CN114214392A

CN114214392A - 一种基于核酸四面体的冠状病毒定量检测方法及其应用

Info

Publication number: CN114214392A
Application number: CN202111365035.1A
Authority: CN
Inventors: 陈俊华; 刘承帅; 潘家峰; 邓芳
Original assignee: Institute of Eco Environmental and Soil Sciences of Guangdong Academy of Sciens
Current assignee: Institute of Eco Environmental and Soil Sciences of Guangdong Academy of Sciens
Priority date: 2021-11-17
Filing date: 2021-11-17
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2041-11-17
Also published as: CN114214392B

Abstract

本发明公开了一种基于核酸四面体的冠状病毒定量检测方法及其应用，该检测方法包括：将核酸外切酶、检测样品和CDN混合孵育，灭活核酸外切酶，加入发夹探针，底物链，镁离子，根据冠状病毒标准曲线和反应体系的荧光强度计算检测样品中的冠状病毒浓度。本发明中的定量检测方法可以同时检测一种或多种冠状病毒，且灵敏度高，回收率值和相对标准偏差分别为95.8％～107％和4.3％～6.7％，线性范围10fM‑100pM，有效检出限可以达到2.5fM，相比与常规的检测技术更加精准灵敏。

Description

一种基于核酸四面体的冠状病毒定量检测方法及其应用

技术领域

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种基于核酸四面体的冠状病毒定量检测方法及其应用。

背景技术

冠状病毒属于套式病毒目，冠状病毒科，是目前自然界已知的最大RNA病毒。冠状病毒亚科分为四个属，包括α冠状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒和δ冠状病毒。新型冠状病毒因其传播迅速、发病率高和死亡率显著而对人类健康具有极大的危害性。因此，快速准确地诊断冠状病毒对于控制当前的新冠病毒疫情至关重要。

目前主要用于诊断冠状病毒的方法为聚合酶链反应(PCR)，使用PCR检测COVID-19通常需要3个多小时，而且，根据研究发现，使用PCR方法检测COVID-19容易存在假阴性病例。尤其是新冠病毒的重组和突变更是增加了检测单个靶区的PCR假阴性结果的风险，使得患者无法及时隔离和治疗，导致更广泛的传播。

因此，迫切需要开发一种能够高选择性检测不同类型冠状病毒的多功能定量检测方法，以获得更加准确的检测结果，从而切实有效的控制新冠病毒的传播。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种基于核酸四面体的冠状病毒定量检测方法及其应用，本发明中的冠状病毒定量检测方法可以实现同时定量检测多种冠状病毒的技术效果，且检测精度高，检出限低，检测耗时短，具有极好的实际应用价值。

本发明的第一个方面，提供一种冠状病毒定量检测试剂，该冠状病毒定量检测试剂中包括发夹探针、核酸四面体和底物链。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述核酸四面体由4条CDN探针链杂交得到，每一条CDN探针链均含有Mg²⁺依赖性DNA酶的亚单位，其中一条CDN探针链可与另外三条CDN探针链中的任一条杂交获得完整的Mg²⁺依赖性DNA酶链，另外三条CDN探针链之间无法杂交获得完整的Mg²⁺依赖性DNA酶链。

在本发明的一些优选实施方式中，所述CDN探针链的核苷酸序列为：

CDN探针链A：

CDN探针链B：

CDN探针链C：

CDN探针链D：

其中CDN探针链中加粗部分为Mg2+依赖性DNA酶的亚单位，CDN探针链A的Mg2+依赖性DNA酶亚单位序列分别与CDN探针链B、C、D的Mg2+依赖性DNA酶亚单位序列在特定的底物链的干预下会形成完整的Mg2+依赖性DNA酶链。CDN探针链B、C、D的Mg2+依赖性DNA酶亚单位序列之间无法形成完整的Mg2+依赖性DNA酶链。

在本发明的一些优选实施方式中，核酸四面体(CDN)的构建方法为：取CDN探针链A，CDN探针链B，CDN探针链C，CDN探针链D混合(以HEPES缓冲液为溶剂)，90～92℃退火10～11min，然后在1min内冷却到4℃，即可。

组成动态网络(CDN)在控制细胞内转化中起着重要作用。现有技术中尚无基于CDN的冠状病毒诊断传感系统，而且，本发明还同时基于特殊的探针底物组合，使用DNA作为构建块来执行二进制算术处理，从而实现CDN与DNA生物计算系统的有机结合，使其能够执行基本、高级和复杂的逻辑功能，对冠状病毒诊断方法的开发起到了重要的推进作用。

在本发明的一些优选实施方式中，所述发夹探针靶向冠状病毒，其核苷酸序列分别为：

发夹探针H1：

发夹探针H2：

发夹探针H3：

发夹探针H4：

发夹探针H5：

其中，发夹探针H1、H4加粗部分靶向COVID-19特异性序列，发夹探针H2、H5加粗部分靶向Bat-SL-CoVZC45特异性序列，发夹探针H3加粗部分靶向SARS-CoV特异性序列。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述底物链的两端分别连接有荧光基团和淬灭基团，且所述底物链中含有Mg²⁺依赖性DNA酶的酶切位点。

底物链核苷酸序列分别为：

Sub-AB：5'-AGAGTATrAGGATATC-3'(SEQ ID NO.10)；

Sub-AC：5'-TGACGATrAGGATATC-3'(SEQ ID NO.11)；

Sub-AD：5'-TCAGGATrAGGATATC-3'(SEQ ID NO.12)。

其中，rA为DNA酶的酶切位点。3条底物链的5’端和3’端均分别连接有荧光基团和淬灭基团。在本发明实施例中，Sub-AB的5’端连接有FAM，3’端连接有BHQ1；Sub-AC的5’端连接有ROX，3’端连接有BHQ2；Sub-AD的5’端连接有Cy5，3’端连接有BHQ2。

当然，本领域技术人员也可以选择其他的荧光基团与淬灭基团的组合，所选择的各荧光基团的检测波长不同。

本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的冠状病毒定量检测试剂在制备冠状病毒定性检测产品中的应用。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述产品包括检测试剂盒和生物传感器。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述冠状病毒为β属冠状病毒；在本发明的一些优选实施方式中，所述冠状病毒包括COVID-19、Bat-SL-CoVZC45和SARS-CoV。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述冠状病毒定量检测产品的使用方法为：将核酸外切酶、检测样品和CDN探针链A、CDN探针链B、CDN探针链C、CDN探针链D混合孵育，灭活核酸外切酶，加入发夹探针H1(或替换为H4)、发夹探针H2(或替换为H5)、发夹探针H3中的至少一种，Sub-AB、Sub-AC、Sub-AD中的至少一种(发夹探针H1或H4对应Sub-AB，发夹探针H2或H5对应Sub-AC，发夹探针H3对应Sub-AD)，镁离子，根据冠状病毒标准曲线和反应体系的荧光强度计算检测样品中的冠状病毒浓度。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述冠状病毒定性检测产品的检测体系为：

在本发明的一些优选实施方式中，所述反应体系为：

原理示意图如说明书附图图1所示。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述冠状病毒为β属冠状病毒，所述冠状病毒优选包括COVID-19、Bat-SL-CoVZC45和SARS-CoV。

判断标准为：

当反应体系在500～650nm波长存在荧光光谱(Ex＝480nm，Em＝520nm)，则说明检测样品中含有冠状病毒COVID-19，根据冠状病毒COVID-19标准曲线和反应体系的荧光强度可定量待测样品中的COVID-19冠状病毒浓度。

当反应体系在590～740nm波长存在荧光光谱(Ex＝550nm，Em＝610nm)，则说明检测样品中含有冠状病毒Bat-SL-CoVZC45，根据冠状病毒Bat-SL-CoVZC45标准曲线和反应体系的荧光强度可定量待测样品中的Bat-SL-CoVZC45冠状病毒浓度。

当反应体系在600～750nm波长存在荧光光谱(Ex＝570nm，Em＝670nm)，则说明检测样品中含有冠状病毒SARS-CoV，根据冠状病毒SARS-CoV标准曲线和反应体系的荧光强度可定量待测样品中的SARS-CoV冠状病毒浓度。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种可以定性检测冠状病毒的检测方法，该方法基于核酸四面体和特殊的探针底物组合，可以同时检测一种或多种冠状病毒，且灵敏度高，回收率值和相对标准偏差分别为95.8％～107％和4.3％～6.7％，线性范围10fM-100pM，有效检出限可以达到2.5fM，相比与常规的检测技术更加精准灵敏。

附图说明

图1为本发明实施例中的冠状病毒定量检测方法的原理示意图；

图2为不同孵育温度对冠状病毒定量检测方法的影响；

图3为不同Exo-III反应时间对冠状病毒定量检测方法的影响；

图4为不同Exo-III剂量对冠状病毒定量检测方法的影响；

图5为冠状病毒定量检测方法检测COVID-19病毒片段(A)、Bat-SL-CoVZC45病毒片段(B)、SARS-CoV病毒片段(C)的单独检测荧光强度；

图6为冠状病毒定量检测方法检测COVID-19病毒片段(A)、Bat-SL-CoVZC45病毒片段(B)、SARS-CoV病毒片段(C)的单探针和多探讨荧光差异对比图；

图7为冠状病毒定量检测方法检测不同COVID-19病毒片段的荧光强度差异；

图8为冠状病毒定量检测方法对COVID-19病毒片段的特异性检测结果；

图9为冠状病毒定量检测方法对Bat-SL-CoVZC45病毒片段的特异性检测结果；

图10为冠状病毒定量检测方法对SARS-CoV病毒片段的特异性检测结果；

图11为不同浓度COVID-19病毒片段的荧光成像图(A)和荧光曲线图(B)；

图12为COVID-19病毒片段的浓度-荧光强度曲线图(A)和标准曲线图(B)；

图13为不同浓度Bat-SL-CoVZC45病毒片段的荧光成像图(A)和荧光曲线图(B)；

图14为Bat-SL-CoVZC45病毒片段的浓度-荧光强度曲线图(A)和标准曲线图(B)；

图15为不同浓度SARS-CoV病毒片段的荧光成像图(A)和荧光曲线图(B)；

图16为SARS-CoV病毒片段的浓度-荧光强度曲线图(A)和标准曲线图(B)。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

一种基于核酸四面体的冠状病毒定量检测方法

本实施例中的基于核酸四面体的冠状病毒定量检测方法，其主要基于核酸四面体的结构动态网络、探针和底物链的搭配构建得到，从而实现三种冠状病毒的快速、高灵敏度的定量检测。

本实施例中的用于定量检测冠状病毒的检测方法主要基于核酸四面体(核酸四面体结构动态网络CDN)、发夹探针、底物链和核酸外切酶(Exo III，购自新英格兰生物实验室公司)各组分构成。

其中，核酸四面体由A、B、C和D共4条CDN探针链中的各一条组成，其中，各CDN探针链的核苷酸序列分别为：

CDN探针链A：

CDN探针链B：

CDN探针链C：

CDN探针链D：

发夹探针的核苷酸序列分别为：

发夹探针H1：

发夹探针H2：

发夹探针H3：

发夹探针H4：

发夹探针H5：

底物链包括下述3条底物链，其核苷酸序列分别为：

Sub-AB：5'-AGAGTATrAGGATATC-3'(SEQ ID NO.10)；

Sub-AC：5'-TGACGATrAGGATATC-3'(SEQ ID NO.11)；

Sub-AD：5'-TCAGGATrAGGATATC-3'(SEQ ID NO.12)。

该冠状病毒定量检测方法的具体步骤为：

(1)试验材料的准备与前处理：

①核酸四面体(CDN)的构建：

将250nM的CDN探针链A、B、C和D(溶解于10mM HEPES缓冲液(pH 7.2，20mM MgCl₂)中)与10mM HEPES缓冲液混合，在90℃退火10min，然后在1min内冷却到4℃，即可得到CDN。

其中，CDN的纯化可采用QIAquick Gel Extraction Kit(购自QIAgen)进行，纯化步骤参考试剂盒说明书。

②发夹探针的发夹结构的获得：

将发夹探针在HEPES缓冲液(pH 7.2，20mM MgCl₂)中加热至95℃，持续5min，然后冷却至室温，即可得到具有发夹结构的发夹探针。

(2)冠状病毒的检测：

使用特定的底物链配合CDN和发夹探针分别对SARS-CoV、COVID-19或Bat-SL-CoVZC45进行定量检测，具体检测步骤为：

将具有发夹结构的发夹探针发夹探针H1、H2和H3(当然，根据实际检测对象，可选择加入其中的一种或多种)、检测样品、Exo III在25℃条件下混合孵育30min，然后加热至70℃，保持10～20min(本实施例为10min)使混合体系中的Exo III失活。然后再加入核酸四面体(CDN，由CDN探针链A、B、C、D组成)、底物链(根据实际检测对象，可选择加入其中的一种或多种)、镁离子溶液，室温(25±2℃)孵育45min(反应体系如表1所示)，记录500～750nm波长下的荧光光谱，根据标准曲线和荧光强度计算待测样品中的冠状病毒浓度。

表1

判断标准为：

本实施例中的定量检测原理如图1所示：

当检测样品中存在一种或多种冠状病毒，这些冠状病毒的特异性序列会在EoxIII酶和对应的发夹探针(COVID-19对应发夹探针H1、Bat-SL-CoVZC45对应H2、SARS-CoV对应H3，当然，也可以将H1替换为H4，或H2替换为H5，或将同时H1和H2替换H4盒H5)的作用下产生不同的序列(如对应于COVID-19的序列A*B*、对应于Bat-SL-CoVZC45的序列A*C*、以及对应于SARS-CoV的序列A*D*)。这些结合序列会分别与CDN杂交，从而促使CDN探针链A与另一条CDN探针链的尾端的Mg²⁺依赖性DNA酶亚单位尾端结合形成完整的Mg²⁺依赖性DNA酶链(具体为：序列A*B*会促使CDN探针链A与CDN探针链B尾端的Mg²⁺依赖性DNA酶亚单位尾端结合形成完整的Mg²⁺依赖性DNA酶链；序列A*C*会促使CDN探针链A与CDN探针链C尾端的Mg²⁺依赖性DNA酶亚单位尾端结合形成完整的Mg²⁺依赖性DNA酶链；序列A*D*会促使CDN探针链A与CDN探针链D尾端的Mg²⁺依赖性DNA酶亚单位尾端结合形成完整的Mg²⁺依赖性DNA酶链)，从而在体系中的Mg²⁺作用下酶切其对应的底物链(Sub-AB、Sub-AC和Sub-AD)。由于底物链两端均连接有荧光和淬灭基团，酶切使两者分别存在于不同的酶切片段中，从而荧光基团会产生强荧光。根据不同底物设置不同的荧光基团，选择各自合适的通道进行检测其荧光强度，通过不同冠状病毒的标准曲线和反应体系的荧光强度可定量待测样品中的对应冠状病毒的浓度。

冠状病毒定量检测方法的优化和可行性评估

为了获得最佳的检测体系，发明人分别探究了反应温度、Exo III反应时间和ExoIII剂量对上述检测方法的影响。在本实施例中，以1nM COVID-19病毒片段(DNA1)为检测样品。

(1)反应温度：

反应温度对于上述冠状病毒定量检测方法具有极为重要的意义，它不仅影响核酸四面体CDN的稳定性，还会影响Exo III的切割能力。

定量检测方法同上述实施例，混合孵育温度分别设置为4℃、25℃、37℃和45℃。

结果如图2所示。

可以发现，与对照组(Background，不含DNA1的等量蒸馏水)相比，随着温度从4℃增加到37℃，响应信号相应增加，但当温度进一步增加到45℃时，荧光信号开始显著降低。这可能是因为Exo III的催化活性在高于最佳温度(37℃)时会出现显著降低，从而影响其工作效率。而且，较高的温度也可能会降低核酸四面体的稳定性，导致背景增加。因此，为了获得最佳信号背景比(S/N)，保证检测的精度，最佳反应温度应为25℃。

(2)Exo-III反应时间：

定量检测方法同上述实施例，孵育反应温度设定为25℃，测试不同混合孵育时间(0，10，20，30，40和50min)下的检测效果。

结果如图3所示。

可以发现，在0～30min内，荧光信号随着反应时间逐渐增加，在30min后达到平台值，表明Exo III辅助扩增过程已完全完成，体系中的Sub-AB几乎被完全切割，不再产生更高的荧光信号，因此，为了节省检测时间，最佳反应时间应为30min。

(3)Exo-III剂量：

定量检测方法同上述实施例，反应温度设定为25℃，测试不同Exo-III剂量(5，10，20，30和40U)下的检测效果。

结果如图4所示。

可以发现，在5～20U使用剂量内，荧光信号随着剂量的增加逐渐增加，在20U后达到稳定值，不再产生更高的荧光信号，因此，为了节省检测成本，Exo III的最佳酶剂量为20U。

(4)可行性评估：

发明人分别以COVID-19病毒片段(DNA1)、Bat-SL-CoVZC45病毒片段(DNA2)、SARS-CoV病毒片段(DNA3)单独作为检测样品进行检测，检测方法同上述实施例。对照组(NoImput)为蒸馏水。

结果如图5所示。

可以发现，上述实施例均能够有效的检测出COVID-19病毒片段(DNA1)、Bat-SL-CoVZC45病毒片段(DNA2)、SARS-CoV病毒片段(DNA3)，且荧光指示特征明显，能够有效区分出COVID-19病毒片段(DNA1)、Bat-SL-CoVZC45病毒片段(DNA2)、SARS-CoV病毒片段(DNA3)。

同时，基于上述检测，在体系中还加入了其他不对应的底物链，以检测多探针环境下的检测效果。以COVID-19病毒片段(DNA1)为样品，检测方法同上述实施例，区别在于：在加入核酸四面体(CDN)和Sub-AB-FAM(表示其带有的荧光基团为FAM)的同时，还加入Sub-AC-ROX和Sub-AD-Cy5。

检测结果如图6所示。

图6中的纵坐标F₁/F₀是指存在(F₁)和不存在(F₀)COVID-19的情况下FAM的荧光强度。其中，FAM组表示只加入Sub-AB-FAM，FAM/ROX/Cy5组则表示加入了Sub-AC-ROX和Sub-AD-Cy5的体系。可以发现，两组之间不存在显著的差异性，说明Sub-AC-ROX和Sub-AD-Cy5的加入并不会对体系的荧光强度带来显著的变化，其检测精度不会受其影响。

同样，发明人对Bat-SL-CoVZC45病毒片段(DNA2)、SARS-CoV病毒片段(DNA3)的检测结果与此一致(图6B和6C)。

为了进一步验证上述实施例中的定量检测方法的可行性，发明人以不同的COVID-19病毒片段(DNA1、DNA4和DNA5)作为检测样品，采用上述实施例中的检测方法重复检测三次。

其中，DNA4的核苷酸序列为：5'-TTGAAGTGAATAGTTTTAGT-3'(SEQ ID NO.13)；

DNA5的核苷酸序列为：5'-TATGAGGCCCAATTTCACTA-3'(SEQ ID NO.14)。

结果如图7所示。

可以发现，在使用不同的病毒片段后，上述实施例中的检测方法依然能够稳定的检出，说明上述实施例中的定量检测方法对于特定冠状病毒的检测是稳定可行的，有效地减少检测的假阴性结果。

冠状病毒定量检测方法检测效果验证

(1)选择性(特异性)评估：

为了评估冠状病毒定量检测方法对冠状病毒诊断的选择性，发明人分别以COVID-19病毒片段(DNA1)、Bat-SL-CoVZC45病毒片段(DNA2)、SARS-CoV病毒片段(DNA3)和其他干扰序列作为检测样品(浓度均为1nM)进行测试。

DNA1～3均是基于GISAID和GenBank中的COVID-19、Bat-SL-CoVZC45和SARS-CoV全基因组序列获得的对应的特异性序列，能够用于代表COVID-19、Bat-SL-CoVZC45和SARS-CoV。

其中，COVID-19病毒片段的核苷酸序列为：

DNA1：5'-AGACAACTACTATTCAAACA-3'(SEQ ID NO.15)。

Bat-SL-CoVZC45病毒片段的核苷酸序列为：

DNA2：5'-CTGCAGTTGAAGAAAATAAA-3'(SEQ ID NO.16)。

SARS-CoV病毒片段的核苷酸序列为：

DNA3：5'-TGATACTACTGAGCAATCA-3'(SEQ ID NO.17)。

其他干扰序列包括：

①DNA1～3的单碱基错配序列(其中，下划线部分为对应的错配碱基)：

DNA1单碱基错配序列MC1：5'-AGTCAACTACTATTCAAACA-3'(SEQ ID NO.18)；

DNA2单碱基错配序列MB1：5'-CTTCAGTTGAAGAAAATAAA-3'(SEQ ID NO.19)；

DNA3单碱基错配序列MS1：5'-TGTTACTACTGAGCAATCA-3'(SEQ ID NO.20)。

②DNA1～3的双碱基错配序列(其中，下划线部分为对应的错配碱基)：

DNA1双碱基错配序列MC2：5'-AGTCTACTACTATTCAAACA-3'(SEQ ID NO.21)；

DNA2双碱基错配序列MB2：5'-CTTCTGTTGAAGAAAATAAA-3'(SEQ ID NO.22)；

DNA3双碱基错配序列MS2：5'-TGTTTCTACTGAGCAATCA-3'(SEQ ID NO.23)。

③DNA1～3的三碱基错配序列(其中，下划线部分为对应的错配碱基)：

DNA1三碱基错配序列MC3：5'-AGTCTATTACTATTCAAACA-3'(SEQ ID NO.24)；

DNA2三碱基错配序列MB3：5'-CTTCTGATGAAGAAAATAAA-3'(SEQ ID NO.25)；

DNA3三碱基错配序列MS3：5'-TGTTTCAACTGAGCAATCA-3'(SEQ ID NO.26)。

④DNA1～3的非互补序列：

DNA1非互补序列MCNC：5'-TCTGTTGTTGTTTTGTTTGT-3'(SEQ ID NO.27)；

DNA2非互补序列MBNC：5'-TATTTTAGTTTTTTTTGTTT-3'(SEQ ID NO.28)；

DNA3非互补序列MSNC：5'-GTTGTTATTGTTTTTTGTT-3'(SEQ ID NO.29)。

检测方法和检测体系同上述实施例。

结果如图8～10所示。

可以发现，使用上述实施例中的检测方法，DNA1、DNA2、DNA3和其他干扰序列的荧光强度存在显著差异，即便其他干扰序列为相应冠状病毒的单碱基突变序列，也能有效的进行区分，从而说明上述实施例中的检测方法对于冠状病毒的检测具有极好的选择性。

(2)灵敏度：

为了检测上述实施例中的检测方法的灵敏度，发明人分别选择了不同浓度(0、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM和1nM)的DNA1、DNA2、DNA3作为样品进行检测。

检测方法和检测体系同上述实施例。

DNA1的检测结果如图11～12所示。

DNA2的检测结果如图13～14所示。

DNA3的检测结果如图15～16所示。

可以发现，使用上述实施例中的检测方法的检测效果要远优于凝胶电泳，上述实施例中的检测方法对于DNA1的检测，从10fM到1nM呈良好的线性关系，回归方程为：

F520＝6.16×106+6.07×106lgC

式中，F520表示520nm下的荧光强度，C表示DNA1浓度，R²＝0.99。检测限为2.5fM(S/N＝3)。

对于DNA2和DNA3的检测，线性范围均为10fM至100μm。检测限分别为3.1fM(S/N＝3，DNA2)和2.9fM(S/N＝3，DNA3)。说明本发明实施例中的定量检测方法对于冠状病毒的检测具有极高的灵敏度。

上述冠状病毒定量检测方法的实际检测效果

在本实施例中，发明人以广州医科大学附属第四医院采集得到的口腔唾液样本为基础材料，分别加入不同浓度的上述DNA1、DNA2、DNA3进行检测。

在检测开始前，对所有的口腔唾液样本进行预处理：使用0.22μm微滤膜过滤，以去除不溶性颗粒。

检测方法和检测体系同上述实施例。

检测结果如表2所示。

表2口腔唾液样本实际检测结果

可以发现，使用上述实施例中的冠状病毒定量检测方法，其回收率值和相对标准偏差分别为95.8％～107％和4.3％～6.7％，说明其对于不同临床样品之间可能存在的干扰可以忽略不计，依然能够保持一个高灵敏度的检测水平。

上述冠状病毒定量检测方法与现有检测技术的对比

为了进一步体现上述实施例中的冠状病毒定量检测方法的高灵敏度检测效果，发明人分别参考不同文献中的COVID-19检测方法，对比上述实施例中的冠状病毒定量检测方法进行对比测试，结果如表3所示。

表3不同方法之间的COVID-19检测差异

从检测时间和检测成本上考量，结合检测限和线性范围，可以发现，上述实施例中的冠状病毒定量检测方法相对于目前现有的新冠病毒检测技术具有更高的技术优势(多种同时检测)和实际可用性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省科学院生态环境与土壤研究所

<120> 一种基于核酸四面体的冠状病毒定量检测方法及其应用

<130>

<160> 29

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gatatcagcg atacgcctac agcacttctt tttacattcc taagtctgaa acattacagc 60

ttgctacacg agaagagccg ccatagta 88

<210> 2

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttcagactta ggaatgtgct tcccacgtag tgtcgtttgt attggaccct cgcattttta 60

ctatggactc tgcgtcaccc atgttactct 90

<210> 3

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tatcaccagg cagttgacag tgtagcaagc tgtaatagat gcgagggtcc aatacttttt 60

atcaccgtac cagcgtcacc catgttcgtc a 91

<210> 4

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcaactgcct ggtgataaaa cgacactacg tgggaatcta ctatggcggc tcttcttttt 60

ttgattcagc tcggcgtcac ccatgttcct ga 92

<210> 5

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaagtgctgt agagagtcca tagttttttt actatggact ctctacagca cttcaatagt 60

agttgt 66

<210> 6

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaagtgctgt agtggtacgg tgattttttt atcaccgtac cactacagca cttccttcaa 60

ctgcag 66

<210> 7

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaagtgctgt agcgagctga atcatttttt tgattcagct cgctacagca cttcctcagt 60

agtatc 66

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgatactaca gagtccatag tttttttact atggactctg tagtatcaaa tagtagttgt 60

<210> 9

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgatactact ggtacggtga tttttttatc accgtaccag tagtatcact tcaactgcag 60

<210> 10

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agagtatagg atatc 15

<210> 11

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgacgatagg atatc 15

<210> 12

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcaggatagg atatc 15

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> COVID-19

<400> 13

ttgaagtgaa tagttttagt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> COVID-19

<400> 14

tatgaggccc aatttcacta 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> COVID-19

<400> 15

agacaactac tattcaaaca 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Bat-SL-CoVZC45

<400> 16

ctgcagttga agaaaataaa 20

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> SARS-CoV

<400> 17

tgatactact gagcaatca 19

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

agtcaactac tattcaaaca 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cttcagttga agaaaataaa 20

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tgttactact gagcaatca 19

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

agtctactac tattcaaaca 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cttctgttga agaaaataaa 20

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tgtttctact gagcaatca 19

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

agtctattac tattcaaaca 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cttctgatga agaaaataaa 20

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tgtttcaact gagcaatca 19

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tctgttgttg ttttgtttgt 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

tattttagtt ttttttgttt 20

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gttgttattg ttttttgtt 19

Claims

1.一种冠状病毒定量检测试剂，其特征在于，所述冠状病毒定量检测试剂中包括发夹探针、核酸四面体和底物链。

2.根据权利要求1所述的冠状病毒定量检测试剂，其特征在于，所述核酸四面体由4条CDN探针链杂交得到，每一条CDN探针链均含有Mg²⁺依赖性DNA酶的亚单位，其中一条CDN探针链可与另外三条CDN探针链中的任一条杂交获得完整的Mg²⁺依赖性DNA酶链，另外三条CDN探针链之间无法杂交获得完整的Mg²⁺依赖性DNA酶链。

3.根据权利要求1所述的冠状病毒定量检测试剂，其特征在于，所述发夹探针靶向冠状病毒。

4.根据权利要求1或3所述的冠状病毒定量检测试剂，其特征在于，所述发夹探针包括：

发夹探针H1：5'-GAAGTGCTGTAGAGAGTCCATAGTTTTTTTACTATGGACTCTCTACAGCACTTCAATAGTAGTTGT-3'(SEQ ID NO.5)；

发夹探针H2：5'-GAAGTGCTGTAGTGGTACGGTGATTTTTTTATCACCGTACCACTACAGCACTTCCTTCAACTGCAG-3'(SEQ ID NO.6)；

发夹探针H3：5'-GAAGTGCTGTAGCGAGCTGAATCATTTTTTTGATTCAGCTCGCTACAGCACTTCCTCAGTAGTATC-3'(SEQ ID NO.7)；

发夹探针H4：5'-TGATACTACAGAGTCCATAGTTTTTTTACTATGGACTCTGTAGTATCAAATAGTAGTTGT-3'(SEQ ID NO.8)；

发夹探针H5：5'-TGATACTACTGGTACGGTGATTTTTTTATCACCGTACCAGTAGTATCACTTCAACTGCAG-3'(SEQ ID NO.9)中的至少一种。

5.根据权利要求2所述的冠状病毒定量检测试剂，其特征在于，所述CDN探针链包括：

CDN探针链A：5'-GATATCAGCGATACGCCTACAGCACTTCTTTTTACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTA-3'(SEQ ID NO.1)；

CDN探针链B：5'-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCATTTTTACTATGGACTCTGCGTCACCCATGTTACTCT-3'(SEQ ID NO.2)；

CDN探针链C：5'-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATACTTTTTATCACCGTACCAGCGTCACCCATGTTCGTCA-3'(SEQ ID NO.3)；

CDN探针链D：5'-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTCTTTTTTTGATTCAGCTCGGCGTCACCCATGTTCCTGA-3'(SEQ ID NO.4)。

6.根据权利要求1所述的冠状病毒定量检测试剂，其特征在于，所述底物链的两端分别连接有荧光基团和淬灭基团，且所述底物链中含有Mg²⁺依赖性DNA酶的酶切位点；

所述底物链优选包括：

Sub-AB：5'-AGAGTATrAGGATATC-3'(SEQ ID NO.10)；

Sub-AC：5'-TGACGATrAGGATATC-3'(SEQ ID NO.11)；

Sub-AD：5'-TCAGGATrAGGATATC-3'(SEQ ID NO.12)中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的冠状病毒定量检测试剂，其特征在于，所述底物链的5’端和3’端分别连接有荧光基团和淬灭基团。

8.权利要求1～7任一项所述的冠状病毒定量检测试剂在制备冠状病毒定性检测产品中的应用；所述产品包括检测试剂盒和生物传感器。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述冠状病毒为β属冠状病毒，所述冠状病毒优选包括COVID-19、Bat-SL-CoVZC45和SARS-CoV。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述冠状病毒定性检测产品的检测体系为：