CN102301011A

CN102301011A - 对小rna进行定量的方法

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Publication number: CN102301011A
Application number: CN201080006461XA
Authority: CN
Inventors: 彼得·坎波·巴斯克
Original assignee: Exiqon AS
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 2009-02-02
Filing date: 2010-02-02
Publication date: 2011-12-28
Anticipated expiration: 2030-02-02
Also published as: JP2012516678A; IL214301A; US9096895B2; IL214301A0; ES2541356T3; EP2391736A2; DK2391736T3; AU2010207826A1; CN102301011B; WO2010085966A2; SG173506A1; EP2391736B1; AU2010207826B2; US20120071332A1; HK1162196A1; WO2010085966A3; JP5749656B2; CA2750029C; CA2750029A1

Abstract

本发明涉及利用定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术对微RNA分子进行扩增和定量的方法。所述方法包括以下步骤：(a)利用多聚腺苷化和引物延伸通过逆转录来产生与样品微RNA互补的cDNA分子和(b)利用微RNA特异的引物组通过qPCR对cDNA进行扩增和定量，所述微RNA特异的引物组为包含LNA单体的正向和反向引物。

Description

对小RNA进行定量的方法

发明领域

本发明涉及利用定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术对小的非编码的RNA分子进行扩增和定量的方法。

发明背景

微RNA是一类丰富的约22个核苷酸的非编码RNA，它们在动物、植物和病毒发育中起着重要的调节作用。差不多在15年前发现lin-4时就开始关注微RNA，lin-4编码的小RNA在线虫(C.elegans)生命周期和幼虫发育中参与线虫的时控和进程(Lee et al.1993 Cell 75：843-854，Wightman et al.1993 Cell 75：855-862)，但是直到最近才意识到微RNA所形成的主要类别的核糖调控子在动物中具有广泛的调节作用(Lagos-Quintana et al.2001 Science 294：853-858，Lau et al.2001 Science294：858-862，Lee and Ambros.2001 Science 294：862-864)。自从那时，对微RNA的研究发生了重大变革，现在miRBase数据库12.0版(http://微 RNA.sanger.ac.uk/)包括866种人类微RNA，并且PubMed数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)包括3900种微RNA相关的条款，这反映了对微RNA的兴趣和关注。

微RNA通过降解信使RNA靶标或阻碍其翻译在转录后水平参与基因表达的调控，并且据推测约有30％的人类基因组受微RNA的调控。微RNA的重要性还在于其参与多种细胞过程，包括发育、生长和增殖、凋亡、分化和诸如癌症和糖尿病的多种人类疾病(http://www.mir2disease.org/)。

最近的文章(Barbarotto et al 2008 Int.J.Cancer.122：969-977)中强调了微RNA在癌症中的重要性，这篇文章概括了miRNA参与人类癌症的主要模式：因此，“(i)在每类被分析的人类癌症中，miRNA均改变了；(ii)miRNA充当癌基因和肿瘤抑制物；(iii)miRNA的改变可导致易患癌症；(iv)miRNA谱型是癌症患者的新的诊断工具和(v)miRNA谱型代表癌症患者的诊断工具”。因此，对癌症患者细胞和体液中的微RNA进行表达谱分析和定量的方法意义重大。为了满足这个需求，本发明描述了为微RNA测定开发出的新的坚实且可靠的qRT-PCR测定。

通过qRT-PCR程序来定量微RNA是非常具有挑战性的，这是由于微RNA小，仅为21-25个核苷酸，这是正常用于PCR的引物的大小。Raymond et al.RNA.2005 Nov；11(11)：1737-44，Gilad et al.PLoS ONE.2008 Sep 5；3(9)：e3148和Sharbati-Tehrani et al.BMC Molecular Biology.2008，9：34公布了这个问题的解决方案。Raymond et al.描述的qRT-PCR测定包括基因特异的逆转录步骤以及随后利用含有锁核酸(LNA)分子的基因特异的正向引物和通用反向引物的SYBR

green qPCR步骤。Giladet al.报道的qRT-PCR测定包括多聚腺苷化步骤、非特异的逆转录步骤和qPCR步骤，该qPCR步骤涉及基因特异的正向引物、基因特异的TaqMan引物和通用反向引物。Sharbati-Tehrani et al.开发的qRT-PCR测定包括基因特异的逆转录步骤以及随后利用基因特异的正向引物和2条通用引物的SYBRgreen qPCR步骤。

然而，目前的通过qRT-PCR来定量微RNA的技术不能满足当前微RNA测定的需要，当前的微RNA测定需要允许在密切相关的微RNA之间进行辨别的高特异性、高敏感度、低本底以及相对简单的方案。

本发明的特征为对样品中的所有微RNA仅需要一步逆转录反应，此外，提供了一种具有不匹配特异性的极其敏感的PCR方法，可用来精确定量诸如微RNA的小RNA分子。

发明概述

为了建立和理解与诸如癌症的人类疾病相关的微RNA调节异常模式，需要新的改良的技术对人类细胞和体液中的微RNA进行检测和定量。为了本目的，本发明介绍了一种新的高度敏感和特异的测定。

一方面，本发明提供了对样品中的微RNA分子进行扩增和定量的方案：在本方案的第一步中，通过单管反应中两种酶的协同作用产生样品微RNA的互补DNA(cDNA)。首先，利用poly(A)聚合酶使微RNA的3’-末端加上poly-A尾，其次，使延伸引物与poly-A尾杂交，并利用微RNA作为模板通过逆转录酶产生cDNA。所述第一步骤是非特异性的，并且产生样品中存在的所有微RNA的cDNA。在本方案的第二步中，在qPCR反应中利用微RNA特异的引物组对特定cDNA进行扩增和定量，所述微RNA特异的引物组的正向引物和反向引物包含LNA单体。

另一方面，本发明提供了表18列出的寡核苷酸引物(SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 128)。

本发明的引物利用本发明方法可用来检测哺乳动物微RNA。

另一方面，本发明提供了检测哺乳动物微RNA的试剂盒，所述试剂盒包括通用延伸引物和微RNA特异的正向和反向引物组，这些引物组用来对至少一种微RNA、微RNA子集或所有已知的微RNA进行定量。

本发明可用于可靠且特异的定量微RNA测定，包括利用单一测定或自动平台上的高通量应用软件来诊断和预后疾病(例如癌症)的测定。利用本发明的方法可以分析从活有机体的各种细胞类型提取的含有RNA的样品，所述活有机体例如哺乳动物和植物以及包括受病毒感染的细胞。

尽管本发明的主要目的为提供定量微RNA的方法，但是所述方法可用于检测和/或定量所有类型的RNA，尤其是所有类型的小的非编码RNA。

附图

图1显示本发明的特异的qRT-PCR所涉及的步骤。为了说明原理，以微RNA的qRT-PCR为例，利用本方法分析的RNA还可以是任何其它小RNA分子或者甚至是mRNA。步骤1是用于样品中存在的所有微RNA的一管式反应。步骤2是利用特异微RNA的正向和反向引物所进行的微RNA特异的qPCR。椭圆形指示LNA插入正向和反向引物。当实际操作该方法时，首先利用poly(A)聚合酶使样品中存在的miRNA加上poly-A尾，所述poly(A)聚合酶将腺嘌呤残基添加到RNA分子的3’-末端。其次，通过与延伸引物的VN-poly-T-序列(N＝C、G、A和T；V＝C、G和A)的杂交，使该延伸引物与带poly-A尾的miRNA退火，所述延伸引物具有poly-T中央核苷酸序列、3’-末端VN简并基序和5’-末端尾。该引物可被称为通用RT引物。再次，延伸引物利用miRNA为模板在逆转录反应中被延伸。所有这些反应均在一管式反应中进行。得到的初级延伸产物由延伸引物和新合成的DNA组成，该产物是与样品中的所有miRNA互补的cDNA。下一步进行miRNA特异的PCR。miRNA特异的正向引物与新合成的cDNA的3’-末端退火，并且通过在DNA-聚合反应中利用初级延伸产物为模板延伸正向引物来进行上链合成。然后由miRNA特异的3’-末端序列、poly-T区段和5’-末端尾组成的miRNA特异的反向引物与所述上链杂交，并通过反向引物的延伸来合成下链。实施例部分对本发明方法进行了多方面的论述。

图2显示用正向引物5’ttmCaccaccttctcca(SEQ ID NO 1)和反向引物5’-ctttttttttttttttGctgggt(SEQ ID NO 2)对hsa-miR-197(实施例1)的扩增。合成的模板：加polyA尾/RT使用10⁷拷贝的合成的hsa-miR-197。PCR使用10⁵拷贝的量。总的人RNA：加polyA尾/RT(步骤1)使用100ng的总的人RNA。PCR使用1ng的量。阴性对照：水对照和RT反应中不加PolyA聚合酶的总的人RNA对照。黑线表示合成的模板所获得的结果，而灰线表示总的人RNA为模板所获得的结果。合成的模板和总的人RNA所获得的结果的熔解曲线几乎相同。

图3显示实施例2的扩增曲线和第一衍生的熔解曲线。

图4显示实施例4的扩增曲线，其中证实了hsa-let-7a和变体hsa-let-7f、hsa-let-7c与hsa-let-7e之间的差别。还指出了阴性对照的扩增信号。

图5A、5B和5C显示能在成熟miR、前miR和初级miR之间进行PCR扩增并作出区分的方法和过程。参见实施例6、7和8。A)所有RNA的3’-末端均被多聚腺苷化。B)利用通用RT引物(N＝C、G、A和T；V＝C、G和A)使多聚腺苷化的RNA逆转录成cDNA。C)利用基因特异的引物进行微RNA特异的PCR扩增。注意多聚腺苷化和基因特异的反向引物的位点能确保特异地检测个体分子成熟miR、前miR和初级miR中的每一种。图5A显示用于测定成熟miR的测定。图5B显示用于测定前miR的测定，以及图5C显示用于测定初级miR的测定。

图6显示(A)对前miR-203、miR-203和无模板对照(NTC)进行前miR-203测定的扩增曲线。(B)对前miR-203、miR-203和无模板对照(NTC)进行miR-203测定的扩增曲线。

图7显示一组挑选的miRNA基因在心脏和肝中的差别表达。数据用心脏和肝之间的交叉点(Cp)值(ΔCp)差异来表示，参见表15。

图8显示通过本方法对四种列出的miR的每一种进行检测(菱形黑线)，并与商用方法进行比较，其中以一管式反应对样品中存在的所有微RNA进行逆转录(球形灰线)。该图将交叉点(Cp)值表示为模板浓度的函数。每个值都是三次重复。

定义

“小RNA分子”是指活细胞中的微小RNA分子，例如小的“非编码RNA分子”，即不翻译成蛋白质的分子。非编码RNA分子包括的RNA例如微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNAs)、小时序RNA(stRNA)、抗基因RNA(agRNA)和piwi相互作用RNA(piRNA)。

术语“microRNA(微RNA)”、“miRNA”和“miR”是同义使用的，是指来源于诸如动物和植物的活有机体内源基因的21-25个核苷酸的非编码RNA。这些所谓的成熟miRNA是生物学活性的，且从具有长约75个核苷酸的被称为前miRNA(前miR)的较长的发夹样前体加工而来。前miRNA的前体是长为500-3000个核苷酸的初级miRNA(pri-miR)。MiRNA组装成称为miRNP的复合体，通过与信使RNA结合并干扰翻译效率来充当重要生物过程的主要调节物。本发明的靶微RNA是指所有已知的微RNA，例如从科技文献和诸如miRBase数据库(http://microRNA.sanger.ac.uk/)的公开数据库了解到的微RNA，miRBase数据库是由英国Sanger学院管理的互联网上的微RNA数据的首页。通过引用将miRBase release 12并入，包括其中公开的所有成熟的miRNA和成熟前的miRNA序列。“微RNA谱分析”描述了大规模的分析，其中测定样品(例如肿瘤样品)中所有微RNA的表达水平来建立特定疾病(例如癌症)的微RNA特征。

“添加poly-A尾(Adding poly-A tails)”、“添加poly-A尾(Poly-A tailing)”和“多聚腺苷化”是指合成poly(A)尾，poly(A)尾是位于RNA分子3’-末端的所有碱基均是腺嘌呤的RNA区段。多聚腺苷化是活有机体中天然的生物学过程，但是利用诸如商购的大肠杆菌Poly(A)聚合酶I(E-PAP)的多种聚合酶也可以在体外进行多聚腺苷化。

“延伸引物”和“RT引物”是指包含识别序列和随后的PCR扩增所必需的锚定序列的寡核苷酸引物，所述识别序列与靶脱氧核糖核酸和/或核糖核酸序列中的序列互补，例如与靶核糖核酸序列中成熟的微RNA或小的非编码RNA的3′-末端互补。所述延伸引物被用作逆转录反应中的锚定引物来产生引物延伸产物或cDNA。

“cDNA”是指利用逆转录酶对RNA模板的逆转录所产生的互补DNA。任何逆转录酶均可用来合成cDNA分子，例如源自莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV)逆转录酶、禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶、牛白血病病毒(BLV)逆转录酶、劳氏肉瘤病毒(RSV)逆转录酶和人类免疫缺陷病毒(HIV)逆转录酶的逆转录酶。

“引物”是指长度通常为约20至30个碱基的、短的、化学合成的寡核苷酸。它们与靶DNA杂交，然后靶DNA通过DNA聚合酶复制产生互补的DNA链。“正向引物”和“反向引物”构成PCR中所用的“PCR引物组”，其中它们与互补的DNA链杂交，并指导向着彼此复制，分别产生上链和下链，导致靶DNA片段以指数增长。可以通过任何DNA聚合酶进行模板来源的PCR引物延伸，例如细菌热稳定的DNA聚合酶，包括来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的Taq DNA聚合酶、来自激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)的Pfu DNA聚合酶、来自嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)的Vent DNA聚合酶或诸如Phusion DNA聚合酶的重组DNA聚合酶。

术语“扩增”、“PCR”、“PCR反应”和PCR扩增”是用来表示核酸扩增系统用途的可交替的术语，其利用聚合酶链式反应(PCR)使靶核酸增加。

“qPCR”和“实时定量PCR”是指利用PCR来扩增并同时对靶DNA分子进行定量。当使DNA输入标准化时，qPCR能同时检测和确定DNA样品中特定序列的拷贝数和相对量。随着每次扩增循环之后反应中积累的扩增DNA来对其进行实时定量。利用多种测定化学物来进行定量，包括诸如SYBR

green的荧光染料和诸如Taqman探针的荧光报告寡核苷酸探针，SYBR

green可插入双链DNA，Taqman探针可在扩增过程中释放荧光信号。

“qRT-PCR”是指其中逆转录反应中所产生的cDNA充当扩增过程的起始DNA模板的定量逆转录聚合酶链式反应，随后联合qPCR对低丰度的RNA分子(例如特定细胞或组织类型样品中的微RNA)进行定量。qPCR和qRT-PCR的方法描述于“定量PCR的A-Z”(Bustin，SA(ed.)InternationalUniversity Line(La Jolla，CA，USA)，2004)中，通过引用将其全文并入本文。

“杂交”是指两个互补单链核酸聚合物(例如寡核苷酸)的连接，所述核酸聚合物例如RNA、DNA或含核苷酸类似物(例如LNA寡核苷酸)或由所述核苷酸类似物组成的聚合物。杂交是高度特异的，并且可通过调节盐浓度和温度来控制。杂交在互补序列间发生，但是也可以在包含一些错配的序列间发生。因此，本发明方法所用的寡核苷酸可与靶分子100％互补。可选地，在一个实施方案中，寡核苷酸可以包含至少一处或两处错配。

术语寡核苷酸的“T_m”或“解链温度”在本文背景下是在115mM Na⁺、无甲酰胺时所测定的寡核苷酸和其完美互补的DNA链之间所形成的双螺旋稳定性的测定结果。通常将T_m定义为寡核苷酸和互补核苷酸链之间形成的双螺旋有50％解离为单链时的温度。寡核苷酸的长度和核苷酸组成，例如核苷酸序列和G和C核苷酸的含量是影响T_m的重要因素。用相应的LNA分子来取代寡核苷酸中的正常的A、G、C和T核苷酸可提高T_m。同样，由盐浓度、寡核苷酸浓度和存在的变性剂(例如甲酰胺或DMSO)所确定的杂交条件影响T_m。分子生物学领域内的技术人员了解，已经开发出了数个有用的计算理论T_m的公式用来评价PCR、Southern印迹和Northern印迹以及原位杂交的寡核苷酸的T_m。T_m计算的实例是OligoCalc(W.A.Kibbe(2007)Nucleic Acids Res Volume 35，Web Serverissue W43-W46)和http://www.exiqon.com/oligo-tools上的LNA探针T_m预测器。

本文所用的术语“碱基”包括天然存在的核碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以及非天然存在的核碱基，并且“非天然存在的”核碱基描述于Benner et al.、美国专利第5,432,272号和Susan M.Freier and Karl-Heinz Altmann，Nucleic Acid Research，25：4429-4443，1997中，非天然存在的核碱基例如黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧-N⁶-甲基腺嘌呤、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N⁴，N⁴-ethanocytosin、N⁶，N⁶-乙酰-2，6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C³-C⁶)-炔基-胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑嘧啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷。因此术语“核碱基”不仅包括已知的嘌呤和嘧啶杂环，还包括杂环类似物及其互变异构体。此外，天然和非天然存在的核碱基包括美国专利第3,687,808号、Sanghvi在Antisense Research andApplication中的第15章，Ed.S.T.Crooke and B.Lebleu，CRC Press，1993、Englisch，et al.，Angewandte Chemie，International Edition，30：613-722，1991(尤其参见第622和623页，以及Polymer Science and Engineering的Concise Encyclopedia，J.I.Kroschwitz Ed.，John Wiley & Sons，第858-859页，1990，Cook，Anti-Cancer DrugDesign 6：585-607，1991，通过引用将以上每一篇全文并入本文)中所公开的那些核碱基。

并入寡核苷酸中的核苷酸被称为核苷酸残基。

术语“核苷碱基”或“核碱基类似物”还意图包括可以充当类似于核苷碱基作用的杂环化合物，包括在大多数传统意义上不是核苷碱基但却作起到核苷碱基作用的某些“通用碱基”。特别提及的通用碱基是3-硝基吡咯或5-硝基吲哚。其它优选的化合物包括芘和吡啶基恶唑(pyridyloxazole)衍生物、芘基、芘甲基甘油(pyrenylmethylglycerol)衍生物等。其它优选的通用碱基包括吡咯、二唑或三唑衍生物，包括本领域内已知的那些通用碱基。

“锁核酸”、“LNA”、“LNA单体”或“LNA分子”(例如LNA核苷或LNA核苷酸)或LNA寡聚体(例如寡核苷酸或核酸)表示包含至少一个LNA单体的核苷或核苷酸类似物。

为了区分文中出现的含LNA的寡核苷酸序列中的LNA和天然存在的核苷酸残基，用大写字母表示LNA，而用小写字母表示天然存在的核苷酸残基：mC表示LNA甲基胞嘧啶。

PCT公开号WO 99/14226中所公开的LNA单体通常是用于并入本发明寡核苷酸中的特别理想的修饰核酸。此外，可以通过本领域内已知的任何修饰类型在3’和/或5’末端对核酸进行修饰。例如，一端或两端均可以加上保护基帽、均可与柔韧的连接基连接、均可与反应基连接以有助于连接到底物表面等。理想的LNA单体及其合成方法还在WO 98/39352中公开。

优选的LNA单体(也被称为“氧-LNA”)是PCT公开号WO 03/020739中所公开的包括双环化合物的LNA单体，其中如以下的通式(I)所示的R^4*和R^2*之间的桥为-CH₂-O-或-CH₂-CH₂-O-。

应当理解为本文提到的核酸单元、核酸残基、LNA单体或相似的术语包括单个的核苷单元和核苷酸单元以及寡核苷酸中的核苷单元和核苷酸单元。

“修饰的碱基”或其它相似的术语指的是可以与天然碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和/或胸腺嘧啶)配对和/或可以与非天然存在的核苷酸或核苷碱基配对的组合物(例如非天然存在的核苷酸或核苷碱基)。如本文所述，期望修饰的碱基提供的T_m能相差15、12、10、8、6、4或2℃或更低。示例性的修饰碱基如EP 1 072 679和WO 97/12896中所描述。

术语“化学部分”指的是分子的一部分。因此，“经化学部分修饰的”指的是通过不常见的化学结构的并入而对标准分子结构的修饰。所述结构的连接可以是共价的或非共价的。

因此，术语寡核苷酸探针中“化学部分的并入”指的是分子结构的连接。例如化学部分包括但不限于共价和/或非共价连接的小沟结合物(MGB)和/或嵌入核酸物(INA)，所述嵌入核酸物选自不对称的花青染料、DAPI、SYBRGreen I、SYBR

Green II、SYBR

Gold、PicoGreen

、噻唑橙、Hoechst 33342、溴化乙锭、1-O-(1-芘甲基)甘油和Hoechst 33258。其它的化学部分包括修饰的核苷酸、核苷碱基或LNA修饰的寡核苷酸。

“寡核苷酸类似物”指的是能识别特定靶核苷酸序列的核酸结合分子。特定的寡核苷酸类似物是肽核酸(PNA)，其中寡核苷酸的糖磷酸主链由蛋白样主链替代。PNA中，核苷酸与不带电的聚酰胺主链连接，产生嵌合的伪肽核酸结构，该结构与核酸形式同形。

“高亲和性核苷酸类似物”或“亲和性提高的核苷酸类似物”指的是当用至少一种这类高亲和性核苷酸类似物取代时，能增加寡核苷酸探针与其互补识别序列间的“结合亲和性”的非天然存在的核苷酸类似物。

如本文所用，与包含相同序列但不含稳定核苷酸的探针相比，与识别序列的“结合亲和性”提高的探针指的是这样的探针：探针识别区段的结合常数(K_a)高于双链分子的互补链的结合常数。在另一个优选的实施方案中，探针识别区段的结合常数高于双链分子靶序列中识别序列的互补链的解离常数(K_d)。

如果单体包含能形成Watson-Crick碱基配对原则(例如G与C、A与T或A与U)的氢键的核苷酸或其它氢键基序，则将这些单体称为“互补的”，所述其它氢键基序例如二氨基嘌呤与T、5-甲基C与G、2-硫代胸苷与A、肌苷与C、假异胞嘧啶与G等。

“寡核苷酸”、“寡聚体”或“寡核苷酸(oligo)”表示通过核苷间连接所连接的连续的单体(例如杂环碱基的糖苷)链。寡核苷酸中两个连续的单体间的连接由2-4个、优选3个选自以下的基团/原子组成：-CH₂-、-O-、-S-、-NR^H-、＞C＝O、＞C＝NR^H、＞C＝S、-Si(R″)₂-、-SO-、-S(O)₂-、-P(O)₂-、-PO(BH₃)-、-P(O，S)-、-P(S)₂-、-PO(R″)-、-PO(OCH₃)-和-PO(NHR^H)-，其中R^H选自氢和C_1-4-烷基，R″选自C_1-6-烷基和苯基。这类连接的示例性实例是-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CO-CH₂-、-CH₂-CHOH-CH₂-、-O-CH₂-O-、-O-CH₂-CH₂-、-O-CH₂-CH＝(当用作与下一个单体连接时，包括R⁵(参见通式I))、-CH₂-CH₂-O-、-NR^H-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-NR^H-、-CH₂-NR^H-CH₂-、-O-CH₂-CH₂-NR^H-、-NR^H-CO-O-、-NR^H-CO-NR^H-、-NR^H-CS-NR^H-、-NR^H-C(＝NR^H)-NR^H-、-NR^H-CO-CH₂-NR^H-、-O-CO-O-、-O-CO-CH₂-O-、-O-CH₂-CO-O-、-CH₂-CO-NR^H-、-O-CO-NR^H-、-NR^H-CO-CH₂-、-O-CH₂-CO-NR^H-、-O-CH₂-CH₂-NR^H-、-CH＝N-O-、-CH₂-NR^H-O-、-CH₂-O-N＝(当用作与下一个单体连接时，包括R⁵)，-CH₂-O-NR^H-、-CO-NR^H-CH₂-、-CH₂-NR^H-O-、-CH₂-NR^H-CO-、-O-NR^H-CH₂-、-O-NR^H-、-O-CH₂-S-、-S-CH₂-O-、-CH₂-CH₂-S-、-O-CH₂-CH₂-S-、-S-CH₂-CH＝(当用作与下一个单体连接时，包括R⁵)、-S-CH₂-CH₂-、-S-CH₂-CH₂-O-、-S-CH₂-CH₂-S-、-CH₂-S-CH₂-、-CH₂-SO-CH₂-、-CH₂-SO₂-CH₂-、-O-SO-O-、-O-S(O)₂-O-、-O-S(O)₂-CH₂-、-O-S(O)₂-NR^H-、-NR^H-S(O)₂-CH₂-、-O-S(O)₂-CH₂-、-O-P(O)₂-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)₂-O-、-S-P(O)₂-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)₂-O-、-O-P(O)₂-S-、-O-P(O，S)-S-、-O-P(S)₂-S-、-S-P(O)₂-S-、-S-P(O，S)-S-、-S-P(S)₂-S-、-O-PO(R″)-O-、-O-PO(OCH₃)-O-、-O-PO-(OCH₂CH₃)-O-、-O-PO(OCH₂CH₂S-R)-O-、-O-PO(BH₃)-O-、-O-PO(NHR^N)-O-、-O-P(O)₂-NR^H-、-NR^H-P(O)₂-O-、-O-P(O，NR^H)-O-、-CH₂-P(O)₂-O-、-O-P(O)₂-CH₂-和-O-Si(R″)₂-O-；以及-CH₂-CO-NR^H-、-CH₂-NR^H-O-、-S-CH₂-O-、-O-P(O)₂-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)₂-O-、-NR^H-P(O)₂-O-、-O-P(O，NR^H)-O-、-O-PO(R″)-O-、-O-PO(CH₃)-O-和-O-PO(NHR^N)-O-，R^H选自氢和C_1-4-烷基，R″选自C_1-6-烷基和苯基是特别理想的。Mesmaeker et.al.，Current Opinion in Structural Biology 1995，5，343-355和Susan M.Freier and Karl-Heinz Altmann，Nucleic Acids Research，1997，vol 25，pp 4429-4443中给出其它示例性的实例。核苷间连接的左侧作为取代3′-位置的P^*与5-元环连接，而右侧与上一个单体的5′-位置连接。

术语“下一个单体”指的是邻近5’-末端方向的单体，而“上一个单体”指的是邻近3’-末端方向的单体。应当指出，尽管DNA和RNA的天然合成以5’至3’方向进行，但是许多化学合成方案以3’至5’方向进行。

进行定量PCR时，样品荧光达到阈值时的循环数被称为“循环阈值”或Ct。Ct用来对模板定量。

“交叉点”或Cp值稍有不同，但是可用来对模板定量的相关值，这与Ct的用途略微相似。LightCycler

480软件计算整个扩增曲线的第二衍生并确定何时该值最大。该值(交叉点，Cp)代表荧光最高时的循环，并且此时PCR开始指数阶段。两个术语Ct和Cp在Bustin，SA(ed.)“定量PCR的A-Z”International University Line(La Jolla，California，USA)，2004，中均有进一步的解释，通过引用将该文章包括在本文中。

适当地，“靶标”或“靶核酸”或“靶核糖核酸”指的是单段特定序列的任何相关核酸，例如来源于个体或人的生物核酸。在本发明检测miRNA所用的寡核苷酸和检测探针的背景条件下，“靶标”是人类miRNA或其前体，或者在一个实施方案中，包括保留了遗传序列信息的分子-例如核苷酸序列的全部或(足够的)部分或其反向互补物。

“靶序列”指的是任何靶核酸中的特定核酸序列(或其对应的核碱基序列)。

术语“引物设计”指的是如以下所提供的那些方法。引物设计是用于设计正向和反向引物中的核苷酸序列，进而确保与靶微RNA的探针特异性以及结合效率的系统方法。以下原则用来设计miR-特异的qPCR的引物：

正向引物设计：

优选地，将正向引物设计成与miR序列5’末端的12-18个碱基一致。优选地，正向引物的T_m的范围应该为55℃-65℃，不过，T_m低于55℃和高于65℃也是可以接受的。为了确保引物的T_m范围优选为55℃-65℃，可以将一个或多个LNA单体插入序列中来取代天然的核苷酸。还可以将人工核苷酸序列添加到正向引物的5’-末端，从而确保Tm的范围为55℃-65℃。

反向引物设计：

反向引物为通式II：

R³-(T)x-R⁴(II)

其中R³是5’-末端核苷酸序列，(T)x是中间部分x个连续的胸腺嘧啶残基，其中x是1-100的整数，R⁴是与微RNA分子的一部分特异杂交的3’-末端核苷酸序列。

R⁴优选为从特定miRNA的3’-末端设计的1-10个核苷酸的核苷酸序列。R⁴能与由相应的miRNA的特异正向引物延伸所产生的DNA链(即上链)特异杂交。为了确保miRNA特异性并确定引物T_m的范围优选为55℃-65℃，可以将一个或多个LNA单体插入R⁴序列中来取代天然的核苷酸。

(T)x中间部分优选为约15个连续的胸腺嘧啶核苷酸残基区段，其与由相应的miRNA的特异正向引物所产生的DNA链的poly-A尾的部分杂交。

反向引物的R³序列的长度通常为1-20个核苷酸。例如R³可以是17个核苷酸长，8、7或6个核苷酸长或者甚至仅为1个核苷酸长。在本发明的某些实施方案中，R³序列是5’-TGACACGGAGGTACTAG-3’(SEQ IDNO 3)。R³序列的长度可从5’-末端减少，以将反向引物的T_m调至55℃-65℃的优选范围。R³序列与延伸引物的R¹序列(通式(III))的一部分一致或至少有重叠。

设计反向引物的程序如下述。

A.设计满足以下条件的多条引物：

1)删除miR核苷酸序列3’末端的所有腺嘌呤残基。这些腺嘌呤残基将形成poly-A尾的一部分。

2)删除腺嘌呤残基之后，开始与miR的3’末端碱基反向互补，并继续直到与正向引物重叠1个碱基。

3)如果反向引物的3’末端序列是胞嘧啶残基且正向引物的3’末端是鸟嘌呤残基，则从反向引物的3’末端删除1个碱基。

4)如果引物的3’末端序列是鸟嘌呤残基且正向引物的3’末端是胞嘧啶残基，则从该引物的3’末端删除1个碱基。

5)如果引物的3’末端的最后两个碱基与正向引物的最后2个碱基(从3’末端)重叠，则从该引物的3’末端删除1个碱基。

6)重复该过程直到满足条件。

7)如果没有满足条件的引物，则忽略#2和3，并允许末端为AA、AT、TA或TT的序列重叠2个碱基(但是不能更多)。

8)如果没有满足条件的引物，尝试设计另一条正向引物。

B.选择满足以下条件的最长的反向引物：

1)至少4碱基长。

2)在引物3’末端的最后6个碱基中，胞嘧啶残基和鸟嘌呤残基少于5个。

3)在引物3’末端的最后5个碱基中，胞嘧啶残基和鸟嘌呤残基少于4个，除非最后或倒第二个碱基是腺嘌呤残基或胸腺嘧啶残基。

4)如果可能，3’末端不要超过2个腺嘌呤残基或胸腺嘧啶残基

5)如果没有满足条件的引物，尝试设计另一条正向引物。

C.按照以下规则任选地插入一个LNA单体：

1)在反向引物R⁴部分5’末端的第一个胞嘧啶残基或鸟嘌呤残基处插入LNA。

2)具有3个或更多个连续的胞嘧啶残基或鸟嘌呤残基的序列没有LNA。

3)LNA应该在引物的3’末端的第4个位置或更高。

4)如果不能满足条件，则在反向引物R⁴部分5’末端的第一个腺嘌呤残基或胸腺嘧啶残基处插入LNA。

5)LNA应该在引物的3’末端的第4个位置或更高。

6)如果不能满足条件，则在引物R⁴部分5’末端插入LNA-胸腺嘧啶(LNA-T)。

D.加尾：

将通式R³-(T)x的序列加到反向引物的5’末端。在本发明的某些实施方案中，将核苷酸序列：

5’-TGACACGGAGGTACTAGTTTTTTTTTTTTTTT-3’(SEQ ID NO 4)加到反向引物的5’末端。

如果向反向引物的miR-特异的部分添加了LNA-T(步骤C6)，则删除1个胸腺嘧啶残基，因为不应该超过15个连续的胸腺嘧啶残基。

最后，从反向引物的5’-末端去除核苷酸，以调整引物的T_m。

RNA“样品”指的是获自有机体的细胞、组织或液体的包含RNA的组合物，按照例如本领域技术人员已知的RNA Isolation and CharacterizationProtocols(RNA分离和鉴定方案)(Rapley，Ralph；Manning，David L.(Eds.)1998)中所描述的传统方案或使用诸如miRNeasy(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany))或miRVana(Ambion Inc.，Austin，TX，US)的商品试剂盒来获得该RNA“样品”。用于分离RNA部分的来源是从有机体分离的细胞、组织或液体样品，这些样品包括但不限于例如，皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿、眼泪、血细胞、器官、肿瘤，并且还包括体外细胞培养组分(包括但不限于细胞在细胞培养基中生长产生的条件培养基、重组细胞和细胞成分)的样品。“样品”还可以指可直接用在qRT-PCR过程中而不用提前富集RNA部分的细胞或液体，或者甚至是指包含人工合成RNA的含有RNA的组合物。

细胞或细胞类型还指真核生物、原核生物和古生菌来源的任何细胞。

“活有机体”指的是活的机体，包括但不限于例如，人、小鼠、大鼠、果蝇、线虫、酵母、拟南芥、玉米、水稻、斑马鱼、灵长类、家畜等。

优选实施方案的详细描述

对qRT-PCR反应以及涉及的引物的详细描述

本发明提供了扩增样品中的微RNA分子方法，所述方法包括图1概括描述的步骤，并且包括：

a)向样品中的RNA分子群加poly-A尾；

b)在逆转录反应中利用引物使带poly-A尾的RNA分子产生cDNA分子；以及

c)利用对所述特定的RNA分子特异的正向引物和反向引物通过PCR扩增cDNA分子。

当在实践中实施该方法时，通常将步骤(a)和(b)合成一步反应，这对待分析的所有RNA是通用的-因此它的昵称为“通用RT”。仅以一步第一链cDNA合成反应(或RT反应)作为多重实时PCR测定的模板的优点是它节省了宝贵的样品、降低了技术变化以及降低了实验室中的时耗。

在本方法的步骤(c)中，个体(或个体组)RNA是利用特异的正向和反向引物特异性PCR扩增的。通常通过将一个或多个LNA核苷酸类似物引入引物序列来对该引物进行优化，并且通常PCR是定量实时PCR。从实施例可以看出，所述方法导致1)能区别高度相关的RNA序列的极其特异的测定和2)能对非常低的RNA水平进行精确定量的非常低的本底。

所述方法已广泛用来定量小RNA。在优选的实施方案中，小RNA包括小的非编码的RNA，例如小干扰RNA(siRNA)、成熟微RNA和前微RNA。还有较大的RNA，例如前微RNA的前体初级miRNA(pri-miR)以及mRNA也可以通过本方法进行评估。

最优选的小RNA是微RNA。

延伸引物的长度范围可以为10-100个核苷酸，例如长度范围为15-45个核苷酸。优选地，延伸引物的长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。

在优选的实施方案中，延伸引物为通式III：

R¹-(T)y-R²(III)

其中R¹是5’-末端的核苷酸序列，(T)y是中间部分y个连续的胸腺嘧啶残基，其中y是1-100的整数，R²是3’-末端的核苷酸序列。

通常，5’-末端部分的R¹是长度为1-30个核苷酸的核苷酸序列。例如R¹序列可为6、7、8、9或10个核苷酸长。R¹序列包含至少一条与通式II的反向引物中的R³序列(参见以下)杂交的序列，从而用于随后的miRNA-特异的qPCR。

优选地，通式III中的y的区间为5-50，更优选地，y的区间为5-21。例如y为12、13、14、15、16、17或18。更优选y为15。

在一个特别优选的实施方案中，通式(III)的y等于通式(II)的x。

在优选的实施方案中，R²是简并的锚定序列基序VN，包含2个3’-末端核苷酸残基，其中指定V残基选择包含能与除了一个之外的所有天然碱基发生碱基配对(例如与鸟嘌呤、胞嘧啶，尿嘧啶和胸腺嘧啶发生碱基配对，但是不能与腺嘌呤碱基配对)的碱基，通常指定任何引物分子中的V碱基在腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶之间随机选择，并且其中指定N为能与任何天然碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶)发生碱基配对的碱基。通常，N碱基可以在腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶残基之间随机选择。

在另一个优选的实施方案中，R²是简并的序列基序VNN，包含3个3’-末端核苷酸残基，其中指定V残基选择包含能与除了一个之外的所有天然碱基发生碱基配对(例如与鸟嘌呤、胞嘧啶，尿嘧啶和胸腺嘧啶发生碱基配对，但是不能与腺嘌呤碱基配对)的碱基，通常指定V碱基在腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶之间随机选择，并且其中指定N为能与任何天然碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶)发生碱基配对的碱基。通常，N碱基可以在腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶残基之间随机选择。

在优选的实施方案中，延伸引物包含至少一个LNA。

在本发明的某个实施方案中，延伸引物的序列为5’-GGTACTAGTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’(SEQ ID NO 5)。

优选地，正向引物的长度范围为10-100个核苷酸，例如12-22或13-20或14、15、16、17、18或19个核苷酸。具体的实施方案参见表18。

正向引物可以包含一个、两个或者甚至更多个LNA。

在优选的实施方案中，利用“引物设计”定义中所描述的引物设计原则(参见定义部分)，将正向引物的核苷酸序列设计成与特定微RNA分子的互补DNA分子特异杂交。

优选地，反向引物为通式II：

R³-(T)x-R⁴(II)

其中R³是5’-末端核苷酸序列，(T)x是中间部分x个连续的胸腺嘧啶残基，其中x是1-100的整数，R⁴是与靶RNA分子的核苷酸序列特异杂交的3’-末端核苷酸序列。

优选地，通式II反向引物的5’-末端核苷酸序列R³是长度为1-30个核苷酸的核苷酸序列。

优选地，通式II中x的区间为5-50，更优选地，x的区间为5-21。例如x为12、13、14、15、16、17或18。更优选x为15。

在一个特别优选的实施方案中，通式(II)的x等于通式(III)的y。

在优选的实施方案中，通式II反向引物的3’-末端核苷酸序列R⁴的长度范围为1-10个核苷酸。

如实施例2所示，LNA具有深远的影响。因此，在优选的实施方案中，通式II反向引物的3’-末端部分R⁴包含至少一个LNA。更优选地，通式II反向引物的3’-末端部分R⁴只包含一个LNA。在特别优选的实施方案中，LNA位于反向引物R⁴部分的5’位置或者位于邻近该位置的位置。

在优选的实施方案中，利用“引物设计”定义中所描述的引物设计原则(参见定义部分)，将反向引物的核苷酸序列设计成与特定微RNA分子特异杂交。

引物的设计

本发明还提供了设计本发明中所用的正向引物和反向引物的核苷酸序列的方法。实施例3部分给出了引物的系统方法和实验评价。

本发明的应用实例

如实施例5和9所示，本发明用于对来源于人或其它有机体的各种细胞或组织中的诸如微RNA或siRNA的小RNA分子进行扩增和定量。如实施例10所示，当与可商购的略微相似的单管cDNA合成法相比，本方法在敏感性和特异性方面较好。

因此，本发明的一方面是测定活生物的样品中的靶微RNA的量的方法，所述方法包括以下步骤：

a)按照权利要求1-28中任一项所述的方法扩增靶微RNA；

b)测定扩增出的DNA分子的量。

通常利用基于荧光的定量实时PCR来测定扩增出的DNA分子的量，例如通过监测SYBR

green荧光作为PCR循环数的函数。

因此，本发明可用作活有机体中不同细胞和组织类型的微RNA谱分析的工具。因此，可以利用本发明来确定不同细胞和组织类型中存在的特定微RNA的数和特定微RNA的量。同样，通过利用靶向于成熟微RNA或其前体的合适的引物，本发明可用来区分不同细胞和组织类型中的成熟微RNA、前微RNA和pri-微RNA的水平(参见图5)。

另一方面，本发明可用作罹患各种疾病(诸如癌症)的患者的微RNA谱分析的工具。举例来说，利用本发明可以建立各种癌组织的微RNA阵列。

另一方面，通过对正常个体和患病个体的组织和体液中的微RNA表达进行检测，随后对微RNA谱的差异进行分析，本发明可用来诊断各种疾病(诸如癌症)。

在另一个实施方案中，本发明可用来检测患病个体特定微RNA响应于药物(化疗剂)和手术治疗的量的变化。

在另一个实施方案中，本发明可用来检测与患病(例如癌症)患者的无发作存活相关的特定预测性的微RNA生物标记。

由于其简易性：一步“通用RT”步骤和一步差别PCR步骤，本发明还适于针对一种微RNA或微RNA组进行定量的自动平台的高通量方法。因此，所述方法特别适于对各种微RNA进行多重相继的PCR反应，如实施例5、9和10所述。

在某个实施方案中，本发明的方法可用来定量测定样品中的成熟微RNA的量，而不受对应的前miR的干扰，并且反之亦然，可以测定前miR的量而不受成熟微RNA的干扰，如实施例6、7和8所述。

在另一个实施方案中，本发明的方法可用来区别具有单核苷酸差异的靶标，如实施例4所述。

另一方面，本发明提供了检测至少一种靶RNA的试剂盒，所述试剂盒包括一组或多组对所检测的靶RNA特异的引物组，每组引物组包括：第一，用于产生互补于靶微RNA的cDNA分子的通用延伸引物和第二，用于扩增所述cDNA分子的PCR引物组，所述PCR引物组包括对靶miRNA的5’-末端特异的正向引物和对靶miRNA的3’-末端特异的反向引物。

因此，一方面，本发明提供了检测至少一种靶RNA的试剂盒，所述试剂盒包括至少一组对所检测的靶RNA特异的引物组，所述引物组包括：

a)通式I的延伸引物：R¹-(T)y-R²(III)

b)通式II的反向引物：R³-(T)x-R⁴(II)

其中R³是5’-末端核苷酸序列，(T)x是中间部分x个连续的胸腺嘧啶残基，其中x是1-100的整数，R⁴是与靶RNA分子的核苷酸序列特异杂交的3’-末端核苷酸序列，和

c)正向引物。

在一个实施方案中，将试剂盒设计成检测至少一种哺乳动物靶微RNA，所述试剂盒包括至少一组对所检测的靶RNA特异的引物组。

优选地，按照定义部分的“引物设计”部分和其它部分给出的设计原则来设计延伸引物、反向引物和正向引物，并且包含至少一个LNA分子的正向和反向引物是特别优选的实施方案。

延伸引物的非限制性实例如SEQ ID NO 5所示。

试剂盒中包括的正向和反向引物可被设计成按照本文所描述的方法检测哺乳动物靶微RNA。正向和反向引物的非限制性实例列于表16中。

在某些实施方案中，所述试剂盒包括可用来检测多种哺乳动物微RNA靶标的多组引物组，例如两种微RNA靶标到高达数百种微RNA靶标。

本发明的试剂盒还可以提供供应在微滴度qPCR板中的引物阵列，所述微滴度qPCR板例如适于自动处理的96孔、768孔、869孔、1536孔或者甚至是3456孔微滴度qPCR板，如实施例9所示。

本发明的试剂盒还可以包括加poly-A尾、引物延伸和PCR反应所需的试剂，例如缓冲液、盐、还原剂、脱氧核苷三磷酸、核苷三磷酸和酶。还可以包括用于qPCR的检测试剂，例如SYBR

green。同样，还可以包括用于RNA分离的试剂盒。

本发明的另一方面是利用本发明方法并结合自动化检测活有机体的样品中特定靶微RNA的量的高通量方法，其中将加poly-A尾和逆转录反应一起等分进微滴度板的各孔中，该微滴度板含有微RNA特异的正向和反向引物的引物组，产生的步骤为：

a)向样品中的小RNA分子群加poly-A尾，并且在逆转录反应中利用延伸引物使带poly-A尾的小RNA分子产生cDNA分子；以及

b)用移液管将加poly-A尾和逆转录反应的等分试样一起吸进微滴度板的单个孔中；

c)在含有微RNA特异的引物组的微滴度板的单个孔中扩增特定的靶微RNA；

d)测定单个孔中特定微RNA分子的量。

以与高通量的实验装置相容的方式进行本方法。这种装置通常包括一个或多个移液机器人(pipetting robot)。

实施例

实施例1：利用miR特异的qPCR产生特定的DNA分子

在本实施例中，利用本发明的miR特异的定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)从人RNA样品扩增hsa-miR-197。

冰上混合：

●1μl 10×Poly(A)聚合酶缓冲液(New England Biolabs)

●1μl 1mM ATP

●1μl 10μM RT-引物(＝延伸引物)(L2TA：5’-ggtactagtttttttttttttttvn(SEQ ID NO 5)，v代表胞嘧啶、鸟嘌呤和腺嘌呤残基，n代表胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和胸腺嘧啶残基))。

●1μl的1mM dATP、1mM dCTP、1mM dGTP、1mM dTTP的混合物

●0.5μl(200U/μl)MuLV逆转录酶(New England Biolabs Inc.，Ipswich，MA，US)

●0.2μl(5U/μl)Poly(A)聚合酶(New England Biolabs)

●1μl RNA样品(总的人RNA样品＝25ng人心脏RNA、25ng人脑RNA、25ng人肝RNA和25ng人肺RNA的混合物100ng，所有的均来自Ambion，Austin，TX，US。将合成的模板配制在含10ng/μl噬菌体MS2RNA的TE中，向反应中添加约10⁷拷贝。合成的模板获自Integrated DNAtechnologies Inc.，Coralville，IA，US.)

●加水至10μl

阴性对照：水对照和RT反应中不加PolyA聚合酶的总的人RNA对照。

混合物于42℃孵育1小时，之后于95℃孵育5分钟。

为了进行qPCR，利用hsa-miR-197基因特异的正向和反向引物的每个PCR反应使用1μl或更少的加polyA尾/RT反应(图1的步骤1)；正向引物5’ttmCaccaccttctcca(SEQ ID NO 1)和反向引物5’-ctttttttttttttttGctgggt(SEQ ID NO 2)(核苷酸序列中，小写字母表示天然存在的核苷酸，大写字母表示LNA，mC表示LNA甲基胞嘧啶)。

在ABI 7500

温度循环仪(Applied Biosystems Inc，Foster City，CA，US)上运行实时PCR，将监测的SYBR

green荧光作为PCR循环数的函数。典型的PCR反应混合物含有：

●10μl 2×PCR mastermix(Roche cat#04 673 484 001，RocheDiagnostics A/S，Hvidovre，Denmark)

●1μl或更少的RT反应

●1μl具有2.5μM miR特异的正向引物和2.5μM miR特异的反向引物的TE缓冲液(TE缓冲液：10mM Tris/HCl(pH 8.0)，1mM EDTA)。

●加水至20μl

将混合物于95℃孵育10min，随后以95℃5秒、60℃60秒进行40个循环，并伴随检测荧光。

通过将PCR产物的熔解曲线谱与合成的模板扩增所获得的PCR产物的熔解曲线谱进行比较，来检测扩增的产物是否正确(图2)。阴性对照没有获得信号。该实验显示利用步骤1中的总的人RNA样品和合成的hsa-miR-19为模板都获得了相同且正确的hsa-miR-197PCR产物。

实施例2：反向引物中LNA的效应

可以在步骤2中用与逆转录反应的产物具有相同序列的人工DNA模板来检验不同设计的miR特异PCR引物的效应。利用人工DNA模板进行PCR的一个重要优点就是能消除逆转录步骤效率中的实验变量。

Hsa-let-7a DNA模板：

5’-tgcggtgacacggaggtactagtttttttttttttttaactatacaacctactacctca-3’(SEQ IDNO 6)

鲑鱼DNA：2ng/μl于TE缓冲液中

MiR特异的正向引物：

F7a：5’-tGaGgtagtaggttg(SEQ ID NO 7)(小写字母表示天然纯在的核苷酸，大写字母表示LNA)。

MiR特异的反向引物：

r7a.2：5’-cggtgacacggaggtactagtttttttttttttttaactata(SEQ ID NO 8)

r7a.7：5’-cggtgacacggaggtactagtttttttttttttttaamCtata(SEQ ID NO 9)

配制PCR混合物：

●550μl 2×PCR mastermix(罗氏目录号#04 673 484 001)

●440μl水，如表1所示。

表1：配制4管PCR反应：

在ABI 7500

温度循环仪上运行实时PCR，将监测的SYBR

green荧光作为PCR循环数的函数。

按照扩增温度循环仪生产商(Applied Biosystems，Foster City，CA，US)的建议来检测正确产物的扩增。简单来说，PCR反应于60℃孵育1分钟，并在温度缓慢提高到95℃的过程中检测荧光。第一衍生的熔解曲线显示在图3中：

结果显示(图3)不带LNA的反向引物(r7a.2)在阴性对照中给出阳性信号，而带LNA的反向引物(r7a.7)则没有。因此，为了避免在阴性对照反应中产生非特异的PCR产物，r7a.7中的LNA碱基是必需的。两条引物均扩增阳性对照模板。

从表2可以看出，发现反向引物MiR特异的序列中所包含的一个LNA降低了PCR的本底信号。

表2：引物对中LNA对miR特异qPCR的效应

小写字母表示天然纯在的核苷酸，大写字母表示LNA，：mC表示LNA甲基胞嘧啶，C_T表示循环阈值，nd，未检测出

实施例3：手工设计引物并对miR的引物进行确认

按照定义部分的“引物设计”部分的设计原则手工设计引物。

引物确认：

利用引物设计原则所获得的PCR引物按照以下确认标准在实时PCR实验中的成功率可能＞70％：

配制4种逆转录(RT)样品的Rtmix：

1.水

2.100ng总的人RNA mix*(默认我们使用购自Ambion的心脏、脑、肝和肺总RNA每种25ng的混合物)。

^*RNA mix：1μl 1μg/μl心脏RNA、1μl 1μg/μl脑RNA、1μl 1μg/μl肝RNA、1μl 1μg/μl肺RNA，36μl TE。以1μl等分试样存于-80℃。

3.100ng没有PolyA尾的总的人RNA mix。

4.10⁷拷贝的合成miR于含有10ng噬菌体MS2 RNA的TE中(合成的miR获自Integrated DNA technologies Inc.，Coralville，IA，US.)。可以将miR添加为含有多达至少20种miR的库。

RTmix	共
		10×PAP缓冲液	4.4μl
1mM ATP	4.4μl
		1μM L6TA RT引物	4.4μl
4×1mM dNTP	4.4μl
		逆转录酶1∶10	2.2μl
水	11μl

PAP缓冲液＝Poly(A)聚合酶缓冲液(New England Biolabs)。

L6TA＝5’-tgcggtgacacggaggtactagtttttttttttttttVN(SEQ ID NO 129).

逆转录酶(Transcriptor)＝逆转录酶(Roche Diagnostics A/S，Hvidovre，Denmark，cat#03 531 295 001)。

逆转录反应：

孵育42℃，1h；＞95℃，5分钟

向每种样品添加90μl TE并于-20℃储存

a)使用之前记得以1∶10稀释poly(A)聚合酶(PAP)！

MiR特异的qPCR：

用正向和反向引物在1μl的每种逆转录(RT)反应上运行PCR：

样品	1μl RT反应	5μM正向引物	5μM反向引物	2×faststart	水
						#1	#1	0.5μl	0.5μl	10μl	8μl
#2	#2	0.5μl	0.5μl	10μl	8μl
						#3	#3	0.5μl	0.5μl	10μl	8μl
#4	#4	0.5μl	0.5μl	10μl	8μl

在ABI 7500上运行实时PCR

95℃，10min

95℃，15秒；60℃，60秒；40个循环

运行熔解曲线分析

接受标准：

样品1：与#2和4的指数区域相比，循环阈值(Ct)大于40。

衍生的熔解峰低于5000。

样品2：Ct小于35

钟形熔解曲线上有一个峰，除非有其它合理的理由，该峰应当在69℃-80℃间。峰与样品4中的峰处于相同的温度(+/-0.5℃)。

在指数区域中，10倍ΔRn处的交叉点减去ΔRn处的交叉点应该为3.2-4.4：

3.2＜(C10T-CT)＜4.4

样品3：与#2和4的指数区域相比，循环阈值(Ct)大于40。衍生的熔解峰低于5000。

样品4：钟形熔解曲线上有一个峰，除非有其它合理的理由，该峰应当在69℃-80℃间。峰与样品2中的峰处于相同的温度(+/-0.5℃)。

表3：对17对引物的设计与确认

小写字母表示天然存在的核苷酸，大写字母表示LNA，mC表示LNA甲基胞嘧啶。

结果(参见表3)：按照设计原则设计了17对引物。按照确认方案，

17个测定中有12个被成功地证实有效，成功率为71％。

表4：对15对引物的设计与确认。反向引物的理论Tm被优化到59℃：

结果(参见表4)：按照设计原则设计了15对引物。按照确认方案，

15个测定中有12个被成功地证实有效，成功率为80％。

实施例4：区别具有单核苷酸差异的靶标

有三种miR与hsa-let-7a仅有一个核苷酸的差异(下表)。

表5：let-7家族miRNA的核苷酸序列

a)：用粗体字母指示let-7家族4个紧密相关的成员间的差异。

为了检验hsa-let-7a的qPCR引物是否能检测出具有单核苷酸差异的miR，进行了以下MiR特异的qPCR实验：

冰上混合：

RT mix：

●1μl 10×PAP缓冲液(Epicentre Biotechnologies，Madison，WI，US.)

●1μl 1mM ATP

●1μl 10μM RT-引物(L2TA：5’-ggtactagtttttttttttttttvn(SEQ ID NO 5)，v表示c、g和a，n表示c、g、a和t))

●1μl的1mM dATP、1mM dCTP、1mM dGTP、1mM dTTP的混合物

●0.5μl 2单位/μl的逆转录酶(Roche Diagnostics A/S，Hvidovre，Denmark，cat# 03 531 295 001).

●0.2μl(5U/μl)Poly(A)聚合酶(Epicentre)

●5μl水

配制以下样品，并于42℃孵育1小时，之后于95℃孵育5分钟：

合成的模板	RT mix
		1μl TE中的10ng/μl噬菌体MS2 RNA	9μl
1μl 10⁸拷贝的hsa-let-7a¹	9μl
		1μl 10⁸拷贝的hsa-let-7f¹	9μl
1μl 10⁸拷贝的hsa-let-7c¹	9μl
		1μl 10⁸拷贝的hsa-let-7e¹	9μl

¹将合成的模板配制在含10ng/μl噬菌体MS2 RNA的TE中。合成的模板获自Integrated DNA technologies Inc.，Coralville，IA，US。

为了进行qPCR，每个PCR反应使用1μl的加polyA尾/RT反应，并用hsa-let-7a正向引物5’-tGaGgtagtaggttg(SEQ ID NO 7)和反向引物5’-cggaggtactagtttttttttttttttAactat(SEQ ID NO 94)。

在ABI 7500

温度循环仪上运行实时PCR，将监测的SYBRgreen荧光作为PCR循环数的函数。PCR反应混合物含有：

●10μl 2×PCR mastermix(Roche cat#04 673 484 001)

●1μl或更少的RT反应

●1μl具有2.5μM miR特异的正向引物和2.5μM miR特异的反向引物的TE缓冲液(TE缓冲液：10mM Tris/HCl(pH 8.0)，1mM EDTA)

●加水至20μl

通过将PCR产物的熔解曲线谱与合成的模板扩增所获得的PCR产物的熔解曲线谱进行比较，来检测正确产物的扩增。

按照标准方法来分析实时PCR实验的结果(Bustin，SA(ed.)“定量PCR的A-Z”International University Line(La Jolla，California，USA)，2004)。

结果显示在表6中，且扩增曲线如图4所示。

表6：

模板	C_T	hsa-let-7a模板²上的信号％
			10ng/μl噬菌体MS2 RNA	nd¹	0
hsa-let-7a	25	100
			hsa-let-7f	38	0.01
hsa-let-7c	30	4
			hsa-let-7e	nd	0

¹nd，未检测出

²假设扩增效率为100，按100/2^{(CT(模板)-CT(hsa-let-7a))}来计算百分比信号。

实施例5：对人脑总RNA的miR进行定量

在本实施例中，测定总的人脑RNA(Ambion)中miR hsa-let-7a、hsa-miR-21、hsa-miR-27b和hsa-miR-195的拷贝数。

冰上混合：

RT mix：

●1μl 10×PAP缓冲液(New England Biolabs)

●1μl 1mM ATP

●1μl 10μM RT-引物(L2TA：5’-ggtactagtttttttttttttttvn(SEQ ID NO 5)，v代表胞嘧啶、鸟嘌呤和腺嘌呤残基，n代表胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和胸腺嘧啶残基))。

●1μl的1mM dATP、1mM dCTP、1mM dGTP、1mM dTTP的混合物

●0.5μl 2单位/μl逆转录酶(Roche cat# 03 531 295 001，RocheDiagnostics A/S，Hvidovre，Denmark)

●0.5μl(5U/μl)Poly(A)聚合酶(New England Biolabs Inc.，Ipswich，MA，US)

●3μl水

配制以下样品，并于42℃孵育1小时，之后于95℃孵育5分钟：

合成的模板：将合成的hsa-let-7a、hsa-miR-21、hsa-miR-27b和hsa-miR-195等量(拷贝数)溶于含10ng/μl噬菌体MS2 RNA的TE中(获自Integrated DNA technologies Inc)。

TE：10mM Tris/HCl(pH 8.0)，1mM EDTA.

为了进行qPCR，利用基因特异引物的每个PCR反应使用1μl的加polyA尾/RT反应：

表7：

在ABI 7500

温度循环仪上运行实时PCR，将监测的SYBR

green荧光作为PCR循环数的函数。PCR反应混合物含有：

●10μl 2×PCR mastermix(Roche cat#04 673 484 001)

●1μl或更少的RT反应

●1μl具有2.5μM miR特异的正向引物和2.5μM miR特异的反向引物的TE缓冲液

●加水至20μl

对于每种miR，按照标准方法来分析实时PCR实验的结果(Bustin，SA(ed.)“定量PCR的A-Z”International University Line(La Jolla，California，USA)，2004)，并用非人脑RNA的样品的Ct值来建立标准曲线。

将人脑RNA样品的Ct与标准曲线进行比较来确定样品中miR的数量(Bustin，SA(ed.)“定量PCR的A-Z”International University Line(LaJolla，California，USA)，2004)。

结果：

表8：

miR	每10pg脑RNA的拷贝
		hsa-let-7a	16000
hsa-miR-21	400
		hsa-miR-27b	400
hsa-miR-195	1000

实施例6：对前miR qPCR测定的设计

本实施例表明，hsa-miR-10a测定不能检测出对应的前miR、hsa-前miR-10a。同样，可能设计出能检测hsa-前miR-10a但不能检测hsa-miR-10a的引物。

冰上混合：

RT mix：

●1μl 10×PAP缓冲液(New England Biolabs)

●1μl 1mM ATP

●1μl的1mM dATP、1mM dCTP、1mM dGTP、1mM dTTP的混合物

●0.5μl 2单位/μl逆转录酶(Roche cat#03 531 295 001)

●0.5μl(5U/μl)Poly(A)聚合酶(New England Biolabs Inc.)

●3μl水

配制以下样品，并于42℃孵育1小时，之后于95℃孵育5分钟：

RNA样品	RT mix
		1μl～水	9μl
1μl～10⁶拷贝hsa-miR-10a	9μl
		1μl～10⁶拷贝hsa-前miR-10a	9μl

为了进行qPCR，利用表9中的特异引物的每个PCR反应使用1μl的加polyA尾/RT反应。

表9：

在ABI 7500温度循环仪上运行实时PCR，将监测的SYBR

green荧光作为PCR循环数的函数。PCR反应混合物含有：

●10μl 2×PCR mastermix(Roche cat#04 673 484 001)

●1μl或更少的RT反应

●加水至20μl

对于每种miR，按照标准方法来分析实时PCR实验的结果(Bustin，SA(ed.)“定量PCR的A-Z”International University Line，2004)。

表10：

RNA	hsa-miR10a测定	hsa-前miR10a测定
			阴性对照	低于检测水平	低于检测水平
hsa-miR10a	C_T＝29.53	低于检测水平
			hsa-前miR10a	低于检测水平	C_T＝30.82

结果表明hsa-miR-10a和hsa-前miR-10a测定都能检测出正确的靶标，分别与前miR-10a或miR-10a均没有交叉反应。

实施例7：利用qPCR来检测前miR

本实施例中，在总的人RNA中检测hsa-miR-10a和对应的前miR、hsa-前miR-10a。

冰上混合：

RT mix：

●1μl 10×PAP缓冲液(New England Biolabs)

●1μl 1mM ATP

●1μl的1mM dATP、1mM dCTP、1mM dGTP、1mM dTTP的混合物

●0.5μl 2单位/μl逆转录酶(Roche cat#03 531 295 001)

●0.5μl(5U/μl)Poly(A)聚合酶(New England Biolabs Inc.)

●3μl水

配制以下样品，并于42℃孵育1小时，之后于95℃孵育5分钟：

RNA样品	RT mix
		1μl水	9μl
1μl～100ng/μl RNA mix^a	9μl
		1μl～10⁶拷贝hsa-miR-10a	9μl
1μl～10⁶拷贝hsa-前miR-10a	9μl

^a在TE中的1μl 1μg/μl心脏RNA、1μl 1μg/μl脑RNA、1μl 1μg/μl肝RNA、1μl 1μg/μl肺RNA、1μl 1μg/μl肾RNA、1μl 1μg/μl淋巴RNA、1μl 1μg/μl空肠RNA、1μl 1μg/μl结肠RNA、1μl 1μg/μl乳房RNA和1μl 1μg/μl白细胞瘤RNA的混合物

TE缓冲液：10mM Tris/HCl(pH 8.0)，1mM EDTA。

为了进行qPCR，利用表11中的特异引物的每个PCR反应使用1μl的加polyA尾/RT反应。

表11：

在ABI 7500温度循环仪上运行实时PCR，将监测的SYBRgreen荧光作为PCR循环数的函数。PCR反应混合物含有：

●10μl 2×PCR mastermix(Roche cat#04 673 484 001)

●1μl或更少的RT反应

●加水至20μl

对于每种miR，按照标准方法来分析实时PCR实验的结果(Bustin，SA(ed.)“定量PCR的A-Z”International University Line，2004)。结果显示在表12中。

表12：

RNA	hsa-miR10a测定	Has-前miR10a测定
			阴性对照	低于检测水平	低于检测水平
总RNA	C_T＝26.22	C_T＝37.25
			hsa-miR10a	C_T＝28.83	未检测到
hsa-前miR10a	未检测到	C_T＝32.59

结果表明，总RNA样品含有的hsa-miR-10a大于10⁶拷贝，因为C_T低于具有10⁶拷贝hsa-miR-10a的样品的C_T，而总RNA样品含有的hsa-前miR-10a小于10⁶拷贝，因为C_T低于具有10⁶拷贝hsa-前miR-10a的样品的C_T。

实施例8：对前miRNA的特异检测

实验目的：为了确定本申请所描述的通用逆转录酶定量PCR方法(UniRT qPCR)是否能用来特异地检测前miR，而不会同时检测对应的成熟miR。

材料：选择合成的miR 203 RNA(5’-gugaaauguuuaggaccacuag)(SEQID NO 103)和前miR 203 RNA(5’-agugguucuuaacaguucaacaguucugu-agcgcaauugugaaauguuuaggaccacuag)(SEQ ID NO 104)作为检验个体。合成的RNA由Integrated DNAtechnologies Inc.，Coralville，IA，US来合成。将RNA以1*10⁶分子/μL稀释于TEMS2(TE缓冲液(pH 8的10mM Tris HCl和0.1mM EDTA)混合10ng/μL MS2病毒RNA(Roche Applied Science Inc)中。所用的引物是miR-203.Rev(5’-tgacacggaggtactagtttttttttttttttCtag)(SEQ ID NO 105)、miR-203.Fwd(5’-gtGaaatGtttaggacca)(SEQ ID NO 106)和前miR-203.Fwd(5’-cagttcaacagttctgtagc)(SEQ ID NO 107)。设计的前miR-203 Fwd引物位于前miR-203分子的环结构中。利用通用cDNA合成试剂盒(Exiqon AS，Cat.no #203300)对成熟miR-203模板和前miR-203进行逆转录。

混合：

●合成的RNA 1*10⁶分子

●5×UniRT反应缓冲液 2μL

●10×酶混合物 1μL

●水加至10μL

于42℃孵育60分钟，并于85℃加热变性5分钟。以10倍稀释于水中。

用SYBR Green Master Mix，UniRT(Exiqon AS，Cat.No.203400)进行qPCR

混合：

引物混合(每条3uM) 1μL

SYBR green master mix 5μL

cDNA模板 1μL

水 3μL

使用两组引物混合1)miR-203((miR-203.Fwd和miR-203.Rev引物)和2)前miR-203(前miR-203.Fwd和miR-203.Rev引物)。使用mir-203和前miR-203模板。每次PCR测定还运行无模板对照(NTC)的qPCR。所有的qPCR均进行两个重复。

在LightCycler 480(Roche Diagnostics)的384孔板中按以下PCR方案运行q-RT-PCR反应。

1.95℃，10分钟

2.95℃，10秒

3.60℃，1分钟

用SYBR green(HRM dye)方案进行信号检测。重复2-3步45次，随后进行熔解曲线分析。

结果和讨论

标准miR-203引物所检测的miR-203模板孔的Cp值为28.86。同样是miR-203测定，部分检测到了前miR-203(Cp为30,125)，这是由于miR位于前miR-203的3’末端。前miR-203测定设计所检测的前miR的Cp值为25.7，然而，用前miR-203特异的测定没有检测到成熟miR-203(Cp＝40)。该数据明显表明，可以将前miR特异的测定设计成特异地靶向前miR分子。

表13：利用miR特异的引物和前miR特异的引物对前miR-203和miR-203的检测

模板	测定	平均Cp	百分比检测
				NTC	miR-203
miR-203	miR-203	28,86	100,0
				前miR-203	miR-203	30,125	41,6
NTC	前miR-203
				miR-203	前miR-203	40	0,0
前miR-203	前miR-203	25,675	100

平均Cp表示两次qPCR反应的平均值。按a＝100/2^{(Cp_检验-Cp_ref)}来估算百分比检测，其中Cp_ref是对应的模板和引物组的Cp值。

实施例9：在心脏和肝组织中差别表达的微RNA

实验目的是确定基于本发明的SYBR green通用逆转录酶定量PCR(UniRT qPCR)方法利用qPCR阵列是否能区别表达心脏和肝组织之间差别表达miRNA的孔。

材料和方法

肝和完整心脏的总RNA获自Ambion Inc.，将其在无核酸酶的水中稀释至10ng/μL的浓度，并于-80℃储存。我们选择了几种从文献中了解到的在心脏和肝组织样品中差别表达的miRNA(参见例如：Liang，Y.，et al.(2007)BMC Genomics.8：pp166和Landgraf P.，et al.(2007)NatureBiotechnol.(9)：pp 996-7)。选择的miR是hsa-miR-1、hsa-miR-126和hsa-miR-133b(心脏)以及hsa-miR-192、hsa-miR-122^*、hsa-miR-194和hsa-miR-122(肝)。

表14：7组mIR测定的引物序列，大写字母表示LNA核苷酸

大写字母表示LNA核苷酸

用通用cDNA合成试剂盒(Exiqon AS，Cat.no #203300)进行RT反应，每个组织和非酶对照(NEC)三个重复。

总的RNA 20ng

5×UniRT反应缓冲液 4μL

酶混合物 2μL

水加至20μL

于42℃孵育60分钟，并于85℃加热变性5分钟。将cDNA以1/100稀释于无核酸酶的水中。

按下述进行方案的步骤2，定量聚合酶链式反应(q-PCR)：

将5μL稀释的cDNA与5μL SYBR Green Master Mix，UniRT(ExiqonAS，Cat.No.203400)混合加入384孔板中，该384孔板中有以下所述的7组干的miR测定引物组。将板密封，并直接置于LightCycler上用于扩增和分析。

在LightCycler 480(Roche Diagnostics)中利用以下PCR方案运行q-RT-PCR反应：

1.95℃，10分钟

2.95℃，10秒

3.60℃，1分钟

利用提供的数据分析软件(Roche Diagnostics)对LC480原始数据进行标准数据分析。采集的Cp值为Abs量/第二衍生最大值。

对于查看表达肝和心脏miRNA基因的孔的实施例的本实验，我们使用了原始数据Cp值的平均值，而没有经过标准化或校准。这样做是由于组织之间的标准化对于评价不同来源的miR来说不是一种非常精确的方式。那么我们依据ΔCp值来比较了两组织之间的差异。注意Cp值相差1表示表达约相差两倍。

结果和讨论

我们总共选择了从以前的文献中了解到的在心脏和肝组织之间差别表达的7种miRNA。结果显示在表15和图7中。获得的数据表明，三种基因miR-1、miR-133b和126均表现出在心脏样品中的表达远高于肝样品。同样，miR-192、miR-194、miR-122和122^*均表现出在肝中的表达远高于心脏。Cp的差异范围为2.6-12.9，这对应于表达的差异范围为5倍-高于1000倍。通常，通过利用本文所描述的测定的UniRT表达平台很容易区分文献中所描述的差别表达的miR。

表15：所选的7种miR在UniRT平台上测定的表达值

miR名称	心脏(平均Cp)	肝(平均Cp)	ΔCp
				hsa-miR-1	20.9	33.9	12.9
hsa-miR-133b	22.0	34.7	12.7
				hsa-miR-126	22.5	25.1	2.6
hsa-miR-192	31.6	25.3	-6.3
				hsa-miR-122^*	37.6	30.0	-7.5
hsa-miR-194	32.3	25.9	-6.4
				hsa-miR-122	31.8	21.1	-10.8

正的ΔCp值表示在心脏中超表达，负的Cp表示在肝中超表达

实施例10：本发明所设计的miR特异的测定与利用纯DNA引物的竞争方法的比较

将本发明所描述的基于LNA的设计与商业基于DNA的产品、miScript逆转录试剂盒(Qiagen，Cat.no.218060，QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)进行比较。该基于DNA的产品还依赖于miRNA 3’-多聚腺苷化步骤，随后用基于DNA的poly dT引物进行逆转录，其中两步反应在一管式反应中发生。由于两种方法使用相同的酶促步骤，所以进行比较能很好地揭示该基于LNA的方法具有意想不到的优点，因为miScript的引物中不包含LNA。另一个差异是miScript使用对加在RT引物上的通用标签特异的反向引物，而本方法的基于LNA的反向引物对待检测的miRNA是特异的。

表16：被比较的miRNA的核苷酸序列

miR	序列	SEQ ID NO	miR gc％	miR Tm
					hsa-let-7a	5’-ugagguaguagguuguauaguu-3’	90	36	50
hsa-miR-143	5’-ugagaugaagcacuguagcuc-3’	122	39	54
					hsa-miR-155	5’-uuaaugcuaaucgugauaggggu-3’	123	47	54
hsa-mir-1	5’-uggaauguaaagaaguauguau-3’	124	27	47

表17：比较中所用的引物组

第一步

利用通用cDNA合成试剂盒(Exiqon A/S，Vedbaek，Denmark.，Prod.No.203300)或miScript逆转录试剂盒(Qiagen，目录号218060，QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)按照厂商说明对合成的miRNA靶标(获自IntegratedDNA technologies Inc.，Coralville，IA，US.)的系列稀释物进行逆转录，本底为10ng/μl的MS2噬菌体RNA(Roche Applied Science，目录号10165948001)。

第二步

一旦利用通用cDNA合成试剂盒(Exiqon，Prod.No.203300)获得cDNA，即利用SYBR Green master mix、通用RT(Exiqon，Prod.No.203400)进行qPCR，引物组如表17所述。一旦利用miScript逆转录试剂盒(Qiagen，Cat.no.218060)获得cDNA，即利用miScript SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen，目录号218073)进行qPCR。两种情况下，扩增和检测均在RocheLC480 LightCycler(Roche Diagnostics A/S，Hvidovre，Denmark)上运行，均利用厂商指示的循环条件。每种cDNA/测定组合物均运行三个重复。

结果

图8表明实验中四种受试miRNA的每一种所获得的三个重复的Cp值与模板浓度的关系。在所有四组比较测定中，如通过本发明的测定获得的Cp值总是较低所显示，本发明的方法(连接菱形的黑线)均比miScript测定(连接球形的灰线)敏感。对于hsa-let-7a，以定量检测的最低拷贝数测量，本发明测定的敏感度提高10倍。对于hsa-miR-143和hsa-miR-155而言，本发明测定在敏感度差异上要好100倍。对于gc含量非常低并因此具有低解链温度的hsa-miR-1(参见表16)而言，备选测定无法检测出模板，即使在RNA浓度最高时。本发明所设计的测定在PCR反应中能定量检测到低至10个miRNA拷贝。该数据明显表明，本发明测定具有出人意料的高敏感度。我们将敏感度的改进部分归于延伸引物的设计，部分归于qPCR反应的模板特异的(例如miR特异的)正向和反向引物的设计，所述延伸引物包含5’“标签序列”(R¹)和3’“锚定序列”(R²)，所述正向和反向引物包含LNA。我们的结果表明，基因特异的正向和反向引物设计比利用通用反向引物的纯DNA引物允许更高的敏感度检测。

表18：核苷酸序列

小写字母表示天然存在的核苷酸，大写字母表示LNA，mC表示LNA甲基胞嘧啶。v是腺嘌呤残基、鸟嘌呤残基或胞嘧啶残基，并且n是腺嘌呤残基、鸟嘌呤残基、胞嘧啶残基或胸腺嘧啶残基

Claims

1.扩增样品中特定RNA分子的方法，所述方法包括以下步骤：

a)向样品中RNA分子群加poly-A尾；

b)在逆转录反应中利用引物产生带poly-A尾的RNA分子的cDNA分子；以及

c)利用对所述特定RNA分子特异的正向引物和反向引物通过PCR扩增所述cDNA分子。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述特定RNA分子是小的、非编码的RNA。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述特定小RNA分子是微RNA。

4.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其中所述延伸引物的长度范围为10-100个核苷酸。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述延伸引物的长度范围为15-45个核苷酸。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述延伸引物为通式III的核苷酸序列：

R¹-(T)y-R²(III)

其中R¹是5’-末端的核苷酸序列，(T)y是中间部分y个连续的胸腺嘧啶残基，其中y为1-100的整数，R²是3’-末端的核苷酸序列。

7.如权利要求6所述的方法，其中R¹是长度为1-30个核苷酸的核苷酸序列。

8.如权利要求7所述的方法，其中R¹是长度为6-10个核苷酸的核苷酸序列。

9.如权利要求8所述的方法，其中R¹是长度为8个核苷酸的核苷酸序列。

10.如权利要求6-9中任一项所述的方法，其中y为5-50的整数。

11.如权利要求10所述的方法，其中y为5-21的整数。

12.如权利要求11所述的方法，其中y为12、13、14、15、16、17或18。

13.如权利要求12所述的方法，其中y为15。

14.如权利要求6-13中任一项所述的方法，其中R²是由两个3’-末端核苷酸残基组成的序列基序VN，其中V是腺嘌呤残基、鸟嘌呤残基或胞嘧啶残基，且N是腺嘌呤残基、鸟嘌呤残基、胞嘧啶残基或胸腺嘧啶残基。

15.如权利要求6-13中任一项所述的方法，其中R²是由三个3’-末端核苷酸组成的序列基序VNN，其中V是腺嘌呤残基、鸟嘌呤残基或胞嘧啶残基，且N是腺嘌呤残基、鸟嘌呤残基、胞嘧啶残基或胸腺嘧啶残基。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述延伸引物包含至少一个LNA。

17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述正向引物的长度范围为10-100个核苷酸。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述正向引物包含至少一个LNA。

19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述正向引物被设计成与靶RNA分子的互补DNA分子特异杂交。

20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述反向引物为通式II的核苷酸序列：

R³-(T)x-R⁴(II)

其中R³是5’-末端核苷酸序列，(T)x是中间部分x个连续的胸腺嘧啶残基，其中x为1-100的整数，R⁴是与靶RNA分子的核苷酸序列特异杂交的3’-末端核苷酸序列。

21.如权利要求20所述的方法，其中R³是长度为1-30个核苷酸的核苷酸序列。

22.如权利要求20或21之一所述的方法，其中x为5-50。

23.如权利要求22所述的方法，其中x为5-21。

24.如权利要求23所述的方法，其中x为15。

25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中通式(II)的x等于通式(III)的y。

26.如权利要求20-25中任一项所述的方法，其中R⁴的长度范围为1-10个核苷酸。

27.如权利要求20-26中任一项所述的方法，其中R⁴包含至少一个LNA。

28.如权利要求27所述的方法，其中R⁴仅包含一个LNA。

29.如权利要求20-28中任一项所述的方法，其中R⁴被设计成与靶RNA的3’-末端特异杂交。

30.如权利要求27-29中任一项所述的方法，其中所述LNA位于所述反向引物R⁴部分的5’位置或者位于邻近该位置的位置。

31.测定活有机体的样品中的靶微RNA的量的方法，所述方法包括以下步骤：

a)按照权利要求1-30中任一项的方法扩增所述靶微RNA；

b)测定扩增出的DNA分子的量。

32.如权利要求31所述的方法，其中利用基于荧光的定量实时PCR方法测定所述扩增出的DNA分子的量。

33.如权利要求31或32之一所述的方法，其中使用SYBR

green染料测定所述扩增出的DNA分子的量。

34.检测至少一种靶RNA的试剂盒，包括至少一组对所述靶RNA的检测特异的引物组，所述引物组包括：

a)通式III的延伸引物：R¹-(T)y-R²(III)

其中R¹是5’-末端的核苷酸序列，(T)y是中间部分y个连续的胸腺嘧啶残基，其中y为1-100的整数，R²是3’-末端的核苷酸序列；

b)通式II的反向引物：R³-(T)x-R⁴(II)

其中R³是5’-末端的核苷酸序列，(T)x是中间部分x个连续的胸腺嘧啶残基，其中x是1-100的整数，R⁴是与靶RNA分子的核苷酸序列特异杂交的3’-末端核苷酸序列；

c)正向引物。

35.如权利要求34所述的试剂盒，用于检测至少一种哺乳动物靶微RNA，包括至少一组对所述靶微RNA的检测特异的引物组。

36.如权利要求34或35所述的试剂盒，其中所述正向引物的长度范围为10-100个核苷酸。

37.如权利要求34-36中任一项所述的试剂盒，其中所述正向引物包含至少一个LNA。

38.如权利要求34-37中任一项所述的试剂盒，其中所述反向引物包含至少一个LNA。

39.如权利要求34-38中任一项所述的试剂盒，其中所述正向引物被设计成与靶微RNA分子的互补DNA分子特异杂交。

40.如权利要求34-39中任一项所述的试剂盒，其中所述反向引物是权利要求27-30中任一项所述的反向引物。

41.如权利要求34-40中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种哺乳动物靶微RNA是人类微RNA。

42.如权利要求34-41中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种哺乳动物靶微RNA选自可从miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/)得到的所有已知的人类微RNA。

43.如权利要求34-41中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种哺乳动物靶微RNA是鼠微RNA。

44.检测或测定权利要求1-33中任一项的活有机体的样品中的特定靶微RNA量的高通量方法，所述方法还包括分配步骤，其中将加poly-A尾和逆转录反应一起等分进微滴度板的各孔中，该微滴度板含有微RNA特异的正向和反向引物的引物组，产生的步骤为：

c)向样品中的小RNA分子群加poly-A尾，并且在逆转录反应中利用延伸引物产生带poly-A尾的小RNA分子的cDNA分子；以及

d)用移液管将加poly-A尾和逆转录反应的等分试样一起吸进微滴度板的单个孔中；

e)在含有微RNA特异的引物组的微滴度板的单个孔中扩增特定的靶微RNA；

f)测定单个孔中特定微RNA分子的量；

以与高通量的实验装置相容的方式进行本方法。

45.寡核苷酸，选自表18所公开的寡核苷酸。