CN1961081A - 用于定量微rna和小干扰rna的新方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测、定量以及监控成熟微RNA和小干扰RNA(siRNA)的表达的核糖核酸、探针和方法。本发明进一步涉及用于监控其它非编码RNA、mRNA剪接变体的表达，以及检测和定量RNA编辑、单一转录物的等位基因变体、转录物中特定外显子的突变、缺失或重复，例如与人疾病(如癌)相关的改变的方法。本发明进一步涉及用于检测、定量以及监控脱氧核酸的表达的方法。

Description

用于定量微RNA和小干扰RNA的新方法
本发明涉及用于检测、定量以及监控成熟微RNA(microRNA)和小干扰RNA(siRNA)的表达的核酸、探针和方法。本发明进一步涉及用于监控其它非编码RNA、mRNA剪接变体的表达，以及检测和定量RNA编辑、单一转录物的等位基因变体、转录物中特定外显子的突变、缺失或重复，例如与人疾病(如癌)相关的改变的方法。本发明此外还涉及用于检测和定量靶标DNA序列的方法。
发明背景
本发明涉及在多种核酸样品中定量靶标核苷酸序列并且更具体地涉及采用设计和使用寡核苷酸探针的方法，所述的探针可用于检测和定量感兴趣的靶标核苷酸序列，特别是RNA靶标序列，例如微RNA和siRNA靶标序列以及可用于检测核酸样品(例如来自癌患者和健康患者)之间的不同。
微RNA
不断扩大的国际序列数据库以及伴随的代表全部三个生命领域(细菌、古细菌、真核生物)的近200个基因组的测序已经成为解析生物有机体为基因、转录物和蛋白质的复杂分子目录的过程中的主要驱动力。单个物种中的遗传变异的重要性已经变得明显，数个重要基因组的遗传蓝图的完成后，最终导致在2001年人基因序列的工作草图的发表(Lander，Linton，Birren等，2001 Nature 409：860-921；Venter，Adams，Myers等，2001 Science 291：1304-1351；Sachidanandam，Weissman，Schmidt等，2001 Nature 409：928-933)。另一方面，对源于人和小鼠基因组的转录物的增加数量的详细的、大规模的分子分析，以及新近的数种类型的非蛋白质编码RNA，例如小核RNA、siRNA、微RNA和反义RNA的鉴定，表明更高等真核生物的转录组(transcriptome)比最先预计的要更为复杂(Wong等，2001，Genome Research 11：1975-1977；Kampa等，2004，Genome Research14：331-342)。
作为中心法则的一个结论：‘DNA产生RNA，RNA产生蛋白质’，RNA仅被认为是将基因信息翻译成蛋白质的简单分子。最近，据估计虽然大部分基因组都发生了转录，但高等真核生物中几乎97％的基因组不编码蛋白质，而推断是非编码RNA(Wong等2001，Genome Research11：1975-1977)。非编码RNA(ncRNA)看起来特别适于需要高度特异性核酸识别的调控作用。因此，对RNA的认识，快速地从仅为信息分子转变为细胞中的包括多种多样的结构、信息和催化功能的分子。
最近，大量小的非编码RNA基因已经得以鉴定并称为微RNA(miRNA)(对于综述，参见Ke等，2003，Curr.Opin.Chem.Biol.7：516-523)。发现的第一种miRNA是lin-4和let-7，其为线虫(C.elegans)中对不同发育事件的正常的时序控制必需的异时性开关基因(heterochronic switching gene)。miRNA在广阔范围的物种中在进化上是保守的并在表达谱(expression profile)中表现出多样性，暗示它们具有多种多样的调控功能并对细胞生长和发育施加显著影响(Ke等，2003，Curr.Opin.Chem.Biol.7：516-523)。最近研究表明miRNA可以在许多水平上调节基因表达，表现出新的基因调控机制并支持这样的想法，即RNA能够行使与蛋白质相似的调控作用。理解这种基于RNA的调控作用将有助于我们理解高等真核生物中基因组的复杂性以及理解复杂的基因调控网络。
miRNA是21-25个核苷酸(nt)的RNA，从更长的内源性发夹结构转录物加工而来(Ambros等，2003，RNA 9：277-279)。根据由SangerInstitute，UK管理的微RNA登记数据库，迄今为止在人、蠕虫、果蝇和植物中已经鉴定出多于719种微RNA，并且许多对应推定基因(putative gene)的微RNA也已经得以鉴定。一些miRNA在基因组中具有多个基因座(Reinhart等，2002，Genes Dev.16：1616-1626)并且偶尔地，几个miRNA基因排列于串联的簇中(Lagos-Quintana等，2001，Science 294：853-858)。事实上，许多到此为止报道的miRNA仅被分离一次，这暗示许多新miRNA将会在未来发现。最近的一项对人21和22号染色体的转录物的深入分析发现，49％的观测到的转录物已经超出了任何已知的注解，并且进一步来说，这些新的转录物既有编码RNA又有非编码RNA(Kampa等，2004，Genome Research 14：331-342)。迄今鉴定的miRNA可能仅仅代表冰山一角，并且miRNA的数目可能证明是十分巨大的。
迄今得以表征的微RNA的综合特征(Ke等，2003，Curr.Opin.Chem.Biol.7：516-523；Lee等，1993，Cell 75：843-854；Reinhart等，2000，Nature 403：901-906)可以总结如下：
1.miRNA是约21-25nt的单链RNA。
2.它们通过Dicer酶从更长的内源性双链-发夹结构前体切割而来。
3.miRNA精确地匹配可以潜在地编码双链发夹结构形式的前体RNA的基因区。
4.miRNA及它们预测的前体二级结构在系统进化上是保守的。
数条证据表明Dicer酶及Argonaute酶在miRNA的生物合成、成熟和功能中是关键的参与者(Grishok等，2001，Cell 106：23-24)。miRNA生物合成需要的基因的突变导致遗传性的发育缺陷，这种缺陷(至少部分)源于产生miRNA的作用。目前的观点是，miRNA由Dicer从双链体形式的发夹结构的前体切割而来，最初在3’末端具有2或3nt的突出，称为前-miRNA。辅助因子结合前-miRNP并解链前-miRNA为单链miRNA，则前-miRNP然后转化为miRNP。作为miRNP复合体的一部分的miRNA可以识别调控靶标。在miRNP和RNA-诱导的沉默复合体(RISC)之间有数种相似性，包括相似的大小以及两者都含有RNA解旋酶和PPD蛋白。因此据报道miRNP和RISC是具有多功能的相同RNP(Ke等，2003，Curr.Opin.Chem.Biol.7：516-523)。不同的效应物引导miRNA进入不同的通路。前-miRNA的结构与这样的观测结果相一致，即在3’末端具有2或3nt的22nt突出端的RNA双链体有利于蛋白复合物的重构并且可能是短RNA双链体高度特异性结合至蛋白质组分所需要的(对于综述，参见Ke等，2003，Curr.Opin.Chem.Biol.7：516-523)。
增加的证据表明miRNA在真核基因调控中起关键作用。首先发现的miRNA即lin-4和let-7，与其它异时性基因的3’非翻译区(UTR)中重复的元件进行不完全地碱基配对，并且通过反义RNA-RNA相互作用直接地和负调控性质地调控转录(Lee等，1993，Cell 75：843-854；Reinhart等2000，Nature 403：901-906)。其它miRNA据认为通过有限的匹配与靶标mRNA相互作用并且也抑制翻译(Lagos-Quintana等，2001，Science 294：853-858；Lee和Ambros 2001，Science 294：858-862)。然而，许多研究表明，假如miRNA与它们的靶标RNA之间有着完全的互补性，则可导致靶标RNA降解而不是抑制翻译(Hutvanger和Zamore 2002，Science 297：2056-2060)，暗示着互补性的程度决定它们的功能。通过鉴定具有相近互补性的序列，数种靶标基因得以预测，它们的大部分可能是潜在的细胞生长和发育中关键的转录因子。高比例的预测的miRNA靶标作为发育调节物起作用并且靶标位点的保守性暗示miRNA涉及广范围的生物体发育和行为以及细胞命运的决定(综述参见Ke等，2003，Curr.Opin.Chem.Biol.7：516-523)。
微RNA和人疾病
miRNA的基因组定位分析表明它们在人发育和疾病中起重要作用。已经查明数种人疾病中miRNA或它们的加工机制可能牵涉其中。其中一种是脊髓性肌萎缩(SMA)，其为由运动元神经存活(SMN)基因的减少的蛋白质水平或丧失功能的突变引起的儿童神经变性疾病(Paushkin等人，2002，Curr.Opin.Cell Biol.14：305-312)。作为SMN复合物一部分的两种蛋白质(Gemin3和Gemin4)也是miRNP的组分，然而在SMA中miRNA生物合成或功能是否是失调以及这对发病机理有什么影响仍然有待研究。另一种与mi/siRNA相关联的神经疾病是由脆性X综合征蛋白(FMRP)的缺失或突变引起的脆性X综合征(fragile Xmental retardation)(FXMR)(Nelson等，2003，TIBS28：534-540)，并且有另外的线索表明miRNA可能在其它神经疾病中起作用。然而另一有趣的发现是miR-224基因座位于两种不同的神经疾病：早发性帕金森综合征和X-连锁智力障碍的最小候选区域内(Dostie等，2003，RNA：9：180-186)。癌和miRNA之间的关联最近也已经有描述。在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中最频繁的单基因异常是位于染色体13q14的缺失(50％的病例)。最近的研究确定，两种不同的miRNA(miR15和miR16)基因形成簇并位于LEU2的内含子内，该内含子位于B-细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)肿瘤抑制基因座位的删除的最小区域内，并且在大部分CLL病例中两种基因都缺失或受到下调(Calin等，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：15524-15529)。据预测miRNA和人疾病之间的联系只有伴随对miRNA及它们控制的基因网络的了解才将会得以加强。而且，对RNA-介导的基因表达的调控的理解正引起新的治疗方法的开发，这将有可能引起医学实践的革命性变化(Nelson等，2003，TIBS 28：534-54。)。
小干扰RNA和RNAi
最近一些对大小范围在21-25nt的小RNA的关注是由于RNA干扰(RNAi)现象，其中双链RNA导致任何同源RNA的降解(Fire等，1998，Nature 391：806-811)。RNAi依赖一种复合物以及远古的细胞机制，这种细胞机制可能是进化用来保护免受病毒攻击和移动性基因元件的影响。RNAi机制中的关键步骤是短的干扰RNA(siRNA)的产生，其为每条链约22nt长的双链RNA。siRNA导致同源靶标RNA的降解并产生更多对抗相同靶标RNA的siRNA(Lipardi等，2001，Cell 107：297-307)。目前对RNAi的mRNA降解途径的观点是，反向平行的Dicer二聚体以ATP-依赖的方式切割长的双链dsRNA形成siRNA。然后siRNA整合进RNA-诱导的沉默复合物(RISC)并且ATP-依赖的siRNA的解链激活了RISC(Zhang等，2002，EMBO J.21：5875-5885；Nyknen等，2001，Cell 107：309-321)。活性RISC复合物因而经引导降解了特定的靶标mRNA。
微RNA和siRNA的检测和分析
当前的观点认为，miRNA可以代表一种新发现的、深层隐藏的基因调控，这已经在全世界研究人员中引起了高度的兴趣去发现miRNA、它们的靶标和作用机制。然而，这些小RNA的检测和分析并不是没有价值的。因此，至今多于700种miRNA的发现要求人们去利用它们特别的特征。首先，研究小组已经将miRNA的小的大小用作分离和检测的首要标准。主要是因为在cDNA文库构建过程中通过大小选择通常排除了小的基因，因此，标准的cDNA文库缺少miRNA。来自果蝇胚、蠕虫或Hela细胞的总RNA已经按大小分级，这样仅25个核苷酸或更小的分子将得以捕获(Moss 2002，Curr.Biology 12：R138-R140)。使用T4RNA连接酶将合成的寡聚物直接连接至RNA库。然后将该序列反转录、通过PCR扩增、克隆并测序(Moss 2002，Curr.Biology 12：R138-R140)。随后用该序列查询基因组数据库，确认来自这些生物体的miRNA的来源，同时将这些miRNA基因在物理上放入基因组中的其它基因的背景内。大量的克隆序列已经定位于内含子区域或在偶尔在成簇的基因之间，暗示着串联排列的miRNA从单个转录物加工而来使得能协同调节。而且，基因组序列已经揭示，miRNA前体的回折结构(fold-back structure)(Moss 2002，Curr.Biology 12：R138-R140)。
不同miRNA的大小以及有时候低水平表达需要使用灵敏的和定量的分析工具。由于它们21-25nt这么小的大小，排除了使用定量实时RCR来监控成熟miRNA的表达。因此，大多数miRNA研究人员目前使用RNA印迹分析结合聚丙烯酰胺凝胶电泳来检查成熟的以及前-miRNA两者的表达(Reinhart等，2000，Nature 403：901-906；Lagos-Quintana等，2001，Science 294：853-858；Lee和Ambros 2001，Science 294：862-864)。引物延伸也已经用来检测成熟miRNA(Zeng和Cullen 2003，RNA 9：112-123)。作为用于监控miRNA表达工具的所有基于凝胶的测定法的缺点包括低的处理量和不好的灵敏性。因为微阵列具有良好的处理量，所以DNA微阵列看起来是用于定量miRNA的RNA印迹分析的好的备选方法。然而，微阵列的缺点是其需要高浓度的输入靶标基因以便进行有效的杂交和信号产生、对稀少的靶标基因敏感性低以及必须使用更灵敏的测定法如实时定量PCR来进行微阵列处理后的确认，这是不可行的。最近报道了用cDNA微阵列来监控神经发育中miRNA的表达，该方法使用5-10μg一份的输入总RNA作为靶标基因，但成熟的miRNA必须在微阵列杂交前使用微量浓缩器从miRNA前体分离(Krichevsky等，2003，RNA 9：1274-1281)。一种PCR方法也已经用于测定成熟miRNA的表达水平(Grad等，2003，Mol.Cell 11：1253-1263)。这种方法可用于克隆miRNA，但是对用于常规的miRNA表达分析是十分不切实际的，因为该方法涉及凝胶分离小RNA并连接至连接寡核苷酸上。Schmittgen等，(2004，Nucleic Acids Res.32：e43)描述了RNA印迹分析的备选方法，其中他们使用实时PCR测定法来定量miRNA前体的表达。该方法的不利之处是其仅容许定量前体miRNA，而前体miRNA不一定反映成熟miRNA的表达水平。为了全面描述大量miRNA的表达，有必要定量成熟miRNA，例如那些在人疾病中表达的成熟miRNA，其中miRNA生物合成的改变引起了与前体miRNA的那些水平十分不同的成熟miRNA的水平。例如，26种miRNA的前体在来自患者的非-癌性和癌性结肠直肠组织中同水平表达，而成熟的人miR143和miR145的表达在癌组织中较于非癌组织极大地减少，暗示在人疾病中特定miRNA的加工的改变(Michael等，2003，Mol.CancerRes.1：882-891)。另一方面，在拟南芥(Arabidopsis thaliana)的miR165和玉米中miR166的最近发现表明，微RNA作为信号在植物中确定叶的极性并甚至可以形成可以移动的信号从初生叶下的信号中心发散(Juarez等，2004，Nature 428：84-88；Kidner and Martienssen2004，Nature 428：81-84)。
总而言之，使用实时定量PCR测量成熟miRNA以及siRNA的最大的挑战是它们21-25nt这样小的大小。本发明描述的方法解决了在检测和定量小RNA分子即miRNA及siRNA中前述实践的问题，并且目标在于确保发展灵活、方便并且便宜的测定法来精确地并且特异地定量miRNA和siRNA转录物。
RNA编辑和选择剪接
RNA编辑用于描述在RNA分子的一级序列中的任何特定的改变，不包括其它在机理上确定了的加工例如选择性剪接或多腺苷酸化。RNA由于编辑引起的改变分为两大类，这取决于改变是在碱基水平还是核苷酸水平(Gott 2003，C.R.Biologies 326 901-908)。RNA编辑是十分广泛的，发生于哺乳动物、病毒、有袋类动物、植物、蝇类、青蛙、蠕虫、乌贼、真菌、粘菌、腰鞭毛虫、动质体原生动物(kinetoplastid protozoa)及其它单细胞真核生物。现在列出的极可能仅代表冰山一角；基于已知的编辑酶的同系物的分布，RNA编辑几乎无疑发生在许多其它物种，包括全部的后生动物。既然RNA编辑可以以发育或组织-特异性的方式受到调节，其有可能在人疾病的病原学中起重要作用(Gott 2003，C.R.Biologies 326 901-908)。
真核基因的共同特征是它们由蛋白质编码性外显子和内含子组成。内含子的特征是在RNA剪接中从前-mRNA分子切离，内含子两边的序列剪接在一起。RNA剪接不仅提供功能性的mRNA，而且也负责产生另外的多样性。这种现象称为选择性剪接，其导致产生来自相同基因的不同mRNA。代表来自单个基因的亚型的mRNA可以通过利用备选外显子或保留打断两个外显子的内含子而不同。该过程常常导致不同的蛋白质产物，这些蛋白质产物可能相对不同或完全不同，甚至具有相反的细胞功能。不断有证据表明，选择性剪接是十分广泛的(Croft等，Nature Genetics，2000)。最近的研究已经揭示，人基因组中大约35,000种基因的至少80％经选择性剪接(Kampa等，2004，GenomeResearch 14：331-342)。显然，通过组合不同类型的修饰并因而产生不同基因转录物的不同的可能组合，选择性剪接与RNA编辑一起是产生蛋白质多样性的有效机制。对选择性剪接变体和RNA编辑的分析，反过来，代表了功能基因组学、疾病诊断学和药物基因组学的新方法。
作为人疾病致病因子的选择性剪接的错位控制
转录物的详细结构的检测是细胞或组织的分子描述的一个重要目标。没有检测和定量存在于一种组织中的剪接变体的能力，就不能准确地描述转录物的含量或蛋白质的含量。分子医学研究显示，许多癌导致剪接变体水平的改变，所以需要检测和定量这些转录物的精确方法。产生异常剪接形式的突变也可以是这种严重疾病如脊髓性肌萎缩和囊性纤维化的首要原因。
多数对人疾病的研究，以及多数遗传学研究是基于对少数几种模式生物体的研究。选择性剪接模式的进化稳定性以及剪接根据突变和环境及细胞状况而改变的程度影响着这些模式体系的实用性。目前，对选择性剪接模式或RNA编辑改变的速率(rate)以及影响这些速率的因素知之甚少。
之前，进行了其它分析方法来在酵母本身中检测RNA转录物的剪接，或在大鼠组织中检测假定的外显子跳跃剪接(exon skippingsplicing)事件，但这些方法中没有一种具有足够的分辨率来估计剪接变体的量，而剪接变体的量可能是理解细胞生活周期和疾病中的改变所必需的。因而，需要改良的方法来用于核酸扩增、杂交和定量。本发明目前的方法能够区分mRNA剪接变体以及RNA-编辑的转录物，并能定量核酸样品，例如源于患者的样品中的每种变体的量。
真核生物中的反义转录
RNA-介导的基因调控在高等真核生物中是广泛存在的，并且复杂的基因现象如RNA干扰、共抑制、转基因沉默、印记、甲基化，以及可能的位置-效应斑驳和转位，全部涉及基于RNA信号或与RNA信号关联的交叉途径(Mattick 2001；EMBO reports 2，11：986-991)。最近研究表明反义转录是小鼠和人基因组中十分普通的现象(Okazaki等，2002；Nature 420：563-573；Yelin等，2003，Nature Biotechnol)。因而，真核细胞，例如人细胞中基因表达的反义调控看起来是普通的调控机制。鉴于此，本发明提供了用于定量非编码反义RNA的方法，以及用于有义-反义转录单元之间交叠区的高精度基因定位的方法。
发明概述
确定基因组功能和理解隐藏在高等真核生物的复杂转录组中的信息层面的挑战要求有新的、改良的技术来检测、分析和定量复杂核酸样品中的RNA分子。因而，在同源测定体系(homogeneous assaysystem)中使用基于特异性的和灵敏的寡核苷酸检测探针的方法能够在真核生物的转录组中检测和定量成熟的微RNA、siRNA、RNA-编辑的转录物以及高度同源的剪接变体将是十分期望的。
本发明解决了当前上面列举的同源测定法的常规方法面临的问题，本发通过提供一种方法用于设计、合成并组合使用新的寡核苷酸标签探针和检测探针，所述的探针对短的核酸靶标(例如RNA靶标序列)具有足够的序列特异性和高度亲和性，这样它们不太可能检测随机RNA靶标分子并且也不太可能检测前-成熟RNA分子。这种标签探针含有一种序列，其锚定于标签探针上，该序列是作为随后在实时定量PCR测定法中通过聚合酶链式反应的核酸扩增的引发位点所必需的。本发明方法利用两种锚定标签探针，每种探针设计用来组合检测互补的靶标序列(例如短的RNA序列)，其中第一种标签探针杂交至靶标序列内的第一个区域以及第二种标签探针杂交至同一互补靶标序列内的第二个区域(例如与第一个区域邻接的短RNA靶标序列)。在优选的模式中，其中一种标签探针经5’磷酸化，使得杂交至互补靶标序列的两种邻近的标签寡核苷酸探针通过连接酶共价偶联形成单一的寡核苷酸序列。与复杂的核酸样品中的靶标RNA序列杂交的背景通过使用两种标签探针除去，其中两种探针杂交至互补的靶标序列(例如短的RNA靶标序列)上是共价偶联两种探针所需要的。本方法进一步利用高度亲和性的核酸类似物(例如LNA)代替识别序列用以灵敏地以及特异性地杂交至短的靶标序列(例如miRNA或siRNA)上。连接反应后进行靶标序列的定量实时PCR，例如，用核糖核酸即共价连接的寡核苷酸分子作为模板，用连接于标签探针上的锚定序列作为PCR引物的引发位点，以及使用具有足够双链稳定性的短的检测探针来使得能结合扩增子，并采用同源测定法中使用的多种检测原理中的任意一种进行检测。在优选的模式中，将检测探针用双链稳定性的、高度亲和性的核苷酸类似物(例如LNA，并优选氧-LNA)取代，以使得能将短的检测探针用于实时定量PCR测定法。
在另一方法中，杂交至核酸样品中的靶标核糖核酸的标签探针的共价连接用热稳定性连接酶进行，这使得能在靶标序列标记反应(tagging reaction)中在高温下进行变性、退火和连接的重复循环，因而产生许多共价连接的模板分子用于随后的实时定量PCR测定法。在优选的模式中调节退火温度而使得能在复杂核酸分子样品中区分高度同源的靶标核糖核酸。在另一方面调节退火温度而使得能区分在高度同源的靶标序列间的单个错配。
然而，在另一方法中，第一种标签探针的识别序列互补于靶标核糖核酸序列中的序列，例如互补于成熟微RNA或siRNA的3’-末端或互补于位于靶标核糖核酸序列中的RNA编辑核苷酸、剪接点、单核苷酸多态性或点突变的3’的序列。所述的第一标签探针(称为RT标签探针)在使用逆转录酶的逆转录反应中用作锚定引物来产生互补于靶标RNA序列的引物延伸产物。设计第二标签探针(称为2nd链标签探针)而使得其识别序列互补于逆转录酶-延伸的核苷酸序列，所述的逆转录酶-延伸的核苷酸序列对应于成熟微RNA或siRNA的5’-末端或位于核糖核酸靶标序列中的RNA编辑的核苷酸、剪接点、单核苷酸多态性或点突变的5’的序列。2nd链标签探针用作锚定引物来产生互补于引物延伸产物的第二条链。反应的特异性是基于依次使用两种锚定标签探针，其分别杂交至靶标RNA和互补的DNA序列的3’-末端和5’-末端区域。在优选的模式中，用双链稳定性的、高度亲和性的核苷酸类似物(例如LNA，并优选氧-LNA)修饰RT标签探针使得能使用高度严格的引物退火条件。然而，在另一优选的模式中，两种标签探针的识别序列都用双链稳定性的、高度亲和性的核苷酸类似物(例如LNA，并优选氧-LNA)修饰使得能分别在逆转录反应和第二链合成反应中都能使用高度严格的引物退火条件。第二链反应后将得到的双链靶标序列进行定量实时PCR，所述的双链靶标序列对应于锚定的靶标核糖核酸序列(例如微RNA序列)，所述的PCR用连接在标签探针上的锚定序列作为PCR引物的引发位点，并使用具有足够双链稳定性的短检测探针来使得能结合扩增子，并采用同源测定法中使用的多种检测原理中的任意一种。在优选的模式中，将检测探针用双链稳定性的、高度亲和性的核苷酸类似物(例如LNA，并优选氧-LNA)取代，以使得能将短的检测探针用于实时定量PCR测定法。在另一优选的模式中，检测探针进一步用双链稳定性LNA二氨基嘌呤或LNA 2-硫-T高度亲和性类似物以及LNA单体取代。
当组合miRNA或siRNA靶标特异性标签探针集和miRNA或siRNA检测探针时，本发明当前的方法对检测和定量由几十万种不同核酸组成的复杂混合物中单个的小RNA分子(例如测定成熟miRNA或siRNA)是非常有用和适用的。标签探针集以及检测探针中的识别序列通过用高度亲和性的核苷酸类似物(例如LNA，以及优选氧-LNA)代替来合成，使得能在高温下发生高度灵敏和特异性的杂交和连接。通过使用用高度亲和性的核苷酸类似物(例如LNA、LNA二氨基嘌呤和LNA 2-硫-胸腺嘧啶脱氧核苷)代替的本发明的短检测探针，对应成熟miRNA或siRNA的短的扩增子，包括标签探针集的锚定引物位点，可以直接在标准的实时定量PCR测定法中监控。本发明方法此外在检测和定量复杂核酸样品中的miRNA或siRNA外的非编码RNA、反义RNA转录物、RNA-编辑的转录物或高度同源的、选择性剪接转录物中非常有用，所述的核酸样品是例如人、小鼠、大鼠、美丽线虫(C.elegans)、果蝇(Drosophila melanogaster)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、稻和玉米转录组，在它们各自的转录组中由几十万种不同核糖核酸组成。本方法也直接可应用于检测、测试、诊断或定量在复杂的人核酸样品(例如来自癌患者的样品)中涉及或与人疾病关联的miRNA、siRNA、其它非编码RNA、RNA-编辑的转录物或选择性mRNA剪接变体。
附图简述
Fig.1是本发明用于通过序列-特异性实时定量RT-PCT定量微RNA的一种方法的图示。
Fig.2A显示用于人miR-15a微RNA靶标序列的实时定量PCR扩增曲线。将序列特异性LNA-修饰的微RNA标签探针退火并连接，然后使用实时PCR、锚定PCR引物和LNA-修饰的miR-15a微RNA的双-标记检测探针测定连接的标签探针(实心正方形)，用负模板作为阴性对照(十字)。反应的特异性用没有连接酶的反应测试(空心正方形)。使用miR-15a微RNA模板的连接了的微RNA探针的阈值循环数(Ct)是35.0，而阴性对照实验(负模板和负连接酶)没有检测到Ct值。ΔRn是基线校正的标准化报告信号(Rn)并表示在开始的几个PCR循环中确定的Rn减去基线信号。Fig.2B显示在用Gelstar(1∶10000稀释，Cambrex Bio Science，USA)染色的2％琼脂糖凝胶电泳上的实时PCR反应的终末点分析。连接了的miR-15a标签探针模板显示了在泳道1中的PCR片段(～65bp)。阴性对照实验(负模板(泳道2))和负连接酶(泳道3)显示了比连接了的mir-15a标签探针模板短的具有低分子量的片段。在实时PCR反应中无模板的对照(NTC)在琼脂糖凝胶电泳没有任何片段(不显示)。
Fig.3显示用于人miR-15a微RNA靶标序列和相应的DNA 3’-封闭靶标序列的实时定量PCR扩增曲线。RNA模板(实心正方形)替换为在3’-末端用磷酸化学封闭的DNA模板(实心三角形)。没有连接酶(空心三角形)，封闭的DNA模板在LNA序列-特异性实时PCR检测法中不能检测到。RNA模板和DNA模板的Ct值分别是35.0和33.3。
Fig.4显示人miR-15a和人miR-16微RNA靶标序列的实时定量PCR扩增曲线。本发明方法的序列-特异性微RNA靶标序列识别通过使用miR-15a微RNA靶标序列(实心正方形)相对于使用与miR-15a靶标序列具有72％序列一致性的miR-16靶标序列(空心圆形)来评估。在实时PCR反应中负模板对照(十字)和NTC(黑的垂直线)都没显示产生任何信号。用于将LNA-修饰的miR-15a靶标序列-特异性的标签探针退火至miR-15a靶标序列的杂交条件得到36.2的Ct值，而将相同标签探针用于高度同源的miR-16得到39.9的Ct值，对应13-倍的辨别差异。
Fig.5显示了使用两种不同的LNA-修饰的、双标记的检测探针的用于人miR-15a微RNA的实时定量PCR扩增曲线。设计两种不同的LNA-修饰的实时PCR检测探针用于人miR-15a微RNA靶标序列，其使用了由Quick T4 DNA连接试剂盒连接的相同的LNA-修饰的标签探针。在实时PCR测定法中LNA-修饰的检测探针EQ15866(实心正方形)和EQ15867(实心三角形)的使用分别得到38.2和32.2的Ct值。从负连接酶对照(EQ15866，空心正方形；EQ15867，空心三角形)中没有检测到信号。
Fig.6显示了使用不同摩尔比的靶标序列和miR-15a标签探针的用于人miR-15a靶标序列的实时定量PCR扩增曲线。靶标序列和标签探针之间的摩尔比是1∶1(实心正方形)时得到最高的终末点荧光信号(ΔRn值)，而1∶5的摩尔比(空心菱形)得到最低的终末点信号(ΔRn值)。摩尔过量的miR-15a标签探针(1∶5的摩尔比(实心菱形))也导致特异性的终末点信号，尽管在PCR反应中从NTC中没有检测到荧光信号。
Fig.7显示了使用miR-15a标签探针和最好模式的LNA-修饰的检测探针的实时定量PCR扩增曲线，所述的PCR用于掺入进复杂的Torulla酵母总RNA背景的人miR-15a靶标序列。miR-15a微RNA分别以2.4μM(空心正方形)和1μM(空心圆)浓度掺入至10μg的酵母总RNA，以等摩尔浓度与miR-15a标签探针退火，然后连接并通过定量实时PCR进行miR-15a检测。从miR-15a靶标序列对照(无复杂酵母总RNA背景)(实心正方形)观测到最高的荧光信号，而从酵母总RNA样品没有检测到信号(垂直线)。如NTC(十字)表明的，没有观测到实时PCR检测的污染。
Fig.8显示用于人miR-15a微RNA靶标序列的实时定量PCR扩增曲线。将序列-特异性LNA-修饰的微RNA标签探针退火，连接，并然后用实时PCR、锚定PCR引物和SYBR绿检测(实心正方形)检测连接了的模板，用负模板作为阴性对照(十字)。反应的特异性用没有连接酶的反应测试(空心菱形)。
Fig.9是本发明用于通过序列-特异性实时定量RT-PCT定量微RNA的一种方法的图示。
Fig.10显示了DNA、LNA和RNA核苷的结构。
Fig.11是本发明用于通过序列-特异性实时定量RT-PCT定量微RNA的一种方法的图示。
Fig.12显示了LNA 2，6-二氨基嘌呤和LNA 2-硫代胸腺嘧啶脱氧核苷的结构。
Fig.13显示了用于人miR-15a微RNA的实时定量PCR扩增曲线，所述的PCR使用三种不同miR-15a标签探针对以微RNA为模板进行连接(I；EQ16311/EQ16452，II；EQ16453/EQ16307，和III；EQ16447/EQ16307)。对I：miR-15a模板(实心正方形)、无模板(空心正方形)和无T4DNA连接酶(空心菱形)，对II：miR-15a模板(实心三角形)、无模板(空心三角形)和无T4DNA连接酶(虚线)，对III：miR-15a模板(实心圆)、无模板(空心圆)和无T4DNA连接酶(黑线)。
Fig.14显示了实时定量PCR扩增曲线，显示了改良的对人miR-15a微RNA检测，该PCR通过以微RNA为模板进行连接并使用LNA2，6-二氨基嘌呤-增强的miR-15a检测探针。检测探针EQ16580对应实心正方形，EQ16581对应实心三角形，EQ16582对应实心圆以及EQ16583对应十字，以及相应的无模板对照；EQ16580对应空心正方形、EQ16581对应空心三角形、EQ16582对应空心圆以及EQ16583对应黑线。
Fig.15是人miR-15a的实时定量PCR测定法的标准曲线。LNA-修饰的人miR-15a微RNA标签探针EQ16311/EQ16452(对I)用于以miR-15a为模板的连接反应，其中人miR-15a模板浓度分别是50、5、0.5、0.05或0.005nM。连接了的模板然后用实时PCR进行检测，所述的PCR使用锚定PCR引物和miR-15a微RNA的LNA-修饰的双标记检测探针EQ15866，负模板用作阴性对照。循环阈值对模板拷贝数的log值的曲线用来产生标准曲线。
Fig.16显示了实时定量PCR扩增曲线来说明对人mir-15a微RNA的检测，所述的PCR扩增使用miR-15a微RNA为模板的RT-PCR反应和不同的LNA-修饰的锚定标签探针和LNA-修饰的双标记检测探针。选取了三种不同的微RNA RT-PCR标签探针对，对IV：EQ16591/EQ16311，miR-15模板(实心正方形)，无模板(黑mark)；对V：EQ16591/EQ16314，miR-15模板(实心菱形)，无模板(空心三角形)；以及对VI：EQ16589/EQ16314，miR-15模板(实心圆)，无模板(黑线)。空心圆表示无RT-PCR酶的混合对照。
Fig.17显示了通过微RNA为模板的RT-PCR说明改良的对人miR-15a微检测的实时定量PCR扩增曲线，所述的实时定量PCR使用LNA 2，6-二氨基嘌呤增强的miR-15a检测探针。不同的双标记检测探针显示如下：EQ16580(实心三角形)、EQ16581(实心正方形)、EQ16582(实心正方形)检测探针和无模板阴性对照(实线)。
Fig.18是人miR-15a的实时定量PCR测定法的标准曲线。人miR-15a的LNA-修饰的微RNA标签探针EQ16624/EQ16620(对VII)用作反转录引物(RT标签探针)和2nd链标签探针。RT-PCR反应分别用50、5、0.5、0.05或0.005nM浓度的miR-15a模板进行。然后通过使用锚定PCR引物和miR-15a微RNA的LNA-修饰的双标记检测探针(EQ16582)用实时PCR检测miR-15a。循环阈值对模板拷贝数的log值的曲线用来产生标准曲线。
Fig.19显示了通过微RNA为模板的RT-PCR反应的实时定量PCR扩增曲线，该曲线说明了对人miR-15a的检测，所述的实时定量PCR使用60℃(实心三角形)、55℃(实心正方形)和50℃(实心菱形)不同的退火温度。无RT-PCR酶的混合对照和无模板负对照没有检测到信号。
Fig.20显示了实时定量PCR扩增曲线，说明了对人mir-15a微RNA的检测，所述的PCR扩增使用了miR-15a微RNA为模板的RT-PCR反应和不同LNA-修饰的双标记检测探针。不同的双标记检测探针显示如下：miR-15a为模板的实时PCR和检测探针EQ16582(实心三角形)，混杂的miR-16为模板的实时PCR和检测探针EQ16582(空心三角形)，miR-15a为模板的实时PCR和检测探针EQ16679(实心圆)，混杂的miR-16为模板的实时PCR和检测探针EQ16679(空心圆)，并且无RT-PCR酶的混合对照和无模板负对照没有检测到信号。
Fig.21显示了实时定量PCR扩增曲线，说明了对人mir-15a微RNA的检测，所述的PCR扩增使用miR-15a微RNA为模板的RT-PCR反应和LNA-修饰的锚定标签探针和LNA-修饰的双标记检测探针。样品显示如下：miR-15a为模板的实时PCR(实心三角形)、混杂的miR-16为模板的实时PCR(实心正方形)、无Superscript III的阴性对照(空心正方形)和无模板阴性对照(空心三角形)。
Fig.22是本发明用于通过序列-特异性实时定量RT-PCT定量微RNA的一种方法的图示。
Fig.23显示了使用微RNA为模板的RT-PCR反应的实时定量PCR扩增曲线，证明了改良的对人miR-15a的检测，所述的实时定量PCR使用LNA 2，6-二氨基嘌呤增强的miR-15a检测探针。该图形说明了miR-15a微RNA靶标序列(空心圆)与miR-16靶标序列(实心三角形)的比较，后者与miR-15a靶标序列有72％的序列一致性。阴性对照是没有微RNA的封闭标签探针(空心三角形)、没有第二链LNA标签探针(实心正方形)和无Klenow片段(3’→5’外切-)酶(空心正方形)，但是在实时PCR反应中，无hsa-miR-15a反向引物2对照(线形)或无Qiagen OneStep RT-PCR酶混合物对照(线)中没有观测到信号。
Fig.24是人miR-15a的实时定量PCR检测的扩增曲线和标准曲线(小图)。将LNA-修饰的人miR-15a微RNA标签探针EQ1695和EQ16624(对IX)用于miR-15a为模板的RT-PCR反应，3’-封闭的LNA-修饰的标签探针用作捕获序列，其中在各个试验中成熟人miR-15a模板分别是500、50、5、0.5或0.05fmol。然后用实时PCR检测该模板的miR-15a微RNA，所述PCR通过使用锚定PCR引物和LNA-修饰的双标记检测探针EQ15866来进行，负模板用作阴性对照。循环阈值对模板拷贝数的log值的曲线用来产生标准曲线。
Fig.25显示了证明对人U6 snRNA为模板的RT-PCR反应的检测的实时定量PCR扩增曲线，所述的PCR使用LNA检测探针和1μL cDNA模板(实心正方形)、5μL cDNA模板(空心正方形)和无模板阴性对照(空心三角形)。
Fig.26显示了实时定量PCR扩增曲线，该曲线说明了对hsa
miR-7a为模板的TR-PCR的检测，所述的PCR产生了足够量信号的S形的扩增曲线，Ct值为18.5。
Fig.27是本发明用于通过序列-特异性实时定量RT-PCT定量微RNA的一种方法的图示。
Fig.28是本发明用于通过序列-特异性实时定量RT-PCT定量微RNA的一种方法的图示。
Fig.29显示了部分的Hsa miR-15a前体序列、成熟的Hsa miR-15a序列以及本发明的一种方法的图示，所述的方法通过序列-特异性实时定量RT-PCR用于定量微RNA。
Fig.30显示了部分的Hsa miR-143前体序列、成熟的Hsa miR-143序列以及本发明的一种方法的图示，所述的方法通过序列-特异性实时定量RT-PCR用于定量微RNA。
Fig.31是本发明用于通过序列-特异性实时定量RT-PCT定量微RNA的一种方法的图示。
Fig.32显示用于人miR-143微RNA靶标序列的实时定量PCR扩增曲线。本检测法根据Fig.31中的图示进行并如实施例30中描述。空心正方形表示在实施例30步骤2中纯化了的反应，实心正方形表示在实施例30的第2步中没有纯化的反应。没有从基线上升的曲线表示对应的“无miR”-对照。
Fig.33是本发明的一种方法的图示，所述的方法用于通过序列-特异性实时定量RT-PCT定量微RNA。
Fig.34显示了部分的Hsa miR-143前体序列、成熟的Hsa miR-143序列以及本发明的-种方法的图示，所述的方法通过序列-特异性实时定量RT-PCR用于定量微RNA。
Fig.35显示了实时定量PCR扩增曲线，其证明了RNA接头与成熟微RNA的连接和随后的逆转录，并且实时PCR使用具有淬灭基团Q2的LNA-修饰的检测探针。bsa-let-7a对应空心正方形、hsa-let-7g对应实心正方形、无miRNA对应空心三角形，以及无PCR模板对照对应实心三角形。
Fig.36是本发明的一种方法的图示，所述的方法用于通过序列-特异性实时定量RT-PCT定量微RNA。
Fig.37是本发明的一种方法的图示，所述的方法用于通过序列-特异性实时定量RT-PCT定量微RNA。
定义
为了后面详细描述本发明这个目的，为特定术语提供以下的定义，所述的术语用于本发明的公开内容。
在下文中，“封闭探针”指一种探针，其含有与靶标序列(例如短的RNA靶标序列、寡核苷酸、引物)互补的识别序列。所述的封闭序列用于防止序列相同的分子与互补的靶标序列杂交。一般而言，封闭序列含有一个、两个或更多LNA单体并且封闭探针的3’-末端经修饰以抑制封闭探针整合进引物延伸产物内。这种“封闭”可以通过使用非互补的碱基或通过加入化学部分如生物素或磷酸基团至最后的核苷酸的3’-羟基基团而达到。
在下文中，“dNTP”表示2′-脱氧腺苷-5’-三磷酸、2′-脱氧胞苷-5’-三磷酸，2′-脱氧鸟苷-5’-三磷酸和2′-脱氧胸苷-5’-三磷酸的混合物。
“RT-引物”指一种引物，其含有与靶标脱氧核糖核酸和/或核糖核酸序列中的序列互补的识别序列，例如与成熟的微RNA或siRNA的3’-末端或与RNA-DNA嵌合体，或与位于靶标核糖核酸序列中的RNA-编辑的核苷酸、剪接点、单核苷酸多态性或点突变的3’的序列互补的识别序列，并含有随后的捕获或PCR扩增所必需的锚定序列。所述的RT-引物在使用逆转录酶的逆转录反应中用作锚定引物来产生互补于靶标RNA序列的引物延伸产物。
术语“捕获探针”指一种探针，其含有互补于靶标序列(如短的RNA靶标序列)的识别序列和随后的捕获、逆转录反应或PCR扩增所必需的锚定序列。锚定序列用作随后的逆转录反应、实时PCR的RT-或PCR引物的引发位点，或作为捕获检测法的标签。
在本文中，术语“连接物”表示在热化学上和光化学上无活性的产生间隔(distance-making)的基团，其用于连接两个或多个不同的上面定义的类型的核苷酸部分。连接序列是基于不同的性质而选择的，这些性质包括疏水性、亲水性、分子柔性和长度(例如，参见Hermanson等，″Immobilized Affinity Ligand Techniques″，Academic Press，San Diego，California(1992)，p.137-ff)。一般而言，连接序列的长度少于或约400埃，在一些应用中优选少于100埃。因而，连接序列含有一条任选由一个或多个杂原子(例如氧原子、氮原子，和/或硫原子)打断或以它们结尾的碳原子链。因而，连接序列可以含有一个或多个酰胺、酯、氨基、醚和/或硫醚官能团，并任选为芳香的或单/多不饱和烃、聚氧乙烯(如聚乙二醇)、寡/聚酰胺(例如多聚-(3-丙氨酸)、多聚甘氨酸、多聚赖氨酸)和肽，一般是低聚糖、寡/多聚磷酸酯。而且连接序列可以由它们的组合单位组成。连接序列的长度可以不同，这要考虑关于5-或6-元环的涉及基团的“活性/官能性”部分的理想的或必需的定位和空间取向。在特别感兴趣的实施方案中，连接序列包括可化学裂解的基团。这种可化学裂解基团的实例包括在还原条件下可裂解的二硫化物基团、可由肽酶裂解的肽片段等。
在本文中，“固体支持物”可以选自广泛围的聚合物材料，例如CPG(可控多孔玻璃)、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯或聚乙烯，并且可以采用不同的形式，例如管、微量滴定孔板、棒、珠、粒子、虑器等。寡核苷酸可以经由其5’-或3’-末端(或经由连接至5’-或3’-末端的连接物的末端)固定于固体支持物上，这可通过多种通常在寡核苷酸的固定中采用的化学或光化学方法或通过非-共价偶联(例如通过将生物素化的寡核苷酸与固定化的链霉亲和素结合)来进行。
“环状引物”指一种探针，其含有与靶标脱氧核糖核酸序列中的序列互补的识别序列，所述的识别序列与对应于成熟微RNA或siRNA的5’-末端或位于最初的核糖核酸靶标序列中的RNA编辑的核苷酸、剪接点、单核苷酸多态性或点突变的5’的逆转录酶-延伸的核苷酸序列互补，还含有对于随后的捕获或PCR扩增所必需的锚定序列，所述的环状引物用作锚定引物来产生与引物延伸产物互补的第二核酸链。环状引物的另一方面是，锚定序列在选定的测定温度下形成一个分子内的发夹结构，这种结构的形成由在该寡核苷酸的5’-和3’-末端的互补序列介导。反应的特异性是基于依次使用具有不交叠的识别序列的两种锚定标签探针，其分别杂交至靶标RNA和互补DNA序列的3’-末端和5’-末端区域。
“发夹结构”指在选定的检测温度下的寡核苷酸的分子内结构，这种结构由该寡核苷酸的5’-和3’-末端的互补序列的杂交介导。
“U”指酶单位，其定义为在给定时间和温度下转化给定量的反应物为产物所需的酶的量。
在本文中，“配体”指能结合的一些物质。配体包括生物素和官能基团，例如：芳香基团(例如苯、吡啶、萘、蒽和菲)、杂芳基团(例如噻吩、呋喃、四氢呋喃、吡啶、二噁烷和嘧啶)、羧酸、羧酸酯、碳酰卤、碳酰叠氮化物、碳酰肼、磺酸、磺酸酯、磺酰卤、氨基脲、氨基硫脲、醛、酮、伯醇、仲醇、叔醇、酚、烷基卤、硫醇、二硫化物、伯胺、仲胺、叔胺、肼、环氧化物、马来酰亚胺、任选由一个或多个杂原子(例如氧原子、氮原子和/或硫原子)打断或以它们结尾的C1-C20烷基，其任选含有芳香的或单/多不饱和烃、聚氧乙烯(如聚乙二醇)、寡/聚酰胺(例如多聚β-丙氨酸、多聚甘氨酸、多聚赖氨酸)、肽、寡/多聚糖、寡/多聚磷酸酯、毒素、抗生素、细胞毒素和类固醇，以及还有″亲合性配体″，即对特定蛋白质、抗体、多-和寡糖及其它生物分子上的位点具有特异亲合性的官能团或生物分子。
单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代，除非文中清楚地另外指出。例如，术语“细胞”包括多个细胞，包括它们的混合物。术语“核酸分子”包括多个核酸分子。
“转录组”指任何物种的基因组的转录单位的全部总和。除了编码蛋白质的mRNA，其也代表非编码RNA，例如小的核仁RNA、siRNA、微RNA和反义RNA，其在细胞中包含重要的结构和调节功能。
术语“扩增子”指小的、复制的DNA片段。
“样品”指细胞或从生物体分离的组织或液体样品，包括(但不限于)，例如皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿、泪液、血细胞、器官、肿瘤，并且也指体外细胞培养成分的样品(包括但限于细胞在细胞培养基中生长产生的条件培养基、重组细胞及细胞组分)。
“生物”指生活实体，包括但不限于，例如，人、小鼠、大鼠、果蝇、美丽线虫、酵母、拟南芥、玉米、稻、斑马鱼、灵长类、家畜等。
“标签探针”指探针，其含有与靶标序列(例如短的RNA靶标序列)互补的识别序列和随后捕获或PCR扩增所需的锚定序列。“两种标签探针”或“标签探针对”指两种锚定标签探针，每种设计来组合检测短的互补靶标序列(例如短的RNA序列)，其中第一种标签探针的识别序列杂交至靶标序列内的第一个区域并且第二个标签探针的识别序列杂交至相同互补靶标序列内的第二个区域(例如邻接第一个区域的短的RNA靶标序列)。在本发明方法中，其中一种标签探针经5’磷酸化，使得杂交至互补的靶标序列的两种邻近的、非交叠的标签寡核苷酸探针通过连接酶共价偶联形成单条寡核苷酸序列。连接至标签探针的锚定序列经设计而使得它们在本发明方法中使用的杂交条件下不与给定转录组中的任何靶标核酸或相互之间发生交叉-杂交。锚定序列用作随后实时定量PCR的PCR引发位点，或作为捕获检测法的标签。
“RT标签探针”指一种探针，其含有与靶标核糖核酸序列中的序列互补的识别序列，例如与成熟的微RNA或siRNA的3’-末端或与位于靶标核糖核酸序列中的RNA-编辑的核苷酸、剪接点、单核苷酸多态性或点突变的3’的序列互补的识别序列，并含有随后的捕获或PCR扩增所必需的锚定序列。所述的RT标签探针在使用逆转录酶的逆转录反应中用作锚定引物来产生互补于靶标RNA序列的引物延伸产物。“2nd链标签探针”指锚定的标签探针，其识别序列与对应于成熟微RNA或siRNA的5’-末端或位于初始核糖核酸靶标序列中的RNA编辑核苷酸、剪接点、单核苷酸多态性或点突变的5’的序列的逆转录酶-延伸的核苷酸序列互补。2nd链标签探针用作锚定引物来产生与引物延伸产物互补的第二条核酸链。反应的特异性是基于依次使用具有不交叠的识别序列的两种锚定标记探针，分别杂交至靶标RNA和互补DNA序列的3’-末端和5’-末端区域。
“两种标签探针”或“标签探针对”指两种锚定标签探针，每种经设计来组合探测短的互补靶标序列(例如短的RNA序列)，其中第一种标签探针的识别序列杂交至靶标序列内的第一个区域并且识别序列的2nd链标签探针识别与逆转录酶-延伸的核苷酸序列互补的序列，逆转录酶-延伸的核苷酸序列对应成熟微RNA或siRNA的5’-末端或位于最初的核糖核酸靶标序列中的RNA编辑的核苷酸、剪接点、单核苷酸多态性或点突变的5’。2nd链标签探针用作锚定引物来产生与引物延伸产物互补的第二条核酸链。
连接至这两种标签探针的每种的锚定序列经设计而使得它们在本发明方法中使用的杂交条件下不与给定转录组中的任何靶标核酸或相互之间发生交叉杂交。锚定序列用作随后实时定量PCR的PCR引物引发位点，或作为捕获检测法的标签。
术语“引物”可以指多于一种引物并指寡核苷酸，不论是天然产生的(如经纯化的限制酶切消化物中的)还是合成产生，当置于其中与核酸链互补的引物延伸产物的合成得以催化的条件下时，其能作为沿互补链的合成的起始点。这种条件包括在合适的缓冲系(“缓冲系”包括为辅助因子或影响pH、离子强度等的物质)并在合适温度下四种不同的脱氧核糖核苷三磷酸和聚合作用诱导剂如DNA聚合酶或逆转录酶的存在。引物优选在合适的缓冲系(“缓冲系”包括为辅助因子或影响pH、离子强度等的物质)中以及在适合温度下是单链的以最大效率地由聚合酶或逆转录酶进行扩增。引物优选是单链用以最大效率的扩增。
术语“检测探针”指经标记的寡核苷酸，其由于该探针与靶标区域的互补性而与扩增的靶标核酸(例如短的RNA靶标序列)内的序列形成双链结构。检测探针优选不含有与用来引发聚合酶链式反应的序列互补的序列。一般而言，探针的3’末端将受到“封闭”以抑制该探针整合进引物延伸产物。“封闭”可以通过使用非互补性碱基或通过加入化学部分如生物素或磷酸基团至最后的核苷酸的3’羟基而获得，这取决于选择的部分，其可以起双重目的，即也可以作为标记。
术语“miRNA”和“微RNA”指源于内源基因的21-25nt的非编码RNA。它们从更长(约75nt)的称为前-miRNA的发夹状的前体加工而来。微RNA装配进称为miRNP的复合体中并通过反义互补性识别它们的靶标。如果微RNA与它们的靶标100％匹配，即完全互补，则靶标mRNA被切割，并且miRNA如同siRNA起作用。如果不完全匹配，即部分互补，那么靶标mRNA的翻译受到阻断。
术语“小干扰RNA”或“siRNA”指21-25nt的RNA，其源于对线形双链RNA的加工。siRNA组装进称为RISC(RNA-诱导的沉默复合体)的复合物中，并且针对同源的RNA序列进行内切核苷酸的切割。合成的siRNA也组装成RISC并能切割同源RNA序列。
术语“RNA干扰”(RNAi)指其中与靶标mRNA同源的双链RNA导致该靶标mRNA的降解的现象。更广义地定义为通过同源siRNA对靶标mRNA的降解。
术语“识别序列”指与靶标核苷酸序列内的区域互补的核苷酸序列，所述的区域是靶标核苷酸序列和识别序列之间的序列特异性杂交所必需的。本发明的标签探针以及检测探针含有靶标序列特异性的识别序列。
术语“锚定序列”指连续地连接至标签探针对的两个核苷酸序列，所述的锚定序列经设计以使得它们相互之间或与靶标核苷酸序列或含有靶标核苷酸序列的核酸样品中的任意核苷酸序列不发生交叉杂交。
如此处使用的术语“标签”指可用于提供可检测(优选可定量)的信号的任何原子或分子，并且其可以连接至核酸或蛋白质上。标签可以提供通过荧光、放射性、比色法、X-射线衍射或吸收、磁性、酶促活性等等而可以检测的信号。
标签是报告基团，其可以通过其本身检测或可作为检测系列的一部分检测。报告基团的官能性部分的实例是生物素、地高辛、荧光基团(能够吸收某种波长的电磁辐射(例如光或X-射线)的基团，并且其随后再发射吸收的能量为更长波长的辐射；说明性的实例是DANSYL(5-二甲基氨基)-1-萘磺酰基)、DOXYL(N-氧-4，4-二甲基噁唑烷)、PROXYL(N-氧-2，2，5，5-四甲基吡咯烷)、TEMPO(N-氧-2，2，6，6-四甲基哌啶)、二硝基苯基、吖啶类、香豆素类、Cy3和Cy5(Biological Detection Systems公司的商标)、赤藓红、香豆酸、伞形酮、德克萨斯红、罗丹明、四甲基罗丹明、Rox、7-硝基苯-2-氧杂-1-二唑(NBD)、芘、荧光素、铕、钌、钐及其它稀有碱土金属)、放射性同位素标记、化学发光标记(在化学反应时通过光的发射而可检测的标记)、自旋标记(通过使用电子自旋共振光谱可以检测的结合至生物分子上的自由基(例如，经取代的有机硝基氧化物)或其它顺磁探针(例如Cu2+、Mg2+))。特别重要的实例是生物素、荧光素、德克萨斯红、罗丹明、二硝基苯基、地高辛、钌、铕、Cy5、Cy3等。
“连接”或“共价偶联”指共价偶联两种邻接的核苷酸序列(例如本发明的标签寡核苷酸探针序列)而形成单条核苷酸序列。本反应通过连接酶催化，在一条核苷酸序列的5’-末端和邻近的核苷酸序列的3’-末端之间(例如在退火至它们的互补靶标核酸序列上的本发明的两个邻接的标签探针之间)形成磷酸二酯键。
“RNA为模板的寡核苷酸连接”指共价偶联退火至互补RNA靶标序列上的两个邻近的寡核苷酸探针序列而形成单条核苷酸序列。本反应通过连接酶催化，其在一条核苷酸序列的5’-末端和邻近的核苷酸序列的3’-末端之间(例如在本发明的两个邻接的标签探针之间)形成磷酸二酯键。
术语“PCR反应”、“PCR扩增”、“PCR”、“预-PCR”和“实时定量PCR”是可互换的术语，其用于表示使用扩增要检测的靶标核酸的核酸扩增体系。这种体系的实例包括聚合酶链式反应(PCR)体系和连接酶链式反应(LCR)体系。最近描述的以及本领域技术人员已知的其它方法是基于核酸序列的扩增(NASBATM，Cangene，Mississauga，Ontario)和Q Beta复制酶体系。通过所述的扩增反应形成的产物可以或不可以进行实时监控或仅在反应后作为终末点测量。
如此处使用的，术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”指用于检测的引物、探针、寡聚体片段、寡聚体对照和未标记的封闭寡聚体，并应该是聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)，以及多核苷酸的任意其它类型的上位概念，所述的其它类型是嘌呤或嘧啶碱基或经修饰的嘌呤或嘧啶碱基的N糖苷。在术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”之间在长度上没有作有意的区别，并且这些术语将可以互换使用。这些术语仅指分子的一级结构。因而，这些术语包括双-和单-链DNA以及双-和单-链RNA。寡核苷酸包括对应指定靶标核苷酸序列的区域的约至少3个核苷酸、优选至少约6个核苷酸，并且更优选至少8-30个核苷酸的序列。“对应”表示与指定序列相同或互补。寡核苷酸不一定在物理上源于任何存在的或天然的序列，而是可以以任何方式(包括化学合成、DNA复制、逆转录或它们的组合)产生。
术语“寡核苷酸”或“核酸”指基因组DNA或RNA、cDNA(半合成的多核苷酸或合成的来源)的多核苷酸，其由于它的来源或操作：(1)与其天然结合的多核苷酸的全部或部分不结合；和/或(2)连接至不同于其天然连接的多核苷酸的多核苷酸；并(3)天然中没发现。由于单核苷酸以某种方式反应而形成寡核苷酸，使得一个单核苷酸戊糖环的5’-磷酸经磷酸二酯键连接至其在一个方向上邻近的单核苷酸的3’-氧上，寡核苷酸的一个末端如果其5’磷酸没有连接至单核苷酸戊糖环的3’氧上则称为“5’末端”，而如果其3’氧没有连接至随后的单核苷酸戊糖环的5’磷酸上则称为“3’末端”。如此处使用的，核苷酸序列，即使处于更大的寡核苷酸内部，也可以说是具有5’和3’末端。当两种不同的、非交叠的寡核苷酸退火至相同的线形互补核酸序列的不同区域上，一条寡核苷酸的3’末端指向另一条的5’末端；前者可以称为“上游”寡核苷酸而后者称为“下游”寡核苷酸。
术语“SBC核碱基(nucleobase)”指“选择性结合互补的”核碱基，即可以与它们的互补核碱基形成稳定氢键，但不能与其它SBC核碱基形成稳定氢键的经修饰的核碱基。举个例子，SBC核碱基A’，它可以与其互补的未修饰的核碱基T形成稳定氢键对。类似地，SBC核碱基T’可以与其互补的未经修饰的核碱基A形成稳定的氢键对。然而，与碱基对A’-T和A-T’相比，SBC核碱基A’和T’将形成不稳定的氢键对。类似地，C的SBC核碱基称为C’并可以与其互补的未经修饰的G形成稳定的氢键对，而G的SBC核碱基称为G’并可以与其互补的未经修饰的核碱基C形成稳定的氢键对，仍然，与碱基对C’-G和C-G’相比，C’和G’将形成不稳定的氢键对。当形成了2个或多个氢键时可获得稳定的氢键对，例如A’和T、A和T’、C和G’以及C’和G之间的对。当形成1个或没有氢键时获得不稳定的氢键对，例如A’和T’以及C’和G’之间的对。特别重要的SBC核碱基是2，6-二氨基嘌呤(A’，也称为D)以及2-硫-尿嘧啶(U’，也称为2SU)(2-硫-4-氧-嘧啶)和2-硫-胸腺嘧啶(T’，也称为2ST)(2-硫-4-氧-5-甲基-嘧啶)。Fig.4说明了A-2ST和D-T对具有2个或多于2个氢键，而D-2ST对形成单个(不稳定的)氢键。类似地，SBC核碱基吡咯并-[2，3-d]嘧啶-2(3H)-酮(C’，也称为Pyrrolopyr)和次黄嘌呤(G’，也称为I)(6-氧-嘌呤)显示于Fig.9中，其中PyrroloPyr-G对和C-I对每对具有2个氢键，而PyrroloPyr-I对形成单个氢键。
“SBC LNA寡聚物”指含有至少一个LNA单体的“LNA寡聚物”，其中核碱基是“SBC核碱基”。“具有SBC核碱基的LNA单体”表示“SBC LNA单体”。一般而言，SBC LNA寡聚物包括除了SBC LNA单体还含有其它经修饰的或天然出现的核苷酸或核苷的寡聚物。“SBC单体”表示具有SBC核碱基的非LNA单体。“异序列寡核苷酸”表示在Watson-Crick意义上具有与相应的经修饰的寡核苷酸相同序列的一条寡核苷酸，例如序列agTtcATg等价于agTscD2SUg，其中s等价于SBC DNA单体2-硫-t或2-硫-u，D等价于SBC LNA单体LNA-D以及2SU等价于SBC LNA单体LNA2SU。
如此处使用的核酸序列的互补序列指一条寡核苷酸，其当与该核酸序列比对而使得一条序列的5′末端与另一条的3’末端配对时，是“反向平行结合”。一般在天然核酸中没发现的碱基可以包含在本发明的核酸内，例如，肌苷和7-脱氮鸟嘌呤。互补性可以不是完全的；稳定的双链可以含有错配碱基对或不匹配碱基。在核酸技术领域的技术人员考虑许多变量(包括例如，寡核苷酸的长度、寡核苷酸中胞嘧啶和鸟嘌呤的百分比含量、离子强度和错配碱基对的发生率)根据经验可以确定双链稳定性。
解链温度或“Tm”用以度量核酸双链的稳定性。在特定条件下特定核酸双链的Tm是一半的双链已经解聚时的温度。
如此处定义的，“5′→3′核酸酶活性”或“5′至3’核酸酶活性”指模板-特异性核酸聚合酶的活性，其包括5′→3′核酸外切酶活性，该外切酶活性通常与一些DNA聚合酶相关联，藉此核苷酸相继从寡核苷酸的5’末端被除去(即大肠杆菌DNA聚合酶I具有该活性而Klenow片段没有)，或包括5′→3′核酸内切酶活性，其中在5’末端多于一个核苷酸发生了切割，或包括这两种活性。
“热稳定性核酸聚合酶”指当比较时，例如与来自大肠杆菌聚合酶比较时对热相对稳定，并催化核苷的聚合作用的酶。一般而言，该酶将在退火至靶标序列的引物的3’-末端起始合成，并沿模板向5’-方向进行，并且如果具有5’至3’核酸酶活性，则水解或取代插入的、退火的探针而释放标记的和未标记的探针片段或完整的探针，直至合成终止。一种代表性热稳定性酶从栖热水生菌(Taq)中分离，其描述于美国专利号4,889,818，并且在常规PCR中使用它的方法描述于Saiki等，(1988)，Science 239：487。
“热稳定性逆转录酶”指一种逆转录酶，其与例如禽骨髓瘤病毒(AMV)逆转录酶或莫洛尼氏猴白血病毒(MMLV)逆转录酶相比更具有热稳定性。
术语“核碱基”涵盖了天然出现的核碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以及非天然出现的核碱基例如黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N4，N4-桥亚乙基胞嘧啶、N6，N6-桥亚乙基-2，6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基-胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷，并且描述于Benner等，U.S.Patent No.5,432,272和Susan M.Freier和Karl-Heinz Altmann，Nucleic AcidResearch，25：4429-4443，1997中的“非天然出现”核碱基。术语“核碱基”因而不仅包括已知的嘌呤和嘧啶杂环，而且还包括其杂环类似物和互变异构体。其它天然出现的和非天然出现的核碱基包括在美国专利No.3,687,808中；在Sanghvi的Antisense Research andApplication，S.T.Crooke和B.Lebleu编辑，CRC Press，1993的第15章中；在Englisch等，Angewandte Chemie，InternationalEdition，30：613-722，1991中(特别参见622-623页，以及在ConciseEncyclopedia of Polymer Science and Engineering，J.I.Kroschwitz编辑，John Wiley & Sons，pages 858-859，1990、Cook，Anti-Cancer DrugDesign 6：585-607，1991中)描述的那些核碱基。
术语“核苷碱基”或“核碱基类似物”另外旨在包括可以作为类似核苷碱基的杂环化合物，包括某些在最经典意义上不是核苷碱基但作为核苷碱基的“通用碱基”。特别提到的通用碱基是3-硝基吡咯或5-硝基吲哚。其它优选的化合物包括芘和吡啶基噁唑衍生物、芘基、芘基甲基丙三醇衍生物等等。其它优选的通用碱基包括吡咯、二唑或三唑衍生物，包括那些本领域已知的通用碱基。
“通用碱基”指天然出现的或理想地非天然出现的化合物或部分，其可以与至少-种或优选地与全部天然碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和/或胸腺嘧啶)配对，并且其具有此处描述的15、12、10、8、6、4或2℃或更小的Tm差别。
“寡核苷酸”、“寡聚体”或“寡”表示通过核苷酸间键合连接的单体(例如杂环碱基的糖苷)的连续的链。在寡核苷酸中的两个连续的单体之间的键由2-4个(优选3个)基团/原子组成，所述的基团/原子选自-CH2-、-O-、-S-、-NRH-、＞C＝O、＞C＝NRH、＞C＝S、-Si(R″)2-、-SO-、-S(O)2-、-P(O)2-、-PO(BH3)-、-P(O，S)-、-P(S)2-、-PO(R″)-、-PO(OCH3)-和-PO(NHRH)-，其中RH选自氢和C1-4-烷基，以及R″选自C1-6-烷基和苯基。这种键的说明性实例是-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CO-CH2-、-CH2-CHOH-CH2-、-O-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-O-CH2-CH＝(当用作连接随后的单体的键时包括R5)、-CH2-CH2-O-、-NRH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NRH-、-CH2-NRH-CH2-、-O-CH2-CH2-NRH-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-、-NRH-CS-NRH-、-NRH-C(＝NRH)-NRH-、-NRH-CO-CH2-NRH-、-O-CO-O-、-O-CO-CH2-O-、-O-CH2-CO-O-、-CH2-CO-NRH-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CHCH2-NRH-、-CH＝N-O-、-CH2-NRH-O-、-CH2-O-N＝(当用作连接随后的单体的键时包括R5)、-CH2-O-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-O-、-CH2-NRH-CO-、-O-NRH-CH2-、-O-NRH-、-O-CH2-S-、-S-CH2-O-、-CH2-CH2-S-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH＝(当用作连接随后的单体的键时包括R5)、-S-CH2-CH2-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-S-CH2-、-CH2-SO-CH2-、-CH2-SO2-CH2-、-O-SO-O-、-O-S(O)2-O-、-O-S(O)2-CH2-、-O-S(O)2-NRH-、-NRH-S(O)2-CH2-、-O-S(O)2-CH2-、-O-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O，S)-S-、-O-P(S)2-S-、-S-P(O)2-S-、-S-P(O，S)-S-、-S-P(S)2-S-、-O-PO(R″)-O-、-O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(OCH2CH3)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRN)-O-，-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-O-P(O，NRH)-O-、-CH2-P(O)2-O-、-O-P(O)2-CH2-和-O-Si(R″)2-O-；其中-CH2-CO-NRH-、-CH2-NRH-O-、-S-CH2-O-、-O-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-NRH-P(O)2-O-、-O-P(O，NRH)-O-、-O-PO(R″)-O-、-O-PO(CH3)-O-和-O-PO(NHRN)-O-(其中RH选自氢和C1-4-烷基，以及R″选自C1-6-烷基和苯基)是特别理想的。另外的说明性实例在Mesmaeker等，Current Opinion inStructural Biology 1995，5，343-355和Susan M.Freier和Karl-Heinz Altmann，Nucleic Acids Research，1997，vol 25，pp4429-4443中给出。
核苷间键合的左手边结合至3’-位置的P*取代基的5-元环，而右手边结合至前面的单体的5’-位置。
“LNA”或“LNA单体”(例如LNA核苷或LNA核苷酸)或LNA寡聚物(例如寡核苷酸或核酸)表示包括至少一个LNA单体的核苷或核苷酸类似物。公开于PCT出版物WO 99/14226中的LNA单体通常是最理想的经修饰的用来整合进本发明的寡核苷酸的核酸。而且，核酸可以通过本领域已知的任何类型的修饰在3’和/或5’末端修饰。例如，任一端或两端可以盖有保护基团、连接至柔性连接基团、连接至反应基团以助于连接至底物表面等等。理想的LNA单体和它们的合成方法也公开于US 6,043,060、US 6,268,490、PCT出版物WO 01/07455、WO 01/00641、WO 98/39352、WO 00/56746、WO 00/56748和WO 00/66604以及公开于以下文献：Morita等，Bioorg.Med.Chem.Lett.12(1)：73-76，2002；Hakansson等，Bioorg.Med.Chem.Lett.11(7)：935-938，2001；Koshkin等，J.Org.Chem.66(25)：8504-8512，2001；Kvaerno等，J.Org.Chem.66(16)：5498-5503，2001；Hakansson等，J.Org.Chem.65(17)：5161-5166，2000；Kvaerno等，J.Org.Chem.65(17)：5167-5176，2000；Pfundheller等，Nucleosides Nucleotides18(9)：2017-2030，1999；以及Kumar等，Bioorg.Med.Chem.Lett.8(16)：2219-2222，1998。
优选的LNA单体，也称为“氧-LNA”是包括如公开于PCT出版物WO 03/020739的双环化合物的LNA单体，其中如下式(I)显示的R4’和R2’一起指-CH2-O-或-CH2-CH2-O-。“LNA修饰的寡核苷酸”或“LNA取代的寡核苷酸”表示含有至少一个下面描述的式(I)的LNA单体的寡核苷酸，其具有下面描述的说明性修饰实例。
Figure A20058001768800401
其中X选自-O-、-S-、-N(RN)-、-C(R6R6*)-、-O-C(R7R7*)-、-C(R6R6*)-O-、-S-C(R7R7*)-、-C(R6R6*)-S-、-N(RN*)-C(R7R7*)-、-C(R6R6*)-N(RN*)-和-C(R6R6*)-C(R7R7*)。
B选自如上面讨论的经修饰的碱基，例如任选取代的碳环芳基(例如任选取代的芘或任选取代的芘基甲基丙三醇)或任选取代杂脂环或任选取代的杂芳香环(例如任选取代的吡啶基噁唑、任选取代的吡咯、任选取代的二唑或任选取代的三唑部分)；氢、羟基、任选取代的C1-4-烷氧基、任选取代的C1-4烷基、任选取代的C1-4-酰氧基、核碱基、DNA插入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报告基团和配体。
P指用于核苷间键合至随后的单体的自由基位置，或指5’-末端基团，这种核苷间键或5’-末端基团任选包括取代基R5。取代基R2、R2*、R3和R3*之一是指核苷间键合至随后的单体的基团P*或2’/3’-末端基团。取代基R1*、R4*、R5、R5*、R6、R6*、R7、R7*、RN，以及不表示P*的取代基R2、R2*、R3和R3*每种指含有约1-8基团/原子的双自由基，其选自-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Ra)-、-C(Ra)＝N-、-C(Ra)-O-、-O-、-Si(Ra)2-、-C(Ra)-S、-S-、-SO2-、-C(Ra)-N(Rb)-、-N(Ra)-和＞C＝Q，其中Q选自-O-、-S-和-N(Ra)-，以及Ra和Rb每个独立地选自氢、任选取代的C1-12-烷基、任选取代的C2-12-链烯基、任选取代的C2-12-炔基、羟基、C1-12-烷氧基、C2-12-链烯氧基、羧基、C1-2-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基-羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、单-和双(C1-6-烷基)氨基、氨甲酰基、单-和双(C1-6烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、单-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰基氧基、sulphono、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、磺酰基、C1-6-烷硫基、卤素、DNA插入剂、光化学活性基、热化学活性基、螯合基团、报告基团、及配体，其中芳基和杂芳基可以经任选取代，以及其中两个成对的取代基Ra和Rb一起可以指任选取代的亚甲基(＝CH2)，以及其中选自Ra、Rb的两个非成对的或成对的取代基以及存在的且不涉及P、P*或双自由基的任意取代基R1*、R2、R2*、R3、R3*、R4*、R5、R5*、R6和R6*、R7和R7*一起可以形成选自如前面定义的相同类型的双自由基的连接的双自由基；非成对的取代基的对因此与(i)所述的非成对取代基连接的原子以及(ii)任何间插原子一起形成单-或双环实体。
存在的但不涉及P、P*或双自由基的取代基R1*、R2、R2*、R3、R4*、R5、R5*、R6和R6*、R7以及R7*的每种独立地选自氢、任选取代的C1-12-烷基、任选取代的C2-12-链烯基、任选取代的C2-12-炔基、羟基、C1-12-烷氧基、C2-12-链烯氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基-羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、单-和二(C1-6-烷基)氨基、氨甲酰基、单-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、单-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰基氧基、sulphono、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、磺酰基、C1-6-烷基硫、卤素、DNA插入剂、光化学活性基、热化学活性基、螯合基团、报告基团和配体，其中芳基和杂芳基可经任选取代，以及其中两种成对取代基一起可以指氧、硫氧、亚氨基或经任选取代的亚甲基，或一起可以形成具有1-5个碳原子烯基链的螺双自由基，其任选被一个或多个选自-O-、-S-和-(NRN)-(其中RN选自氢和C1-4-烷基)的杂原子/基团打断和/或终止，并且其中两个邻接的(非成对)取代基可以指产生双键的另一个键；以及RN*当存在并不涉及双自由基时，选自氢和C1-4-烷基；以及其碱盐和酸加成盐。
示范性的5′、3′和/或2′末端基团包括-H、-OH、卤素(例如氯、氟、碘或溴)、任选取代的芳基(例如苯基或苄基)、烷基(例如，甲基或乙基)、烷氧基(例如甲氧基)、酰基(例如乙酰基或苯甲酰基)、芳酰基、芳烷基、羟基、羟基烷基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、硝基、氰基、羧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、芳烷氧基羰基、酰氨基、芳酰基氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、杂芳基磺酰基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、杂芳基亚磺酰基、烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、芳烷基硫基、杂芳烷基硫基、脒基、氨基、氨甲酰基、氨磺酰基、链烯、炔、保护基(例如甲硅烷基、4，4′-二甲氧基三苯甲基、单甲氧基三苯甲基或三苯甲基(三苯基甲基))、连接物(例如，含有氨、乙二醇、醌如蒽醌的连接物)、可检测标记(例如，放射性标记或荧光标记)和生物素。
可以理解，这里对核酸单位、核酸残基、LNA单体的提及或相似的术语是既包括独立的核苷单位和核苷酸单位也包括在寡核苷酸内的核苷单位和核苷酸单位。
“经修饰的碱基”或其它相似的术语指可以与天然碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和/或胸腺嘧啶)配对和/或与非天然出现的核碱基或核苷碱基配对的物质(例如，非天然出现的核碱基或核苷碱基)。理想地，经修饰的碱基产生在此描述的15、12、10、8、6、4或2℃或更少的Tm差异。示例性的经修饰的碱基描述于EP 1 072679和WO 97/12896中。
术语“化学部分”指分子的一部分。“用化学部分修饰”因而指通过包含不一般的化学结构而修饰标准的分子结构。所述的结构的连接可以是共价或非共价连接。
术语在寡核苷酸探针中“包括化学部分”因而指连接分子结构。这种化学部分包括但不限于选自不对称花青染料、DAPI、SYBR Green I、SYBR Green II、SYBR Gold、PicoGreen、噻唑橙、Hoechst 33342、溴化乙锭、1-O-(1-芘基甲基)丙三醇和Hoechst 33258的共价和/或非共价结合的小沟结合剂(MGB)和/或插入性核酸(INA)。
其它化学部分包括经修饰的核碱基、核苷碱基或LNA修饰的寡核苷酸。术语“双标记探针”指具有两个连接的标记的寡核苷酸。在一方面，一个标记连接至探针分子的5’末端，而另一标记连接至该分子的3’末端。本发明的一个特别方面包括连接至一端的荧光分子以及连接至另一端的能通过荧光共振能量转移(FRET)淬灭该荧光团的分子。5’核酸酶测定探针和一些分子信标是双标记探针的实例。
“5’核酸酶检测探针”指可以通过DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性水解的双标记探针。5’核酸酶检测探针不一定在特定PCR测定法下采用的条件下被DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性水解。名称“5’核酸酶检测”的使用不考虑观测到的水解程度并且不代表实验者的任何期望。术语“5’核酸酶检测探针”和“5’核酸酶检测”仅指其中没有采取特别的手段来避免探针的水解的测定法。“5’核酸酶检测探针”常常指“TaqMan检测探针”，“5’核酸酶检测”称为“TaqMan检测”。在该申请案中这些名称可以互换使用。
“寡核苷酸类似物”指能识别特定靶标核苷酸序列的核酸结合分子。特别的寡核苷酸类似物是肽核酸(PNA)，其中寡核苷酸的糖磷酸主链由蛋白质样主链代替。在PNA中，核碱基连接于不带电的聚酰胺主链产生一个嵌合的假肽-核酸结构，其与核酸形式是同形的。
“分子信标”指单或双标记探针，所述的标记不太可能受DNA-聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性影响。对探针、聚合酶或测定条件进行特殊的修饰以避免通过DNA-聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性分开标记或组分核苷酸。因此检测原理依赖于分子信标结合至其靶标序列时标记引发的信号的可检测的差别。在本发明的一个方面，该寡核苷酸探针在选定的测定温度下形成一个分子内的发夹结构，这种结构的形成由在该寡核苷酸的5’-和3’-末端的互补序列介导。该寡核苷酸可以具有连接至一端的荧光分子和连接至另一端的一个分子，当在发夹结构中相互十分靠近时该分子能淬灭荧光团。在本发明的另一方面，发夹结构没有基于在探针序列末端的互补结构形成发夹结构，结合时检测到的信号改变可以由一个或两个标记与形成的双链结构之间相互作用或由结合时探针的空间构象的一般变化-或由结合后标记之间减少的相互作用而引起。分子信标的一个特别方面含有一些LNA残基以抑制DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性引起的水解。
“高度亲合性核苷酸类似物”指当用至少一个这种高度-亲合性核苷酸类似物取代时，增加寡核苷酸探针与其互补的识别序列的“结合亲合性”的非天然出现的核苷酸类似物。
如此处使用的，与包含相同序列但不包含稳定性核苷酸的探针比较对识别序列具有增加的“结合亲合性”的探针指这样一种探针，即它的探针识别片段结合常数(Ka)高于双链分子的互补序列的结合常数。在另一优选的实施方案中，探针识别片段的结合常数高于双链分子中靶标序列中的识别序列的互补链的解离常数(Kd)。
如果它们含有能根据Watson-Crick碱基-配对原则(例如，G与C，A与T或A与U)可以形成氢键的核苷碱基或其它氢键基序(例如二氨基嘌呤与T，S-甲基C与G，2-硫胸腺嘧啶与A，肌苷与C，假异胞嘧啶与G等等)时，将这些单体称为是“互补的”。
术语“随后的单体”指在5’-末端方向的邻近单体而“前面的单体”指在3’-末端方向的邻近单体。
术语“靶标核酸”或“靶标核糖核酸”指具有单条特异性序列的任何相关核酸，例如生物核酸，如源于患者、动物(人或非人动物)、植物、细菌、真菌、古细菌、细胞、组织、器官等。例如，如果靶标核糖核酸或核酸源于细菌、古细菌、植物、非-人动物、细胞、真菌或非人生物体时，本方法任选进一步包括基于对靶标核酸的检测而选取细菌、古细菌、植物、非人动物、细胞、真菌或非人生物体。在一个实施方案中，靶标核酸源于患者，例如人患者。在这些实施方案中，本发明任选进一步包括基于对靶标核酸的检测而选择治疗、诊断疾病，或诊断对疾病的遗传倾向。
“靶标序列”指任何靶标核酸内的特异性核酸序列。
如此处使用的术语“严格条件”是在约Tm-5℃(低于解链温度(Tm)5℃)至低于Tm约20℃到25℃的范围内发生的“严格性”。本领域技术人员将理解，杂交的严格性可以改变以便鉴定或检测相同的或相关的多核苷酸序列。Nucleic Acid Hybridization，A PracticalApproach，Ed.Hames，B.D.和Higgins，S.J.，IRL Press，1985；Gall和Pardue，Proc.Natl.Acad Sci.，USA 63：378-383，1969；和John等，Nature 223：582-587，1969中对杂交技术进行了一般性描述。
本发明也提供用于分离、纯化、扩增、检测、鉴定、定量或捕获天然的或合成的核酸的试剂盒，其中该试剂盒包括反应体和如上定义的一种或多种LNA修饰的寡核苷酸(寡聚体)。LNA修饰的寡核苷酸优选固定在所述的反应体上。
对于根据本发明的试剂盒，反应体优选是固体支持材料，例如其选自硼硅玻璃、钠钙玻璃、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯、聚乙二醇对苯二酸酯、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸甲酯和聚氯乙烯，优选聚苯乙烯和聚碳酸酯。反应体可以是标本管、管形瓶、载玻片、片、薄膜、珠、小丸、盘、板、环、杆、网、滤垫、碟(tray)、微量滴定板、棒或多叶片棒的形式。
试剂盒通常带有书面的说明书，说明使用该试剂盒的最佳条件。
发明详述
本发明涉及使用寡核苷酸用于分离、纯化、扩增、检测、鉴定、定量或捕获微RNA或小干扰RNA，其特征是该寡核苷酸含有一些核苷类似物。
更特别地，本发明提供具有高度灵敏性或好的选择性的用于检测和定量微RNA或小干扰RNA的方法。根据本发明，在对应从100pM-10fM或更少(10aM)RNA靶标浓度的样品中，微RNA和小干扰RNA的定量在从10fmol-10amol RNA靶标序列或更少(10zmol)的水平上是可检测的。
在一优选的实施方案中，本发明包括如Fig.1和Fig.9中显示的以下步骤：
1)设计并合成两个标签探针使得每种由互补于靶标序列(例如成熟miRNA)的10-12nt的高度亲和性的核苷酸序列和与靶标序列或相互没有任何互补性的锚定DNA序列组成。与在溶液中复杂核酸样品中的靶标序列合并，含有识别元件的两个标签探针在严格条件下杂交，因而由靶标序列确定使得两个标签探针靠近相邻，其中一个标签探针的5’-末端与一个标签探针的3’-末端邻近。
2)由于其中一个探针的5’-末端经磷酸化，使用DNA连接酶以及将靶标序列(例如miRNA)作为模板，该靶标-特异性标签探针由连接作用得以连接。该连接反应可以使用热稳定性连接酶在高温下进行，并因而循环而增加用于随后的PCR扩增的模板分子的拷贝数。
3)高度亲和性标签探针的以靶标序列为模板的连接反应后，将连接的探针分子用作定量实时PCR的模板，使用具有足够双链稳定性的短检测探针使得能结合至扩增子，并采用同源测定法中使用的多种检测原理的任何一种。
根据另一优选的本发明实施方案，检测和定量包括Fig.27中显示的以下步骤：
a)将靶标核糖核酸序列与寡核苷酸捕获探针接触，其中识别核苷酸序列与靶标序列中的序列互补；
b)使用DNA聚合酶和靶标核糖核酸序列作为引物，合成捕获序列探针中的锚定核苷酸序列的互补链。
c)固定形成的双链于固体支持物上并使靶标序列样品富集，随后将靶标序列从固体支持物上释放；
d)使用逆转录酶以及将标签探针中的锚定核苷酸序列作为引物结合位点，通过逆转录合成靶标核糖核酸的互补DNA链。
e)通过使用DNA聚合酶和第二标签探针作为引物合成第二链，置换杂双链体中的核糖核酸序列，其中所述的第二标签探针由锚定核苷酸序列和识别核苷酸序列组成，其中所述的识别核苷酸序列互补于逆转录酶-延伸的核酸序列中的序列。
f)使用对应连接在寡核苷酸标签探针上的锚定核苷酸序列的引物和包括靶标识别序列和检测部分的标记的检测探针通过实时PCR定量得到的核酸。
在另一优选的本发明实施方案中，检测和定量包括Fig.28中显示的以下步骤：
a)将靶标核糖核酸序列与寡核苷酸捕获探针接触，其中识别核苷酸序列与靶标序列中的序列互补；
b)使用DNA聚合酶以及将靶标核糖核酸序列作为引物，合成捕获探针中的锚定核苷酸序列的互补链；
c)固定形成的双链于固体支持物上并使靶标样品富集。
d)使用逆转录酶以及将捕获探针作为引物，通过逆转录合成靶标核糖核酸的互补DNA链；
e)通过使用DNA聚合酶和第二标签探针作为引物合成第二链，置换杂双链体中的核糖核酸序列，其中所述的第二标签探针由锚定核苷酸序列和识别核苷酸序列组成，并且其中所述的识别核苷酸序列互补于逆转录酶-延伸的核酸序列中的序列；
f)随后使用DNA聚合酶和引物对进行靶标序列为模板的PCR扩增；
e)使用对应于连接在寡核苷酸标签探针上的锚定核苷酸序列的引物和包括靶标识别序列和检测部分的标记的检测探针通过实时PCR定量得到的核酸。
对于该固定的捕获探针方法的一个优势是，不必进行总RNA样品的非蛋白质编码性RNA(例如小核仁RNA、siRNA、微RNA和反义RNA)的初始浓缩。优选地，捕获探针将杂交至溶液中的特异性靶标上。其次，当捕获探针固定于固体支持物上时，可以除去未结合的物质并因而进行了特异性靶标的浓缩。
在另一优选的本发明实施方案，包括Fig.11中显示的以下步骤：
1)设计并合成两个标签探针即RT标签探针和2nd链标签探针，使得每种由对应6-12nt的靶标核糖核酸序列(例如成熟miRNA)的核苷酸识别序列和与靶标序列或相互没有任何互补性的锚定序列组成。RT标签探针的识别序列或RT和2nd链标签探针两者通过高度亲和性的核苷酸类似物(例如LNA)修饰。RT标签探针中的识别序列互补于靶标核糖核酸序列中的序列，例如互补于成熟微RNA或siRNA的3’-末端或互补于位于靶标核糖核酸序列中的RNA-编辑核苷酸、剪接点、单核苷酸多态性或点突变的3’的序列。RT标签探针在严格条件下杂交至复杂核酸样品中的靶标RNA序列并在使用逆转录酶的逆转录反应中用作锚定引物来产生互补于靶标RNA序列的锚定引物延伸产物。
2)2nd链标签探针包含识别序列，该识别序列互补于逆转录酶-延伸的核苷酸序列，所述的逆转录酶-延伸的核苷酸序列对应成熟微RNA或siRNA的5’-末端或对应位于初始的核糖核酸靶标序列中的RNA-编辑核苷酸、剪接点、单核苷酸多态性或点突变的5’的序列。在严格杂交条件下2nd链标签探针杂交至RT反应产物上并随后作为锚定引物通过DNA聚合酶(例如热稳定性DNA聚合酶)来产生互补于引物延伸产物的第二条链。该反应的特异性是基于依次使用锚定RT和2nd链标签探针，所述的两种探针具有非交叠的识别序列，分别杂交至靶标RNA和互补DNA序列的3’-末端和5’-末端区域。设计连接至标签探针的锚定序列使得它们在本发明方法中使用的杂交条件下与给定转录组中的任何靶标核酸或相互之间不发生交叉杂交。锚定序列在随后的实时定量PCR中作为PCR引物的引发位点或作为捕获测定法的标签。逆转录反应以及第二链反应由于在识别序列中使用了高度亲和性的核苷酸类似物(这是本发明的一个新的组分)可以使用热稳定性逆转录酶和热稳定性DNA聚合酶在高温下进行，因而增加了产生用于随后PCR扩增的模板分子的特异性。本发明另一新的组成是，发现所述的高度亲和性识别序列(通过例如LNA修饰)可以用作逆转录酶或DNA聚合酶的引物，并且这种所述的高度亲和性识别序列可以用作模板以通过DNA聚合酶来合成互补链。
3)靶标RNA序列-特异性的逆转录和2nd链合成反应后，将双链分子用作定量实时PCR的模板，使用具有足够双链稳定性的短检测探针使得能结合至扩增子，并采用同源测定法中使用的多种检测原理的任何一种。
结合的检测可以直接通过结合至靶标序列后一个或多个标记的特性的可检测的变化(例如具有或不具有茎结构的分子信标型检测法)或间接通过结合后接着的反应，例如在5’核酸酶检测中通过DNA聚合酶的5’核酸酶活性的切割来进行。检测探针也是本发明的另一新的组成。其包括短的寡核苷酸部分，该序列经选择而使得能特异性检测对应核心片段中的靶标序列和用作PCR引物的退火位点的锚定序列的短的扩增的DNA分子。
设计用来检测靶标序列(例如不同的成熟miRNA靶标分子)的新的、短的检测探针使得能发现，十分短的8-12-mer LNA-DNA嵌合的、mix-mer探针与基于实时PCR的测定法相兼容。在本发明的一方面，将修饰的或核碱基类似物、核苷碱基或核苷酸整合进标签探针以及检测探针，有可能还有小沟结合剂和其它修饰，它们全部用于稳定在探针和靶标分子之间形成的双链以使得最短的可能序列可用于杂交并检测靶标分子。在本发明优选的方面，该修饰是整合LNA残基而减少检测探针的长度至8或9或10或11或12至14个核苷酸而保持形成的双链的足够稳定性使得在标准实时PCR测定法条件下可以检测。在本发明的另一优选方面，用于连接反应的一个或两个标签探针中的靶标识别序列或RT标签探针中的识别序列或用于RT-PCR反应的RT标签探针和2nd链标签探针两者中的识别序列在每两个、每三个或每四个核苷酸位置用LNA单体代替，同时分别在两个探针的3’-末端具有至少一个DNA核苷酸，使得由于LNA修饰的寡核苷酸探针对它们互补靶标分子，尤其是靶标RNA分子具有增加的双链稳定性而能在高温下进行高度特异性和灵敏性的杂交事件。
在另一优选的本发明实施方案，检测和定量包括Fig.22中显示的以下步骤：
a)将靶标核糖核酸序列与权利要求1-3的寡核苷酸标签探针接触，其中识别核苷酸序列与靶标序列中的序列互补；
b)用DNA聚合酶和靶标核糖核酸序列作为引物合成标签探针中的锚定核苷酸序列的互补链；
c)用逆转录酶和标签探针中的锚定核苷酸序列作为引物结合位点通过逆转录反应合成靶标核糖核酸的互补DNA链；
d)用DNA聚合酶和第二标签探针作为引物通过合成第二链而代替杂双链中核糖核酸序列，其中所述的第二标签探针由锚定核苷酸序列和识别核苷酸序列组成，其中所述的识别核苷酸序列与逆转录酶延伸的核酸序列中的序列互补；
e)使用对应连接在寡核苷酸标签探针上的锚定核苷酸序列的引物和含有识别序列及检测部分的标记的检测探针通过实时PCR定量得到的核酸。
在另外的优选实施方案中，本发明包括如Fig.29中显示的步骤。
在另外的优选实施方案中，本发明包括如Fig.30中显示的步骤。
一个另外的实施方案包括使用含有“封闭探针”的LNA来防止RT-引物结合至超出成熟miRNA转录物长度的模板。该封闭探针设计为结合与成熟miRNA序列3’区域侧翼的pri-/前体miRNA序列内的非成熟miRNA区互补的序列。另外该封闭探针设计为部分与成熟序列交叠，因而防止RT-引物(如在实施例12-16中描述的，并在Fig 11的步骤1中叙述)结合至pri-/前体序列并使得RT标签探针仅退火至成熟miRNA序列上。反应步骤在Fig.33的步骤I和Fig.22.2-22.4中叙述。
在另一采用的实施方案中，成熟的miRNA序列(类似于HsamiRNA-15a序列，Fig 29)利用RT-引物而得以检测，所述的RT-引物设计来抑制与超出某长度的即例如pri-和pre-成熟miRNA的长度的模板结合。这种封闭通过例如整合大的分子结构进RT-引物，或通过将短的含有LNA的探针(封闭探针)退火至引物而导入双链结构，定位来防止引物结合至超过成熟miRNA的长度的模板上而获得。设计的封闭引物使得仅允许成熟的miRNA序列退火，而更长的模板不退火。反应步骤在Fig.29中叙述。
在另外的实施方案中，前述实施方案中的RT-引物也包括在反应中的一种PCR引物。任选地，其它PCR引物也可以设计为抑制结合至超过某长度的模板。反应步骤在Fig.29b中叙述。
另一实施方案采用将人工的寡核苷酸模板加入至反应中。在其中miRNA从前体分子的远离3’-末端表达的情况中(类似于Has miR-143，序列Fig.30)，成熟的以及前体miRNA模板含有适于通过聚合酶(例如Klenow片段)延伸的3’-末端。通过采用如Fig.31中叙述的RT-引物(该引物随后通过RNA-指导的DNA聚合酶(例如逆转录酶)延伸)，得到的模板取决于成熟的还是前体miRNA转录物用作模板将在长度上不同。在实施例12-16以及如在Fig 11步骤2中叙述的2nd链标签探针已经交换为在Fig.31中叙述的3’-封闭的人工寡核苷酸模板，而仅允许源于成熟miRNA的RT转录物的延伸。3’-封闭的人工寡核苷酸随后用作模板来产生随后PCR扩增的引物位点。
在另一实施方案中，其中miRNA从前体分子的远离3’-末端表达(类似于Hsa miR-143序列，Fig.30)，成熟的miRNA利用杂交至逆转录的miRNA的3’-末端(最初的成熟miRNA的5’-末端)的PCR引物而得以检测，并且该引物设计为抑制结合超出某长度即例如逆转录的pri-/前体miRNA的长度的模板。该封闭通过例如整合大的分子结构进这种PCR引物(例如，为环状引物，其保留锚定序列并在给定的试验温度下通过该寡核苷酸的5’-和3’-末端的互补序列介导形成分子内发夹结构)或通过退火短的含有LNA的探针(封闭探针)至引物上而引入双链结构，定位以防止引物结合至超过成熟miRNA长度的模板上。特定地设计该引物使得仅允许成熟的经加工的miRNA序列退火，而更长的模板不退火。反应步骤在Fig.34中叙述。
在细胞中，微RNA分子既作为更长的(超过70个核苷酸)pricursor和前体分子存在以及以活性形式的成熟miRNA(17-25个核苷酸)的形式存在。检测微RNA分子中的一个挑战是仅检测成熟形式的分子，其为一个17-25bp长的单链RNA分子。
在本发明优选的实施方案中，成熟miRNA作为引物，即miRNA杂交至模板上并通过能进行RNA-引发的DNA-指导的DNA合成的酶延伸。其次，检测依赖于该延伸的发生并且此外延伸的发生依赖在离退火至模板的位点期望距离处在miRNA的3’末端具有-OH终点，其用于确保仅检测经加工的成熟miRNA分子。在检测反应中使用靶标(在该情况中为miRNA)作为引物的原理可以应用于使用其它靶标(既可以是DNA又可以是RNA)的其它检测形式上。
本发明的一般方面
许多非编码RNA分子，例如微RNA分子十分短并不能容纳用于逆转录酶、PCR扩增两者的引物以及任选地用于通过PCR的扩增和检测的经标记检测探针。根据本发明，容纳这个的一种解决方案是，将额外的序列附加至微RNA上，优选通过使得能进行成熟-特异性测定法的设计的方法进行。
如描述的(参见实施例)，这种序列可以通过提供(通过序列特异性杂交)用于聚合酶反应的模板给微RNA，并提供聚合酶(例如Klenow聚合酶)和核苷酸使得能进行延伸，导致与提供的模板部分相似的序列附加在成熟的微RNA上。这种附加的序列可以单独地或与微RNA的核酸序列一起部分容纳用于逆转录酶、用于PCR扩增或用于经标记的检测探针的引物。
附加额外序列的另外的方法可以是连接反应方法。在这样一种反应中，可将接头核酸序列通过连接反应连接至微RNA分子的3’-末端、5’-末端或两个末端。这种连接反应可以通过提供“桥连”核酸序列来帮助，所述的“桥连”核酸序列包含特异于成熟靶标RNA序列的末端部分的核苷酸序列和特异于所述接头分子的末端部分的核苷酸序列，这样该成熟RNA靶标和所述接头分子在序列特异性杂交时得以相互紧密地靠近放置。这种通过连接反应附加的序列可以单独地或与微RNA的核酸序列一起部分容纳用于逆转录酶、用于PCR扩增或用于经标记的检测探针的引物。
将额外序列附加至靶标小RNA分子的另外的方法可以是非模板依赖的聚合酶反应的方法。在这样的一个实施方案中，将小靶标RNA分子的样品接受聚合酶反应，提供polyA尾巴给样品中存在的所有微RNA。这可以例如通过使用polyA聚合酶进行。在另一个这种实施方案中，将小靶标RNA分子的样品接受末端转移酶反应，当分别加入dATP、dCTP、dGTP或dTTP时其能提供A、C、G或T多聚核苷酸尾给样品中存在的所有微RNA。可将这种提供了相似核苷酸的核苷酸尾巴的微RNA样品通过在逆转录酶反应中使用包含互补的相似核苷酸的引物转化为cDNA，因而提供了具有附加的相似核苷酸的多聚核苷酸尾的微RNA的cDNA样品。通过与微RNA序列的部分交叠，RT-引物也可以对特定的微RNA或一组微RNA或微RNA家族有特异性。这种cDNA样品随后用作使用对特定微RNA序列有特异性的引物的PCR扩增的模板，所述的引物处于成熟微RNA序列内或与通过不依赖模板的聚合酶反应附加上的序列部分交叠。
一个这种实例描述于Fig.37中，其中总RNA样品或仅含有大小在200个核苷酸以下的RNA的样品级分接受polyA聚合酶而将polyA核苷酸尾附加在了所有的微RNA靶标分子上。随后，将polyT引物在逆转录酶反应中用作引物将RNA样品转化为cDNA。所述的RT反应可以进一步通过让RT-引物序列与对特定微RNA或一组微RNA或微RNA家族特异性的微RNA序列部分交叠而赋予序列特异性。随后，将所述的cDNA样品接受PCR扩增，所述的PCR扩增使用对特定微RNA靶标有特异性的PCR引物以及任选地使用经标记的检测探针。这种PCR引物可以整个或部分与附加的序列交叠。
本发明的一个广泛的方面因而涉及用于定量测定具有最多100个核苷酸长度的短的RNA(其可以是这里描述的任何小RNA类型)的方法，所述的方法包括：
a)从含有所述短RNA的样品制备模板多核苷酸，该模板多核苷酸由下列组成：1)由所述短RNA序列、其对应的DNA序列或与所述短RNA序列互补的核苷酸序列组成的单链靶标序列以及2)5’或3’邻接的核苷酸序列，
b)在逆转录反应或核苷酸聚合作用中使用所述的模板多核苷酸来获得cDNA链，并且
c)进行定量实时PCR(qPCR)，所述的cDNA用作模板并且任选地将模板多核苷酸用作模板。
本发明的这方面反映了本发明的最根本的概念，即短RNA的特定检测可以通过在全部的步骤a-c中确保相对高程度的特异性以及每个步骤中的特异性增加了本方法的总体的特异性。一个主要的特征是在步骤a中的模板多核苷酸的提供，其中所述的模板包括在随后的步骤中可用引物的“柄”的附加的序列，因而为所有必需的引物和使用的检测探针提供了空间。正如这里的描述要表现的，这些“柄”对期望定量的短RNA既可以有特异性又可以无特异性，在特异性序列的情况下，在将这些特异性序列优选地或特异性地加至短的RNA而不是包括短RNA的序列上的反应中，这些特异性序列得以附加上短RNA上。
当在内容中使用术语“对应于”时表示，对应于参照核苷酸序列的核苷酸序列或者与参照序列相同或构成了严格杂交于参照核苷酸序列的互补序列的序列。通常，这表示如果DNA序列的互补序列可以转录为讨论的RNA序列，那么所述RNA序列相当于所述DNA序列。
在本文中术语“cDNA”表示DNA片段，其可以或者通过模板多核苷酸的逆转录反应或者通过基于模板核苷酸的核苷酸聚合作用(例如DNA聚合作用)获得。
如前面提到的短的RNA最多100个核苷酸，但通过本方法的手段可以测定更短的RNA。具有最多90、最多80、最多70、最多60、最多50、最多40、最多30以及最多25个核苷酸残基的RNA可以通过本方法和试剂盒方便地测定，以及甚至更短的RNA，例如具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24和25个核苷酸残基的那些RNA。优选地，短的RNA具有16-25个核苷酸残基之间的长度。
用于步骤c中的qPCR的引物在一个实施方案中选自：
-至少2种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的至少一种对应于或互补于5’或3’邻接的核苷酸序列中的序列-一个实施方案，其特别是如果两个引物涉及邻接的序列，受益于在步骤a和b中存在附加在5’和/或3’序列的特异性(对短RNA或源于其的序列特异性)序列和/或步骤b利用了对短RNA特异性的方法；
-至少2种寡核苷酸，其中至少一种所述的寡核苷酸对应于或互补于模板多核苷酸中的连续的序列，该模板多核苷酸由部分单链靶标序列和部分邻接的5’或3’核苷酸序列构成-一个实施方案，其中由于部分短的RNA(或源于其的序列)的特异性识别而在步骤c中存在相对高程度的特异性，并且其中基于序列特异性方法而附加5’或3’核苷酸序列和/或步骤b利用对短RNA特异性的方法可能是有利的；以及
-至少2种寡核苷酸，其中一种对应于单链靶标中的第一个核苷酸序列而另一种互补于该单链靶标序列中的第二个核苷酸序列-一个实施方案，其中由于短RNA(或源于其的序列)的特异性识别而在步骤c中存在高度的特异性。
用于qPCR的所述的引物可以各自独立地包括可检测标记。
在另外的实施方案中，在步骤(b)的反应中利用逆转录反应引物或DNA聚合作用引物，所述的引物对应于或互补于单链靶标序列或其对应于或互补于由部分单链靶标序列或部分邻接的5’或3’核苷酸序列构成的模板多核苷酸中的连续序列。优选逆转录反应引物或核苷酸聚合作用引物特异于至少一种短RNA；这反映的事实是在一些短RNA属于具有高度序列一致性的某些家族。
附加上的5’和/或3’邻接核苷酸序列在一些实施方案中是由相同的核苷酸组成的多核苷酸(可以通过利用用于附加序列的末端转移酶或通过利用加入相同核苷酸残基的聚合酶而获得)。
无论如何，单链靶标序列和5’和/或3′邻接核苷酸序列可以通过共价作用也可通过非共价连接-重要的问题是该模板序列是否在步骤b中可以接受逆转录反应或核苷酸聚合作用。
在一些实施方案中5’和/或3’邻接的核苷酸序列包括可检测的标记，因而有助于后面的检测。
在大多数实施方案中，5’和/或3’邻接核苷酸序列通过酶促反应连接至单链靶标序列上，但也考虑通过非酶促反应。
可用于加入相同核苷酸的酶包括以下(使用IUBMB酶命名法)：
转移酶：EC 2.7.7.19(多核苷酸腺苷酰基转移酶)、EC 2.7.7.52(RNA尿苷酰转移酶)和EC 2.7.7.31(DNA核苷酸外转移酶)。
连接酶：EC 6.5.1.1(DNA连接酶(ATP))、EC 6.5.1.2(DNA连接酶(NAD+))和EC 6.5.1.3(RNA连接酶(ATP))。
在某些实施方案中，5’和/或3’邻接的核苷酸序列在样品RNA所来源的有机体中天然不存在。据信这减少在样品中检测到不相关序列的风险。优选5’和/或3’邻接的核苷酸序列是非哺乳动物的。
在另外的实施方案中，步骤(a)包括通过连接反应将5’和/或3’邻接核苷酸序列连接至短RNA而制备模板多核苷酸，或步骤(a)包括通过在末端转移酶反应中，优选在poly-A转移酶反应中将5’和/或3’邻接核苷酸序列连接至短RNA而制备模板多核苷酸。连接反应既可以是序列特异性的(例如突出端连接反应)和平末端连接反应，但优选利用突出端连接反应。在优选的突出端连接反应方案中，该方法涉及将部分互补于5’或3’邻接核苷酸序列的连接酶-活性末端和部分互补于短RNA分子的连接酶-活性末端的寡核苷酸退火至短RNA，这样使5’或3’邻接核苷酸序列的连接酶活性末端直接邻接小RNA分子的连接酶-活性末端而使得能进行突出端连接。
使用连接反应或末端转移酶的一个主要优势是样品中的所有RNA使得能用于随后的步骤(其然后在另一方面，应该是高度特异性的)。这使得产生了例如一个非特异性的cDNA文库，该文库后面在b和c中可用于更特异性的步骤。
通常，连接反应或末端转移酶反应仅在靶标序列的3’末端进行，但通过在进行连接反应前将靶标序列的5’末端磷酸化可进行对靶标序列5’末端的连接反应。无论如何，为了避免邻接核苷酸序列的“自我-连接”，优选封闭一个末端(因为连接酶需要分子中的3’-羟基和5’-磷酸来连接，这对技术人员来说是相当容易的)。因而，在进行连接反应前将5’邻接核苷酸序列在其5’末端封闭而将3’邻接核苷酸序列在其3’末端封闭，并且因为这两种核苷酸序列通常在分开的步骤加入，这避免了它们的自我-连接。
在步骤(a)中5′和/或3’邻接核苷酸序列优选地或专一地连接至规定加工状态的所述的短RNA上。这意味着用于附加邻接核苷酸序列的方法利用了取决于在短RNA中游离3’或5’末端的存在的序列偶联步骤(藉此，引入了对例如成熟前RNA的辨别，所述的成熟前RNA包括相同的序列，但在其相应的末端不相同)。优选规定加工状态的所述的RNA是成熟状态。
在许多实施方案中步骤(b)包括模板多核苷酸的逆转录反应以获得cDNA(参见例如Fig.27)。然而，如上面提到的，步骤b也可以包括步骤b中的核苷酸聚合作用而获得cDNA(参见，例如Fig.31的实施方案)。
除了利用连接反应或末端转移酶，步骤(a)可以包括核苷酸聚合作用的步骤来连接邻接的核苷酸序列。用于这个目的的聚合酶既可以是非模板依赖的也可以是模板依赖的聚合酶。通常采用的聚合酶是DNA聚合酶。
尽管优选的实施方案利用模板特异性的聚合作用，该聚合作用也可以包括加入poly-A，poly-G、poly-T或poly-C尾至靶标序列的3’-末端。
然而，如已经提到的，目前优选的实施方案要求使用模板特异性方法。在检测微RNA的情况中，本发明的一个目标是能区分成熟的和成熟前的微RNA，并且在该方面考虑两种不同的情形是重要的：其中微RNA位于其成熟前前体的3’末端的情形和其中微RNA位于成熟前前体的5’末端的情形。为了把成熟形式与这些前体的每种区分开来，使用了不同的方法。
下面的实施方案说明了获得这种区分的多种方法，但不以任何方式限制对微RNA的定量，因为当定量或检测任意短RNA时这些实施方案是可以使用的：
一个实施方案(参见Fig.27)要求步骤(a)包括通过以下步骤制备模板多核苷酸：
-将短RNA的3’末端退火至寡核苷酸捕获探针上(它的5’末端与该短RNA的3’末端互补)，以及
-用寡核苷酸捕获探针作为模板通过核苷酸聚合作用延伸短RNA以便获得构成模板多核苷酸的延伸了的短RNA分子。通常，核苷酸聚合作用包括DNA聚合作用以获得RNA-DNA杂合物，其构成了模板多核苷酸。
在该实施方案中，步骤(b)优选包括逆转录RNA-DNA杂合链获得cDNA，任选在除去了没有退火至寡核苷酸捕获探针上的物质后进行(如果该捕获探针包括使得能实现固定的标签的话，这可以获得)。在逆转录反应中，使用的引物可以是寡核苷酸捕获探针本身或，是单独的逆转录引物(当捕获探针可以固定时，通常是这种情况-在那个情况中，将双链变性并将模板转移至另外的容器中，在其中加入新的引物和其它试剂)。
另一个实施方案(参见Fig.31)要求步骤(a)包括通过以下步骤制备模板多核苷酸：
-将短RNA的5’末端退火至寡核苷酸捕获探针上，所述的捕获探针的3’末端互补于短RNA的5’并且其5’末端包括5’邻接核苷酸序列，以及
-使用短RNA作为模板通过逆转录反应延伸该捕获探针获得延伸了的捕获探针，其构成了模板多核苷酸。在该情况中，模板多核苷酸不包括任何起始的短RNA。
这个实施方案可以进一步要求步骤(b)包括：将短RNA从延伸了的捕获探针上除去(例如通过升高温度)，让捕获探针以其3’末端退火至辅助寡核苷酸上，所述的辅助寡核苷酸包括与3’邻接核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且用辅助寡核苷酸作为模板通过DNA聚合作用的方式进一步在5’→3’方向延长该捕获探针而获得cDNA。因而，在这个实施方案中，有5’和3’邻接核苷酸序列两者的加入，这都通过靶标序列特异性方法加入。
如提到的，如果捕获寡核苷酸含有能使其固定于固相支持物上的部分则可以有益于这两个实施方案。在这样的实施方案中，退火后通常将捕获探针固定以便能除去未退火的物质。
这里描述的所有实施方案可通过在步骤(a)中富集样品的短的RNA而得以优化-这可以通过多种技术人员已知的方法(大小排阻色谱法、电泳法等)完成。这降低了在测定步骤中获得来源于mRNA中的序列和其它长RNA片段的假阳性采样的风险。
根据本发明的原理，步骤c可以需要任何在此描述的检测方法。然而优选步骤(c)包括使用包含经修饰的核苷酸(例如LNA核苷酸)的检测探针。在多数这些实施方案中，该检测探针对应于或互补于短RNA中的序列，但是如果早先的步骤a和b足够特异性，这不是必须的-在那些情况中，该检测探针可以对来自步骤b的反应产物的其它部分是特异性的。
而且用于逆转录反应或DNA聚合作用或一般来说步骤a-c中的多种引物(和/或捕获探针和/或辅助寡核苷酸)可以包括经修饰的核苷酸。主要的优势是，引物和其它寡核苷酸的全长可以减少，因为例如LNA表现出与DNA高度杂交，所以使用短的寡核苷酸可以获得序列特异性结合。
在步骤c中的检测中利用与步骤b中使用的相同引物作为引物(即由在逆转录反应中或步骤(b)的核苷酸聚合作用中使用的引物构成的引物)也是可能的。此外，如果步骤中的特异性程度在整体上足够高使得能进行短RNA的“无噪声”检测，则在步骤c中使用这种“再循环的”引物将不会明显地影响该方法。
根据本发明的这种一般方面的描述，本发明也涉及用于定量测定具有最多100个核苷酸长度的成熟的短RNA的试剂盒，所述的试剂盒包含
-可用于这里描述的方法最小数目的转录反应引物和/或核苷酸聚合作用引物和/或用于qPCR的引物和/或寡核苷酸捕获探针和/或辅助寡核苷酸探针和/或寡核苷酸探针，其中逆转录反应引物、核苷酸聚合反应引物、用于qPCR的引物、寡核苷酸捕获探针、辅助寡核苷酸和寡核苷酸具有上面所描述的性质；和
-关于使用逆转录反应和/或核苷酸聚合作用引物和/用于qPCR的引物和/或寡核苷酸捕获探针和/或辅助寡核苷酸和/或寡核苷酸探针来定量测定短RNA的说明书。
涉及试剂盒的条款的所有公开内容作了必要地细节上的改动来生产该试剂盒。该试剂盒可进一步包括如这里描述的一种或多种酶和其它试剂。
作为这种“最小试剂盒”的一个实例，提供了以下物质用于进行在Fig.27中列出的方法(参考引物和探针是可选的)：
miR-特异性测定法
●Biotinyleret LNA捕获探针
●miR-特异性反向引物
●miR-特异性正向引物和反向引物
●miR-特异性双-标记探针
●RNA对照寡核苷酸
●DNA对照寡核苷酸
参照的U6 snoRNA测定法
●参照U6 snoRNA RT引物/随机六聚体引物
●参照U6 snoRNA引物和双-标记探针
  寡核苷酸   量：一次测定   10次测定   浓度   体积
  生物素化LNA捕获探针miR-特异性反向引物miR-特异性正向引物miR-特异性反向引物miR-特异性双-标记探针RNA对照寡核苷酸DNA对照寡核苷酸   0.5pmol0.1pmol2.025pmol2.025pmol0.3125pmol0.01pmol0.01pmol   5pmol1pmol20.25pmol20.25pmol3.125pmol0.1pmol0.1pmol   0.5μM0.1μM0.9μM0.9μM0.25μM0.01μM0.01μM   1μL1μL2.25μL2.25μL1.25μL1μL1μL
  参照U6s noRNA RT引物/随
  机六聚体引物参照U6 snoRNA正向引物参照U6 snoRNA反向引物参照U6 snoRNA双标记引物   2pmol2.025pmol2.025pmol0.3125pmol   20pmol20.25pmol20.25pmol3.125pmol   2μM0.9μM0.9μM0.25μM   1μL2.25μL2.25μL1.25μL
本发明的另外方面
一旦选取了合适的靶标序列，LNA取代的标签探针和检测探针优选使用如本领域描述的商业提供的方法和设备(Tetrahedron 54：3607-30，1998)用化学方法合成。例如，固相亚磷酰胺方法可以用于产生短的LNA探针(Caruthers等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47：411-418，1982；Adams等，J.Am.Chem.Soc.105：661(1983))。
含有LNA的探针通常在合成时标记。亚磷酰胺合成方法的灵活性此外有助于容易产生携带有全部商业可得的连接物、荧光团以及用于该标准化学的标记分子的LNA。LNA也可以通过酶促反应(例如通过激酶反应)标记。
根据本发明的检测探针可以包括单个标记或多个标记。在一方面，多个标记包括一对标记，当发生检测探针杂交至靶标序列时，其相互作用或者产生信号或产生信号变化。
在另一方面，该检测探针包括荧光团部分和淬灭物部分，定位方式使得探针的杂交状态可以通过该核苷酸的荧光信号的增加与该探针的未杂交状态区分出来。在一方面，除了识别元件外，检测探针还包括第一和第二互补序列，当该探针未杂交至靶标分子中的识别序列时，其相互特异性杂交，使得淬灭物分子足够邻近所述的报告分子来淬灭报告分子的荧光。与靶标分子杂交隔开了淬灭物与报告分子并产生信号，该信号与杂交的量成比例。
在另一方面，核酸分子的链的聚合可以用具有5’核酸酶活性的聚合酶检测。荧光团和淬灭物分子足够邻近地整合进探针中，这样当探针杂交至其识别序列时淬灭物淬灭了荧光团分子的信号。通过具有5’核酸酶活性的聚合酶对探针的切割导致了淬灭物和荧光团分子的分离，并按核酸序列的增加导致增加量的信号。
靶标核酸分子的合适样品可以包括广范围的真核和原核细胞，包括原生质体；或可能包含靶标核酸的其它生物材料。该方法因而可以应用于组织培养的动物细胞、动物细胞(例如血液、血清、血浆、网状细胞、淋巴细胞、尿、骨髓组织、脑脊液或从血液或淋巴制备的任何产品)或任何类型的组织的活检样品(例如肌肉活检样品、肝脏活检样品、肾脏活检样品、膀胱活检样品、骨活检样品、软骨活检样品、皮肤活检样品、胰腺活检样品、肠道活检样品、胸腺活检样品、乳房活检样品、子宫活检样品、睾丸活检样品、眼活检样品或脑活检样品，例如，在溶解缓冲液中匀浆)、archival tissue核酸、植物细胞或对渗压休克敏感的其它细胞以及细菌、酵母、病毒、支原体、原生动物、立克次体、真菌的细胞和其它小的微生物细胞等等。
多种扩增反应是本领域一般技术人员所周知的，并包括(但不限于)PCR、RT-PCR、LCR、体外转录、滚环PCR和OLA等等。多种引物也可用于多重PCR用于检测一组特定的靶标分子。
优选地，本发明的标签探针以及检测探针经修饰以便在相同的杂交条件下或严格杂交条件下使探针对靶标序列的结合亲和性与没有修饰的相同探针相比增加至少两倍。优选的修饰包括(但不限于)将已经通过化学部分修饰或通过类似物代替的核碱基、核苷碱基或核苷酸包括在内以增加结合亲和性。优选的修饰也可以包括连接双链-稳定剂，例如小沟结合剂(MGB)或插入核酸(INA)。而且，优选的修饰也可以包括加入非辨别性碱基(例如5-硝基吲哚)，其能稳定双链形成而不考虑靶标链上的相对位置处的核碱基。最后，包括非糖-磷酸骨架(例如PNA，其能让序列特异性结合至靶标序列)的多探针也认为是修饰。所有上述不同的增加结合亲和性的修饰将在下文中称为“稳定化修饰”，以及标签探针和检测探针将在下面也称为“经修饰的寡核苷酸”。更优选地，经修饰的寡核苷酸的结合亲和性比相同序列但没有稳定化修饰的探针的结合高至少约3倍、4倍、5倍或20倍。
更优选地，稳定化修饰是将一个或多个LNA核苷酸类似物包括在内。根据本发明的6-30个核苷酸的探针可以包括1-8个稳定化核苷酸，例如LNA核苷酸。当包括至少两个LNA核苷酸时，这些核苷酸可以是连续的或由一个或多个非LNA核苷酸隔开。在一个方面，LNA核苷酸是α和/或木糖型LNA核苷酸。
本发明也提供包括具有如上定义的稳定化修饰的标签探针和检测探针的探针文库。优选地，检测探针长度是少于约20个核苷酸并更优选少于15个核苷酸，并最优选约7或8或9或10或11个核苷酸。而且，优选地，标签探针长度少于约40个核苷酸并更优选少于35个核苷酸，并最优选约20或30个核苷酸。而且，优选地，标签探针连接反应和用于RT-PCR反应的RT标签探针以及2nd链标签探针包括长度少于约15个核苷酸的高度亲和性的标签识别序列，所述标签识别序列更优选少于14个核苷酸，并且最优选在6-13个核苷酸之间，并且另外包括作为PCR引物的引发位点的锚定序列，其长为少于约30个核苷酸并更优选少于25个核苷酸，并且最优选在15-20个核苷酸之间。含有标记的检测探针的探针文库取决于连接在识别元件上的检测元件的类型可用于多种应用。这些应用包括(但不限于)双或单标记测定法(例如5’核酸酶测定法)、分子信标应用(见例如Tyagi and Kramer Nat.Biotechnol.14：303-308，1996)和其它基于FRET的测定法。
现存的用于如上列出的微RNA、siRNA、RNA-编辑的转录物、选择性剪接变体和反义非编码RNA的定量检测法的问题通过使用本发明的探针，结合本发明的任何方法得以解决，这包括一组RNA标签探针和检测探针或组合2nd链标签探针和检测探针的RNA RT标签探针的探针组，选择这些探针以识别或检测在给定生物体的给定细胞类型中的多数全部发现的和检测的miRNA、RNA-编辑的转录物、siRNA、选择性剪接变体和反义非编码RNA。在一方面，探针文库包括标记和检测哺乳动物成熟miRNA，例如小鼠、大鼠、兔、猴或人miRNA的探针。通过提供合算的可用于成熟miRNA、RNA-编辑的转录物、siRNA、选择性剪接变体和反义非编码RNA的定量实时的和终末-点PCR测定法的方法，本发明克服了上面讨论的特别是常规miRNA测定法和siRNA测定法的局限性。根据本发明的检测探针的检测元件可以是单或双标记的(例如通过在探针的每端包括一个标记或在内部位置包括标记)。因而，根据本发明的探针可以适用于5’核酸酶测定法、分子信标测定法、FRET测定法以及其它类似的测定法。在一方面，测定探针包括两个标记，其能相互作用而产生信号或改变信号，这样当探针杂交至靶标序列时信号或信号的改变可以得以检测。一个特别的方面是当有两个标记时包括淬灭物和报告分子。
在另一方面，探针包括靶标-特异性识别片段，该片段能特异性杂交至包括互补识别序列的靶标分子。称为“具有茎杆区域的分子信标”的本发明的一个特别的检测方面是，当识别序列的侧翼是第一和第二个互补的能形成发夹的序列时，其能退火形成发夹。将一个报告标记连接至一个互补序列的末端并将淬灭部分连接至另一互补序列的末端。当第一和第二互补序列杂交时(即，当探针识别序列与其靶标不杂交时)形成的茎杆部分使得这两个标记相互靠近邻接而引起信号，该信号由报告分子产生，通过荧光共振能量转移(FRET)而淬灭。当探针杂交至靶标序列时减少了这两种标记的距离并且这种距离的减少产生了标记之间相互作用的改变。因而探针的杂交导致了报告分子产生信号(例如荧光)，该信号可以检测和/或定量。
然而在另一方面，靶标检测探针在短的靶标识别序列的相对的末端包含报告分子和淬灭分子，这样这些部分相互足够接近，因而淬灭分子相当地减少了报告分子产生的信号。当探针游离于溶液中以及当其结合至靶标核酸上时就是这种情况。称为“5’核酸酶测定法”的本发明的一个特别的检测方面是检测探针易于受DNA聚合酶的5’核酸酶活性的切割。该反应可能引起淬灭分子与报告分子分离并产生可检测的信号。因而，这种探针可用于基于扩增的测定法来检测和/或定量靶标核酸的扩增过程。
本发明也提供方法、体系和存于计算机可读取的介质中的计算机程序(“计算机程序产品”)来设计包含至少一个稳定化核碱基的标签探针和检测探针。本方法包括查询靶标序列的数据库(例如登记于http：//www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml的miRNA)并设计探针，该探针：i)在严格杂交条件下具有足够的结合稳定性来结合它们各自的靶标序列，ii)具有有限的倾向与自身形成双链结构，以及iii)能结合并检测/定量给定数据库中的至少约60％、至少约70％，至少约80％、至少约90％或至少约95％的全部靶标序列。
捕获探针设计程序。
本发明也提供方法、体系和存于计算机可读取的介质中的计算机程序(“计算机程序产品”)来设计核苷酸序列来实现捕获探针。
本方法包括以下步骤：
a)最初猜测一个或多个核苷酸序列来实现捕获探针；
b)基于条件和目标的实现重复改良最初的猜测；
c)当足够满足该条件和目标(也包括用于本方法的计算时间)时终止该算法。
解链稳度称为“Tm”
这三个步骤的详细描述：
A)初始的猜测是基于miRNA序列去匹配一系列合适的通过使用引物发现软件找到的反向引物(引物3)。产生随机序列来补足该捕获探针的非初始猜测部分。随机产生通过使用双核苷酸Tm表来引导以确保序列具有在目标Tm值附近的Tm。
B)重复改良通过打分函数引导，该打分函数基于目标和条件以及双核苷酸Tm表。做随机改变以避免最适度以下的重复。
C)当基于目标、条件和计算时间的打分函数得到满足时终止该算法。
获得引物和探针条件的目标列于以下：
1.捕获探针与miRNA杂交的解链温度条件
捕获探针和miRNA形成的双链的解链温度扩展为适于DNA聚合酶延伸反应。该双链内的寡核苷酸长度应该满足上述的DNA聚合酶延伸反应的Tm条件。miRNA杂交至捕获探针的3’-末端。
2.捕获探针和DNA聚合酶延伸的miRNA形成的双链的解链温度条件
捕获探针和DNA聚合酶延伸的miRNA靶标形成的双链的Tm不允许超过能变性该杂双链而不破坏RNA-DNA靶标的温度。
3.捕获探针和逆转录(RT)引物之间的关系
RT引物与捕获探针的5’-末端序列相同并杂交至DNA聚合酶-延伸的miRNA的3’-末端。RT引物和DNA聚合酶-延伸的miRNA形成的这种双链的Tm必须适于使用逆转录酶的第一链合成。
4.成熟的和前体miRNA之间的区别
前体miRNA的3’-末端不允许在给定的捕获反应的杂交条件下以显著量的寡核苷酸杂交至捕获探针上。同样，在前体miRNA序列内在成熟miRNA基序后的前面的单体不允许杂交至非miRNA-相关的捕获探针序列。
每个设计的探针和引物的一般条件是要求低的自身-退火和低的自身-杂交。
双标记的探针设计程序。
本发明也提供方法、体系和存于计算机可读取的介质中的计算机程序(“计算机程序产品”)来设计核苷酸序列来实现双标记探针。双标记探针用于最大特异性地检测特定的miRNA或特定的miRNA家族。
双标记探针必需满足以下条件：
a)要求低的自身-退火和低的自身-杂交。
b)必须退火至靶标而具有合适的Tm来在PCR反应中起作用。
c)在PCR反应中必须不退火至引物。
本方法包括以下步骤：
A)设计对miRNA或miRNA家族具有最大特异性的探针。满足条件(称为双标记探针匹配)的优选探针通过该双标记探针结合至其它miRNA的能力来研究。然后根据打分函数给双标记探针匹配赋予特异性分值。序列匹配、序列长度以及序列中LNA-修饰的核苷酸的使用决定双标记探针匹配。
B)双标记探针通过它们满足上述条件的程度来打分。根据打分函数双标记探针通过它们满足上述条件的程度来打分。特异性分数和满足条件的分数然后用于确定最好的双标记探针的核苷酸序列。
淬灭分子优选选自如EP申请案No.2004078170.0中公开的暗淬灭分子(dark quencher)，特别是选自1，4-双-(3-羟基-丙基氨基)-蒽醌、1-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-4-(3-羟基丙基氨基)-蒽醌、1-(3-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基)丙基氨基)-4-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-蒽醌(#Q1)、1，5-双-(3-羟基-丙基氨基)-蒽醌、1-(3-羟基丙基氨基)-5-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-蒽醌、1-(3-(氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基)丙基氨基)-5-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-蒽醌(#Q2)、1，4-双-(4-(2-羟基乙基)苯基氨基)-蒽醌、1-(4-(2-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)乙基)苯基氨基)-4-(4-(2-羟基乙基)苯基氨基)-蒽醌、1-(4-(2-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基)乙基)苯基氨)-4-(4-(2-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)乙基)苯基氨基)-蒽醌以及1，8-双-(3-羟基-丙基氨基)-蒽醌；或备选地选自6-甲基-醌茜、1，4-双(3-羟基丙基氨基)-6-甲基蒽醌、1-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-4-(3-羟基丙基氨基)-6(7)-甲基-蒽醌、1-(3-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基)丙基氨基)-4-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-6(7)-甲基-蒽醌、1，4-双(4-(2-羟乙基)苯基氨基)-6-甲基-蒽醌、1，4-二羟基-2，3-二氢-6-羧基-蒽醌、1，4-双(4-甲基-苯基氨基)-6-羧基-蒽醌、1，4-双(4-甲基-苯基氨基)-6-(N-(6，7-二羟基-4-氧-庚烷-1-基))甲酰胺基-蒽醌、1，4-双(4-甲基-苯基氨基)-6-(N-(7-二甲氧基三苯甲氧基-6-羟基-4-氧-庚烷-1-基))甲酰胺基-蒽醌、1，4-双(4-甲基-苯基氨基)-6-(N-(7-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基)-6-羟基-4-氧-庚烷-1-基))甲酰胺基-蒽醌、1，4-双(丙基氨基)-6-羧基-蒽醌、1，4-双(丙基氨基)-6-(N-(6，7-二羟基-4-氧-庚烷-1-基))甲酰胺基-蒽醌、1，4-双(丙基氨基)-6-(N-(7-二甲氧基三苯甲氧基-6-羟基-4-氧-庚烷-1-基))甲酰胺基-蒽醌、1，5-双(4-(2-羟乙基)苯基氨基)-蒽醌、1-(4-(2-羟乙基)苯基氨基)-5-(4-(2-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)乙基)苯基氨基)-蒽醌、1-(4-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基)乙基)苯基氨基)-5-(4-(2--(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)乙基)苯基氨基)-蒽醌、1，8-双(3-羟基丙基氨基)-蒽醌、1-(3-羟基丙基氨基)-8-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-蒽醌、1，8-双(4-(2-羟乙基)苯基氨基)-蒽醌以及1-(4-(2-羟乙基)苯基氨基)-8-(4-(2-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)乙基)苯基氨基)-蒽醌。
共价偶联寡核苷酸至不同的固体支持物上的一种优选方法是如WO 96/31557或WO 99/14226中描述的使用连接至寡核苷酸5’-或3’-末端的光化学活性蒽醌的光化学固定法。
在另一优选的实施方案中，高度亲和性和特异性的LNA修饰的寡核苷酸用于天然的或合成的核酸的序列特异性捕获和纯化。在一方面，将天然的或合成的核酸与固定在固体表面上的LNA修饰的寡核苷酸接触。在本情况中杂交和捕获同时发生。捕获的核酸可以例如在表面上通过多种本领域已知的方法直接检测、鉴定、定量或扩增，或在进行这种鉴定或扩增前将其从表面上释放，这通过将固定的、经修饰的寡核苷酸和捕获的核酸接受去杂交条件，例如加热或通过使用低离子强度的缓冲液而达到。
在另一方面，LNA修饰的寡核苷酸携带有共价连接至5’或3’末端上的配体。在本情况中，在溶液中将LNA修饰的寡核苷酸与天然的或合成的核酸接触，随后形成的杂交产物捕获于携带有能特异性结合该配体的分子的固体支持物上。
在一优选的方面，靶标序列数据库包括对应人、小鼠、大鼠、Drosophila melanogaster、美丽线虫、拟南芥、玉米、河豚、斑马鱼、原鸡(Gallus Gallus)、vira或稻miRNA的核酸序列。
在另一方面，本方法进一步包括基于这种假设即识别序列包括至少一种稳定化核苷酸(例如LNA分子)来计算稳定性。在一优选的方面，计算得到的稳定性用于在最初查询靶标序列数据库来初始确定最优的探针识别序列前，将具有不足稳定性的探针从虚拟的候选探针数据库中除去。
在另一方面，本方法另外包括计算给定探针序列与其自身形成双链结构的稳定性，这种稳定性的计算基于这种假设即该序列包括至少一个稳定化核苷酸，例如LNA分子。在一优选的方面，计算得到的倾向用于将可能形成探针双链的探针序列从虚拟候选探针的数据库中除去。
本发明的一个优选的实施方案是用于检测或定量靶标miRNA、siRNA、RNA-编辑的转录物、非编码反义转录物或选择性剪接变体的试剂盒，其包括标签探针和靶标检测探针的文库。在一方面，试剂盒包括关于它们使用的in silico方法。在另一方面，试剂盒包括关于获得廉价DNA引物的建议的信息。包括于这些试剂盒中的探针可能具有任意或全部上述性质。在一优选的方面，多种探针包括至少一个稳定化核苷酸，例如LNA核苷酸。在另一方面，多个探针包括偶联至至少一个化学部分或与其稳定连接的核苷酸以增加该探针的结合稳定性。根据本发明的试剂盒使得用户能快速并有效地发展一种用于不同miRNA靶标、siRNA靶标、RNA-编辑的转录物、非编码反义转录物或选择性剪接变体的检测法。
一般而言，本发明描述了对高度亲和性的具有双链稳定性特性的寡核苷酸探针的设计以及十分有用的用于多种靶标核酸检测、扩增以及定量(例如通过实时定量PCR来监控微RNA或siRNA的表达)的方法。这些寡核苷酸探针的一些含有通过组合特异化的具有LNA主链的核碱基产生的新的核苷酸，因而产生了具有特异性性质(例如减少的与互补链的序列差别或减少的形成分子内双链结构的能力)的高度亲和性的寡核苷酸。本发明也提供用于在复杂的核酸样品中检测和定量核酸的改良方法。其它理想的经修饰的碱基具有减少的自我-退火或与含有一个或多个经修饰的寡核苷酸探针形成双链的能力。
实施例
现在将进一步通过参考以下实施例说明本发明。应该理解，以下是仅通过实例的方式并且可以对细节进行修饰而仍然在本发明的内容之内。
在下面的实施例中，探针参考号指在下面的合成实施例中显示的LNA-寡核苷酸序列。
人miR-15a微RNA靶标序列的实时定量PCR测定的灵敏性和特异性的评估。
材料和方法
1.用于微RNA检测和定量的寡核苷酸标签探针和检测探针的设计和合成。
RNA寡核苷酸(EQ15885和EQ15886)购自DNA Technology(Aarhus，丹麦)并通过反相色谱(RP-HPLC)纯化。将RNA寡核苷酸溶解于焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的H2O中并在NanoDrop ND-1000(NanoDroptechnologies，USA)上确定浓度。或者，合成寡核苷酸或在DNAtechnology购买标准的DNA寡核苷酸。
表I：微RNA标签探针、合成的转录模板和检测探针的设计。
  EQ No   名称   5′-末端   序列a   3′-末端
  7396   M13正向   gtaaaacgacggccagt
  7655   pTRIamp18M13反向   gaaacagctatgacatg
  15848   hsa-miR-15a micROLA探针1   aTgtGctGcTaactggccgtcgttttac
  15849   hsa-miR-15a micROLA探针2   gaaacagctatgacatgcacAaamCcaTt
  15852   hsa-miR-15a DNA phos   tagcagcacataatggtttgtg   P
  15853   hsa-miR-16DNA phos   tagcagcacgtaaatattggcg   P
  15866   hsa-miR-15A_02   6-Fitc   aATGGTTTG#Q1z   P
  15867   hsa-miR-15A_03   6-Fitc   tGTGmCTGmCT#Q1z   P
  15885   hsa-miR-15a RNA   uagcagcacauaaugguuugug
  15886   hsa-miR-16 RNA   uagcagcacguaaauauuggcg
  15887   hsa miR-15a M13 for ex   cgtaaaacgacggccagt
  15888   hsa miR-15a M13 revex   caagtcttgaaacagctatgacatg
aLNA(大写字母)、DNA(小写字母)、RNA(斜体和小写字母)、5-甲基C(mC)；荧光素(6-FITC(Glenn Research，Prod.Id.No.10-1964))、#Q1(如实施例8a中描述的制备)、z(5-硝基吲哚(GlennResearch，Prod.Id.No.10-1044))以及磷酸(P)。
用10U T4多核苷酸激酶(New England Biolabs(NEB)USA)、400pmol hsa-miR-15a微RNA探针1(EQ15848)和1×T4DNA连接酶缓冲液(NEB，USA)，将具有3’-末端识别序列的人miR-15a微RNA标签探针在50μL反应物中经酶促反应5’-磷酸化。将反应在37℃下孵育30分钟并在70℃下加热灭活10分钟。通过加入50μL DECP-处理的H2O并通过YM-30Microcon离心柱(Millipore，USA)3分钟14000×g过滤反应物除去激酶。
在NanoDrop ND-1000(NanoDrop technologies，USA)上测定磷酸化标签探针的浓度
2.以微RNA为模板的连接反应
连接反应在20μL反应物中进行，所述的反应物的组成为120nMmiR-15a RNA模板(EQ15885)、120nM的每种微RNA标签探针(磷酸化的EQ15848(见上面)和EQ15849)、10mM Tris-HCl pH7.0(Ambion，USA)、10mM MgCl2(PE Biosystems，USA)、0.05×T4DNA连接酶缓冲液[2.5mM TRIS-HCl、0.5mM MgCl2、0.5mM DTT、50μM ATP、1.25μg/mL BSA、pH7.5@25；(NEB，USA)]。在37℃下将反应预孵育15分钟并加入800U T4DNA连接酶并在37℃孵育另外的2小时。最后在65℃热灭活反应20分钟。使用miR-15a DNA(EQ15852)、miR-16RNA(EQ15886)作为靶标或不用模板而使用miR-15a RNA靶标重复该连接反应。除了1∶1摩尔比的靶标：微RNA标签探针，在独立的连接反应中还使用5∶1和1∶5的比率。
用Quick连接试剂盒(NEB，USA)进行的连接反应根据供应商的说明书进行。简而言之，寡核苷酸与上面描述的一样，在20μL的反应混合物中，在25℃下孵育寡核苷酸和1×快速连接缓冲液(NEB，USA)孵育15分钟并加入1μL Quick T4 DNA连接酶(NEB，USA)并且延长孵育另外30分钟。在65℃下热灭活酶20分钟。
3.实时聚合酶链式反应(PCR)测定
3.1.使用SYBR绿检测的微RNA实时PCR测定
反应包括(50μL)1×SYBR Green PCR Master Mix(AppliedBiosystems，USA)、200nM M13正向引物(EQ7396)、200nM M13反向引物(EQ7655)和2.5μL连接反应物(如上描述的)。循环程序：在ABI Prism 7000 Sequence Detection System中95℃10分钟、50个循环(95℃15秒)、45℃1分钟、60℃1分钟，以及最后从60℃-95℃解离20分钟。
3.2.使用LNA-修饰的检测探针的微RNA实时PCR测定
反应物(50μL)是1×Quanti Tect Probe PCR mastermix(Qiagen，Germany)、200nM hsa miR-15a M13正向引物(EQ15887)、200nMhsa miR-15a M13反向引物(EQ15888)、100nM LNA序列特异性探针(EQ15866或EQ15867)、2.5μL连接反应物(如上描述)。循环程序：在ABI Prism 7000 Sequence Detection System中95℃15分钟、95℃20秒(50个循环)、60℃1分钟。
在以下，dUTP表示2′-脱氧尿苷-5’-三磷酸。
实施例1
用于人miR-15a微RNA靶标序列的实时定量PCR测定法
将序列-特异性的LNA-修饰的微RNA标签探针退火并连接。随后用实时PCR、用于miR-15a微RNA的锚定PCR引物和LNA-修饰的双标记检测探针检测连接的模板，负模板用作阴性对照。使用没有连接酶的反应测验该反应的特异性。循环阈值(Ct)，其代表报告荧光增加高于基线信号可以第一次检测时的PCR循环，对于连接了的微RNA探针，使用miR-15a微RNA模板时是35.0(Fig.2A)，而对于阴性对照试验(分别是负模板和负连接酶)观测不到Ct。在PCR反应过程中测量标准化的报告信号(Rn)，其表示报告染料的荧光信号除以无源(passive)参照染料的荧光信号。在PCR过程中，当扩增子拷贝数增加时Rn增加，直到反应到达平台期。基线校正的Rn(ΔRn)表示Rn减去在起初几个PCR循环确定的基线信号。对于终末点分析(Fig 2B)，将实时PCR样本(4μL)施加在用1：10000 Gelstar染色的2％的琼脂糖凝胶上并在1×TBE缓冲液(90mM Tris-硼酸盐，2mM EDTA，pH8.3)中8V/cm下电泳2小时。泳道1显示了在实时PCR中作为模板的连接的miR-15a标签探针。阴性对照为泳道2：负模板，以及泳道3：无连接酶。
实施例2
用于人miR-15a微RNA靶标序列和相应的DNA 3’-封闭靶标的实时定量PCR测定法
用DNA模板代替RNA模板，该DNA模板经化学封闭在3’-末端具有磷酸。在连接反应中不加入连接酶，则不能在LNA序列-特异性实时PCR测定中检测到封闭的DNA模板。RNA模板和DNA模板的Ct值分别是35.0和33.3(Fig.3)。
实施例3
用于人miR-15a和人miR-16微RNA靶标序列的实时定量PCR测定法的特异性
本发明的序列-特异性微RNA靶标序列识别通过使用miR-15a微RNA靶标与人miR-16靶标相比较来评估，miR-16靶标与miR-15a靶标序列具有72％的序列一致性。在实时PCR反应中负模板对照和无模板对照(NTC)都没有显示产生任何信号。使用用于将如上描述的LNA-修饰的miR-15a靶标序列-特异性标签探针退火至miR-15a靶标的杂交条件得到了36.2的Ct值，而使用相同的标签探针用于高度同源性的miR-16得到39.9的Ct值，相当于13倍的辨别差异(Fig.4)。
实施例4
用于人miR-15a微RNA靶标序列的实时定量PCR测定法，该PCR使用两种不同的LNA-修饰的、双标记检测探针。
使用相同的由Quick T4 DNA连接试剂盒连接的LNA-修饰的标签探针，设计用于人miR-15a微RNA序列的两种不同的LNA-修饰的实时PCR检测探针。在实时PCR测定法中使用LNA-修饰的检测探针EQ15866和EQ15867分别得到38.2和32.2的Ct值(Fig.5)。负连接酶对照(EQ15866，空心圆；EQ15867，空心三角形)两者都没有检测到信号。
实施例5
用于人miR-15a靶标序列的实时定量PCR测定法，该PCR使用靶标和miR-15a标签探针之间不同的摩尔比。
靶标和标签探针之间的摩尔比是1∶1时得到最高的终末点荧光信号(Fig.6)(ΔRn值)，而1∶5的摩尔比得到最低的终末点信号(ΔRn值)。摩尔过量的miR-15a标签探针(1∶5摩尔比)也导致了特异性的终末点信号(Fig.6)，而PCR反应中无模板对照(NTC)没有显示任何显著的荧光信号。
实施例6
用于掺入进Torulla酵母RNA复杂背景的人miR-15a靶标序列的实时定量PCR测定法，该PCR使用miR-15a标签探针和最佳模式的LNA-修饰的检测探针。
将miR-15a微RNA以2.4μM和1μM的浓度分别掺入10μg Torulla酵母RNA中，与等摩尔浓度的miR-15a标签探针退火，随后连接并通过定量实时PCR检测miR-15a。在miR-15a靶标序列对照(无复杂的酵母总RNA背景)中观测到最高的荧光信号，而从酵母总RNA样品(Fig.7)没有观测到荧光信号。如负模板对照显示的，没有观测到实时PCR测定法的污染。
实施例7
用于人miR-15a微RNA靶标序列的实时定量PCR测定法，该PCR使用SYBR检测。
将序列-特异性的LNA-修饰的微RNA标签探针退火并连接。使用实时PCR、锚定PCR引物和SYBR绿检测容易地测定连接了的模板(Fig.8)，而从负模板或负连接酶对照没有检测到信号。
实施例8a
1-(3-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基)丙基氨基)-4-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-蒽醌(3)淬灭分子“Q1”的制备
Figure A20058001768800751
1，4-双(3-羟基丙基氨基)-蒽醌(1)
将leucoquinizarin(9.9g；0.04mol)与3-氨基-1-丙醇(10mL)和乙醇(200mL)混合并加热至回流6小时。冷却该混合物至室温并在大气条件下搅拌过夜。将混合物倾注于水(500mL)中，过滤沉淀物，用水(200mL)洗涤并干燥。将该固体在乙酸乙酯(300mL)中沸腾，冷却至室温并通过过滤收集固体。
收率：8.2g(56％)
1-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-4-(3-羟基丙基氨基)-蒽醌(2)
将1，4-双(3-羟基丙基氨基)-蒽醌(7.08g；0.02mol)溶解于干N，N-二甲基甲酰胺(150mL)和干吡啶(50mL)的混合物中。加入二甲氧基三苯甲基氯(3.4g；0.01mol)并搅拌混合物2小时。加入额外的二甲氧基三苯甲基氯(3.4g；0.01mol)并搅拌混合物3小时。在真空下浓缩混合物并将残余物再溶解于二氯甲烷(400mL)中并且用水(2×200ml)洗涤并干燥(Na2SO4)。通过硅胶滤垫(10cm；h 10cm)过滤该溶液并用二氯甲烷洗脱直至单-DMT-蒽醌产物开始洗脱，其后溶剂改变为二氯甲烷中的2％的甲醇。合并纯化的级分并浓缩得到绿色泡沫。
收率：7.1g(54％)
1H-NMR(CDCl3)：10.8(2H，2xt，J＝5.3Hz，NH)，8.31(2H，m，AqH)，7.67(2H，dt，J＝3.8和9.4，AqH)，7.4-7.1(9H，m，ArH+AqH)，6.76(4H，m，ArH)3.86(2H，q，J＝5.5Hz，CH2OH)，3.71(6H，s，CH3)，3.54(4H，m，NCH2)，3.26(2H，t，J＝5.7Hz，CH2ODMT)，2.05(4H，m，CCH2C)，1.74(1H，t，J＝5Hz，OH)。
1-(3-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基)丙基氨基)-4-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-蒽醌(3)
将1-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-4-(3-羟基丙基氨基)-蒽醌(0.66g；1.0mmol)溶解于干二氯甲烷(100mL)中并加入3的分子筛。搅拌混合物3小时并然后加入2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异丙基磷二脒(335mg；1.1mmol)和4，5-二氰基咪唑(105mg；0.9mmol)。搅拌混合物5小时并然后加入饱和NaHCO3(50mL)并搅拌10分钟。分离相并用饱和的NaHCO3(50mL)、盐水(50mL)洗涤有机相并干燥(Na2SO4)。浓缩后，获得亚磷酰胺的绿色泡沫并用于寡核苷酸合成而无需进一步纯化。
收率：705mg(82％)
31P-NMR(CDCl3)：150.0
1H-NMR(CDCl3)：10.8(2H，2xt，J＝5.3Hz，NH)，8.32(2H，m，AqH)，7.67(2H，m，AqH)，7.5-7.1(9H，m，Ar H+AqH)，6.77(4H，m，ArH)3.9-3.75(4H，m)，3.71(6H，s，OCH3)，3.64-3.52(3.54(6H，m)，3.26(2H，t，J＝5.8Hz，CH2ODMT)，2.63(2H，t，J＝6.4Hz，CH2CN)2.05(4H，m，CCH2C)，1.18(12H，dd，J＝3.1Hz，CCH3)。
实施例8b
1-(3-(氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基)丙基氨基)-5-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-蒽醌(6)淬灭分子“Q2”的制备
Figure A20058001768800771
1，5-双(3-羟基丙基氨基)-蒽醌(4)
将1，5-二氯蒽醌(2.8g；10mmol)与3-氨基-1-丙醇(10mL)和DMSO(50mL)混合并加热至130℃4小时。将混合物冷却至～80°并加入水(150mL)。当混合物达到RT，通过过滤分离形成的沉淀，用水(2×50mL)洗涤，在甲苯(200mL)中沸腾并通过过滤分离不溶解的产物并干燥。收率：3.2g(90％)
1-(3-羟基丙基氨基)-5-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-蒽醌(5)
将1，5-双(3-羟基丙基氨基)-蒽醌(1.4g；4mmol)与吡啶(50mL)共蒸发并然后再悬浮于吡啶(50mL)中，加入二甲氧基三苯甲基氯(1.4g；4.1mmol)并搅拌过夜。浓缩混合物并将残余物再溶解于二氯甲烷(150mL)中，用饱和的NaHCO3(2×50mL)、盐水(50mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。在硅胶柱(MeOH/二氯甲烷为2/98)上纯化。浓缩合适的级分后，获得单-DMT化合物的红色泡沫。收率：0.9g(34％)1H-NMR(CDCl3)：9.7(2H，2xt，NH)，7.6-6.7(19H，m，ArH)，3.86(2H，q，J＝5.5Hz，CH2)，3.74(6H，s，CH3)，3.48(4H，m，NCH2)，3.26(2H，t，J＝5，9Hz)，2.05(4H，m，CH2)，1.45(1H，t，J＝5Hz)。
1-(3-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基)丙基氨基)-5-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-蒽醌(6)
将1-(3-羟基丙基氨基)-5-(3-(4，4’-二甲氧基-三苯甲氧基)丙基氨基)-蒽醌(0.4g；0.61mmol)溶解于干二氯甲烷(50mL)中并加入3的分子筛。搅拌混合物3小时并然后加入2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异丙基磷二脒(tetraisopropylphosphordiamidite)(200mg；0.66mmol)和4，5-二氰基咪唑(71mg；0.6mmol)。搅拌混合物2小时并然后加入饱和NaHCO3(50mL)并搅拌10分钟。分离相并用饱和的NaHCO3(50mL)、盐水(50mL)洗涤有机相并干燥(Na2SO4)。浓缩后获得亚磷酰胺的红色泡沫并用于寡核苷酸合成无需进-步纯化。收率：490mg(93％)31P-NMR(CDCl3)：148.3.用于实施例9-11的材料和方法。
1.使用海藻糖的以微RNA-为模板的连接反应
连接反应在20μL反应物中进行，反应物的组成为50nM miR-15aRNA模板(EQ15885，表I)、500nM的每种微RNA标签探针、10mMTris-HCl pH7.0(Ambion，USA)、10mM MgCl2(Ambion，USA)、0.05×T4DNA连接酶缓冲液[2.5mM Tris-HCl、0.5mM MgCl2、0.5mMDTT、50μM ATP、1.25μg/mL BSA、pH7.5，25℃下；(NEB，USA)]、24g/100mL海藻糖(Sigma-Aldrich，USA)、0.05μg/μL Torulla酵母RNA(Ambion，USA)。反应在热循环仪DYADTM(MJ Research DNAengine，USA)中42℃下预孵育15分钟并加入800U T4DNA连接酶(NEB，USA)，并且在42℃下孵育1小时。最后在95℃下将反应物热灭活20分钟。在没有模板而有miR-15a RNA靶标时重复该连接反应。
2.使用LNA-修饰的检测探针的微RNA实时PCR测定法
反应物(50μL)是1×PCR缓冲液[含有Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、1.5mM MgCl2；pH8.7(20℃)](Qiagen，Germany)、终浓度4mM的MgCl2、200nM的每种dATP、dCTP、dGTP和600nM dUTP(Applied Biosystems，USA)；200nM hsa-miR-15a正向引物2(EQ16444，表II)、200nM hsa-miR-15a反向引物2(EQ16445，表II)、250nM LNA序列-特异性miR-15a检测探针(EQ15866，表I)、0.1×ROX参照染料(Invitrogen，USA)、5μL连接反应物(如上描述)和2.5U HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)。循环程序：在Applied Biosystems 7500实时PCR系统中95℃10分钟、50个循环的95℃20秒、60℃1分钟。
表II：用于实施例9-16的不同的微RNA标签探针、检测探针和实时PCR引物的设计。
  Oligo id(EQ No)   寡核苷酸名称   5’-末端   序列(5’-3’)a   3’-末端
  16444   hsa-miR-15a正向引物2   gtaaaacgacggccagttag
  16445   hsa-miR-15a反向引物2   ccgaaacagctatgacatgc
  16307   hsa-miR-15a micROLA探针1.1DNA   P   atgtgctgctaactggccgtcgttttac
  16311   hsa-miR-15a micROLA探针2.1DNA   gaaacagctatgacatgcacaaaccatt
  16314   hsa-miR-15a micROLA探针2.4   gaaacagctatgacatgmCamCaaAccAtt
  16447   hsa-miR-15a micROLA探针3.4   gaaacagctatgacatgCacAaaCcatt
  16452   hsa-miR-15a micROLA探针3.9   P   aTgtgmCtgcTaactggccgtcgttttac
  16453   hsa-miR-15a micROLA探针3.10   gaaacagctatgacatgcAcaaAccaTt
  16580   axkOL140   6-Fitc   aGmCAmCATAAT#Q1z   P
  16581   axkOL142   6-Fitc   aGmCAmCXTAAT#Q1z   P
  16582   axkOL143   6-Fitc   aGmCXmCXTAAT#Q1z   P
  16583   axkOL144   6-Fitc   aGmCXmCXTXAT#Q1z   P
  16589   hsa-miR-15a FP 3 LNA_3 2 DNA   gtaaaacgacggccagttaGcaGcamCat
  16591   hsa-miR-15a FP 3 DNA   gtaaaacgacggccagttagcagcacat
  16618   hsa-miR-15a RT 4.1 DNA   gaaacagctatgacatgcacaaacc
  16620   hsa-miR-15a RT 4.3 LNA   gaaacagctatgacatgmCacAaamCc
  16623   hsa-miR-15a FP 4.6 DNA   gtaaaacgacggccagttagcagcaca
  16624   hsa-miR-15a FP 4.7 LNA   gtaaaacgacggccagtTagmCagmCaca
  16679   axkOL150   6-Fitc   aGmCXmCXZAX#Q1z   P
aLNA(大写字母)、DNA(小写字母)、5-甲基C(mC)；荧光素(6-FITC(Glenn Research，Prod.Id.No.10-1964))、#Q1(如实施例8a中描述的制备)、z(5-硝基吲哚(Glenn Research，Prod.Id.No.10-1044))，磷酸(P)、X指LNA-2，6-二氨基嘌呤以及Z指LNA-2-硫代胸苷。
实施例9
用于人miR-15a微RNA的实时定量PCR，该PCR使用三组不同的miR-15a标签探针对的微RNA为模板进行连接。
将序列-特异性LNA-修饰的微RNA标签探针退火并连接。选取三对不同的人miR-15a微RNA标签探针(表II)：对I.EQ16311/EQ16452、II.EQ16453/EQ16307和III.EQ16447/EQ16307)并且如上描述的进行连接反应。随后用如上描述的实时PCR、通过用于miR-15a微RNA的锚定PCR引物和LNA-修饰的双-标记检测探针检测连接了的模板，负模板用作阴性对照。使用没有加入T4DNA连接酶的反应测试该连接反应的特异性。循环阈值(Ct)表示可以第一次检测到报告荧光大于基线信号的PCR循环数，miR-15a微RNA模板的Ct值对于微RNA标签探针对I、II和III分别是17.2、30.5和28.7(Fig.13)。对于用对II和III进行的阴性对照(分别是负模板和负连接酶)没有检测到Ct值，用对I进行的阴性对照的Ct值分别在第37和第39个循环后可检测到，当与17.2的相应Ct值相比时该值仍然是可以接受的(Fig.13)。在PCR反应过程中测量标准化的报告信号(Rn)，其表示报告染料的荧光信号除以无源(passive)参照染料的荧光信号。在PCR过程中，当扩增子拷贝数增加时Rn增加，直到反应到达平台期。基线校正的Rn(ΔRn)表示Rn减去在起初几个PCR循环确定的基线信号。
实施例10
用于人miR-15a微RNA的改良的实时定量PCR，该PCR使用微RNA为模板的连接和LNA-2，6-二氨基嘌呤-增强的检测探针。
在如上描述的人miR-15a为模板的连接反应中，使用LNA-修饰的序列-特异性微RNA标签探针EQ16311/EQ16452(实施例9中的对I)重复实时PCR反应。随后通过锚定PCR引物和LNA-修饰的双-标记检测探针(EQ16580、EQ16581、EQ16582或EQ16583，表II)，使用如上描述的实时定量PCR检测连接了的模板，负模板用作阴性对照。使用没有加入T4DNA连接酶的反应测试该连接反应的特异性。使用掺入Torulla酵母RNA的复杂背景的人miR-15a微RNA模板的Ct值是十分相当的，即对于LNA-修饰的双-标记检测探针EQ16580、EQ16581、EQ16582和EQ16583，Ct值分别是30.4、30.0、29.9和30.6(Fig.14、表II)。相反，对于阴性对照试验(负模板和负连接酶，Fig.14)没有观测到Ct值。通过用LNA-2，6-二氨基嘌呤单体取代一个或两个LNAA核苷酸，明显增强了在微RNA测定法中检测到的基线校正的荧光信号ΔRn，而用第三个LNA 2，6-二氨基嘌呤单体取代(EQ16583，表II)，没有更进一步增加荧光信号，显示了与双LNA 2，6-二氨基嘌呤-取代的miR-15a检测探针(EQ16582，表II、Fig.14)相当的结果。
实施例11
用微RNA为模板的连接反应产物作为模板产生的人miR-15a微RNA的实时定量PCR标准曲线。
将LNA-修饰的人miR-15a微RNA标签探针对EQ16311/EQ16452(实施例9中的对I)用于如上描述的miR-15a为模板的连接反应，其中人miR-15a模板浓度分别是50、5、0.5、0.05或0.005nM。随后通过用于miR-15a微RNA的锚定PCR引物和LNA-修饰的双-标记检测探针(EQ15866，表I)，使用如上描述的实时定量PCR检测连接的模板，负模板用作阴性对照。使用没有连接酶的反应检验该连接的特异性。使用miR-15a微RNA模板对于50、5、0.5、0.05和0.005nM的miR-15a微RNA浓度的Ct值分别是17.6、22.0、25.9、29.6和35.6，而阴性对照试验(负模板和负连接酶)没有观测到Ct值。Ct值与最初的模板拷贝数的对数成反比例。因而，通过画出Ct值相对拷贝数的对数的曲线得到标准曲线，如Fig.15描绘的。通过线形回归分析确定其斜率和截距。滴定曲线的斜率为-4.31以及截距为30.9。
实施例12
用于人miR-15a微RNA的实时定量PCR，该PCR反应使用具有LNA-修饰的标签探针和LNA-修饰的双-标记检测探针的微RNA为模板的RT-PCR反应物。
1.用LNA-修饰的标签探针的微RNA逆转录和第二链反应。
逆转录反应和PCR(RT-PCR)反应在50μL反应物中进行，所述的反应物的组成为2nM miR-15a RNA模板(EQ15885，表I)、600nM每种微RNA标签探针、1×OneStep RT-PCR缓冲液[含有Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、1.5mM MgCl2、DTT、pH8.7(20℃)](Qiagen，Germany)、400μM的每种dNTP(Qiagen，Germany)、20U SUPERase-In(Ambion，USA)、0.05μg/μL Torulla酵母RNA以及2μL Qiagen OneStep RT-PCREnzyme mix(Qiagen，Germany)。将热循环仪DYADTM(MJ Research DNAengine，USA)预热至起始温度。温度曲线是50℃30分钟、95℃15分钟、50℃1分钟、72℃3分钟，并最后冷却至4℃。无模板时作为阴性对照，重复该RT-PCR反应。
2.使用LNA-修饰的检测探针的微RNA实时定量PCR测定法
PCR反应物(50μL)是1×PCR缓冲液[含有Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、pH8.7(20℃)](Qiagen，Germany)、终浓度为4mM的MgCl2、200nM的每种dATP、dCTP、dGTP和600nM dUTP(Applied Biosystems，USA)”)；200nM hsa-miR-15a正向引物2(EQl6444，表II)、200nM hsa-miR-15a反向引物2(EQ16445，表II)、250nM LNA序列特异性检测探针(EQ15866，表I)、0.1×ROX参照染料(Invitrogen，USA)、5μL的RT-PCR反应产物作为模板(如上描述)和2.5UHotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)。循环程序：在AppliedBiosystems 7500实时PCR系统(Applied Biosystems，USA)中95℃10分钟、50个循环的95℃20秒、60℃1分钟。
将用于人miR-15a的LNA-修饰的微RNA标签探针退火并作为逆转录引物(RT标签探针)和2nd链标签探针延伸。选取三对不同的微RNA标签探针(表I I)：对IV.EQ16591/EQ16311、V.EQ16591/EQ16314和VI.EQ16589/EQ16314。如上描述的进行miR-15a RT-PCR反应。随后使用miR-15a微RNA的锚定PCR引物和LNA-修饰的双-标记检测探针(EQ15866，表I)，使用如上描述的实时PCR检测模板，负模板用作阴性对照。用没有加入OneStep RT-PCR Enzyme mix的反应评估微RNA RT-PCR测定法的特异性。使用miR-15a微RNA模板，对于微RNA探针对IV、V和VI，Ct值(其表示可以首先检测到报告荧光增长至高于基线信号时的PCR循环数)分别是19.2、28.2和22.0(Fig.16)。而用对V和VI进行的阴性对照试验(分别是负模板和负连接酶)没有检测到Ct值，来自使用对V的阴性对照的相应Ct值，对于无模板和无RT-PCR Enzyme mix分别是39.0和39.9，这还是可以接受的值。在整个实时PCR程序过程中测量Rn信号，其表示报告染料的荧光信号除以无源(passive)参照染料的荧光信号。在PCR过程中，当扩增子拷贝数增加时Rn增加，直到反应到达平台期。ΔRn表示Rn减去在起初几个PCR循环中确定的基线信号。
实施例13
用于人miR-15a微RNA的改进的实时定量PCR，该PCR使用具有LNA-修饰的标签探针和LNA 2，6-二氨基嘌呤-增强的检测探针的微RNA为模板的RT-PCR反应物。
1.用LNA-修饰的标签探针的微RNA逆转录和第二链反应。
RT-PCR反应在25μL反应物中进行，所述的反应物组成为2nMmiR-15a RNA模板(EQ 15885，表I)、60nM每种微RNA标签探针、1×OneStep RT-PCR缓冲液[含有Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、1.5mMMgCl2、DTT、pH8.7(20℃)](Qiagen，Germany)、400μM的每种dNTP(Qiagen，Germany)、10U SUPERase-In(Ambion，USA)、0.05μg/μLKTorulla酵母RNA以及1μL Qiagen OneStep RT-PCR Enzymemix(Qiagen，Germany)。将热循环仪DYADTM(MJ Research DNA engine，USA)加热至反应起始温度。温度曲线是50℃30分钟、95℃15分钟、50℃1分钟、72℃3分钟，并最后冷却至4℃。在没有模板作为阴性对照而有miR-15a RNA靶标时重复该连接反应。
2.使用LNA-修饰的检测探针的微RNA实时定量PCR测定法
反应物(25μL)是1×PCR缓冲液[含有Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、pH8.7(20℃)](Qiagen，Germany)、终浓度为4mM的MgCl2、200nM的每种dATP、dCTP、dGTP和600nM dUTP(Applied Biosystems，USA)；200nM hsa-miR-15a正向引物2(EQ16444，表II)、200nMhsa-miR-15a反向引物2(EQ16445，表II)、250nM LNA检测探针(EQ15866，表I)、0.1×ROX参照染料(Invitrogen，USA)、5μL的RT-PCR反应产物(如上描述)和1.25U HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)。循环程序：在Applied Biosystems 7500实时PCR系统(Applied Biosystems，USA)中95℃10分钟、50个循环的95℃20秒、60℃1分钟。
将用于人miR-15a微RNA的LNA-修饰的微RNA标签探针EQ16591/EQ16314(实施例12中的对V)退火并作为如上描述的逆转录引物(RT标签探针)和2nd链标签探针延伸。随后通过锚定PCR引物和LNA-修饰的双-标记检测探针(EQ16580、EQ16581和EQ16582，表II)，使用如上描述的实时PCR检测miR-15RT-PCR反应，负模板用作阴性对照。使用miR-15a微RNA模板的Ct值对于LNA-修饰的双-标记检测探针EQ16580、EQ16581和EQ16582分别是33.0、33.2和33.7(Fig.17)，而阴性对照试验(负模板和负OneStep RT-PCR Enzymemix)没有检测到Ct值。通过用LNA 2，6-二氨基嘌呤单体取代一个或两个LNA A核苷酸明显增强了在微RNA测定法中检测的基线较正的荧光信号ΔRn(Fig.17)。
实施例14
用微RNA为模板的RT-PCR反应产物作为模板产生的人miR-15a微RNA的实时定量PCR标准曲线。
将用于人miR-15a微RNA的LNA-修饰的微RNA标签探针EQ16624/EQ16620(对VII)退火并作为逆转录引物(RT标签探针)和2nd链标签探针延伸。如上描述的进行RT-PCR反应，其中人miR-15a微RNA模板浓度分别是50、5、0.5、0.05或0.005nM。随后通过用于miR-15a微RNA的锚定PCR引物和LNA-修饰的双-标记检测探针(EQ16582)，使用如上描述的实时定量PCR检测miR-15a RT-PCR反应，负模板用作阴性对照。用没有加入OneStep RT-PCR Enzyme mix的反应评估微RNA RT-PCR反应的特异性。使用miR-15a微RNA模板的Ct值对于50、5、0.5、0.05和0.005nM浓度的miR-15a微RNA分别是22.2、26.5、30.6、33.6和37.8，而阴性对照试验(负模板和负OneStep RT-PCR Enzyme mix)没有观测到Ct值。Ct值与最初的模板拷贝数的对数成反比例。因而，通过画出Ct值相对拷贝数的对数的曲线得到标准曲线，如Fig.18描绘的。通过线形回归分析确定其斜率和截距。滴定曲线的斜率为-3.81以及截距为34.0。
实施例15
用于人miR-15a微RNA的实时定量PCR，该PCR使用微RNA为模板的RT-PCR反应产物作为模板和升高的退火温度。
将用于人miR-15a微RNA的LNA-修饰的微RNA标签探针EQ16624/EQ16620(对VII)退火并作为逆转录引物(RT标签探针)和2nd链标签探针延伸。对于逆转录引物和2nd链标签探针两者，退火温度从50℃变至55℃或60℃。如上描述的进行RT-PCR反应。随后通过用于miR-15a微RNA的锚定PCR引物和LNA-修饰的双-标记检测探针(EQ16582)，使用如上描述的实时定量PCR检测miR-15a RT-PCR反应，负模板用作阴性对照。用没有加入OneStep RT-PCR Enzyme mix的反应评估微RNA RT-PCR反应的特异性。使用miR-15a微RNA模板的Ct值对于50、55和60℃退火温度分别是28.6、29.3和31.0(Fig.19)，而阴性对照试验(负模板和负OneStep RT-PCR Enzyme mix)没有检测到Ct值。
实施例16
用于人miR-15a微RNA的改良的实时定量PCR，该PCR使用具有LNA-修饰的标签探针的微RNA为模板的RT-PCR反应物和LNA 2，6二氨基嘌呤/LNA 2-硫代胸苷-增强的检测探针。
1.用LNA-修饰的标签探针的微RNA逆转录和第二链反应。
RT-PCR反应在50μL反应物中进行，所述的反应物组成为2nMmiR-15a RNA模板(EQ15885，表I)、60nM每种微RNA标签探针、1×OneStep RT-PCR缓冲液[含有Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、1.5mMMgCl2、DTT、pH8.7(20℃)](Qiagen，Germany)，400μM的每种dNTP(Qiagen，Germany)、20U SUPERase-In(Ambion，USA)、0.05μg/μL Torulla酵母RNA(Ambion，USA)以及2μL Qiagen OneStepRT-PCR Enzyme mix(Qiagen，Germany)。将热循环仪DYADTM(MJResearch DNA engine，USA)加热至反应起始温度。温度曲线是50℃30分钟、95℃15分钟，50℃1分钟、72℃3分钟，并最后冷却至4℃。在没有模板而有miR-15a RNA靶标时作为阴性对照重复该RT-PCR反应。
2.使用LNA-修饰的检测探针的微RNA实时定量PCR测定法
反应物(25μL)是1×PCR缓冲液[含有Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、pH8.7(20℃)](Qiagen，Germany)、终浓度为4mM的MgCl2、200nM的每种dATP、dCTP、dGTP和600nM dUTP(AppliedBiosystems，)”)；200nM hsa-miR-15a正向引物2(EQ16444，表II)、200nM hsa-miR-15a反向引物2(EQ16445，表II)、250nMLNA检测探针(EQ15866，表I)、0.1×ROX参照染料(Invitrogen，USA)、5μL的RT-PCR反应产物(如上描述)和1.25U HotStarTaqDNA聚合酶(Qiagen，Germany)。循环程序：在Applied Biosystems7500实时PCR系统(Applied Biosystems，USA)中95℃10分钟、50个循环的95℃20秒、60℃1分钟。
将用于人miR-15a微RNA的微RNA标签探针EQ16623/EQ16618(对VIII)退火并作为如上面描述的逆转录引物(RT标签探针)和2nd链标签探针延伸。随后通过锚定PCR引物和LNA-修饰的双-标记检测探针(EQ16852和EQ16679，表II)，使用如上描述的实时PCR检测miR-15RT-PCR反应，并将混杂的对照miR-16微RNA(EQ15886，表I)和负模板用作阴性对照。使用miR-15a微RNA模板的Ct值对于LNA-修饰的双-标记检测探针EQ16582和EQ16679分别是25.6和30.1(Fig.19)。混杂的miR-16微RNA对照的Ct值，对于LNA-修饰的双-标记探针EQ16582和EQ16679分别是33.3和不可检测，而对于阴性试验(负模板和负OneStep RT-PCR Enzyme mix)Ct值是不可检测的。通过用2，6二氨基嘌呤和LNA 2-硫代胸苷单体代替LNA A和LNA T核苷酸显著增强了在微RNA测定法中检测到的完全匹配和混杂的微RNA模板间的区别(Fig.20)。
表III：用于实施例17中的封闭的微RNA标签探针的设计
  Oligo id(EQ No)   寡核苷酸名称   3’-末端   序列(5’-3’)a
  16695   hsa-miR-15a RT 4.3 LNA   P   gaaacagctatgacatgmCacAaamCc
aLNA(大写字母)、DNA(小写字母)、5-甲基C(mC)；和磷酸(P)。
实施例17
用于人miR-15a微RNA的实时定量PCR，该PCR使用具有3′-封闭的LNA-修饰的标签探针的微RNA为模板的RT-PCR反应物和LNA-修饰的检测探针。
1.使用封闭的LNA-修饰的标签探针的微RNA 1链转录反应。
逆转录(RT)反应在20μL反应物中进行，该反应物的组成为25nM miR-15a RNA模板(EQ15885，表I)、50nM微RNA封闭标签探针(EQ16695)、200nM hsa-miR-15a反向引物2(EQ16445，表1)、1×第一链缓冲液(50mM Tris-HCl、75mM KCl、3mM MgCl2、pH8.320℃)(Invitrogen，USA)、5mM DTT(Invitrogen，USA)、500μM的每种dNTP(Applied Biosystems，USA)、10U SUPERase-In(Ambion，USA)、0.05μg/μL Torulla酵母RNA和1U SuperscriptIII逆转录酶(Invitrogen，USA)。混合mir-15a模板、微RNA封闭标签探针和逆转录引物并在70℃下加热10分钟并在冰上淬灭。将热循环仪DYADTM(MJ Research DNA engine，USA)加热至反应起始温度。温度曲线是55℃60分钟、70℃15分钟并最后冷却至4℃。不用模板或Superscript III时作为阴性对照代替miR-15a RNA靶标重复第一链合成。使用miR-16RNA(EQ 15886)作为靶标代替miR-15a RNA靶标也重复第一链反应。
2.用LNA-修饰的标签探针的微RNA第二链定时释放PCR扩增。
反应物(50μL)是1×AmpliTaq Gold缓冲液(AppliedBiosystems，USA)、1.5mM MgCl2、200nM第二链LNA标签探针(EQ16624，表II)、20μL的RT反应产物(如上描述)和1.25U AmpliTaq GoldDNA聚合酶(Applied Biosystems，USA)。循环程序：在DYADTM热循环仪(MJ Research DNA engine，USA)中95℃1分钟和55℃1分钟10个循环。
3.使用LNA-修饰的检测探针的微RNA实时定量PCR测定法。
反应物(25μL)是1×PCR缓冲液[含有Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、pH8.7(20℃)](Qiagen，Germany)、终浓度为4mM的MgCl2、200nM的每种dATP、dCTP、dGTP和600nM dUTP(Applied Biosystems，USA)；200nM hsa-miR-15a正向引物2(EQ16444，表II)、终浓度200nM的hsa-miR-15a反向引物2(EQ16445，表II)、250nM LNA检测探针(EQ15866，表I)、0.1×ROX参照染料(Invitrogen，USA)、5μL的1st和2nd链反应产物(如上描述)和1.25U HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)。循环程序：在Applied Biosystems 7500实时PCR系统(Applied Biosystems，USA)中95℃10分钟、45个循环的95℃20秒、60℃1分钟。
将用于人miR-15a微RNA的LNA-修饰的微RNA标签探针EQ16695(RT标签探针)和hsa-miR-15a反向引物退火并作为逆转录引物延伸。第一链反应后退火2nd链标签探针并如上描述延伸。随后通过用于miR-15a微RNA的锚定PCR引物和LNA-修饰的双-标记检测探针(EQ16582，表II)，使用如上描述的实时PCR检测miR-15RT和PCR反应，负模板用作阴性对照。使用miR-15a微RNA模板的Ct值对于LNA-修饰的双-标记检测探针EQ16582是37.1(Fig.21)，而对于miR-16微RNA模板和阴性对照试验(负模板和负Superscript III)没有检测到Ct值。
实施例18
用于成熟人miR-15a微RNA的实时定量PCR，该PCR使用具有3′-封闭的LNA-修饰的标签探针的微RNA为模板的RT-PCR反应物和LNA-修饰的检测探针。
1.使用能进行RNA-引发的DNA-指导的DNA合成的酶以及封闭的LNA-修饰的miRNA标签探针进行微RNA引物延伸。
miRNA引物延伸反应在20μL反应物中进行。首先混合500nmolmiR-15a RNA模板(EQ15885，表I)、1μg Torulla酵母RNA(Ambion，USA)和25nM微RNA封闭标签探针(EQ16695，表II)，在70℃下加热10分钟并在冰上淬灭。加入1×EcoPol缓冲液(NEB，USA)、500μM的每种dNTP(Applied Biosystems，USA)、10U SUPERase-In(Ambion，USA)、5U Klenow片段(3’→5’外切)酶(NEB，USA)和DEPC-处理过的H2O至总体积20μL。将热循环仪DYADTM(MJ ResearchDNA engine，USA)加热至37℃并用以下退火温度曲线循环：37℃30分钟、75℃20分钟，随后冷却至4℃。
2.通过RT-PCR的成熟miRNA的扩增，该PCR使用LNA-修饰的标签探针和能进行DNA-引发的RNA/DNA-指导的DNA合成的酶。
来自步骤nr1的引物延伸反应产物稀释至50μL的反应混合物，所述的反应混合物含有以下：60nM第二链LNA标签探针(EQ16624，表II)、200nM hsa-miR-15a反向引物2(EQ16445，表I)、400μM的每种dNTP、1×Qiagen OneStep RT-PCR缓冲液(Qiagen，USA)、2μL Qiagen OneStep RT-PCR Enzyme mix(含有OmniscriptTM逆转录酶、SensiScriptTM逆转录酶和HotStarTaqDNA聚合酶；dNTPs、缓冲液和酶购自Qiagen，USA)以及加入DEPC-处理过的H2O至终体积50μL。将热循环仪DYADTM(MJ Research DNA engine，USA)加热至50℃，并使用以下温度曲线进行循环：50℃30分钟、95℃15分钟和10个循环的95℃1分钟、55℃1分钟、72℃2分钟，随后冷却至4℃。
用miR-16RNA(EQ15886，表I)作为靶标代替miR-15a RNA靶标也重复该反应。作为阴性对照，在各个反应混合物中省去微RNA封闭标签探针、第二链LNA标签探针、hsa-miR-15a反向引物2、Klenow片段(3’→5’外切)酶或Qiagen One Step RT-PCR酶。
3.使用LNA-修饰的检测探针的miRNA实时定量PCR。
该实时PCR反应混合物(25μL)含有1×PCR缓冲液[含有Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、pH8.7(20℃)](Qiagen，Germany)、终浓度为4mM的MgCl2、200nM的每种dATP、dCTP、dGTP和600nMdUTP(Applied Biosystems，USA)；200nM hsa-miR-15a正向引物2(EQ16444，表II)、终浓度300nM的hsa-miR-15a反向引物2(EQ16445，表II)、250nM LNA检测探针(EQ15866，表I)、0.1×ROX参照染料(Invitrogen，USA)、5μL的1st和2nd链反应产物(如上描述)和1.25U HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)。循环程序：在Applied Biosystems 7500实时PCR系统(AppliedBiosystems，USA)中95℃10分钟、40个循环的95℃20秒、60℃1分钟。
将在其3’末端受到封闭的用于人miR-15a的LNA-修饰的微RNA标签探针EQ16695(1st链标签探针)用于标记成熟的miR-15a并通过使用miR-15a作为引物采用RNA-引发的DNA-指导的DNA聚合酶延伸。通过退火RT-引物进行逆转录反应并通过RNA/DNA-指导的DNA聚合酶反应延伸。最后，退火2nd链标签探针并通过DNA-指导的DNA聚合酶反应延伸。随后通过miR-15a微RNA的锚定PCR引物和LNA-修饰的双-标记检测探针(EQ16582，表II)，使用如上描述的实时PCR检测分别通过miR-15a引物延伸反应、逆转录和PCR产生的标记的人miRNA模板，用无模板作阴性对照。使用miR-15a微RNA模板的Ct值对于LNA-修饰的双-标记检测探针EQ16582是14.9(Fig.23)，而对于miR-16微RNA模板的Ct值是23.4，同时阴性对照试验的Ct值对于无微RNA封闭标签探针、无第二链LNA标签探针和无Klenow片段(3’→5’外切-)酶反应分别是32.3、27.7和29.9。阴性对照试验(无hsa-miR-15a反向引物2或无Qiagen OneStep RT-PCR Enzyme mix)没有获得可检测的Ct值。
实施例19
使用具有3′-封闭LNA-修饰的标签探针的微RNA为模板的RT-PCR反应物产生的成熟人miR-15a微RNA的实时定量PCR标准曲线。
将LNA-修饰的人miR-15a微RNA标签探针对EQ1695/EQ16624(实施例18中的对IX)用于如上描述的具有3’-封闭的LNA-修饰的标签探针的miR-15a为模板的RT-PCR(实施例18)，其中人miR-15a模板浓度分别是500、50、5、0.5或0.05fmol。随后通过用于miR-15a微RNA的锚定PCR引物和LNA-修饰的双-标记检测探针(EQ15866，表I)，使用如上描述的实时定量PCR检测miRNA-15a模板，负模板用作阴性对照。对于500、50、5、0.5和0.05fmol的miR-15a微RNA模板，Ct值分别是18.4、21.1、24.7、28.5和32.0，而对于无模板的阴性对照试验，Ct值是36.8。Ct值与最初的模板拷贝数的对数成反比例。因而，通过画出Ct值相对拷贝数的对数的曲线得到标准曲线，如Fig.24描绘的。通过线形回归分析确定其斜率和截距。滴定曲线的斜率为-3.45以及截距为27.4。
表IV：微RNA 3′-封闭标签探针的设计。
  EQ No.   名称   5’-末端   序列   3’-末端
  16858   P-hsa-miR-15a rt 5.1LNA   gaaacagctatgacatgmCacAaamC   P
  16859   P-hsa-miR-15a rt 5.2LNA   gaaacagctatgacatgmCacAaAmC   P
  16860   P-hsa-miR-15a rt 5.3LNA   gaaacagctatgacatgmCacAAamC   P
  16861   P-hsa-miR-15a rt 5.4LNA   gaaacagctatgacatgmCacAAAmC   P
  16862   hsa-miR-15a rt 5.5LNA   gaaacagctatgacatgmCacAaamCc
  16863   hsa-miR-15a rt 5.6LNA   gaaacagctatgacatgmCacAaamC
  16864   hsa-miR-15a rt 5.7LNA   gaaacagctatgacatgmCacAaAmC
  16865   hsa-miR-15a rt 5.8LNA   gaaacagctatgacatgmCacAAamC
  16866   hsa-miR-15a rt 5.9LNA   gaaacagctatgacatgmCacAAAmC
  16867   hsa-miR-15a rt 5.10LNA   gaaacagctatgacatgmCACAAAmC
  16868   hsa-miR-15a rt 5.11LNA   gaaacagctatgacatgmCAmCAAA
  16869   hsa-miR-15a rt 5.12LNA   gaaacagctatgacatgmCAmCAA
  16882   hsa-miR-15a rt 6.1LNA   gaaacagctatgacatgmCAmCAAAmCmCATT
  16883   hsa-miR-15a rt 6.2LNA   gaaacagctatgacatgmCAmCAAAmCmCAT
  16884   hsa-miR-15a rt 6.3LNA   gaaacagctatgacatgmCAmCAAAmCmCA
  16885   hsa-miR-15a rt 6.4LNA   gaaacagctatgacatgmCAmCAAAmCmC
aLNA(大写字母)、DNA(小写字母)、5-甲基C(mC)和磷酸(P)。计。
表V.用于实施例20中的U6 snRNA检测探针和实时PCR引物的设
  Oligo id(EQ No)   寡核苷酸名称   5’-末端   序列(5’-3’)a   3’-末端
  17159   U6 snRNA RT引物   tatggaacgcttcacgaatttgcg
  17160   U6 snRNA正向引物   cgcttcggcagcacatatac
  17167   U6 snRNA检测探针   6-Fitc   CAGGgGcmC#Q1z   P
aLNA(大写字母)、DNA(小写字母)、5-甲基C(mC)；荧光素(6-FITC(Glenn Research，Prod.Id.No.10-1964))、#Q1(如实施例8a中描述的制备)、z(5-硝酸吲哚(Glenn Research，Prod.Id.No.10-1044))、磷酸(P)。
实施例20
用于智人(Homo sapien)U6 snRNA的实时PCR。
1.U6 snRNA逆转录
逆转录(RT)反应在20μL反应物中进行，其含有1μg定量PCR人参考总RNA模板(Stratagene，USA)、5μg pd(N)6随机六聚体(Amersham Biosciences，Sweden)、1×第一链缓冲液(50mMTris-HCl、75mM KCl、3mM MgCl2、pH8.3，20℃下)(Invitrogen，USA)、10mM DTT(Invitrogen，USA)、1mM的每种dNTP(AppliedBiosystems，USA)、10U SUPERase-In(Ambion，USA)和200Usuperscript II逆转录酶(Invitrogen，USA)。混合参考总RNA模板和随机六聚体并在70℃加热5分钟并且在冰上淬灭。在热循环仪DYADTM(MJ Research DNA engine，USA)上的温度曲线是37℃下30分钟、42℃下90分钟并然后在4℃下保持。在Microcon YM-30Centrtfugal Filter Unit(Millipore，USA)上根据厂商说明书纯化第一链合成物。将离心后回收的样品稀释至5倍初始RT起始体积(总共100μL)。
2.使用LNA-修饰的检测探针的U6 snRNA实时PCR测定法。
反应物(50μL)是1×PCR缓冲液[Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、pH8.7(20℃)](Qiagen，Germany)、终浓度为4mM的MgCl2、200nM的每种dATP、dCTP、dGTP和600nM dUTP(Applied Biosystems，USA)；900nM U6 snRNA正向引物(EQ17160，表V)、900nM U6 snRNART引物(EQ17159，表V)、250nM LNA检测探针(EQ17167，表V)、0.1×ROX参照染料(Invitrogen，USA)、1或5μL的第一链合成(RT)反应产物(如上描述)和2.5U HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)。循环程序：在Applied Biosystems 7500实时PCR系统(Applied Biosystems，USA)中95℃下10分钟、40个循环的95℃下15秒、60℃下1分钟。
随后使用如上描述的实时PCR、人U6s nRNA的PCR引物和LNA-修饰的双-标记检测探针来检测U6 snRNA(目录号X59362，GenBank)RT反应物，负模板用作阴性对照。使用1或5μL U6 snRNA cDNA模板的Ct值对于LNA-修饰的双-标记的检测探针(EQ17167，表V)分别是28.0和25.6(Fig.25)，而对于阴性对照试验(无模板)没有获得可检测的Ct值。
实施例21
用于人miR-15a的实时RT-PCT，其使用：在3’-封闭的和5’-生物素-标记的LNA-修饰的捕获探针上进行微RNA-引发的延伸反应，在链霉抗生物素管中固定延伸产物，在溶液中进行逆转录酶反应，并使用LNA-修饰的检测探针进行实时PCR。
1.在3’-封闭的、5’-生物素-标记的LNA-修饰的捕获探针上进行微RNA-引发的延伸反应。
将Hsa miR-15a RNA(1fmol；EQ15885，表I)与1μg Torulla酵母RNA(Ambion，USA)和100fmol miR-15a捕获探针(EQ16879，表VI)混合于6μL的总体积中，在65℃下加热5分钟并在冰上淬灭，加入1μL 10×NEBuffer 2(New England Biolabs，USA)、1μL dNTPmix(1mM的每种dNTP；Applied Biosystems，USA)、20U SUPERase-In(Ambion，USA)和5U Klenow外切-(New England Biolabs，USA)。在37℃下继续孵育30分钟。
2.在链霉抗生物素管中固定
将1体积2×结合缓冲液(200mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、800mM LiCl、40mM EDTA)加入至Klenow exo-反应物并将上清液转移至链霉抗生物素包被的PCR管(Roche，Germany)。在37℃下孵育3分钟使得生物素-链霉抗生物素结合得以形成。通过在室温下五倍体积的洗涤缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、20mM LiCl)中洗涤三次除去未结合的材料。“立即进行RT反应”。
3.在溶液中的RT反应
将RT-引物(100fmol，EQ16994，表VI)和10nmol的每种dNTP(Applied Biosystems，USA)混合于12μL总体积中并加入至含有固定了的捕获探针和嵌合的RNA-DNA链的链霉抗生物素PCR管。在70℃下加热该管5分钟并将上清液移至冰上的新的管中。加入5×第一链缓冲液à(50mM Tris-HCl pH8.3(20℃)、75mM KCl、3mM MgCl2；Invitrogen，USA)、10x DTT(1x＝10mM，Invitrogen，USA)、20U SUPERase-In(Ambion，USA)和200U Superscript II逆转录酶(Invitrogen，USA)并在42℃下继续孵育1小时。70℃下加热15分钟来终止反应。
4.使用LNA-修饰的检测探针的实时PCR
反应物(50μL)是1×PCR缓冲液(Qiagen，Germany)、终浓度为4mM的MgCl2、0.2mM的每种dATP、dCTP、dGTP和0.6mM dUTP(Applied Biosystems，USA)、900nM miR-15a正向引物(EQ16990，表VI)、900nM miR反向引物(EQ16989，表VI)、250nM miR-15aLNA检测探针(EQ16992，表VI)、0.1×ROX参照染料(Invitrogen，USA)、1μL的第一链合成(RT)反应物(如上描述)、0.5U脲嘧啶DNA糖基化酶(Invitrogen，USA)和2.5U HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)。温度循环程序是：37℃下10分钟、95℃下10分钟、45℃下1分钟、60℃下1分钟，随后40个循环的95℃下20秒和60℃下1分钟。实时RT-PCR分析在ABI 7500实时PCR系统(Applied Biosystems，USA)上进行。
所述的反应的结果的Ct值是33.1。没有Torulla酵母RNA的反应产生的Ct值是33.3，而在步骤1中没有SUPERase-In的反应得到的Ct为32.1。没有hsa miR-15a RNA(EQ15885，表I)或没有miR-15a捕获探针(EQ16879，表VI)或没有Klenow外切-的阴性对照试验全部都没有得到Ct值。无模板对照(NTC)qPCR也没有得到Ct值。通过在琼脂糖凝胶上让实时RT-PCR反应的样品跑胶的终末点分析确证了该结果，即无Ct值对应于凝胶上缺少PCR扩增子。
表VI：用于实施例21-23的寡核苷酸
  EQ No.   寡核苷酸名称：   5′   连接物  序列(5’-3’)a  3′
  16879   Hsa miR-15a捕获探针   Bio   HEG2  tactgagtaatcgatatcmCacAaamCca  P
  16989   miR反向PCR引物  Caatttcacacaggatactgagt
  16990   Hsa miR-15a PCR引物  Agcggataactagcagcacata
  16992   miR-15a qPCR探针   6-Fitc  TTGTGGATAT#Q1z  P
  16994   miR RT引物  caatttcacacaggatactgagtaatcg
aLNA(大写字母)、DNA(小写字母)、荧光素(6-FITC(Glenn Research，Prod.Id.No.10-1964))、生物素(Bio(Glenn Research))、两个部分的六乙烯基乙二醇(HEG2(Glenn Research)、#Q1(如实施例8a中描述的制备)、z(5-硝基吲哚(Glenn Research，Prod.Id.No.10-1044))、磷酸(P)。
实施例22
用于系列稀释的人miR-15a的实时RT-PCT，其使用：在3’-封闭的和5’-生物素-标记的LNA-修饰的捕获探针上进行微RNA-引发的延伸反应，在链霉抗生物素管中固定延伸产物，在溶液中进行逆转录酶(RT)反应，并使用LNA-修饰的检测探针进行实时PCR。
1.在3’-封闭的、5’-生物素-标记的LNA-修饰的捕获探针上进行微RNA-引发的延伸反应。
在7μL的总体积中将Hsa miR-15a RNA(100fmol，10 fmol，1fmol，100amol或10amol；EQ15885，表I)与1μg Torulla酵母RNA(Ambion，USA)与100fmol miR-15a捕获探针(EQ16879，表VI)混合，在65℃下加热5分钟并在冰上冷却。加入1μL 10×NEBuffer2(New England Biolabs，USA)、1μL dNTP mix(1mM的每种dNTP；Applied Biosystems，USA)和5U Klenow外切-(New England Biolabs，USA)。在37℃下继续孵育30分钟。
2.在链霉抗生物素管中固定
将1体积2×结合缓冲液(200mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、800mM LiCl、40mM EDTA)加入至Klenow exo-反应物并将上清液转移至链霉抗生物素包被的PCR管(Roche，Germany)。在37℃下孵育3分钟使得生物素-链霉抗生物素结合得以形成。通过在室温下五倍体积的洗涤缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、20mM LiCl)中洗涤三次除去未结合的材料。
3.在溶液中的RT反应
将RT-引物(100fmol，EQ 16994，表VI)和10nmol的每种dNTP(Applied Biosystems，USA)混合于12μL总体积中并加入至含有固定了的捕获探针和嵌合的RNA-DNA链的链霉抗生物素PCR管。在70℃下加热5分钟并将上清液移至冰上的新的管中。加入5×第一链缓冲液à(50mM Tris-HCl pH8.3(20℃)、75mM KCl、3mM MgCl2；Invitrogen，USA)、10x DTT(1x＝10mM，Invitrogen，USA)、20U SUPERase-In(Ambion，USA)和200U Superscript II逆转录酶(Invitrogen，UsA)并在42℃下继续孵育1小时。70℃下加热15分钟来终止反应。
4.使用LNA-修饰的检测探针的实时PCR
反应物(50μL)是1×PCR缓冲液(Qiagen，Germany)、终浓度为4mM的MgCl2、0.2mM的每种dATP、dCTP、dGTP和0.6mM dUTP(Applied Biosystems，USA)、900nM miR-15a正向引物(EQ16990，表VI)、900nM miR反向引物(EQ16989，表VI)、250nM miR-15aLNA检测探针(EQ16992，表VI)、0.1×ROX参照染料(Invitrogen，USA)、1μL的第一链合成(RT)反应物(如上描述)、0.5U尿嘧啶DNA糖基化酶(Invitrogen，USA)和2.5U HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)。温度循环程序是：37℃下10分钟、95℃下10分钟、45℃下1分钟、60℃下1分钟，随后40个循环的95℃下20秒和60℃下1分钟。实时RT-PCR分析在ABI 7500实时PCR系统(Applied Biosystems，USA)上进行。
所述反应的结果是对于100fmol、10fmol、1fmol、100amol和10amol hsa miR-15a RNA(EQ15885，表I)加入物Ct值分别是24.0、27.6、31.1、34.8和37.0。没有hsa miR-15a RNA(EQ15885，表I)的阴性对照实验无Ct值。无模板对照(NTC)qPCR也没有得到Ct值。10amol hsa miR-15a RNA(EQ15885，表I)的加入物对应50μL实时RT-PCR混合物中的10fM或更低浓度。通过在琼脂糖凝胶上让实时RT-PCR反应的样品跑胶的终末点分析确证了该结果，即无Ct值对应于凝胶上缺少PCR扩增子。
实施例23
人miR-15a的实时RT-PCT，其使用：在3’-封闭和5’-生物素-标记的LNA-修饰的捕获探针上进行微RNA-引发的延伸反应，在链霉抗生物素珠上固定延伸产物，在溶液中进行逆转录酶(RT)反应，并使用LNA-修饰的检测探针进行实时PCR。
1.在3’-封闭的、5’-生物素-标记的LNA-修饰的捕获探针上进行微RNA-引发的延伸反应。
在7μL的总体积中将Hsa miR-15a RNA(1fmol；EQ15885，表I)与1μg Torulla酵母RNA(Ambion，USA)与100fmol miR-15a捕获探针(EQ16879，表VI)混合，在65℃下加热5分钟并在冰上冷却。加入1μL 10×NEBuffer 2(New England Biolabs，USA)、1μL dNTPmix(每种1mM；Applied Biosystems，USA)和5U Klenow外切-(New England Biolabs，USA)。在37℃下继续孵育30分钟。
2.固定于链霉抗生物素珠上
加入1体积(10μL)含有10μg Dynabeads M-270链霉抗生物素的2×结合缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、2M NaCl、1mM EDTA(Dynal Biotech，Norway)至Klenow外切-反应物并在20℃下伴随旋转孵育10分钟以使得生物素-链霉抗生物素结合得以形成。将管置于磁性粒子浓缩器(Dynal MPC-9600；Dynal Biotech，Norway)中。除去上清液并在100μL洗涤缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、20mM NaCl)中将珠洗涤三次。“立即进行RT反应”。
3.在溶液中的RT反应
将RT-引物(100fmol，EQ16994，表VI)和10nmol的每种dNTP(Applied Biosystems，USA)混合于12μL总体积中并加入至含有固定了的捕获探针和嵌合的RNA-DNA链的管中。在70℃下加热5分钟；转移至磁性粒子浓缩器并将上清液移至冰上的新的管中。加入5×第一链缓冲液à(50mM Tris-HCl pH8.3(20℃)、75mM KCl、3mMMgCl2；Invitrogen，USA)、10x DTT(1x＝10mM，Invitrogen，USA)、20U SUPERase-In(Ambion，USA)和200U Superscript II逆转录酶(Invitrogen，USA)并在42℃下继续孵育1小时。70℃下加热15分钟来终止反应。
4.使用LNA-修饰的检测探针的实时PCR
反应物(50μL)是1×PCR缓冲液(Qiagen，Germany)、终浓度为4mM的MgCl2、0.2mM的每种dATP、dCTP、dGTP和0.6mM dUTP(Applied Biosystems，USA)、900nM miR-15a正向引物(EQ16990，表VI)、900nM miR反向引物(EQ16989，表VI)、250nM miR-15aLNA检测探针(EQ16992，表VI)、0.1×ROX参照染料(Invitrogen，USA)、5μL的第一链合成(RT)反应物(如上描述)、0.5U尿嘧啶DNA糖基化酶(Invitrogen，USA)和2.5U HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)。温度循环程序是：37℃下10分钟、95℃下10分钟、45℃下1分钟、60℃下1分钟，随后40个循环的95℃下20秒和60℃下1分钟。实时RT-PCR分析在ABI 7500实时PCR系统(Applied Biosystems，USA)上进行。
所述的反应的结果的Ct值是28.0。无模板对照(NTC)qPCR没有得到Ct值。
实施例24
用于人miR-7a的实时定量PCR，其使用由含有5’-生物素的LNA-修饰的捕获探针引发的固体支持物上的逆转录反应，该逆转录反应后是使用LNA-修饰的检测探针的实时PCR。
1.在5’-生物素标记的LNA-修饰的捕获探针上进行微RNA-引发的延伸反应。
在10μL的总体中混合以下物质：Hsa miR-7a RNA(10fmol；EQ16898，表VII)、1μg Torulla酵母RNA(Ambion，USA)和100fmolmiR-7a捕获探针(EQ 17367，表VII)、1μL 10×NEBuffer 2(NewEngland Biolabs，USA)、1μL dNTP mix(1mM的每种dNTP；AppliedBiosystems，USA)和5U Klenow外切-(New England Biolabs，USA)。在37℃下孵育混合物30分钟。
2.在链霉抗生物素管中固定
将2.5μL 5×结合缓冲液(500mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、2M LiCl、100mM EDTA)加入至Klenow exo-反应物并将上清液转移至链霉抗生物素包被的PCR管(Roche，Germany)。在37℃下孵育3分钟使得生物素-链霉抗生物素结合得以形成。通过在室温下100μL的洗涤缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、20mM LiCl)中洗涤5次除去未结合的材料。
3.RT反应
将20μL的以下RT反应混合物加入至含有固定了的捕获探针和嵌合RNA-DNA链的链霉抗生物素包被的PCR管中：1×第一链缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.3(20℃)、75mM KCl、3mM MgCl2；Invitrogen，USA)、10mM DTT(Invitrogen，USA)、1.25mM的每种dNTP(AppliedBiosystems，USA)、20U SUPERase-In(Ambion，USA)和200USuperscript II逆转录酶(Invitrogen，USA)，42℃下孵育1小时。
4.预-PCR
移出RT-混合物并用20μL的PCR主混合物替换，该PCR主混合物含有各0.4μM的1×Quantitect Probe PCR Master Mix(Qiagen，USA)正向和反向引物(EQ17372 & EQ17374，表VII)、1U尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG，Roche，Germany)。让预-PCR接受以下条件：95℃下15分钟、30℃下1分钟、40℃下1分钟、60℃下1分钟和10个循环的94℃下20秒和60℃下1分钟。将反应物保持在4℃直到进行实时PCR。然后，在用于实时PCR前将80μL DEPC-H2O加入至预-PCR反应物中。
5.使用LNA-修饰的检测探针的实时PCR
50μL实时PCR mix含有每种0.4μM的1x Quantitect Probe PCRMaster Mix(Qiagen)正向和反向引物(EQ17372 & EQ17374，表VII)、0.2μM miR-7a LNA检测探针(EQ17377，表VII)、1U UNG(Roche，Germany)以及5μL的稀释的第一链合成(RT)-预-PCR反应产物(如上描述的)。温度循环程序是：95℃下15分钟和40个循环的94℃下20秒& 60℃下1分钟。实时PCR在Opticon实时PCR仪(MJResearch，USA)上进行。
结果。
该实时PCR产生具有足够量的信号的S型扩增曲线(Fig.26)，Ct值是18.5。获得的Ct值对于用于当前试验的Hsa-miR-7a的量是现实的并表明本测定法的完全功能性。
表VII：用于实施例24中的寡核苷酸
  EQ No.   寡核苷酸名称：   5′   序列(5’-3’)a  3′
  16898   hsa-let-7a   ugagguaguagguuguauaguu
  16899   hsa-1et-7f   ugagguaguagauuguauaguu
  16917   hsa-let-7g   ugagguaguaguuuguacagu
  17367   cP5_hsa-let-7a捕获探针   Bio   gttgaggatggatggtaggatgagtaactAtAmCaA
  17372   hsa-let-7a_qPcR-F-引物3   agaatggatggatctgaggtagt
  17374   hsa-let-7a_qPcR-R-引物1   aggatggatggtaggatgagt
  17375   hsa-let-7aqPcR-R-引物2   gttgaggatggatggtaggat
  17377   hsa-let-7a_qPcR-Probe2   6-Fitc   AcTATAmCAAmCmCT#Q1z  P
  18089   hsa-let-7a_qPcR-Probe2_Q2   6-Fitc   acTATAmCAAmCmCT#Q2z  P
aLNA(大写字母)、DNA(小写字母)、RNA(斜体和小写字母)、5-甲基C(mC)；荧光素(6-FITC(Glenn Research，Prod.Id.No.10-1964))、生物素(Bio(Glenn Research))、#Q1(如实施例8a中描述的制备)、#Q2(如实施例8b中描述的制备)、z(5-硝基吲哚(Glenn Research，Prod.Id.No.10-1044))、磷酸(P)。
实施例25
双标记的寡核苷酸探针的合成、去保护和纯化
表I、II和V-VII的双标记寡核苷酸探针即EQ15866、EQ15867、EQ16580-16583、EQ16679、EQ17167、EQ16879、EQ16992、EQ17367和EQ17377在自动化DNA合成仪(Expedite 8909 DNA合成仪，PerSeptiveBiosystems，0.2μmol量级)上使用亚磷酰胺方法(Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Lett.22：1859-1862，1981)用2-氰基乙基保护的LNA和DNA亚磷酰胺(Sinha等，Tetrahedron Lett.24：5843-5846，1983)制备。与DNA亚磷酰胺相比，对LNA亚磷酰胺修改合成循环(250s偶联时间)。在偶联步骤中将1H-四唑或4，5-二氰基咪唑(Proligo，Hamburg，Germany)用作活化剂。
用32％的氨水将寡核苷酸去保护(室温下1小时，然后60℃下2小时)并通过HPLC纯化(Shimadzu-SpectraChrom系列；XterraTM RP18柱，10m 7.8×150mm(Waters)。缓冲液：A：0.05M三乙基醋酸铵pH7.4。B.水中50％的乙腈。洗脱：0-25分钟：10-80％B；25-30分钟：80％B)。寡核苷酸的组成和纯度通过MALDI-MS(PerSeptiveBiosystem，Voyager DE-PRO)分析检验。
实施例26
人hsa-Let-7a的实时RT-PCT，其使用：在3’-封闭的和5’-生物素-标记的LNA-修饰的捕获探针上进行微RNA-引发的延伸反应，在链霉抗生物素管中固定延伸产物，在溶液中进行逆转录酶反应，并使用具有淬灭基团Q2的LNA-修饰的检测探针进行实时PCR。
1.在3’-封闭的、5’-生物素-标记的LNA-修饰的捕获探针上进行微RNA-引发的延伸反应。
将Hsa Let-7a RNA(10fmol；EQ16898，表VII)与1μg Torulla酵母RNA(Ambion，USA)和100fmol cP5_hsa-let-7a捕获探针(EQ17367，表VII)、1μL 10×NEBuffer 2(New England Biolabs，USA)、1μL dNTP mix(1mM的每种dNTP；Applied Biosystems，USA)和5U Klenow外切-(New England Biolabs，USA)混合，总体积为10μL。在37℃下进行孵育30分钟。
2.在链霉抗生物素管中固定
将2.5μL 5×结合缓冲液(500mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、2M LiCl、100mM EDTA)加入至Klenow exo-反应物并将混合物转移至链霉抗生物素包被的PCR管(Roche，Germany)底部。在37℃下孵育3分钟使得生物素-链霉抗生物素结合得以形成。通过在室温下100μL的洗涤缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、20mM LiCl)中洗涤5次除去未结合的材料。将洗涤过的管立即接受逆转录反应。
3.在溶液中的RT反应
将RT-引物(1μl 100fmol/μl，EQ17374，表VII)和2.5dNTP(10mM的每种dNTP，Applied Biosystems，USA)混合于12μL总体积中并加入至含有固定了的捕获探针和嵌合的RNA-DNA链的链霉抗生物素PCR管。在70℃下加热5分钟并将上清液移至冰上的新的管中。加入4μl的5×第一链缓冲液(250mM Tris-HCl pH8.3(20℃)、375mM KCl、15mM MgCl2；Invitrogen，USA)、2μl 100mM的DTT(Invitrogen，USA)、1μl 20U/μl SUPERase-In(Ambion，USA)和1μl 200U/μl的Superscript II逆转录酶(Invitrogen，USA)并在42℃下继续孵育1小时。70℃下加热15分钟来终止反应。通过加入80μL的DEPC H2O将总体积调节至100μL。
4.使用LNA-修饰的检测探针的实时PCR
反应物(50μL)是1×QuantiTect Probe PCR Master Mix(Qiagen，Ge rmany)、400nM hsa-let-7a_qPcR-F-引物3(EQ17372，表VII)、400nM hsa-let-7a qPcR-R-引物2(EQ17375，表VII)、200nMhsa-let-7a_qPcR-Probe2_Q2检测探针(EQ18089，表VII)、5μL的第一链合成(RT)反应物(如上描述)和0.5U尿嘧啶DNA糖基化酶(Invitrogen，USA)。温度循环程序是：37℃下10分钟、95℃下15分钟、30℃下1分钟、40℃下1分钟，60℃下1分钟，随后40个循环的95℃下20秒和60℃下1分钟。实时RT-PCR分析在Opticon实时PCR仪(MJ Research，USA)上进行。
5.结果。
重复试验3次，获得的平均Ct值是19.0，CV为0.01。没有加入hsa Let-7a miRNA的试验重复三次都没有产生信号，并没获得Ct值。
实施例27
前体pre-miRNA hsa Let-7a的制备
1.体外转录
a.将T7启动子/前导寡核苷酸(EQ18219，见表VIII)与hsa-let-7a-1前体longmer DNA寡核苷酸(EQ18213，见表VIII)混合，每种寡核苷酸的终浓度是20μM。
b.将样品在95℃下加热5分钟并让该溶液在实验台上冷却至室温。
c.将8μL上面的溶液在普通的20-μL MegaScript反应物(Ambion，USA)中用作模板，所述的反应物含有ATP、GTP、CTP、UTP、反应缓冲液和酶mix。
d.将反应物在37℃下过夜孵育。
e.加入1μL DNA酶并在37℃下将反应物孵育15分钟。
f.在RNeasy min Elute Cleanup离心柱上使用经修改的用于miRNA清除的方法纯化体外转录的前体pre-miRNA。
表VIII：用于实施例27中的寡核苷酸
  EQ No.   寡核苷酸名称：  5′   序列(5’-3’)  3′
  18213   hsa-let 7a-1前体longmer   aagacagtagattgtatagttatctcccagtggtgggtgtgaccctaaaactatacaacctactacctcatctccctatagtgagtcgtattaaatt
  18219   T7启动子/前导序列   aatttaatacgactcactatagggaga
2：经修改的用于前体miRNA清除的方法
1.加入350μl缓冲液RLT至样品中，并通过涡旋振荡完全混合。
2.加入1体积的80％乙醇(350μl)，并通过涡旋振荡完全混合。不离心。立即进行步骤3。
3.吸移样品(包括可能形成了的任何沉淀)至置于2ml收集管中的RNeasy Mini离心柱中。轻轻盖上盖子，在8000×g下离心15秒。
4.弃去RNeasy Mini离心柱
5.吸移来自步骤3的流质(含有miRNA)至2ml反应管中。
6.加入1.4体积的100％乙醇(980μl)，并通过涡旋振荡完全混合。不离心。立即进行步骤7。
7.将700μl的样品吸移至置于2ml收集管中的RNeasyMinElute离心柱中。轻轻盖上盖子，在8000×g下离心15秒。弃去流质。重复步骤7直至已经将全部样品吸移进离心柱中。每次弃去流质。
8.将500l缓冲液RPE吸移至RNeasy MinElute离心柱中。轻轻盖上盖子，在8000×g下离心15秒。弃去流质。
9.将500μl 80％的乙醇吸移至RNeasy MinElute离心柱中。轻轻盖上盖子，在8000×g下离心15秒。弃去流质和收集管。
10.将RNeasy MinElute离心柱置于2ml收集管中。打开盖子，并在8000×g下离心1分钟。
11.将RNeasy MinElute离心柱置于1.5ml收集管中，并将14μl无RNA酶的水吸移至离心柱膜上。轻轻盖上盖子，在8000×g下离心1分钟来洗脱miRNA。
在OD260下测量miRNA洗脱物的浓度，随后通过将其稀释于DEPC H2O水中达到10nM的终浓度(10fmol/μL)。
实施例28
用于相对于人hsa-Let-7a前体而选择性检测成熟的人hsa-Let-7a的实时RT-PCT，其使用：在3’-封闭的和5’-生物素-标记的LNA-修饰的捕获探针上进行微RNA-引发的延伸反应，在链霉抗生物素管中固定延伸产物，在溶液中进行逆转录酶反应，并使用具有淬灭基团Q2的LNA-修饰的检测探针进行实时PCR。
1.在3’-封闭的、5’-生物素-标记的LNA-修饰的捕获探针上进行微RNA-引发的延伸反应。
将miRNA hsa Let-7a(10fmol；EQ16898，表VII)和/或前体pre-miRNA hsa Let-7a(10fmol；如实施例27中描述的产生)与1μgTorulla酵母RNA(Ambion，USA)和100fmol cP5_hsa-let-7a捕获探针(EQ17367，表VII)、1μL 10×NEBuffer 2(New England Biolabs，USA)、1μL dNTP mix(1mM的每种dNTP；Applied Biosystems，USA)和5U Klenow外切-(New England Biolabs，USA)混合，总体积为10μL。在37℃下进行孵育30分钟。
2.在链霉抗生物素管中固定
将2.5μL 5×结合缓冲液(500mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、2M LiCl、100mM EDTA)加入至Klenow exo-反应物并将混合物转移至链霉抗生物素包被的PCR管(Roche，Germany)底部。在37℃下孵育3分钟使得生物素-链霉抗生物素结合得以形成。通过在室温下100μL的洗涤缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、20mM LiCl)中洗涤5次除去未结合的材料。将洗涤过的管立即接受逆转录反应。
3.在溶液中的RT反应
将RT-引物(1μl 100fmol/μl，EQ17374，表VII)和2.5μl dNTP(10mM的每种dNTP，Applied Biosystems，USA)混合于12μL总体积中并加入至含有固定了的捕获探针和嵌合的RNA-DNA链的链霉抗生物素PCR管。在70℃下加热5分钟并将上清液移至冰上的新的管中。加入4μl的5×第一链缓冲液(250mM Tris-HCl pH8.3(20℃)、375mM KCl、15mM MgCl2；Invitrogen，USA)、2μl 100mM的DTT(Invitrogen，USA)、1μl 20U/μl SUPERase-In(Ambion，USA)和1μl 200U/μl的Superscript II逆转录酶(Invitrogen，USA)并在42℃下继续孵育1小时。70℃下加热15分钟来终止反应。通过加入80μL的DEPC H2O将总体积调节至100μL。
4.使用LNA-修饰的检测探针的实时PCR
反应物(50μL)是1×QuantiTect Probe PCR Master Mix(Qiagen，Germany)、400nM hsa-let-7a_qPcR-F-引物3(EQ17372，表VII)、400nM hsa-let-7a qPcR-R-引物2(EQ17375，表VII)、200nMhsa-let-7a_qPcR-Probe2_Q2检测探针(EQ18089，表VII)、5μL的第一链合成(RT)反应物(如上描述)和0.5U尿嘧啶DNA糖基化酶(Invitrogen，USA)。温度循环程序是：37℃下10分钟、95℃下15分钟、30℃下1分钟、40℃下1分钟，60℃下1分钟，随后40个循环的94℃下20秒和60℃下1分钟。实时RT-PCR分析在Opticon实时PCR仪(MJ Research，USA)上进行。
5.结果。
通过对成熟miRNA hsa Let-7a和/或pre-miRNA hsa Let-7a进行如上描述的测定法获得以下Ct值(表IX)。
表IX
  加入的RNA  加入的RNA的量   Ct值
  miRNA hsa Let-7a  10fmol   17.0
  pre-miRNA hsa Let-7a  10fmol   28.9
  miRNA hsa Let-7a & pre-miRNA hsa Let-7a  每种10fmol   17.7
  无miRNA或pre-miRNA  -   无
在成熟的和前体hsa-let-7a miRNA之间的Ct值有11.8的差异(ΔCt)。11.8的ΔCt对应于该测定法对成熟hsa-let-7a miRNA的灵敏性相对于前体要高1000-10,000倍，这表明了该测定法区分这两种miRNA的能力。因此，当仅检测成熟hsa-let-7a miRNA或检测以等摩尔浓度存在的成熟的hsa-let-7a miRNA加上前体hsa-let-7a miRNA时获得十分相似的Ct值。当没有加入miRNA而进行该测定法时没有获得信号和Ct值。当没有加入RT反应物或当模板由用于hsa-let-7amiRNA的前体体外转录的寡核苷酸-模板组成时在qPCR中获得很少的或没有获得信号(结果没有显示)。同样，当加入至qPCR的模板由RT(如上面描述的进行但使用前体hsa-let-7a miRNA作为模板)组成时，即忽略微RNA-引发的延伸反应步骤(结果没有显示)时获得很少或没有获得信号。
实施例29
用于相对于十分相关的miRNAs hsa-Let-7f和hsa-Let-7g而选择性检测hsa-let-7a的实时RT-PCT，其使用：在3’-封闭的和5’-生物素-标记的LNA-修饰的捕获探针上进行微RNA-引发的延伸反应，在链霉抗生物素管中固定延伸产物，在溶液中进行逆转录酶反应，并使用具有淬灭基团Q2的LNA-修饰的检测探针进行实时PCR。
1.在3’-封闭的、5’-生物素-标记的LNA-修饰的捕获探针上进行微RNA-引发的延伸反应。
将10fmol hsa Let-7a miRNA、hsa Let-7f miRNA或hsa Let-7gmiRNA(分别是EQ16898、EQ16899和EQ16917-表VII)与1μg Torulla酵母RNA(Ambion，USA)、100fmol cP5_hsa-let-7a捕获探针(EQ17367，表VII)、1μL 10×NEBuffer 2(New Engl and Biolabs，USA)、1μL dNTP mix(1mM的每种dNTP；Applied Biosystems，USA)和5U Klenow外切-(New England Biolabs，USA)混合，总体积为10μL。在37℃下进行孵育30分钟。
2.在链霉抗生物素管中固定
将2.5μL 5×结合缓冲液(500mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、2M LiCl、100mM EDTA)加入至Klenow exo-反应物并将混合物转移至链霉抗生物素包被的PCR管(Roche，Germany)底部。在37℃下孵育3分钟使得生物素-链霉抗生物素结合得以形成。通过在室温下100μL的洗涤缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5(20℃)、20mM LiCl)中洗涤5次除去未结合的材料。将洗涤过的管立即接受逆转录反应。
3.在溶液中的RT反应
将RT-引物(1μl 100fmol/μl，EQ17374，表VII)和2.5μ1dNTP(10mM的每种dNTP，Applied Biosystems，USA)混合于12μL总体积中并加入至含有固定了的捕获探针和嵌合的RNA-DNA链的链霉抗生物素PCR管。在70℃下加热5分钟并将上清液移至冰上的新的管中。加入4μl的5×第一链缓冲液(250mM Tris-HCl pH8.3(20℃)、375mM KCl、15mM MgCl2；Invitrogen，USA)、2μl 100mM的DTT(Invitrogen，USA)、1μl 20U/μl SUPERase-In(Ambion，USA)和1μl 200U/μl的Superscript II逆转录酶(Invitrogen，USA)并在42℃下继续孵育1小时。70℃下加热15分钟来终止反应。通过加入80μL的DEPC H2O将总体积调节至100μL。
4.使用LNA-修饰的检测探针的实时PCR
反应物(50μL)是1×QuantiTectProbe PCR Master Mix(Qiagen，Germany)、400nM hsa-let-7a_qPcR-F-引物3(EQ17372，表VII)、400nM hsa-let-7a qPcR-R-引物2(EQ17375，表VII)、200nMhsa-let-7a_qPcR-Probe2_Q2检测探针(EQ18089，表VII)、5μL的第一链合成(RT)反应物(如上描述)和0.5U尿嘧啶DNA糖基化酶(Invitrogen，USA)。温度循环程序是：37℃下10分钟、95℃下15分钟、30℃下1分钟、40℃下1分钟，60℃下1分钟，随后40个循环的94℃下20秒和60℃下1分钟。实时RT-PCR分析在Opticon实时PCR仪(MJ Research，USA)上进行。
5.结果。
用hsa Let-7a miRNA作为模板在hsa Let-7a miRNA测定法中获得20.4的Ct值。在其中将hsa Let-7f miRNA和hsa Let-7g miRNA用作模板的测定法中没有信号产生以及没有获得Ct值。同样，从其中没有加入miRNA的测定法或从其中没有加入RT作为模板的测定法中没有获得信号和没有获得Ct值。这表明，该测定法能有区别性地检测hsa-let-7a miRNA而不是十分同源的miRNA hsa Let-7f miRNA和hsaLet-7g miRNA，其中let-7a和hsa Let-7f miRNA之间的唯一不同是从G到A的单个核苷酸改变。
实施例30
hsa-mir-143的实时RT-PCR定量，其使用捕获/RT-探针的两步延伸，要研究的微RNA作为第一模板以及人造辅助寡核苷酸作为第二模板，随后使用LNA修饰的双-标记检测探针通过扩增完全延伸的捕获/RT-探针进行实时PCR定量。
当miRNA位于茎-环分子的下面的链时，通过Dicer酶加工产生成熟miR的独特5’-末端，而pre-miR和成熟miR的3’-末端是相同的。
该实施例按照Fig.31设计的测定法进行。
两种捕获/RT-探针延伸反应在使用“One Step RT/PCR mix”的相同反应混合物中进行。该反应混合物因而含有微RNA、捕获/RT-探针、逆转录酶、3’-磷酸化的和5’-生物素化的人造辅助模板(helpertemplate)以及Taq-聚合酶。
在2-步捕获/RT-探针延伸后，然后将一等分的该反应混合物用作实时PCR定量反应中的加入物。
1.2-步捕获/RT-探针延伸反应混合物。
在具有25μL总体积的反应混合物中，将以下物质混合：hsa-mir-143微RNA(1fmol；EQ16900，表X)、1μg Torulla酵母RNA(Ambion，USA)、hsa-Rim-143_CP5_NoBio(125fmol；EQ18080，表X)、hsa-Rim-143_AT_Bio(6.25pmol；EQ18079，表X)、dNTP mix(终浓度0.2mM的每种dNTP；Applied Biosystems，USA)、1×QiagenOneStep RT-PCR缓冲液(Qiagen，Germany)、1×Qiagen OneStep RT-PCREnzyme Mix和DEPC处理的水(Ambion，USA)。
进行“无-miR”对照，该对照省去了微RNA(hsa-mir-143，表X)。
使用DNA Engine Dyad热循环仪(MJ Research，USA)让反应混合物接受以下的温度循环程序：
逆转录：         60℃30分钟
Taq的活化：      95℃15分钟
捕获探针延伸：   10个循环的(95℃下20秒+60℃下30秒)
冷却：           4℃.
在进一步处理前将反应混合物立即用75μL DEPC处理的水(Ambion，USA)稀释。
2.通过结合至链霉抗生物素将人造辅助寡核苷酸从反应混合物中除去。
将一等份20μL的每种从上面步骤1获得的反应混合物与1μLImmunoPure固定的链霉抗生物素(Pierce)混合，涡旋振荡并在37℃下孵育5分钟并通过离心柱(Harvard Apparatus)离心。
3.使用LNA修饰的双-标记检测探针的实时PCR定量
在具有25μL总体积的反应混合物中，将以下混合：hsa-Rim-143_引物2(0.5μM终浓度，EQ17724，表X)，hsa-miR-143_引物143_C2(0.5μM终浓度，EQ17574，表X)、hsa-Rim-143_P4(0.25μM终浓度，EQ18057，表X)、1×TaqManUniversalPCRMaster Mix(Applied Biosystems，USA)、2.5μL来自上面步骤1或步骤2的经稀释的反应混合物和DEPC处理的水。
使用ABI 7500实时PCR系统(Applied Biosystems，USA)让反应混合物接受以下的温度循环程序：
Taq的活化：95℃15分钟
PCR扩增：40个循环的(95℃下20秒+60℃下30秒)
对于没有在步骤2中纯化的含有微RNA的样品上述反应的结果是Ct值为37，以及对于相应的包括了在步骤2中的纯化的样品Ct值是36。两个相应的“无miR”-对照都没有得到任何在40个循环内的Ct值。见Fig.32。
表X：用于实施例Rim中的寡核苷酸
  EQ No.   寡核苷酸名称：   5′   序列(5’-3’)a  3′
  16900   hsa-mir-143   ugagaugaagcacuguagcuca
  18080   hsa-Rim-143CP5_NoBio   ctgatagagctttgcgtccactgattGagmCtamCagt
  18079   hsa-Rim-143_AT_Bio   Bio   tgaatccgaatctaacgttgcctaggctgagatgaagcact  P
  17724   hsa-Rim-143_引物2   tgaatccgaatctaacgttgc
  17574   hsa-miR-143_引物143_C2   ctgatagagctttgcgtcca
  18057   hsa-Rim-143_P4   6-FITC   aGmCTAmCAGT#Q2z  P
aLNA(大写字母)、DNA(小写字母)、荧光素(6-FITC(Glenn Research，Prod.Id.No.10-1964))、生物素(Bio(Glenn Research))、两个部分的六乙二醇(HEG2(Glenn Research))、#Q2(如实施例8b中描述的制备)、z(5-硝基吲哚(G1enn Research，Prod.Id.No.10-1044))、磷酸(P)。
实施例31
用于相对密切相关的hsa-Let-7g而选择性检测hsa-let-7a的实时RT-PCR，其使用：将RNA接头连接至成熟的微RNA，随后进行逆转录，并使用具有淬灭基团Q2的LNA-修饰的检测探针进行实时PCR。
在该实施例中采用的方法一般是如Fig.36中描述。
1.将RNA接头连接至成熟的微RNA。
将10fmol hsa Let-7a miRNA或hsa Let-7g miRNA(分别是EQ16898和EQ16917-表VII)与20fmol RNA接头(EQ18557；表XI)和40U的T4RNA连接酶(New England Biolabs，USA)混合于20μL的总体积中，其还包括1×T4RNA连接酶缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.8(25℃)、10mM MgCl2、1mM ATP和10mM二硫苏糖醇)。在37℃下进行连接反应15分钟。65℃下加热15分钟来终止反应。
2.RT反应
逆转录反应在50μL反应物中进行，反应物组成为2μMRT-引物(EQ17374，表VII)和500μM的每种dNTP(Applied Biosystems，USA)、1×第一链缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.3(20℃)、75mMKCl、3mM MgCl2；Invitrogen，USA)、10mM DTT(Invitrogen，USA)、60U SUPERase-In(Ambion，USA)、500U Superscript II逆转录酶(Invitrogen，USA)和20μL的如上描述的连接混合物。逆转录反应在42℃下进行1小时。70℃下加热15分钟来终止反应。
4.使用LNA-修饰的检测探针的实时PCR
反应物(50μL)是1×PCR缓冲液(Qiagen，Germany)、终浓度为4mM的MgCl2、0.2mM的每种dATP、dCTP、dGTP和0.6mM dUTP(Applied Biosystems，USA)、900nM hsa-let-7a_qPcR-F-引物3(EQ17372，表VII)、900nM hsa-let-7a qPcR-R-引物2(EQ17375，表VII)、250nM hsa-let-7a_qPcR-Probe2_Q2检测探针(EQ18089，表VII)、0.1×ROX参照染料(Invitrogen，USA)、2.5μL的第一链合成(RT)反应物(如上描述)、0.5U尿嘧啶DNA糖基化酶(Invitrogen，USA)和2.5U HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen，Germany)。温度循环程序是：37℃下10分钟、95℃下10分钟、随后40个循环的95℃下20秒和60℃下1分钟。实时RT-PCR分析在ABI 7500实时PCR系统(Applied Biosystems，USA)上进行。
5.结果。
用hsa Let-7a miRNA作为模板在hsa Let-7a miRNA测定法中获得27.1的Ct值(Fig.35)。在其中将hsa Let-7g miRNA用作模板的测定法中没有信号产生并且没有获得Ct值。同样，从其中没有加入miRNA的测定法或从其中没有加入RT作为模板的qPCR中没有获得信号也没有获得Ct值。表明该检测法有能力区分检测hsa-let-7a miRNA而不是相近的miRNA类似物hsa Let-7g。
表XI：用于连接的寡核苷酸。
  EQ No.   寡核苷酸名称：  5′   序列(5’-3’)a  3′
  18557   RNA接头  P   acucauccuaccauccauccu  P
RNA(斜体字和小写字母)和磷酸(P)。
实施例32
用于相对于密切相关的miRNA hsa-Let-7g而选择性检测hsa-let-7a的实时RT-PCR，其使用：使用“桥连”核酸序列(连接辅助寡核苷酸)将RNA寡核苷酸连接至成熟的微RNA，随后进行逆转录，并使用具有淬灭基团Q2的LNA-修饰的检测探针进行实时PCR。
以下是如何进行连接-辅助-寡核苷酸辅助的连接反应和随后的逆转录反应以及qPCR来检测成熟的微RNA hsa-let-7a的实施例。
1.将RNA连接寡核苷酸接至成熟的微RNA。
将10fmol hsa Let-7a miRNA或hsa Let-7g miRNA(分别是EQ16898和EQ16917-表VII)与100fmol连接寡核苷酸和100fmol连接辅助寡核苷酸(分别是EQ18557和EQ18565-表XII)和400U的T4DNA连接酶(New England Biolabs，USA)混合于20μL的总体积中，其还包括1×T4DNA连接酶缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5(25℃)、10mM MgCl2、1mM ATP和10mM二硫苏糖醇、25μg/ml BSA)。通过在室温下孵育30分钟进行连接反应。65℃下加热10分钟来终止反应。
2.RT反应
将1μL RT-引物(100fmol/μL，EQ17374，表VII)和2μL dNTP(10mM的每种dNTP-Applied Biosystems，USA)与1μL 5×第一链缓冲液(250mM Tris-HCl pH8.3(20℃)、375mM KCl、15mMMgCl2；Invitrogen，USA)、1μL 20U/μL SUPERase-In(Ambion，USA)和1μL 200U/μL Superscript II逆转录酶(Invitrogen，USA)混合。逆转录反应在42℃下进行1小时。70℃下加热15分钟来终止反应。通过加入74μL的DEPC H2O将总体积调节至100μL。
3.使用LNA-修饰的检测探针的实时PCR
用1×QuantiTect Probe PCR Master Mix(Qiagen，Germany)、400nM hsa-let-7a_qPcR-F-引物3(EQ17372，表VII)、400nMhsa-let-7a qPcR-R-引物2(EQ17375，表VII)、200nMhsa-let-7a_qPcR-Probe2_Q2检测探针(EQ18089，表VII)、5μL的第一链合成(RT)反应物(如上描述)和0.5U尿嘧啶DNA糖基化酶(Invitrogen，USA)构建实时PCR反应物(50μL)。使用以下温度循环程序：37℃下10分钟、95℃下15分钟、30℃下1分钟、40℃下1分钟，60℃下1分钟，随后40个循环的94℃下20秒和60℃下1分钟。实时RT-PCR分析可以在Opticon实时PCR仪(MJResearch，USA)上进行。
表XII：用于连接的寡核苷酸。
  EQ No.   寡核苷酸名称  5′   序列(5’-3’)a  3′
  18557   hsa-let-7连接寡核苷酸  P   acucauccuaccauccauccu  P
  18565   hsa-let-7a连接-助手   ggatgagtaactatac  P
实施方案
本发明可以通过以下实施方案定义，其中术语“条款”指有所述编号的前面的条款。
1.定量核酸样品中的靶标核苷酸序列的方法，所述的方法包括：
a)将靶标核苷酸序列与两种寡核苷酸标签探针接触，每种探针由锚定核苷酸序列和识别核苷酸序列组成，其中所述的识别核苷酸序列与靶标序列互补，并且其中第一个标签探针的识别序列杂交至靶标序列的第一个区域而第二个标签探针的第二个识别序列杂交至与靶标序列的第一个区域邻接的第二个靶标序列区域；
b)通过连接反应将两个杂交的标签探针的邻接识别序列共价连接而形成连续的核苷酸序列，该连续的核苷酸序列包括与靶标核苷酸序列互补的序列和两个锚定核苷酸序列，并且
c)通过使用对应锚定核苷酸序列的引物和包括靶标识别序列和检测部分的标记的检测探针的实时PCR定量连接的寡核苷酸分子。
2.如条款1的方法，其中标签探针和检测探针中的识别核苷酸序列用高度亲和性的核苷酸类似物修饰。
3.如条款1-2的方法，其中高度亲和性的核苷酸类似物是LNA。
4.条款1-3的方法，其中5’-磷酸化的标签探针中的识别核苷酸序列从接着5’-核苷酸位置的核苷酸位置以LNA开始在每第二个、第三个或第四个位置用LNA修饰，并且其中在第二个标签探针中的识别核苷酸序列在每第二个、第三个或第四个位置用LNA取代，在3’-核苷酸位置前的核苷酸位置终止。
5.条款4的方法，其中5’-磷酸化的标签探针中的识别序列从接着5’-核苷酸位置的核苷酸位置以LNA开始在每第三个位置用LNA修饰，并且其中在第二个标签探针中的识别核苷酸序列在每第三个位置用LNA取代，在3’-核苷酸位置前的核苷酸位置终止。
6.条款1-5的方法，其中标签探针中的锚定核苷酸序列是DNA序列。
7.条款1-5的方法，其中标签探针中的锚定核苷酸序列用高度亲和性的核苷酸类似物修饰。
8.条款7的方法，其中标签探针中的锚定核苷酸序列用LNA修饰。
9.条款1-8的方法，其中标签探针中的识别核苷酸序列长度少于约20个核苷酸并且更优选少于15个核苷酸，并且最优选在10和14个核苷酸之间。
10.条款1-9的方法，其中标签探针中的锚定核苷酸序列长度少于约30个核苷酸并且更优选少于27个核苷酸，并且最优选在15和25个核苷酸之间。
11.条款1-10的方法，其中检测探针中的识别序列用高度亲和性的核苷酸类似物修饰。
12.如条款11的方法，其中高度亲和性的核苷酸类似物是LNA。
13.条款12的方法，其中检测探针的长度是少于约20个核苷酸并且更优选少于15个核苷酸，并且最优选在8和12个核苷酸之间。
14.条款13的方法，其中检测探针包含LNA序列，其在5’-末端含有DNA核苷酸以及在3’-末端含有磷酸基团。
15.条款14的方法，其中检测探针用至少一个化学部分取代。
16.条款15的方法，其中检测探针含有荧光团-淬灭基团对。
17.条款1-16的方法，其中检测探针通过5’核酸酶测定原理使用双标记而得以检测。
18.条款1-16的方法，其中检测探针通过分子信标原理得以检测。
19.条款1-18的任意之一的方法，其中标签探针用T4 DNA连接酶连接。
20.条款1-18的任意之一的方法，其中标签探针用热稳定性DNA连接酶连接。
21.条款1-18的任意之一的方法，其中标签探针用RNA连接酶连接。
22.条款1-18的任意之一的方法，其中标签探针用热稳定性RNA连接酶连接。
23.条款20或22的方法，其中连接反应在变性和标签探针退火和连接之间重复进行循环，产生许多连接了的寡核苷酸分子。
24.条款1-23任意之一的方法，其中标签探针之一用配体标记。
25.条款24的方法，其中连接了的分子利用配体-捕获分子相互作用来纯化。
26.条款24-25的方法，其中配体是生物素，并且其中配体-捕获分子相互作用是生物素-抗生物素蛋白或生物素-链霉抗生物素。
27.条款1-26任意之一的方法，其中靶标核苷酸序列是RNA序列。
28.条款1-26任意之一的方法，其中靶标核苷酸序列是微RNA序列。
29.条款28的方法，其中靶标核苷酸序列是成熟微RNA序列。
30.条款1-26任意之一的方法，其中靶标核苷酸序列是siRNA序列或RNA-编辑的序列。
31.条款1-26任意之一的方法，其中靶标核苷酸序列是选择性剪接变体序列。
32.条款1-26任意之一的方法，其中靶标序列是非编码或反义RNA序列或含有单核苷酸多态性或点突变的RNA序列。
33.条款1-26任意之一的方法，其中靶标核苷酸序列是DNA序列。
34.条款1-26任意之一的方法，其中靶标核苷酸序列是含有单核苷酸多态性或点突变的DNA序列。
35.条款1-34的方法，其中靶标核苷酸序列是人的序列。
36.条款35的方法，其中靶标核苷酸序列涉及疾病或可用于诊断疾病例如癌。
37.条款1-36任意之一的标签探针和检测探针的文库，其用于检测或定量微RNA。
38.条款37的探针的文库，其用于检测和定量植物或哺乳动物微RNA。
39.条款37的探针的文库，其用于检测和定量人或动物微RNA。
40.条款1-36任意之一的标签探针和检测探针的文库，其用于检测或定量反义RNA、非编码RNA或siRNA。
41.条款1-36任意之一的标签探针和检测探针的文库，其用于检测或定量RNA-编辑的转录物。
42.条款1-36任意之一的标签探针和检测探针的文库，其用于检测或定量选择性剪接变体。
43.条款37-42任意之一的试剂盒。
44.定量核酸样品中的靶标核糖核酸序列的方法，所述的方法包括：
a)将靶标核糖核酸序列与寡核苷酸标签探针接触，所述的标签探针由锚定核苷酸序列和识别核苷酸序列组成，其中所述的识别核苷酸序列与靶标核糖核酸序列中的序列互补；
b)使用逆转录酶和将寡核苷酸标签探针作为引物，通过逆转录反应合成靶标核糖核酸的互补链；
c)通过使用DNA聚合酶和将第二标签探针作为引物合成第二链，置换杂双链中的核糖核酸序列，其中所述的第二标签探针由锚定核苷酸序列和识别核苷酸序列组成，其中所述的识别核苷酸序列互补于逆转录酶延伸的核酸序列中的序列；
d)使用对应于连接在寡核苷酸标签探针上的锚定核苷酸序列的引物和包括靶标识别序列和检测部分的标记的检测探针通过实时PCR定量得到的核酸。
45.如条款44的方法，其中标签探针和检测探针中的识别核苷酸序列用高度亲和性的核苷酸类似物修饰。
46.条款44的方法，其中在第一标签探针和检测探针中与靶标核糖核酸中的序列互补的识别核苷酸序列用高度亲和性的核苷酸类似物修饰，并且在第二标签探针中的识别序列不进行修饰。
47.如条款44的方法，其中标签探针中的识别序列未经修饰而检测探针用高度亲和性的核苷酸类似物修饰。
48.如条款44-47的方法，其中高度亲和性的核苷酸类似物是LNA。
48.条款44-48的方法，其中标签探针中的识别序列在每第二个、第三个或第四个位置用LNA修饰，在识别序列的3’-末端中有至少一个DNA核苷酸。
49.条款48的方法，其中标签探针中的识别序列在每第三个位置用LNA修饰，在识别序列的3’-末端中有至少一个DNA核苷酸结尾。
50.条款44-49的方法，其中标签探针中的锚定核苷酸序列是DNA序列。
51.条款44-50的方法，其中标签探针中的锚定核苷酸序列用高度亲和性的核苷酸类似物修饰。
52.条款51的方法，其中标签探针中的锚定核苷酸序列用LNA修饰。
53.条款44-52的方法，其中标签探针中的识别序列长度少于约20个核苷酸并且更优选少于15个核苷酸，并且最优选在6和14个核苷酸之间。
54.条款44-53的方法，其中标签探针中的锚定核苷酸序列长度少于约30个核苷酸并且更优选少于27个核苷酸，并且最优选在15和25个核苷酸之间。
55.条款44-54的方法，其中检测探针中的识别序列用高度亲和性的核苷酸类似物修饰。
56.如条款55的方法，其中高度亲和性的核苷酸类似物是LNA。
57.条款56的方法，其中LNA任选用SBC核碱基、2’-O-甲基、2，6-二氨基嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸苷、5-硝基吲哚、通用或简并碱基、嵌入核苷酸或小沟结合物。
58.条款57的方法，其中识别序列中至少一个LNA腺苷单体用LNA 2’6-二氨基嘌呤代替。
59.条款58的方法，其中至少一个LNA单体用LNA 2-硫代胸苷代替。
60.条款59的方法，其中检测探针的长度少于约20个核苷酸并且更优选少于15个核苷酸，并且最优选在7和12个核苷酸之间。
61.条款59的方法，其中检测探针包括LNA序列，其在5’-末端含有DNA核苷酸以及在3’-末端含有磷酸基团。
62.条款61的方法，其中检测探针用至少一个化学部分取代。
63.条款62的方法，其中检测探针含有荧光团-淬灭基团对。
64.条款44-63的方法，其中检测探针通过5’核酸酶测定原理使用双标记而得以检测。
65.条款44-63的方法，其中检测探针通过分子信标原理得以检测。
66.条款44-65任意之一的方法，其中靶标核糖核酸的互补链用热稳定性逆转录酶合成。
67.条款44-66任意之一的方法，其中代替杂双链中的靶标核糖核酸序列的第二链用热稳定性DNA聚合酶合成。
68.条款44-67任意之一的方法，其中第二链标签探针用配体标记。
69.条款68的方法，其中第二链分子利用配体-捕获分子相互作用来纯化。
70.条款68-69的方法，其中配体是生物素，并且其中配体-捕获分子相互作用是生物素-抗生物素蛋白或生物素-链霉抗生物素。
71.条款44-70任意之一的方法，其中靶标核糖核酸序列是微RNA序列。
72.条款71的方法，其中靶标核糖核酸序列是成熟微RNA序列。
73.条款72的方法，其中第一标签探针的识别序列与成熟微RNA的3’-末端互补，而第二标签探针的识别序列与逆转录酶延伸的核苷酸序列的3’-末端(对应于成熟微RNA的5’-末端)互补。
74.条款44-70任意之一的方法，其中靶标核糖核酸序列是siRNA序列或RNA-编辑的序列。
75.条款44-70任意之一的方法，其中靶标核糖核酸序列是选择性剪接变体序列。
76.条款44-70任意之一的方法，其中靶标核糖核酸序列是非编码或反义RNA序列或含有单核苷酸多态性或点突变的RNA序列。
77.条款74-76任意之一的方法，其中第一标签探针的识别序列互补于成熟siRNA的3’-末端或互补于位于RNA编辑核苷酸、剪接位点、单核苷酸多态性或点突变的3’的序列，并且第二个标签探针的识别序列互补于逆转录酶延伸的核苷酸序列，所述的逆转录酶延伸的核苷酸序列对应于siRNA的5’-末端或对应于位于核糖核酸靶标序列中的RNA编辑核苷酸、剪接位点、单核苷酸多态性或点突变的’5的序列。
78.条款44-77的方法，其中靶标核糖核酸序列是人的序列。
79.条款78的方法，其中靶标核糖核酸序列涉及疾病或可用于诊断疾病例如癌。
80.条款44-79任意之一的标签探针和检测探针的文库，其用于检测或定量微RNA。
81.条款80的探针的文库，其用于检测和定量植物或哺乳动物微RNA。
82.条款80的探针的文库，其用于检测和定量人或动物微RNA。
83.条款44-79任意之一的标签探针和检测探针的文库，其用于检测或定量反义RNA、非编码RNA、siRNA、RNA-编辑的转录物或选择性剪接变体。
84.条款80-83任意之一的试剂盒。

Claims (51)

1.一种方法，所述的方法用于分离、纯化、扩增、检测、鉴定、定量或捕获非编码RNA，例如微RNA或小干扰RNA(siRNA)，该方法的特征是使用含有一些核苷类似物的寡核苷酸。
2.根据权利要求1的方法，所述的方法包括以下步骤：
a)将非编码核糖核酸序列与寡核苷酸捕获探针接触，其中识别核苷酸序列与非编码RNA中的序列互补；
b)用DNA聚合酶以及将靶标核糖核酸序列作为引物，合成捕获探针中剩余的核苷酸序列(锚定核苷酸序列)的互补链；
c)固定形成的双链于固体支持物上并使靶标样品富集，随后将靶标序列从固体支持物上释放；
d)使用逆转录酶并将捕获探针中的锚定核苷酸序列作为引物结合位点，通过逆转录合成非编码核糖核酸的互补DNA链；
e)通过使用DNA聚合酶和将第二标签探针作为引物合成第二链，置换杂双链中的核糖核酸序列，其中所述的第二标签探针由锚定核苷酸序列和识别核苷酸序列组成，其中所述的识别核苷酸序列互补于逆转录酶延伸的核酸序列中的序列；
f)使用对应连接在寡核苷酸标签探针上的锚定核苷酸序列的引物和包括靶标识别序列和检测部分的标记的检测探针，通过实时PCR定量得到的核酸。
3.根据权利要求1的方法，所述的方法包括以下步骤：
a)将靶标核糖核酸序列与寡核苷酸捕获探针接触，其中识别核苷酸序列与靶标序列中的序列互补；
b)使用DNA聚合酶并将靶标核糖核酸序列作为引物，合成捕获探针中的锚定核苷酸序列的互补链；
c)固定形成的双链于固体支持物上并使靶标样品富集；
d)使用逆转录酶并将捕获探针作为引物，通过逆转录合成靶标核糖核酸的互补DNA链；
e)通过使用DNA聚合酶和将第二标签探针作为引物合成第二链，置换杂双链中的核糖核酸序列，其中所述的第二标签探针由锚定核苷酸序列和识别核苷酸序列组成，并且其中所述的识别核苷酸序列互补于逆转录酶延伸的核酸序列中的序列；
f)使用DNA聚合酶和引物对进行以靶标序列为模板的PCR扩增；
e)使用对应连接在寡核苷酸标签探针上的锚定核苷酸序列的引物和含有靶标识别序列及检测部分的标记的检测探针，通过实时PCR定量由此得到的核酸。
4.根据权利要求1的方法，所述的方法包括通过以下手段定量核酸样品中的靶标核苷酸序列：
a)将靶标核苷酸序列与各由锚定核苷酸序列和识别核苷酸序列组成的两种寡核苷酸标签探针接触，其中所述的识别核苷酸序列与靶标序列互补，并且其中第一种标签探针的识别序列杂交至靶标序列的第一个区域而第二种标签探针的第二个识别序列杂交至邻近靶标序列的第一个区域的靶标序列的第二个区域；
b)通过连接反应将杂交的标签探针的两个邻接的识别序列共价连接而形成连续的核苷酸序列，该连续的核苷酸序列包括与靶标核苷酸序列互补的序列和两个锚定核苷酸序列，并且
c)通过使用对应锚定核苷酸序列的引物和包含靶标识别序列和检测部分的标记的检测探针的实时PCR定量连接了的寡核苷酸分子。
5.根据权利要求1的方法，所述的方法包括通过以下手段定量核酸样品中的小的非编码RNA序列：
a)将靶标核糖核酸序列与寡核苷酸标签探针接触，其中识别核苷酸序列与靶标序列中的序列互补；
b)使用DNA聚合酶和将靶标核糖核酸序列作为引物，合成标签探针中的锚定核苷酸序列的互补链；
c)使用逆转录酶并将标签探针中的锚定核苷酸序列作为引物结合位点，通过逆转录反应合成靶标核糖核酸的互补DNA链；
d)使用DNA聚合酶并将第二标签探针作为引物，通过合成第二链而置换杂双链中的核糖核酸序列，其中所述的第二标签探针由锚定核苷酸序列和识别核苷酸序列组成，其中所述的识别核苷酸序列与逆转录酶延伸的核酸序列中的序列互补；
e)使用对应连接至寡核苷酸标签探针上的锚定核苷酸序列的引物和含有靶标识别序列及检测部分的标记的检测探针通过实时PCR定量得到的核酸。
6.根据权利要求1-5任一项的方法，其中核苷类似物是LNA。
7.一种试剂盒，所述的试剂盒用于分离、纯化、扩增、检测、鉴定、定量或捕获非编码RNA，例如微RNA或小干扰RNA(siRNA)，其中该试剂盒包含反应体和一种或多种经修饰的寡核苷酸。
8.根据权利要求7的试剂盒，其中经修饰的寡核苷酸含有一些寡核苷类似物。
9.根据权利要求8的试剂盒，其中核苷类似物是LNA。
10.用于定量测定具有最多100个核苷酸的短RNA的方法，所述的方法包括
a)从含有所述短RNA的样品制备模板多核苷酸，该模板多核苷酸由下列组成：1)由所述短RNA序列、其对应的DNA序列或与所述短RNA序列互补的核苷酸序列组成的单链靶标序列以及2)5’和/或3’邻接的核苷酸序列，
b)在逆转录反应或核苷酸聚合作用中使用所述的模板多核苷酸来获得cDNA链，并且
c)进行定量实时PCR(qPCR)，所述的cDNA用作模板和任选地将模板多核苷酸用作模板。
11.根据权利要求10的方法，其中用于步骤c的qPCR的引物选自：
-至少2种寡核苷酸，其中至少一种所述的寡核苷酸对应或互补于5’或3’邻接核苷酸序列中的序列，
-至少2种寡核苷酸，其中至少一种所述的寡核苷酸对应于或互补于由部分单链靶标序列和部分邻接的5’或3’核苷酸序列构成的模板多核苷酸中的连续序列，
-至少2种寡核苷酸，其中一种对应于单链靶标序列中的第一个核苷酸序列而另外一种互补于该单链靶标序列中的第二个核苷酸序列，
其中所述的用于qPCR的引物可以各自独立地包含可检测标记。
12.根据权利要求10或11的方法，其中在步骤(b)的反应中利用逆转录反应引物或DNA聚合反应引物，所述的引物对应于或互补于单链靶标序列，或对应于或互补于由部分单链靶标序列和部分邻接的5’或3’核苷酸序列构成的模板多核苷酸中的连续序列。
13.根据权利要求12的方法，其中所述的逆转录反应引物或核苷酸聚合反应引物特异于至少一种短RNA。
14.根据权利要求10-13任一项的方法，其中5’和/或3’邻接核苷酸序列是由相同核苷酸组成的多核苷酸。
15.根据权利要求10-14任一项的方法，其中单链靶标序列和5’和/或3’邻接核苷酸序列通过共价连接。
16.根据权利要求10-15任一项的方法，其中单链靶标序列和5’和/或3’邻接核苷酸序列通过非共价连接。
17.根据权利要求10-16任一项的方法，其中5’和/或3’邻接核苷酸序列包含可检测标记。
18.根据权利要求10-17任一项的方法，其中5’和/或3’邻接核苷酸序列通过酶促反应连接至单链靶标序列。
19.根据权利要求10-17任一项的方法，其中5’和/或3’邻接核苷酸序列通过非酶促反应连接至单链靶标序列。
20.根据权利要求10-19任一项的方法，其中5’和/或3’邻接核苷酸序列在该样品RNA所源自的生物体中不是天然出现的。
21.根据权利要求10-20任一项的方法，其中5’和/或3’邻接核苷酸序列是非哺乳动物的。
22.根据权利要求10-21任一项的方法，其中在末端转移酶反应中，优选在poly-A转移酶反应中，步骤(a)包括通过将5’和/或3’邻接核苷酸序列连接至短RNA而制备模板多核苷酸，或其中步骤(a)包括通过将5’和/或3’邻接核苷酸序列联结至短RNA而制备模板多核苷酸。
23.根据权利要求22的方法，其中连接作用选自突出端连接和平末端连接，优选突出端连接。
24.根据权利要求23的方法，所述的方法包括将部分互补于5’或3’邻接核苷酸序列的连接酶活性末端和部分互补于短RNA分子的连接酶活性末端的寡核苷酸退火至短RNA，这样使5’或3’邻接核苷酸序列的连接酶活性末端直接邻接小RNA分子的连接酶活性末端而使得能进行突出端连接。
25.根据权利要求22-24任一项的方法，其中让样品中的全部RNA接受连接作用或末端转移酶反应。
26.根据权利要求22-25任一项的方法，其中连接反应或末端转移酶反应仅在靶标序列的3’末端进行。
27.根据权利要求22-25任一项的方法，其中连接至靶标序列的5’-末端是通过在连接反应前磷酸化靶标序列的5’末端来进行。
28.根据权利要求22-27任一项的方法，其中在连接反应前5’邻接核苷酸序列在其5’末端被封闭而3’邻接核苷酸序列在其3’末端被封闭。
29.根据权利要求10-28任一项的方法，其中在步骤(a)中5’和/或3’邻接核苷酸序列优先地或专一地连接至所述的短RNA的特定的加工状态。
30.根据权利要求29的方法，其中所述RNA的特定加工状态是成熟状态。
31.根据权利要求22-30任一项的方法，其中步骤(b)包括从模板多核苷酸逆转录而获得cDNA。
32.根据权利要求10-18任一项的方法，其中步骤(a)包括核苷酸聚合作用的步骤以连接邻接的核苷酸序列。
33.根据权利要求32的方法，其中聚合作用是通过聚合酶进行，所述的聚合酶选自非模板依赖性和模板依赖性聚合酶。
34.根据权利要求33的方法，其中聚合酶是DNA聚合酶。
35.根据任一项权利要求的方法，其中聚合作用在于加入poly-A，poly-G、poly-T或poly-C尾巴至靶标序列的3’-末端。
36.根据权利要求32-35的方法，其中步骤(a)包括通过以下步骤制备模板多核苷酸：
-将短RNA的3’末端退火至寡核苷酸捕获探针上，所述捕获探针的5’末端互补于该短RNA的3’末端，以及
-用寡核苷酸捕获探针作为模板通过核苷酸聚合作用延伸短RNA以便获得延伸了的短RNA分子，该延伸了的短RNA分子构成了模板多核苷酸。
37.根据权利要求36的方法，其中核苷酸聚合作用包括DNA聚合作用以便获得RNA-DNA杂合物，该RNA-DNA杂合物构成了模板聚核苷酸。
38.根据权利要求36或37的方法，其中步骤(b)包括(I)逆转录RNA-DNA杂合链而获得cDNA，任选在除去了未退火至寡核苷酸捕获探针的材料后。
39.根据权利要求38的方法，其中逆转录作用中的引物是寡核苷酸捕获探针或单独的逆转录引物。
40.根据权利要求32-35的方法，其中步骤(a)包括通过以下步骤制备模板多核苷酸：
-将短RNA的5’末端退火至寡核苷酸捕获探针上，所述捕获探针的3’末端互补于该短RNA的5’末端，并且其5’末端包含5’邻接核苷酸序列，以及
-用短RNA作为模板通过逆转录作用延伸捕获探针而获得延伸了的捕获探针，该延伸了的捕获探针构成了模板多核苷酸。
41.根据权利要求40的方法，其中步骤(b)包括：将短RNA从延伸了的捕获探针除去，让捕获探针在其3’末端退火至辅助寡核苷酸上，所述的辅助寡核苷酸包含与3’邻接核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且用辅助寡核苷酸作为模板通过DNA聚合作用的方式进一步以5’→3’方向延长该捕获探针而获得cDNA。
42.根据权利要求36-41任一项的方法，其中捕获寡核苷酸含有使得能固定于固体支持物上的部分。
43.根据权利要求42的方法，其中捕获探针在退火后固定以使得能除去未退火的材料。
44.根据权利要求10-43任一项的方法，其中步骤(a)中的样品的短RNA得以富集。
45.根据权利要求10-44任一项的方法，其中步骤(c)包括使用含有经修饰的核苷酸的检测探针。
46.根据权利要求45的方法，其中经修饰的核苷酸是LNA核苷酸。
47.根据权利要求45或46的方法，其中检测探针对应于或互补于短RNA中的序列。
48.根据权利要求10-47任一项的方法，其中用于逆转录作用中或DNA聚合作用中的引物包含经修饰的核苷酸。
49.根据权利要求48的方法，其中经修饰的核苷酸是LNA核苷酸。
50.根据权利要求10-49任一项的方法，其中用于步骤(c)中的qPCR的至少一种引物由用于步骤(b)的逆转录作用或核苷酸聚合作用的引物构成。
51.用于定量测定具有最多100个核苷酸的短RNA的试剂盒，所述的试剂盒包含：
-最小数目的用于根据权利要求10-50任一项的方法的逆转录反应引物和/或核苷酸聚合反应引物和/或用于qPCR的引物和/或寡核苷酸捕获探针和/或辅助寡核苷酸和/或寡核苷酸探针，其中逆转录反应引物、核苷酸聚合反应引物、用于qPCR的引物、寡核苷酸捕获探针、辅助寡核苷酸和寡核苷酸探针是如权利要求11-50任一项定义的，以及
-关于使用逆转录反应引物和/或核苷酸聚合反应引物和/或用于qPCR的引物和/或寡核苷酸捕获探针和/或辅助寡核苷酸和/或寡核苷酸探针来定量测定短RNA的说明书。
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