26
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于独特掺入RNA的正向引物核苷酸序列
<400> 17
atgcagtgcc acattatgca g 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于独特掺入RNA的反向引物核苷酸序列
<400> 18
agcacatgta gtgccactgg 20
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于独特掺入RNA的探针
<400> 19
ccacggttac atccagtggc actaca 26
<210> 20
<211> 89
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 掺入RNA
<400> 20
uaugcagugc cacauuaugc agugccacgg uuacauccag uggcacuaca ugugccauua 60
cauuuacauc caguggcacu acaugugcu 89
<210> 21
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用作用于掺入RNA的模板的合成的核酸序列
<400> 21
tatgcagtgc cacattatgc agtgccacgg ttacatccag tggcactaca tgtgccatta 60
catttacatc cagtggcact acatgtgct 89
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于SARS-CoV-2 E基因的正向引物核苷酸序列
<400> 22
gtactcattc gtttcggaag agacag 26
<210> 23
<211> 78
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于SARS-CoV-2 E基因的阳性对照核糖核苷酸
<400> 23
auguacucau ucguuucgga agacaguuac acuagccauc cuuacugcgc uucgauugug 60
ugcguacugc ugcaauau 78
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_F3引物
<400> 24
gtactcattc gtttcggaag agacag 26
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_R2引物
<400> 25
atattgcagc agtacgcaca ca 22
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_P1探针
<400> 26
acactagcca tccttactgc gcttcg 26
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-F2引物
<400> 27
gtgaaatggt catgtgtggc gg 22
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-R2引物
<400> 28
cgtgacagct tgacaaatgt taaaaac 27
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-P2探针
<400> 29
caggtggaac ctcatcagga gatgc 25
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_F7引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 第2位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 第4位的T是锁核酸
<400> 30
atgtactcat tcgtttcgga aga 23
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_R2引物
<400> 31
atattgcagc agtacgcaca ca 22
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_P1探针
<400> 32
acactagcca tccttactgc gcttcg 26
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-F2引物
<400> 33
gtgaaatggt catgtgtggc gg 22
<210> 34
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-R2引物
<400> 34
cgtgacagct tgacaaatgt taaaaac 27
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-P8探针
<400> 35
tcaggagatg ccacaactgc ttatgc 26
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA酶P正向引物
<400> 36
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA酶P反向引物
<400> 37
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA酶P探针1
<400> 38
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_F7引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 第2位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 第4位的T是锁核酸
<400> 39
atgtactcat tcgtttcgga aga 23
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_R2引物
<400> 40
atattgcagc agtacgcaca ca 22
<210> 41
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_P1探针
<400> 41
acactagcca tccttactgc gcttcg 26
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_P2探针
<400> 42
tagcgtactt ctttttcttg ctttcgtggt 30
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-F2探针
<400> 43
gtgaaatggt catgtgtggc gg 22
<210> 44
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-R2引物
<400> 44
cgtgacagct tgacaaatgt taaaaac 27
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-P2探针
<400> 45
caggtggaac ctcatcagga gatgc 25
<210> 46
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-P8探针
<400> 46
tcaggagatg ccacaactgc ttatgc 26
<210> 47
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA酶P正向引物
<400> 47
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA酶P反向引物
<400> 48
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA酶P探针1
<400> 49
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_F7引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 第2位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 第4位的T是锁核酸
<400> 50
atgtactcat tcgtttcgga aga 23
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_R2引物
<400> 51
atattgcagc agtacgcaca ca 22
<210> 52
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_P1探针
<400> 52
acactagcca tccttactgc gcttcg 26
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_P2探针
<400> 53
tagcgtactt ctttttcttg ctttcgtggt 30
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-F2引物
<400> 54
gtgaaatggt catgtgtggc gg 22
<210> 55
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-R2引物
<400> 55
cgtgacagct tgacaaatgt taaaaac 27
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-P2探针
<400> 56
caggtggaac ctcatcagga gatgc 25
<210> 57
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-P8探针
<400> 57
tcaggagatg ccacaactgc ttatgc 26
<210> 58
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA酶P正向引物
<400> 58
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA酶P反向引物
<400> 59
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA酶P探针1.1
<400> 60
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_F7引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 第2位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 第4位的T是锁核酸
<400> 61
atgtactcat tcgtttcgga aga 23
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_R2引物
<400> 62
atattgcagc agtacgcaca ca 22
<210> 63
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_P1.2探针
<400> 63
acactagcca tccttactgc gcttcg 26
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_P2.2探针
<400> 64
tagcgtactt ctttttcttg ctttcgtggt 30
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-F2引物
<400> 65
gtgaaatggt catgtgtggc gg 22
<210> 66
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-R2引物
<400> 66
cgtgacagct tgacaaatgt taaaaac 27
<210> 67
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-P2探针
<400> 67
caggtggaac ctcatcagga gatgc 25
<210> 68
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-P8探针
<400> 68
tcaggagatg ccacaactgc ttatgc 26
<210> 69
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA酶P正向引物
<400> 69
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA酶P反向引物
<400> 70
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA酶P探针1.2
<400> 71
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_F7引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 第2位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 第4位的T是锁核酸
<400> 72
atgtactcat tcgtttcgga aga 23
<210> 73
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_R2引物
<400> 73
atattgcagc agtacgcaca ca 22
<210> 74
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_P1探针
<400> 74
acactagcca tccttactgc gcttcg 26
<210> 75
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_P2引物
<400> 75
tagcgtactt ctttttcttg ctttcgtggt 30
<210> 76
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-F2引物
<400> 76
gtgaaatggt catgtgtggc gg 22
<210> 77
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-R2引物
<400> 77
cgtgacagct tgacaaatgt taaaaac 27
<210> 78
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-P2探针
<400> 78
caggtggaac ctcatcagga gatgc 25
<210> 79
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-P8探针
<400> 79
tcaggagatg ccacaactgc ttatgc 26
<210> 80
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA酶P正向引物
<400> 80
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA酶P反向引物
<400> 81
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 82
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA酶P探针1.2
<400> 82
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IAV-F1.1引物
<400> 83
ttctagcatg gtggaggcca t 21
<210> 84
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IAV-R1.2引物
<400> 84
ccgtctgagt tcttcaatgg tgg 23
<210> 85
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IAV-探针1.2
<400> 85
tctagggccc ggattgatgc ca 22
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-F2.1引物
<400> 86
agtggactca ggaaagtggc 20
<210> 87
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-R2.3引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> 第6位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> 第9位的T是锁核酸
<400> 87
tccatttgtt gcattgattg aagc 24
<210> 88
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-探针2.3
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 第4位的A是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> 第11位的A是锁核酸
<400> 88
tccaaatgaa atggggaatg gaagct 26
<210> 89
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_F1引物
<400> 89
acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26
<210> 90
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_F2引物
<400> 90
ctcattcgtt tcggaagaga cagg 24
<210> 91
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_F3引物
<400> 91
gtactcattc gtttcggaag agacag 26
<210> 92
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_F4引物
<400> 92
cgtttcggaa gagacaggta cg 22
<210> 93
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_F5引物
<400> 93
tgtactcatt cgtttcggaa gagaca 26
<210> 94
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_F6引物
<400> 94
tgtactcatt cgtttcggaa gagacag 27
<210> 95
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_F7引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 第2位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 第4位的T是锁核酸
<400> 95
atgtactcat tcgtttcgga aga 23
<210> 96
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_F8引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 第2位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 第4位的T是锁核酸
<400> 96
atgtactcat tcgtttcgga agac 24
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_F9引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 第4位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> 第7位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> 第10位的T是锁核酸
<400> 97
atgtactcat tcgtttcgga 20
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_F10引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 第2位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 第4位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> 第7位的T是锁核酸
<400> 98
atgtactcat tcgtttcgga 20
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_F11引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 第4位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> 第10位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 第16位的T是锁核酸
<400> 99
atgtactcat tcgtttcgga 20
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_F12引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 第2位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> 第11位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 第16位的T是锁核酸
<400> 100
atgtactcat tcgtttcgga 20
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_F13引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 第4位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> 第10位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 第15位的T是锁核酸
<400> 101
atgtactcat tcgtttcgga 20
<210> 102
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_R2引物
<400> 102
atattgcagc agtacgcaca ca 22
<210> 103
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_P1探针
<400> 103
acactagcca tccttactgc gcttcg 26
<210> 104
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_P2探针
<400> 104
tagcgtactt ctttttcttg ctttcgtggt 30
<210> 105
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sarbeco_P1rev探针
<400> 105
cgaagcgcag taaggatggc tagtgt 26
<210> 106
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_P3探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 第14位的T是锁核酸
<400> 106
tagcgtactt ctttttcttg ctttcgtggt 30
<210> 107
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_P4探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> 第13位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 第15位的T是锁核酸
<400> 107
tagcgtactt ctttttcttg ctttcgtggt 30
<210> 108
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E_Sarbeco_P5探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 第14位的T是锁核酸
<400> 108
tagcgtactt ctttttcttg ctttcgtggt 30
<210> 109
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-F2引物
<400> 109
gtgaaatggt catgtgtggc gg 22
<210> 110
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-R2引物
<400> 110
cgtgacagct tgacaaatgt taaaaac 27
<210> 111
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-R4引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 第2位的T1是锁核酸
<400> 111
cgtgacagct tgacaaatgt taaaaac 27
<210> 112
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-R5引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> 第18位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 第21位的T是锁核酸
<400> 112
cgtgacagct tgacaaatgt taaaaac 27
<210> 113
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-P2探针
<400> 113
caggtggaac ctcatcagga gatgc 25
<210> 114
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-P3探针
<400> 114
caggtggaac ctcatcagga gatgc 25
<210> 115
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-P4探针
<400> 115
gtggaacctc atcaggagat gccac 25
<210> 116
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-P5探针
<400> 116
gtggaacctc atcaggagat gccac 25
<210> 117
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-P6探针
<400> 117
ggaacctcat caggagatgc cacaac 26
<210> 118
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-P7探针
<400> 118
ggaacctcat caggagatgc cacaac 26
<210> 119
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-P8探针
<400> 119
tcaggagatg ccacaactgc ttatgc 26
<210> 120
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP_SARSr-P9探针
<400> 120
tcaggagatg ccacaactgc ttatgc 26
<210> 121
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IAV-F1.1引物
<400> 121
ttctagcatg gtggaggcca t 21
<210> 122
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IAV-F1.2引物
<400> 122
atttctagca tggtggaggc c 21
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IAV-F2.1引物
<400> 123
aatcccctga atccctttgt 20
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IAV-F2.2引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 第2位的A是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> 第11位的A是锁核酸
<400> 124
aatcccctga atccctttgt 20
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IAV-F2.3引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 第3位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> 第12位的T是锁核酸
<400> 125
aatcccctga atccctttgt 20
<210> 126
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IAV-R1.1引物
<400> 126
cgtctgagtt cttcaatggt gg 22
<210> 127
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IAV-R1.2引物
<400> 127
ccgtctgagt tcttcaatgg tgg 23
<210> 128
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IAV-R2.1引物
<400> 128
tctggcatca atccgggc 18
<210> 129
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IAV-探针1.1
<400> 129
agggcccgga ttgatgccag a 21
<210> 130
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IAV-探针1.2
<400> 130
tctagggccc ggattgatgc ca 22
<210> 131
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IAV-探针1.3
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> 第6位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> 第13位的A是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> 第19位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> 第22位的A是锁核酸
<400> 131
aagagttctc tgagatcatg aagatc 26
<210> 132
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-F1.1引物
<400> 132
aagcaatgcc agcatgggaa 20
<210> 133
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-F1.2引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 第3位的A是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> 第8位的A是锁核酸
<400> 133
tgaatgaaag caatgccagc a 21
<210> 134
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-F1.3引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 第2位的A是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> 第6位的A是锁核酸
<400> 134
gaatgaaagc aatgccagca 20
<210> 135
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-F2.1引物
<400> 135
agtggactca ggaaagtggc 20
<210> 136
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-F2.2引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 第3位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> 第9位的T是锁核酸
<400> 136
tttaggattg gctccctatt tgt 23
<210> 137
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-F2.3引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 第3位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> 第9位的T是锁核酸
<400> 137
tttaggattg gctccctatt tgtg 24
<210> 138
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-F2.4引物
<400> 138
actgtgttta ggattggctc ccta 24
<210> 139
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-R1.1引物
<400> 139
gggagccaat cctaaacaca gt 22
<210> 140
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-R1.2引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 第2位的A是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> 第7位的A是锁核酸
<400> 140
gagccaatcc taaacacagt 20
<210> 141
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-R1.3引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 第2位的A是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> 第7位的A是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> 第12位的A是锁核酸
<400> 141
gagccaatcc taaacacagt 20
<210> 142
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-R2.1引物
<400> 142
tccatttgtt gcattgattg aagc 24
<210> 143
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-R2.2引物
<400> 143
tccatttgtt gcattgattg aagca 25
<210> 144
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-R2.3引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> 第6位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> 第9位的T是锁核酸
<400> 144
tccatttgtt gcattgattg aagc 24
<210> 145
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-探针1.1
<400> 145
agagtggact caggaaagtg gcc 23
<210> 146
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-探针1.2
<400> 146
cagagtggac tcaggaaagt ggcc 24
<210> 147
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-探针2.1
<400> 147
tccaaatgaa atggggaatg gaagct 26
<210> 148
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-探针2.2
<400> 148
agatccaaat gaaatgggga atggaagct 29
<210> 149
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-探针2.3
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 第4位的A是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> 第11位的A是锁核酸
<400> 149
tccaaatgaa atggggaatg gaagct 26
<210> 150
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-探针2.4
<400> 150
tgcagagtga atggcacaaa taagatcca 29
<210> 151
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-探针2.5
<400> 151
tgccgagtga atggcacaaa taagatcc 28
<210> 152
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-探针2.6
<400> 152
actgtgttta ggattggctc cctatttgtg 30
<210> 153
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IBV-探针2.7
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 第4位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 第14位的T是锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> 第24位的T是锁核酸
<400> 153
ctgtgtttag gattggctcc ctatt 25
<210> 154
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA酶P正向引物
<400> 154
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 155
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA酶P反向引物
<400> 155
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 156
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA酶P探针
<400> 156
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23
<210> 157
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2 S基因 - F1
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 第4位的T是LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> 第6位的T是LNA
<400> 157
tcttttccaa tgttacttgg ttc 23
<210> 158
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2 S基因 - R1
<400> 158
agtagggact gggtcttcga atct 24
<210> 159
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B.1.1.7 - F3
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 第3位的T是LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> 第7位的T是LNA
<400> 159
gttacttggt tccatgctat ctc 23
<210> 160
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B.1.1.7 - R36
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> 第5位的T是LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> 第8位的T是LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> 第19位的T是LNA
<400> 160
caacttttgt tgtttttgtg gtaagc 26
<210> 161
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2 S基因 / B.1.1.7 - P3探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> 第19位的T是LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> 第22位的T是LNA
<400> 161
agaggtttga taaccctgtc ctacca 26
<210> 162
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2 S基因 / B.1.1.7- P4探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 第2位的T是LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 第21位的T是LNA
<400> 162
tttgcttcca ctgagaagtc taacat 26

Claims (20)

1.一种PCR方法，其包括用用于SARS-CoV-2RdRP的至少引物核苷酸序列、用于SARS-CoV-2E基因的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤，其中所述PCR方法是多重PCR，优选多重实时RT-PCR，进一步优选地，所述多重实时RT-PCR方法包括用对于所述SARS-CoV-2RdRP特异性的至少一种(例如两种不同的)探针、对于所述SARS-CoV-2E特异性的至少一种(例如两种不同的)探针和对于所述人RNA酶P特异性的至少一种(例如两种不同的)探针进行所述同时扩增步骤。
2.一种PCR方法，其包括
(i)第一PCR方法，所述第一PCR方法包括用用于SARS-CoV-2RdRP的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列，优选地用对于所述SARS-CoV-2RdRP特异性的至少一种(例如两种不同的)探针和对于人RNA酶P特异性的至少一种(例如两种不同的)探针，进行同时扩增步骤；和/或
(ii)第二PCR方法，所述第二PCR方法包括用用于SARS-CoV-2E基因的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列，
优选地用对于所述SARS-CoV-2E特异性的至少一种(例如两种不同的)探针和对于所述人RNA酶P特异性的至少一种(例如两种不同的)探针，进行同时扩增步骤，
其中将怀疑包含SARS-CoV-2核酸的相同来源材料用于(i)和(ii)的所述PCR，其中所述第一和第二PCR方法是多重PCR方法，优选多重实时RT-PCR方法。
3.一种PCR方法，其包括
(i)第一PCR方法，所述第一PCR方法包括用用于SARS-CoV2 E基因的至少引物核苷酸序列和用于独特掺入RNA的至少引物核苷酸序列，
优选地用对于所述SARS-CoV-2E特异性的至少一种(例如两种不同的)探针和对于所述独特掺入RNA特异性的至少一种(例如两种不同的)探针，进行同时扩增步骤；
(ii)第二PCR方法，所述第二PCR方法包括用用于SARS-CoV-2RdRP基因的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列，优选地用对于所述SARS-CoV-2RdRP特异性的至少一种(例如两种不同的)探针和对于所述人RNA酶P特异性的至少一种(例如两种不同的)探针，进行同时扩增步骤；和
(iii)第三PCR方法，所述第三PCR方法包括用用于SARS-CoV-2RdRP基因的至少引物核苷酸序列、用于SARS-CoV-2E基因的至少引物核苷酸序列、用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列和用于独特掺入RNA的至少引物核苷酸序列，优选地用对于所述SARS-CoV-2RdRP特异性的至少一种(例如两种不同的)探针、对于所述SARS-CoV-2E特异性的至少一种(例如两种不同的)探针和对于所述人RNA酶P特异性的至少一种探针和对于所述独特掺入RNA特异性的至少一种探针，进行同时扩增步骤；
其中将怀疑包含SARS-CoV-2核酸的相同来源材料用于(i)和(ii)的所述PCR方法，并且
其中(iii)的所述PCR方法进一步包括作为阳性对照的用于SARS-CoV-2RdRP基因的核糖核酸、用于SARS-CoV-2E基因的核糖核酸、用于人RNA酶P的核糖核酸和用于独特掺入RNA的核糖核酸，其中所述第一、第二和第三PCR方法是多重PCR方法，优选多重实时RT-PCR方法。
4.一种PCR方法，其包括：
(i)第一PCR方法，所述第一PCR方法包括用用于SARS-CoV2 E基因的至少引物核苷酸序列、用于IAV PB1基因的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列，优选地用对于SARS-CoV-2E特异性的至少一种(例如两种)探针、对于IAV PB1基因特异性的至少一种(例如两种)探针和对于人RNA酶P特异性的至少一种探针，进行同时扩增步骤；
(ii)第二PCR方法，所述第二PCR方法包括用用于SARS-CoV-2RdRP基因的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列和用用于IBV PA基因的至少引物核苷酸序列，优选地用对于SARS-CoV-2RdRP特异性的至少一种(例如两种，例如两种部分重叠但不相同的)探针、对于人RNA酶P特异性的至少一种探针和对于IBVPA基因特异性的至少一种(例如两种)探针，进行同时扩增步骤；
其中将怀疑包含SARS-CoV-2核酸的相同来源材料用于(i)和(ii)的所述PCR方法，其中所述第一和第二PCR方法是多重PCR方法，优选多重实时RT-PCR方法。
5.一种PCR方法，其包括用用于SARS-CoV-2RdRP的至少引物核苷酸序列、用于SARS-CoV-2E基因的至少引物核苷酸序列和用于人RNA酶P的至少引物核苷酸序列、用于IBV PA基因的至少引物核苷酸序列和用于IAV PB1基因的至少引物核苷酸序列(其中所述PCR方法是多重PCR方法，优选多重实时RT-PCR)，进一步优选地用对于SARS-CoV-2E特异性的至少一种(例如两种)探针、对于IAV PB1基因特异性的至少一种(例如两种)探针、对于人RNA酶P特异性的至少一种探针、对于SARS-CoV-2RdRP特异性的至少一种(例如两种，例如两种部分重叠但不相同的)探针和对于IBV PA基因特异性的至少一种探针，进行同时扩增步骤。
6.根据前述权利要求中任一项所述的PCR方法，其中：
i)对于IAV PB1的扩增步骤，至少使用SEQ ID NOs:83-84或121-128、优选SEQ ID NOS:83-84中示出的引物核苷酸序列；进一步优选地与选自SEQ ID NOs:85、129-131、优选SEQID NO:85的至少一种探针一起；和/或
ii)对于IBV PA的扩增步骤，至少使用SEQ ID NOs:86-87或132-144、优选SEQ ID NOS:86-87中示出的引物核苷酸序列；进一步优选地与选自SEQ ID NOs:88、145-153、优选SEQID NO:88的至少一种探针一起。
7.根据前述权利要求中任一项所述的PCR方法，其中对于SARS-CoV-2RdRP的扩增步骤，至少使用SEQ ID NOs:1和2、SEQ ID NOs:27和28、SEQ ID NOs:33和34、SEQ ID NOs:43和44、SEQ ID NOs:54和55、SEQ ID NOs:65和66、SEQ ID NOs:76和77、SEQ ID NOs:109和110、SEQ ID NOs:109和111或SEQ ID NOs:109和112中示出的引物核苷酸序列，优选地与选自SEQ ID NOs:29、35、45、46、56、57、67、68、78、79和113-120的至少一种(例如两种)探针一起，进一步优选地与选自SEQ ID NOs:45-46、SEQ ID NOs:56-57、67-68、78-79的两种部分重叠的(例如部分地包含相同的序列，但不相同的)探针一起。
8.根据前述权利要求中任一项所述的PCR方法，其中对于SARS-CoV-2E基因的扩增步骤，至少使用SEQ ID NOs:4或22和5、SEQ ID NOs:24-25、SEQ ID NOs:30-31、SEQ ID NO:39-40、50-51、61-62、72-73、或89-101中任一个与102中示出的引物核苷酸序列，优选地与选自SEQ ID NOs:26、32、41、42、52、53、63、64、74、75、103-108的至少一种(例如两种)探针一起，进一步优选地与选自SEQ ID NOs:41-42、SEQ ID NOs:52-53、63-64、74-75的两种探针一起。
9.根据前述权利要求中任一项所述的PCR方法，其中对于人RNA酶P的扩增步骤，至少使用SEQ ID NOs:7和8、或SEQ ID NOs:36-37、47-48、58-59、69-70、80-81或154-155中示出的引物核苷酸序列，优选地与选自SEQ ID NOs:38、49、60、71、82或156的至少一种探针一起。
10.根据前述权利要求中任一项所述的PCR方法，其中对于独特掺入RNA的扩增步骤，至少使用SEQ ID NOs:17和18中示出的引物核苷酸序列。
11.根据前述权利要求中任一项所述的PCR方法，其进一步包括：
i)包含SEQ ID NO:3中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:6中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:9中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:19中示出的核苷酸序列的探针；和/或
ii)包含SEQ ID NO:26中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:29中示出的核苷酸序列的探针，优选地与SEQ ID NOs:24-25和27-28中示出的引物核苷酸序列相组合；和/或
iii)包含SEQ ID NO:32中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:35中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:38中示出的核苷酸序列的探针，优选地与SEQ ID NOs:30-31、33-34和36-37中示出的引物核苷酸序列相组合；和/或
iv)包含SEQ ID NO:41中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:42中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:45中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:46中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQID NO:49中示出的核苷酸序列的探针，优选地与SEQ IDNOs:39-40、
43-44、47-48中示出的引物核苷酸序列相组合；和/或
v)包含SEQ ID NO:52中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:53中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:56中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:57中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQID NO:60中示出的核苷酸序列的探针，优选地与SEQ ID NOs:50-51、
54-55、58-59中示出的引物核苷酸序列相组合；和/或
vi)包含SEQ ID NO:63中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:64中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:67中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:68中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQID NO:71中示出的核苷酸序列的探针，优选地与SEQ IDNOs:61-62、
65-66和69-70中示出的引物核苷酸序列相组合；和/或
vii)包含SEQ ID NO:74中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:
75中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:78中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:79中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:82中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:85中示出的核苷酸序列的探针、包含SEQ ID NO:88中示出的核苷酸序列的探针，优选地与SEQ ID NOs:72-73、76-77、80-81、83-84和86-87中示出的引物核苷酸序列相组合。
12.根据前述权利要求中任一项所述的PCR方法，其中
使用具有SEQ ID NO:10中示出的序列的核糖核酸作为阳性对照，
使用具有SEQ ID NO:11或23中示出的序列的核糖核酸作为阳性对照，
使用具有SEQ ID NO:12中示出的序列的核糖核酸作为阳性对照，任选地所述阳性对照进一步包含面包酵母tRNA和/或鲑鱼精DNA形式的核酸诱饵。
13.根据前述权利要求中任一项所述的PCR方法，其中使用具有SEQ IDNO:20中示出的序列的核糖核酸作为掺入RNA。
14.一种试剂盒，所述试剂盒至少包含SEQ ID NOs:1和2或SEQ ID NOs:27-28、SEQ IDNOs:33-34、SEQ ID NOs:43-44、SEQ ID NOs:54-55、SEQ ID NOs:65-66、SEQ ID NOs:76-77、SEQ ID NOs:109-110、SEQ ID NOs:109和111或SEQ ID NOs:109和112中示出的引物核苷酸序列，任选地包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NOs:29、35、45、46、56、57、67、68、78、79或113-120的核苷酸序列的至少一种(例如两种不同的)探针，优选地包含选自SEQ ID NOs:45-46、SEQ ID NOs:56-57、67-68、78-79的两种(例如部分重叠但不相同的)探针，以及进一步任选地用于实施PCR扩增步骤的工具，优选地，所述试剂盒是多重PCR试剂盒，优选地，所述多重PCR试剂盒是多重实时RT-PCR试剂盒。
15.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其进一步至少包含SEQ ID NOs:4或22和5或SEQ ID NOs:24-25、SEQ ID NOs:30-31、SEQ ID NOs:39-40、50-51、61-62、72-73、或89-101中任一个与102的组合中示出的引物核苷酸序列，和任选地包含选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NOs:26、32、41、42、52、53、63、64、74、75、103-108的核苷酸序列的至少一种(例如两种不同的)探针，优选地包含选自SEQ ID NOs:41-42、SEQ ID NOs:52-53、63-64、74-75的两种(例如不同的)探针。
16.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其进一步至少包含SEQ ID NOs:7和8或SEQ ID NOs:36-37、47-48、58-59、69-70、80-81或154-155中示出的引物核苷酸序列，和任选地包含选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NOs:38、49、60、71、82或156的核苷酸序列的至少一种(例如两种，例如两种不同的)探针。
17.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其进一步至少包含SEQ ID NOs:83-84或121-128、优选SEQ ID NOs:83-84中示出的引物核苷酸序列，任选地选自SEQ ID NOs:85、129-131、进一步优选SEQ ID NO:85的至少一种(例如两种，例如两种不同的)探针。
18.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其进一步至少包括使用SEQ ID NOs:86-87或132-144、优选SEQ ID NOs:86-87中示出的引物核苷酸序列，任选地选自SEQ IDNOs:88、145-153、进一步优选SEQ ID NO:88的至少一种(例如两种，例如两种不同的)探针。
19.引物核苷酸序列的用途，其中所述引物序列：
(a)在SEQ ID NOs:1-2或SEQ ID NOs:27-28、SEQ ID NOs:33-34、SEQID NOs:43-44、SEQ ID NOs:54-55、SEQ ID NOs:65-66、SEQ IDNOs:76-77、SEQ ID NOs:109-110、SEQ IDNOs:109和111、SEQ IDNOs:109和112中示出，优选地与选自SEQ ID NOs:29、35、45、
46、56、57、67、68、78、79和113-120的至少一种(例如两种)探针一起，进一步优选地与选自SEQ ID NOs:45-46、SEQ ID NOs:56-57、67-68、78-79的两种部分重叠的探针(例如不相同的探针)一起；和/或
(b)在SEQ ID NO:4或22和5、或SEQ ID NOs:24-25、SEQ ID NOs:30-31、SEQ ID NOs:39-40、50-51、61-62、72-73、89-101中任一个与102中示出，优选地与选自SEQ ID NOs:26、32、41、42、52、53、
63、64、74、75、103-108的至少一种(例如两种)探针一起，进一步优选地与选自SEQ IDNOs:41-42、SEQ ID NOs:52-53、63-64、74-75的两种探针一起；和/或
(c)在SEQ ID NOs:83-84或121-128、优选SEQ ID NOs:83-84中示出，
进一步优选地与选自SEQ ID NOs:85、129-131、最优选SEQ ID NO:
85的至少一种探针一起；
(d)在SEQ ID NOs:86-87或132-144、优选SEQ ID NOs:86-87中示出，
进一步优选地与选自SEQ ID NOs:SEQ ID NOs:88、145-153、优选SEQ ID NO:88的至少一种探针一起；
其中(a)、(b)、(c)和(d)的所述序列单独使用或彼此组合使用以用于以下中的一种或多种：
(i)样品中SARS-CoV-2和/或IAV和/或IBV的体外检测(例如同时，例如多重检测)，
(ii)受试者的SARS-CoV-2和/或IAV和/或IBV感染的体外检测(例如同时，例如多重检测)，
(iii)血液样品的SARS-CoV-2和/或IAV和/或IBV污染的体外检测(例如同时，例如多重检测)，或
(iv)体外监测(例如同时，例如多重监测)SARS-CoV-2和/或IAV和/或IBV的治疗，
其中所述用途是用于多重PCR检测、优选多重实时RT-PCR检测的用途；
(v)用于根据前述权利要求中任一项所述的PCR方法/在根据前述权利要求中任一项所述的PCR方法中使用，优选地所述方法是体外或离体方法。
20.根据前述权利要求任一项所述的PCR方法、试剂盒或用途，其中所述引物和/或探针核苷酸序列包含一个或多个(例如2、3或4个)锁核酸(LNA)修饰的核苷酸(例如LNA是合成核酸类似物，其含有桥连的双环糖部分，例如核糖环的2’氧与4’碳之间的亚甲基键)，优选地，所述一个或多个(例如2、3或4个)LNA修饰的核苷酸是LNA修饰的胸腺嘧啶残基(例如LNA-T)和/或LNA修饰的腺苷残基(例如LNA-A)。
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