CN104774959A - 一种检测血液循环肿瘤细胞的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明的技术方案是一种利用MGB探针结合荧光定量聚合酶链式反应法对肺癌患者外周血进行上皮细胞粘附分子表达检测，以反映体内循环肿瘤细胞水平,其方法是把需检测的目的标本,通过RNA提取、cDNA逆转录，后利用MGB探针进行荧光定量聚合酶链式扩增反应，后经荧光定量聚合酶链式扩增反应仪检测荧光强度，得到上皮粘附分子表达水平。本发明具有高灵敏度、高特异度的优点,同时又继承了一般聚合酶链式反应法高通量的优点,提高了检测效率,降低了检测成本。

Description

一种检测血液循环肿瘤细胞的试剂盒

技术领域

本发明涉及利用MGB探针结合荧光定量聚合酶链式反应法进行上皮细胞粘附分子表达检测，以得到上皮粘附分子表达水平，以及该测试方法在检测肺癌患者体内循环肿瘤细胞水平的应用。

背景技术

目前对肺癌患者循环肿瘤细胞的检测多采用免疫磁珠分选法,该方法虽有较高的准确性,但灵敏度不足，面对越来越少样本量的限制,该方法已不足以进行大量肿瘤患者疾病筛选及多次术后疗效评估。

EpCAM(上皮细胞粘附分子)于1979年由Herlyn等^[1]在结肠癌中发现,被认为是人类结肠癌组织的主要肿瘤相关抗原。EpCAM不同程度地表达于所有的正常上皮和上皮源性恶性肿瘤中,且多位于细胞间紧密连接处。在结缔组织及造血系统来源的细胞、脑组织和血管内皮细胞中缺乏明显的EpCAM的表达。因此，EpCAM可作为用于检测非小细胞肺癌CTCs的组织特异性表达标志物，并可以通过QRT-PCR等非常敏感的定量检测方法可对其表达进行检测。

上皮特异性细胞粘附分子EpCAM是最早以单克隆抗体技术鉴定出的肿瘤相关抗原之一。它以多聚体的形式广泛表达于上皮组织表面，介导钙非依赖性细胞间同型黏附功能，据此可归入粘附分子家族。

相关的研究提示EpCAM还具备粘附分子家族的其他特性，参与包括细胞与基质的相互作用、迁移、细胞分化、形态、细胞周期调节、信号传导、代谢等多种过程。同时，EpCAM在多种上皮来源的肿瘤中呈过表达，提示其与肿瘤生长增殖等具有密切相关。多项研究已证实EpCAM的表达与乳腺癌和结肠癌细胞的增殖、周期分布、转移有关。

EpCAM在上皮来源的组织中广泛表达(单层上皮，假复层上皮，移行上皮)，定位于细胞基底外侧膜。一般鳞状上皮不表达，部分上皮来源的腺上皮细胞如肝细胞，上皮角化细胞、胃壁细胞、肌上皮细胞和胸腺皮层上皮亦不表达。间叶组织、肌肉和神经内分泌组织也不表达EpCAM。此外，淋巴样来源的细胞EpCAM也呈阴性表达。不同的组织类型EpCAM的表达水平存在差异。如在胃肠道，胃上皮呈阴性或极弱表达，小肠粘膜相对高表达，结肠在已知EpCAM阳性的细胞中表达水平最高。

大部分粘附分子在细胞发生恶性转化期间和其后都发生表达的改变，或上调，或下调或原位表达，EpCAM也不例外。在大部分上皮来源的肿瘤中EpCAM都呈高表达。在间质或外胚层来源的肿瘤如神经原性肿瘤，肉瘤，黑色素瘤或淋巴瘤等，EpCAM不表达。

经研究证实,实体瘤患者的外周血中存在肿瘤细胞，CTCs的存在是肿瘤转移必需的，因此研究者可把CTCs作为未来正式的一种预后标志物。另外,它也是实体瘤的先锋,被认为是一种有效的抗肿瘤药物的新靶标。

EpCAM(上皮细胞粘附分子，非小细胞肺癌CTCs，外周血循环肿瘤细胞水平。

发明内容

本发明的目的是利用MGB探针结合荧光定量聚合酶链式反应法对肺癌患者外周血进行上皮细胞粘附分子表达检测，以反映体内循环肿瘤细胞水平。

为了实现本发明的目的，提出以下技术方案：

一种荧光定量聚合酶链式反应检测外周血循环肿瘤细胞水平的方法，该方法利用MGB探针结合荧光定量聚合酶链式反应进行上皮细胞粘附分子表达检测，得到上皮粘附分子表达水平，用以检测肺癌患者体内循环肿瘤细胞，其特征在于，所述上皮细胞粘附分子表达检测流程包括以下步骤：

1)在非小细胞肺癌患者肘正中静脉处采取外周血液2mL，将血液保存于EDTA抗凝血管中，并放置在4℃冰箱内存储；

2)以300G离心10分钟，弃去上层血浆，保留血细胞层；

3)利用红细胞裂解液去除血细胞中的红细胞，保留其中有核细胞，在-80℃冰箱中保存；

4)将经上述处理的样本加入Trizol液提取总RNA；

5)将总RNA经过逆转录反应得到相应的cDNA样本；

6)制备EpCAM，利用Qrt-PCR绝对定量法进行EpCAM表达水平检测，并以健康志愿者标本为阴性对照。

在步骤4中，提取总RNA的过程如下：

4.1)匀浆化作用，取出约50～100mg步骤3中处理后的样本,放入10ml的无酶玻璃匀装管中,加入1ml的Trizol液,在电动匀漿器充分匀浆；

4.2)分离阶段，把匀浆液转移至5ml的无酶离心管,室温放置5min,然后加入0.2ml的氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15s；

4.3)再次离心，室温放置5min,放入4℃预冷后的离心机,12000rpm,4℃离心30min；

4.4)RNA的沉淀，取上层水相转移至一新的无酶离心管,加入等量异丙醇,室温放置l0min,再次放入4℃预冷后的离心机,12000rpm,4℃,离心10min；

4.5)RNA的洗脱，倒掉上清,留取底部沉淀,加入1ml现配的预冷好的75％的无酶乙醇，所述配比为DEPC水:无水酒精＝1:3，振荡洗漆RNA沉淀一次,然后放入4℃预冷的离心机,7500rpm,4℃,离心5min；

4.6)RNA的再溶解，倒掉上清,取沉淀置于超净工作台,室温下自然风干5min,此时RNA沉淀变透明,再在管中加入20ul DEPC水，50℃水浴l0min，充分溶解,将所提取的总RNA保存于-80℃冰箱备用；

在步骤5中，cDNA的合成包括步骤：

5.1)在冰上准备0.5ml无酶PCR反应管并建立逆转录反应体系12ul，其中，总RNA 3ul；Oligo dT 18 primer lul；DEPC treatedwater 8ul；

将以上混合物以6000rpm，41℃，离心5sec,旋转混匀，按以下反应条件进行第一步逆转录反应：65℃，5min，再以4℃存10min；

5.2)继续在冰上依次加入5Xreaction buffer 4ul，RibolockRNAse Inhibitor lul，RevertAid M-Reverse Transcriptase lul，dNTP mixture 2ul，总反应体系20ul；

将以上共20ul的混合离心5sec，液旋转混勾,按以下反应条件进行第二步逆转录反应:42℃，60min，70℃，5min；再以4℃存10min，合成的cDNA存放在-2℃的冰箱储存备用。

5.3)使用逆转录试剂盒中提供的1.1KbRNA进行逆转录反应,监测反应体系；

5.4)质量检测:采用试剂盒里提供的485bp的管家基因GAPDH引物对获得的cDNA进行PCR扩增。

在步骤5.4)中，cDNA进行PCR扩增包括步骤：

5.4.1)在冰上建立以下反应体系25ul，包括普通PCR reactionmixture 12.5ul，GAPDH的上、下游引物各lul，cDNA模板lul，加无菌去离子水至25ul；

5.4.2)反应条件：预变性94℃3min，变性94℃45s,退火55℃30s,延伸72℃:45s，共30个循环，终延伸5min；

5.4.3)将PCR产物通过1.5％琼脂糖凝胶进行电泳,120V恒压电泳30min。

在步骤6中，EpCAM制备包括步骤:

6.1)将获得的PCR产物进行1％低熔点琼脂糖进行恒压电泳，DNA上样量50u1,电泳30min,将电泳产物在紫外投射仪下透视,从琼脂糖凝胶中切下所需的目凝胶重量400mg的DNA片段,放入1.5ml无酶离心管中称量；

6.2)将离心管中的凝胶切成小块以助凝胶溶解，以凝胶的重量mg:Solution 1的体积ml为1:3比例加入Solution 1；

6.3)在5℃恒温水浴加热5～15min，直到凝胶完全融化,每隔2～3min将管内混合液混匀一次，温育后如果混合液颜色变紫色,加入l0ul乙酸钾使其变回黄色；

6.4)凝胶完全融化后加入以凝胶重量mg:异丙醇体积ul为1:1的异丙醇并充分混匀，对于DNA片段大于500bp不需要加入异丙醇；

6.5)混合液全部转移至Spin colmran内，放入离心机,20℃,6000rpm,离心1min,弃去接液管中液体；

6.6)向Spin columm内加入500ml Extraction Buffer,20℃,12000rpm,离心1min,弃去接液管中液体；

6.7)向Spin columm内加入750ul Wash Buffer,20℃,12000rpm,离心lmin,弃去接液管中液体；

6.8)弃液后将Spin columm再次放入离心机,室温下,12000rpm,离心lmin,后将Spin columm至于无菌的1.5ml离心管中；

6.9)向Spin columm内加入50ml Elution Buffer,室温静置1min后,12000rpm,离心1min,离心回收DNA样品,1.5ml离心管内液体含有目的DNA片段,回收的DNA样品于-20保存。

在步骤4中，还包括对总RNA提取质量检测：取3ul总RNA溶液加1ul上样缓冲液,以120V稳压电泳30inin,紫外凝胶成像系统进行分析,紫外灯下可见28s,18s,5s三条rRNA的清晰条带,并且28s条带的强度高于18s,18s条带的强度高于5s,表明RNA未降解,质量良好。

在步骤6.9)中，还包括对回收DNA的定量与检测：

6.9.1)DM完整性的检测:吸取2ul回收后的DNA样品进行1.5％琼脂糖凝胶电泳,成像分析可见清晰单一的条带；

6.9.2)根据紫外分光光度仪测定的A260值计算纯化的DNA浓度:取lul的DNA加99ul的DEPC水,充分混匀后测A260值。计算公式:DNA浓度(ug/ml)＝(A260X50X稀释倍数)/1000。

本发明利用MGB探针结合荧光定量聚合酶链式反应法对肺癌患者外周血进行上皮细胞粘附分子表达检测，能够准确反映体内循环肿瘤细胞水平。同时该检测方法检测效率得到提高,检测成本进一步降低。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。

上皮细胞粘附分子表达检测流程包括以下5个步骤：

1、在非小细胞肺癌患者肘正中静脉处采取外周血液2mL，将血液保存于EDTA抗凝血管中，并放置在4℃冰箱内存储；

2、300G离心10分钟，弃去上层血浆，保留血细胞层；

3、利用红细胞裂解液去除血细胞中的红细胞，保留其中有核细胞；

4、将经上述处理的样本加入Trizol液提取总RNA，并经过逆转录反应得到相应的cDNA样本；

5、利用qRT-PCR绝对定量法进行EpCAM表达水平的检测，并以健康志愿者标本为阴性对照。

其中，在步骤4中，提取总RNA的过程如下：

为避免RNA热变性,所有加样操作均必须在冰上完成。

1、匀浆化作用:从-80℃冰箱中取出约50～100mg肺癌组织,将组织放入10ml的无酶玻璃匀装管中,加入1ml的Trizol液,在电动匀漿器充分匀浆,不同标本匀装前均用DEPC水泡洗匀浆器搅拌头,并用无菌纱布擦拭干净,以防交叉污染。

2、分离阶段:把匀浆液转移至5ml的无酶离心管(EP管),室温放置5min,然后加入0.2ml的氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15s。

3、再次离心:室温放置5min,放入4℃预冷后的离心机,12000rpm,4℃离心30min。

4、RNA的沉淀:取上层水相转移至一新的无酶离心管,转移过程中注意不能吸到中层蛋白相，加入等量异丙醇,室温放置l0min,再次放入4℃预冷后的离心机,12000rpm,4℃,离心10min。

5、RNA的洗脱:小心倒掉上清,留取底部沉淀,注意不能把沉淀丢弃,加入1ml现配的预冷好的75％的无酶乙醇(DEPC水:无水酒精＝1:3即10mlDEPC水加入30ml无水酒精)剧烈振荡洗漆RNA沉淀一次,然后放入4℃预冷的离心机,7500rpm,4℃,离心5min。

6、RNA的再溶解:小心倒掉上清(注意不能丢弃管底的RNA沉淀),取沉淀置于超净工作台,室温下自然风干(约5min,此时RNA沉淀变透明),注意不能让RNA沉淀完全干燥(会降低它的可溶性导致其不易溶解)。再在管中加入20ul DEPC水(RNA沉淀较少时,可以只加lml DEPC水)，50℃水浴l0min充分溶解,将所提取的总RNA保存于-80℃冰箱备用。

7、总RNA提取质量检测(琼脂糖凝胶电泳法):通过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性,了解RNA有无降解。方法:取3ul总RNA溶液加1ul上样缓冲液,以120V稳压电泳30inin,紫外凝胶成像系统进行分析,紫外灯下可见28s,18s,5s三条rRNA的清晰条带,并且28s条带的强度高于18s,18s条带的强度高于5s,表明RNA未降解,质量良好。

8、cDNA的合成

采用试剂盒提供的方法(两步法)合成cDNA(RT时注意事项:全部加样操作必须在冰上完成,为避免RNA酶污染,在操作全程均要佩戴一次性手套和口罩并经常予以更换)。

(1)在冰上准备0.5ml无酶PCR反应管(EP管)并建立逆转录反应体系12ul，包括:

总RNA 3ul；

Oligo dT 18 primer lul；

DEPC treated water 8ul；

将以上混合物轻柔旋转混匀,6000rpm,41℃,离心约5sec,按以下反应条件进行第一步逆转录反应:65℃，5min,4℃暂存10min。

(2)继续在冰上依次加入以下各成分,总反应体系20ul:

5Xreaction buffer 4ul

Ribolock RNAse Inhibitor lul

RevertAid M-Reverse Transcriptase lul

dNTP mixture 2ul

将以上混合液(共20ul)轻柔旋转混勾,离心5sec.按以下反应条件进行第二步逆转录反应:42℃60min,70℃5min,4℃暂存10min。合成的cDNA存放在-20℃冰箱储存备用。

(3)使用逆转录试剂盒中提供的1.1Kb RNA,按其说明进行逆转录反应,监测反应体系。

(4)质量检测:采用试剂盒里提供的485bp的管家基因GAPDH引物对获得的cDNA进行PCR扩增。

cDNA进行PCR扩增步骤：

1)在冰上建立以下反应体系25ul:

普通PCR reaction mixture 12.5ul

GAPDH的上、下游引物各lul

cDNA模板lul

加无菌去离子水至25ul。

2)反应条件:94℃预变性3min(变性94℃45s,退火55℃30s,延伸72s:45s，共30个循环)；终延伸5min。

3)将PCR产物通过1.5％琼脂糖凝胶进行电泳,120V恒压电泳30min,紫外成像系统分析,紫外灯下可见485bp左右的单一清晰的条带,证实cDNA逆转录。

9、EpCAM制备:

(1)将PCR产物通过吸附柱式琼脂糖DM回收方法进行回收纯化制备标准品。同时将部分PCR产物电泳后凝胶进行DNA片段回收作为阳性模板。

①将上述实验中获得的PCR产物进行1％低熔点琼脂糖进行恒压电泳(DNA上样量>50111,电泳约30min),将电泳产物在紫外投射仪下透视,从琼脂糖凝胶中切下所需的目的DNA片段(凝胶重量《400mg),放入1.5ml无酶离心管(EP管)中称量。

②将离心管中的凝胶切成小块以助凝胶溶解。按1:3比例加入Solution 1(凝胶的重量mg:Solution 1的体积ml,即1mg凝胶加入3ml Solution 1)。

③5℃恒温水浴加热直到凝胶完全融化(5～15min),每隔2～3min将管内混合液混匀一次(温育后如果混合液颜色变紫色,可以加入l0ul乙酸钾使其变回黄色)。

④凝胶完全融化后按加入1:1比例(凝胶重量mg:异丙醇体积ul)的异丙醇并充分混匀。(DNA片段大于500bp不需要加入异丙醇)

⑤混合液全部转移至Spin colmran内放入离心机,20℃,6000rpm,离心1min,弃去接液管中液体。

⑥向Spin columm内加入500ml Extraction Buffer,20℃,12000rpm,离心1min,弃去接液管中液体。

⑦向Spin columm内加入750ul Wash Buffer,20℃,12000rpm,离心lmin,弃去接液管中液体。

⑧弃液后将Spin columm再次放入离心机,室温下,12000rpm,离心lmin,后将Spin columm至于无菌的1.5ml离心管中。

⑨向Spin columm内加入50ml Elution Buffer,室温静置1min后,12000rpm,离心1min,离心回收DNA样品,1.5ml离心管内液体含有目的DNA片段,回收的DNA样品于-20保存。

(2)回收DNA的定量与检测:

①DM完整性的检测:吸取2ul回收后的DNA样品进行1.5％琼脂糖凝胶电泳,成像分析可见清晰单一的条带。

②根据紫外分光光度仪测定的A260值计算纯化的DNA浓度:取lul的DNA加99ul的DEPC水,充分混匀后测A260值。计算公式:DNA浓度(ug/ml)＝(A260X50X稀释倍数)/1000。

PCR加样和PCR反应程序:

PCR加样：在PCR反应管的25uL体系中,加入QPCR缓冲液,MgC12,dNTP,taq酶,及需要检测基因的上、下游引物及MGB探针,需检测样品的高质量的cDNA,加水补足25μ1。加样完毕后,加盖密封PCR反应管。

PCR反应程序：50℃孵育120s；95℃聚合酶激活20s,68℃延伸45s。

Taqman probe RT-PCR设计

TaqMan probe RT-PCR是一种寡核苷酸探针PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针其结合位点在两条引物之间只与模板特异地结合。荧光报告基团reporter R连接在探针的5`末端而荧光淬灭基团则在3`末端。当完整的探针与目标序列杂交时荧光基团发射的荧光信号与3c端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时聚合酶的5`外切酶活性将将DNA探针逐个降解释放出荧光报告基团，这样PCR体系中荧光的强度与PCR产物量之间呈正比可通过测定荧光强度而对PCR产物定量。我们设计针对homo EpCAM681-890特异性探针序列并交由公司合成，并制备T载体连接EpCAM428-1025片段的标准品，以绝对定量检测技术检测样本中EpCAM cDNA拷贝数，并与实验中所测RNA反转录效率计算初始EpCAM表达量；

探针设计模板为Human(clone GA733-2-2)carcinoma-associated antigen GA733-2 mRNA,complete cds.GenBank:M33011.1

序列名称	序列碱基顺序
		前引物	TGGGCTTTATGATCCTGACTG
后引物	GCAGGTTATTTCAGTGTCCTTG
		探针	TATGATCCTGACTGCGATGAGAGCGG

技术特点：

1、设计跨外显子的Taqman Probe：针对GenBank:M33011.1EpCAM表达mRNA序列，设计跨越相邻的两个外显子的Taqman Probe，并避开已知全部单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点，大大增强了本实验所采用检测方法的特异性。这种跨外显子的设计使得QRT-PCR扩增反应过程中，Taqman Probe理论上只能结合由mRNA反转的cDNA所携带的EpCAM片段；同时，实验过程中，血液标本经过离心、去除血浆过程，可以保证最终所检测到的基因为细胞所携带的mRNA，避免了血浆中游离DNA、microRNA的污染所导致的假阳性；通过前期实验室部分研究，已经证实本方法的可行性与可靠性。

2、为每一例NSCLC患者临床检测标本配对一个健康志愿者的阴性对照。实验过程中，我们采取健康志愿者外周血标本，提取mRNA并反转录成cDNA，每次检测NSCLC患者标本时，均取一份健康志愿者的cDNA作为阴性对照，用以排除血液标本采集过程中，上皮、血管内皮细胞的污染及PCR过程中的非特异性扩增等原因导致的假阳性。最终结果为：NSCLC患者检测标本中CTCs表达EpCAM拷贝数＝肿瘤患者血液EpCAM拷贝数-阴性对照EpCAM拷贝数。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种荧光定量聚合酶链式反应检测外周血循环肿瘤细胞水平的方法， 该方法利用MGB探针结合荧光定量聚合酶链式反应进行上皮细胞粘附分子表达检测，得到上皮粘附分子表达水平，用以检测肺癌患者体内循环肿瘤细胞，其特征在于，所述上皮细胞粘附分子表达检测流程包括以下步骤：

1）在非小细胞肺癌患者肘正中静脉处采取外周血液2mL，将血液保存于EDTA抗凝血管中，并放置在4℃冰箱内存储；

2）以300G离心10分钟，弃去上层血浆，保留血细胞层；

3）利用红细胞裂解液去除血细胞中的红细胞，保留其中有核细胞，在-80℃冰箱中保存；

4）将经上述处理的样本加入Trizol液提取总RNA；

5）将总RNA经过逆转录反应得到相应的cDNA样本；

6）制备EpCAM，利用Qrt-PCR绝对定量法进行EpCAM表达水平检测，并以健康志愿者标本为阴性对照。

2.根据权利要求1所述的检测外周血循环肿瘤细胞水平的方法，其特征在于，在步骤4中，提取总RNA的过程如下：

4.1）匀浆化作用，取出约50～100mg步骤3中处理后的样本,放入10ml的无酶玻璃匀装管中,加入1ml的Trizol液,在电动匀漿器充分匀浆；

4.2）分离阶段，把匀浆液转移至5ml的无酶离心管,室温放置5 min,然后加入0.2ml的氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15s；

4.3）再次离心，室温放置5min,放入4℃预冷后的离心机,12000rpm,4℃离心30min；

4.4）RNA的沉淀，取上层水相转移至一新的无酶离心管,加入等量异丙醇,室温放置l0min,再次放入4℃预冷后的离心机,12000rpm,4℃,离心10min；

4.5）RNA的洗脱，倒掉上清,留取底部沉淀,加入1ml现配的预冷好的75%的无酶乙醇，所述配比为DEPC水:无水酒精=1 :3，振荡洗漆RNA沉淀一次,然后放入4℃预冷的离心机,7500rpm,4℃,离心5min；

4.6）RNA的再溶解，倒掉上清,取沉淀置于超净工作台,室温下自然风干5min,此时RNA沉淀变透明,再在管中加入20ul DEPC水，50℃水浴l0min，充分溶解,将所提取的总RNA保存于-80℃冰箱备用。

3.根据权利要求2所述的检测外周血循环肿瘤细胞水平的方法，其特征在于，在步骤5中，cDNA的合成包括步骤：

5.1)在冰上准备0.5ml无酶PCR反应管并建立逆转录反应体系12ul，其中，总RNA 3ul；Oligo dT 18 primer lul；DEPC treated water 8ul；

将以上混合物以6000rpm，41℃，离心5sec,旋转混匀，按以下反应条件进行第一步逆转录反应：65℃，5min，再以4℃存10min；

5.2)继续在冰上依次加入5Xreaction buffer 4ul，Ribolock  RNAse Inhibitor lul，RevertAid M-Reverse Transcriptase lul，dNTP mixture 2ul，总反应体系20ul；

将以上共20ul的混合离心5sec，液旋转混勾,按以下反应条件进行第二步逆转录反应:42℃，60min，70℃，5min；再以4℃存10min，合成的cDNA存放在-2℃的冰箱储存备用；

5.3)使用逆转录试剂盒中提供的1.1Kb RNA进行逆转录反应,监测反应体系；

5.4)质量检测:采用试剂盒里提供的485bp的管家基因GAPDH引物对获得的cDNA进行PCR扩增。

4.根据权利要求3所述的检测外周血循环肿瘤细胞水平的方法，其特征在于，在步骤5.4）中，cDNA进行PCR扩增包括步骤：

5.4.1）在冰上建立以下反应体系25ul，包括普通PCR reaction mixture 12.5ul，GAPDH的上、下游引物各lul，cDNA模板lul，加无菌去离子水至25ul；

5.4.2）反应条件：预变性94℃ 3min，变性94℃ 45s,退火55℃ 30s,延伸72℃:45s，共30个循环，终延伸5min；

5.4.3）将PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶进行电泳,120V恒压电泳30min。

5.根据权利要求4所述的检测外周血循环肿瘤细胞水平的方法，其特征在于，在步骤6中，EpCAM制备包括步骤:

6.1)将获得的PCR产物进行1%低熔点琼脂糖进行恒压电泳，DNA上样量50u1,电泳30min,将电泳产物在紫外投射仪下透视,从琼脂糖凝胶中切下所需的目凝胶重量400mg的DNA片段,放入1.5ml无酶离心管中称量；

6.2）将离心管中的凝胶切成小块以助凝胶溶解，以凝胶的重量mg:Solution 1的体积ml为1:3比例加入Solution 1；

6.3）在5℃恒温水浴加热5～15min，直到凝胶完全融化,每隔2～3min将管内混合液混匀一次，温育后如果混合液颜色变紫色,加入l0ul乙酸钾使其变回黄色；

6.4）凝胶完全融化后加入以凝胶重量mg:异丙醇体积ul为1:1的异丙醇并充分混匀，对于DNA片段大于500bp不需要加入异丙醇；

6.5）混合液全部转移至Spin colmran内，放入离心机,20℃, 6000rpm,离心1min,弃去接液管中液体；

6.6）向Spin columm内加入500ml Extraction Buffer,20℃, 12000rpm,离心1min,弃去接液管中液体；

6.7）向Spin columm内加入750ul Wash Buffer,20℃,12000rpm,离心lmin,弃去接液管中液体；

6.8）弃液后将Spin columm再次放入离心机,室温下,12000rpm,离心lmin,后将Spin columm至于无菌的1.5ml离心管中；

6.9）向Spin columm内加入50ml Elution Buffer,室温静置1min后,12000rpm,离心1min,离心回收DNA样品,1.5ml离心管内液体含有目的DNA片段,回收的DNA样品于-20保存。

6.根据权利要求5所述的检测外周血循环肿瘤细胞水平的方法，其特征在于，在步骤4中，还包括对总RNA提取质量检测：取3ul总RNA溶液加1ul上样缓冲液,以120V稳压电泳30inin,紫外凝胶成像系统进行分析,紫外灯下可见28s, 18s, 5s三条rRNA的清晰条带,并且28s条带的强度高于18s,18s条带的强度高于5s,表明RNA未降解,质量良好。

7.根据权利要求6所述的检测外周血循环肿瘤细胞水平的方法，，其特征在于，在步骤6.9）中，还包括对回收DNA的定量与检测：

6.9.1）DM完整性的检测:吸取2ul回收后的DNA样品进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,成像分析可见清晰单一的条带；

6.9.2）根据紫外分光光度仪测定的A260值计算纯化的DNA浓度:取lul的DNA加99ul的DEPC水,充分混匀后测A260值；

计算公式:DNA浓度(ug/ml) = (A260X50X稀释倍数)/ 1000。

8.根据权利要求7所述的检测外周血循环肿瘤细胞水平的方法，，其特征在于，在步骤4中，PCR加样和PCR反应程序:

PCR加样：在PCR反应管的25uL体系中,加入QPCR缓冲液, MgC12, dNTP, taq 酶,及需要检测基因的上、下游引物及MGB探针,需检测样品的高质量的cDNA,加水补足25μ1；

加样完毕后, 加盖密封PCR反应管；

PCR反应程序：50℃ 孵育120s；95℃ 聚合酶激活20s,68℃延伸45s。

9.根据权利要求7所述的检测外周血循环肿瘤细胞水平的方法，，其特征在于，在步骤4中，Taqman probe RT-PCR设计

TaqMan probe RT-PCR是一种寡核苷酸探针PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针其结合位点在两条引物之间只与模板特异地结合；

荧光报告基团reporter R连接在探针的5`末端而荧光淬灭基团则在3`末端；

当完整的探针与目标序列杂交时荧光基团发射的荧光信号与3c端的淬灭剂接近而被淬灭；

但在进行延伸反应时聚合酶的5`外切酶活性将将DNA探针逐个降解释放出荧光报告基团，这样PCR体系中荧光的强度与PCR产物量之间呈正比可通过测定荧光强度而对PCR产物定量；

我们设计针对homo EpCAM 681-890 特异性探针序列并交由公司合成，并制备T载体连接EpCAM 428-1025片段的标准品，以绝对定量检测技术检测样本中EpCAM cDNA拷贝数，并与实验中所测RNA反转录效率计算初始EpCAM表达量。