CN103013994A

CN103013994A - 引物及该引物筛选9种已知bcr/abl融合基因方法

Info

Publication number: CN103013994A
Application number: CN2012105758191A
Authority: CN
Inventors: 李小青; 孙黎; 李金欢; 叶贵; 陈然; 郝玮; 梁超; 韩韬; 涂赞兵; 方国伟; 陈忠; 黄士昂
Original assignee: WUHAN KANGSHENGDA MEDICAL INSTITUTE Co Ltd
Current assignee: WUHAN KANGSHENGDA MEDICAL INSTITUTE Co Ltd
Priority date: 2012-12-26
Filing date: 2012-12-26
Publication date: 2013-04-03

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体来说是一种引物及该引物筛选9种已知BCR/ABL融合基因方法，是一种临床检验用途的基因融合检测试剂盒，采用PCR技术，能够对人类慢性粒细胞白血病（CML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、以及少数急性粒细胞白血病（AML）患者体内各种融合型的BCR/ABL融合基因进行检测，一次性确定具体的BCR/ABL融合型，利于后期的定量检测和疗效监测。可有效的节约检测时间，节约检测成本，提高检测效率。

Description

引物及该引物筛选9种已知BCR/ABL融合基因方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说是一种引物及该引物筛选9种已知BCR/ABL融合基因方法。

背景技术

白血病是一类造血干细胞异常的克隆性恶性疾病。其克隆中的白血病细胞失去进一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。根据白血病细胞的成熟程度和自然病程，白血病可分为急性和慢性两大类。急性白血病病情进展迅速,自然病程仅有数周至数月。一般可根据白血病细胞系列归属分为急性髓系细胞白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)两大类。而慢性白血病的发生是由于有功能的已分化成熟的细胞过度增生，因此慢性白血病应是一种由于信号传导不良或细胞增殖失控所至的疾患，而非成熟障碍所至。慢性白血病常见有慢性粒细胞性白血病（CML）、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）。由于白血病类型不同，治疗方案及预后亦不尽相同，因此确诊后，应进一步分型。关于人类白血病的病因与发病机理，至今仍未完全明了。已知病因有感染因素、电离辐射、化学物质，遗传因素及免疫功能异常等。目前认为白血病病因是以上各种因素相互作用的结果。

白血病的诊断和治疗，一直是国际性的重大难题。近年来，随着各种诊断技术的不断发展，特别是分子生物学研究手段的不断更新，其在血液病诊断中所起的作用越来越重要。尤其是对有明显检测靶标的白血病的诊断，分子生物学的检测结果已经不可或缺。

Ph染色体是在血液病中最早确定的染色体异常，主要出现在慢性粒细胞白血病和部分急性淋巴细胞白血病中，它是由9号和22号染色体易位造成的。这种易位也造成了位于22号染色体上的BCR基因和位于9号染色体上的ABL基因的融合，产生了一个新的BCR/ABL融合基因（图、1）。应用分子生物学方法（RT-PCR）检测该融合基因的存在，已经成了确诊CML或ALL的重要参考依据之一。近年来慢性粒细胞白血病(CML)的分子生物学研究不断有新的进展，其中之一就是陆续报道了多种不同融合位点的BCR/ABL融合基因。而且不同的融合型的BCR/ABL融合基因对病程的影响和治疗的反应是不尽相同的。例如P190比P2l0的致癌能力更高,表达更倾向于导致AL表型。因此，从CML和ALL病人中检测出存在BCR/ABL融合基因与否，以及确定具体的融合型，对于CML和ALL病人的诊断和治疗方案的选择均有重大意义。

在实际应用中，用于检测BCR/ABL融合基因的方法主要为荧光原位杂交和RT-PCR法。但目前使用这两种方法来对BCR/ABL融合基因进行检测的，均是只针对某种特定的融合型进行检测。如要对目前已知的所有融合型的BCR/ABL融合基因进行检测，则只能一个一个单独进行检测，费时费力，且检测成本非常昂贵。因而急需一种能同时对所有已知的融合型的BCR/ABL融合基因进行筛查的方法，省时省力，更有利于患者的及时诊治。多重PCR技术则能够解决这种需求。

多重PCR技术是在传统PCR原理上进行改进，即在同一体系中加入多对特异性引物，对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增出多个目的DNA片段。应用多重PCR技术，设计出针对9种已知融合型BCR/ABL融合基因（e1a2,e1a3,e6a2,e8a2,e13a2,e13a3,e14a2,e14a3,e19a2）（图、2）的公共特异性引物，并避免各对特异性引物之间的相互干扰，即可实现在同一检测体系中，对这些不同型的BCR/ABL融合基因进行一次性检测。节约了大量的检测时间和检测成本。因此本研究采用多重PCR技术应用于9种已知融合型的BCR/ABL融合基因的筛查检测。

发明内容

本发明设计了检测内参/目的基因用引物序列，采用多重PCR技术，一次性检测9种已知融合型BCR/ABL融合基因的存在与否，试剂盒通过调整公共检测引物的比例，以及PCR反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种引物，所述引物序列如下:

BCR-1:ACCTCCAGCGAGGAGGACTTCTC

BCR-6:AACCTGAGAGCCAGAAGCAACAAAGATG

BCR-12:GGAGAACATCCGGGAGCAGCAGAAG

BCR-19:GCACTGAAGGCAGCCTTCGACG

BCR-R:GGATGTCCGTGGCCACACCGGAC

ABL-3:CCCCATTGTGATTATAGCCTAAGACCCGG。

本发明的另一个目的是利用该引物筛选9种已知BCR/ABL融合基因方法，包括如下步骤：

（1）、RNA的提取；

（2）、将RNA反转录成cDNA；

（3）、PCR反应；

（4）、PCR反应产物检测；

（5）、结果判断。

进一步的：所述步骤（3）中PCR反应的反应液包括cDNA模板，GoTaq GreenMaster Mix（2×），检测已知融合型的BCR/ABL融合基因用上下游公共引物BCR-1、BCR-6、BCR-12、BCR-19和ABL-3，检测内参基因BCR用引物为BCR-12、BCR-R和ddH₂O；其中：

BCR-1:ACCTCCAGCGAGGAGGACTTCTC

BCR-6:AACCTGAGAGCCAGAAGCAACAAAGATG

BCR-12:GGAGAACATCCGGGAGCAGCAGAAG

BCR-19:GCACTGAAGGCAGCCTTCGACG

BCR-R:GGATGTCCGTGGCCACACCGGAC

ABL-3:CCCCATTGTGATTATAGCCTAAGACCCGG。

进一步的：所述的PCR反应条件为94℃10min循环数1次；94℃30s、58℃30s、72℃45s循环35次；72℃5min循环1次。

本发明的有益技术效果是：本发明利用多重PCR技术，设计检测9种已知融合型BCR/ABL融合基因的公共特异性引物，对这些BCR/ABL融合基因进行一次性筛查检测，使初诊和复查的CML和ALL患者能一次性得到更全面更及时的检测，节约检测时间和检测成本；尽早确定存在的BCR/ABL融合型有助于临床上CML和ALL的早期预防、早期诊断；还可对于疑似进入慢性粒细胞白血病（CML）加速期、急变期的高危人群进行较为准确的筛查。

附图说明

图1.BCR和ABL基因的转录本；

图2.各型BCR-ABL融合基因的转录本；

图3.各型BCR-ABL融合基因检测结果电泳图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

引物及该引物筛选9种已知BCR/ABL融合基因方法；

包括如下步骤：

1、RNA的提取：

(1)向经高压灭菌处理过的15ml离心管中加入采集的新鲜血液及7ml的红细胞裂解液，漩涡振荡混匀。

(2)冰浴15分钟后，低速离心3分钟（1500r/min）。

(3)离心完后，倒掉上层液体，再向沉淀中加入4ml的红细胞裂解液，漩涡振荡混匀后，低速离心3分钟（1500r/min）。

(4)离心后去掉上清，再加入8mlPBS，漩涡振荡混匀，低速离心3分钟（1500r/min）。

(5)离心完后去掉上清。

(6)向沉淀中加入1.5ml的PBS，将沉淀吹打混匀后，分别取1ml和0.5ml至两个经过灭菌的干净离心管中。1ml的为实验用，0.5ml的留作备份。

(7)将上述离心管进行低速离心3分钟（1500r/min）。

(8)离心完后去掉上清，分别向两个管子中加入1ml的Trizol和300ul的白细胞裂解液，并吹打混匀。加Trizol为实验用的，加白细胞裂解液的为备份，放入-20℃保存。

(9)给每一个1ml Trizol管写一个干净的灭菌的备份管，并向加入了1mlTrizol的离心管中加入200ul的三氯甲烷，剧烈振荡后，4℃，12000r/min离心10min。

(10)在离心的过程中，向备份管中加入500ul的异丙醇。等离心完后，将上清取至对应的干净离心管中，上下混匀后，-20℃冷藏20min。

(11)20分钟后，将离心管取出，4℃，15000r/min离心12min。

(12)离心完后，去掉上清，再加1ml75%的乙醇，上下混匀后，-4℃，12000r/min离心8min。

(13)离心后，倒掉上清，在通风橱中将乙醇风干，再向沉底中加入适量的超纯水，得到总RNA。

2、参考Promega公司的M-MLV PCR RT Kit试剂盒说明书，将RNA反转为cDNA。

逆转录体系:

试剂	体积（uL）
		RNA	6
随机引物	1
		M-MLV	0.25
dNTP	0.5
		RNA抑制剂	0.25
10×M-MLV buffer	2
		总体积	10

逆转录反应条件:

RNA和随机引物共7uL的体系	70℃5min
		再加入逆转录反应混合液3uL共10uL体系	37℃60min

3、PCR反应

取逆转录产物2ul,作为PCR反应模板，以BCR(p210)-F和ABL(p210)-R为上下游引物，BCR(p190)-F和ABL(p190)-R为上下游引物进行PCR扩增，PCR反应体系为20ul。具体配方如下：

成分	加入量(μl)
		GoTaq Green Master Mix	10
ddH₂O	6.5
		Primers（5μM each）	2
cDNA	1.5
		总体积	20

PCR的扩增条件如下：

4、检测：取5ul PCR产物，用2%琼脂糖凝胶进行凝胶电泳，结果如图3所示。

5、结果判断：BCR/ABL 9种剪切型的扩增片段大小如下：

剪切型	片段大小（bp）
		e1a2	474
e1a3	300

e6a2	270
		e8a2	465
e13a2	345
		e13a3	170
e14a2	420
		e14a3	245
e19a2	236

若在凝胶图像中观察到上述任一种片段大小的条带出现，则对应样本为阳性；若观察不到条带出现，则对应样本为阴性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种引物，其特征在于：所述引物序列如下:

BCR-1:ACCTCCAGCGAGGAGGACTTCTC

BCR-6:AACCTGAGAGCCAGAAGCAACAAAGATG

BCR-12:GGAGAACATCCGGGAGCAGCAGAAG

BCR-19:GCACTGAAGGCAGCCTTCGACG

BCR-R:GGATGTCCGTGGCCACACCGGAC

ABL-3:CCCCATTGTGATTATAGCCTAAGACCCGG。

2.根据权利要求1所述该引物筛选9种已知BCR/ABL融合基因方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）、RNA的提取；

（2）、将RNA反转录成cDNA；

（3）、以cDNA为模板进行PCR反应；

（4）、PCR反应产物检测；

（5）、结果判断。

3.根据权利要求2所述该引物筛选9种已知BCR/ABL融合基因方法，其特征在于：所述步骤（3）中PCR反应的反应液包括cDNA模板，GoTaq Green MasterMix（2×），检测已知融合型的BCR/ABL融合基因用上下游公共引物BCR-1、BCR-6、BCR-12、BCR-19和ABL-3，检测内参基因BCR用引物为BCR-12、BCR-R和ddH2O；其中：

BCR-1:ACCTCCAGCGAGGAGGACTTCTC

BCR-6:AACCTGAGAGCCAGAAGCAACAAAGATG

BCR-12:GGAGAACATCCGGGAGCAGCAGAAG

BCR-19:GCACTGAAGGCAGCCTTCGACG

BCR-R:GGATGTCCGTGGCCACACCGGAC

ABL-3:CCCCATTGTGATTATAGCCTAAGACCCGG。

4.根据权利要求2、3所述该引物筛选9种已知BCR/ABL融合基因方法，其特征在于：所述的PCR反应条件为94℃10min循环数1次；94℃30s、58℃30s、72℃45s循环35次；72℃5min循环1次。