CN116355991A - 一种用于检测点突变、插入和缺失突变的rna参考品及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种用于检测点突变、插入和缺失突变的RNA参考品及其制备方法与应用，属于基因检测领域。本申请公开的参考品为提取自包括目标基因突变位点突变的细胞系的RNA，通过采用ddPCR和NGS两种方法验证所选择的细胞系的目标序列位点信息和拷贝数，将细胞系RNA水平突变信息与DNA水平突变信息进行比对，发现所选择的细胞系在RNA水平稳定表达，进一步根据突变位点及其拷贝数配制不同拷贝数梯度的参考品，并进行ddPCR拷贝数验证，结果表明本申请提供的RNA参考品可以作为检测SNV/Indel突变类型的RNA测序产品研发过程中的参考品，有助于基于RNA检测的肿瘤基因变异检测产品的研发。

Description

一种用于检测点突变、插入和缺失突变的RNA参考品及其制备 方法与应用

技术领域

本申请属于基因检测领域，具体涉及一种用于检测点突变、插入和缺失突变的RNA参考品及其制备方法与应用。

背景技术

RNA测序是一种高度灵敏的检测转录组表达的技术，越来越多的证据表明了其在融合基因检测上的优势，能够检测到DNA测序无法检测到的融合突变。目前常规的做法是，当使用DNA测序无法检测到点突变、插入/缺失突变（SNV/Indel）和融合靶向位点，以致无法进行靶向治疗后，才会进一步使用RNA测序，这种做法无疑给病患家庭增加了额外的经济负担。但DNA测序检测由于其技术本身存在的局限性，只能够识别发生在较短内含子中的基因融合，实际上临床上一些重要的基因融合往往来自于长的内含子区域。如果在设计DNA测序产品时包含这些长内含子，必将降低产品中其他基因的覆盖率和目标区域的捕获效率。这样不仅增加了测序成本，还会影响测序的敏感性。因此多数DNA测序产品对基因突变类型的检测都很难做到全面。鉴于RNA测序在检测融合基因方面的优势，近些年，随着RNA测序技术的发展，能够同时检测SNV/Indel和融合的RNA测序产品成为研究热点。

肿瘤基因变异检测产品研发的过程需要有企业内部参考品进行质控，目前对融合RNA参考品的研究较多，尚未有关于点突变、插入和缺失突变（SNV/Indel）的RNA参考品。

发明内容

1. 要解决的问题

针对点突变、插入和缺失突变（SNV/Indel）的RNA参考品缺失的问题，本申请提供了一种用于检测点突变、插入和缺失突变（SNV/Indel）的RNA参考品及其制备方法与应用，RNA参考品是在mRNA水平上的突变，为转录产物，更具有针对性，能够很好的解决检测SNV/Indel突变类型的RNA测序产品研发过程中缺少内部质控的问题。

2. 技术方案

为了解决上述问题，本申请所采用的技术方案如下：

本申请提供了一种用于检测点突变、插入和缺失突变的RNA参考品，该参考品包括提取自如下含有目的基因位点突变的细胞系的RNA中的一种或多种，细胞系由南京科佰生物科技有限公司提供，具体如下：

。

进一步地，上述一种用于检测点突变、插入和缺失突变的RNA参考品，该参考品包括提取自细胞系H1975、PC9、RKO-719AN-118和SW1573的RNA，可用于作为RNA测序检测基因EGFR的c.2573T>G、c.2369C>T、c.2235_2249del15、c.2156G>C和基因KRAS的c.34G>T突变的参考品。

进一步地，上述一种用于检测点突变、插入和缺失突变的RNA参考品，该参考品包括提取自细胞系HCC827、RKO-L861Q-N2-86和NOZ的RNA，可用于作为RNA测序检测基因EGFR的c.2236_2250del15、c.2582T>A和基因KRAS的c.35G>T突变的参考品。

进一步地，上述一种用于检测点突变、插入和缺失突变的RNA参考品，该参考品包括提取自细胞系RKO-ASV-75和T3M4的RNA，可用于作为RNA测序检测基因EGFR的c.2300_2308dupCCAGCGTGG和基因KRAS的c.183A>C突变的参考品。

进一步地，上述一种用于检测点突变、插入和缺失突变的RNA参考品，该参考品包括提取自细胞系KYSE450、RKO-YVWA3-85和T84的RNA，可用于作为RNA测序检测基因EGFR的c.2303G>T、基因ERBB2的c.2313_2324dupATACGTGATGGC、基因PIK3CA的c.1624G>A和基因KRAS的c.38G>A突变的参考品。

本申请还提供了上述一种用于检测点突变、插入和缺失突变的RNA参考品的制备方法，该方法包括如下步骤：

S1：根据预期用途，选取来源细胞系的RNA作为单点参考品；

S2：根据单点参考品的原始突变型拷贝数，使用阴性参考品对单点参考品进行稀释，将各单点参考品稀释至相接近的浓度再进行混合。

进一步地，上述使用阴性参考品对单点参考品进行稀释的规则如下：

当原始突变型拷贝数≤2000，不进行稀释；

当2001<原始突变型拷贝数≤5000，则使用阴性参考品将单点参考品稀释2.5倍；

当5001<原始突变型拷贝数≤10000，则使用阴性参考品将单点参考品稀释5倍；

当10001<原始突变型拷贝数≤20000，则使用阴性参考品将单点参考品稀释10倍；

当原始突变型拷贝数＞20001，则使用阴性参考品将单点参考品稀释20倍。

本申请还提供了上述一种用于检测点突变、插入和缺失突变的RNA参考品的制备方法在制备RNA测序产品中的应用。

本申请还提供了上述一种用于检测点突变、插入和缺失突变的RNA参考品在RNA测序产品性能评估中的应用。

本申请还提供了上述一种用于检测点突变、插入和缺失突变的RNA参考品的制备方法在RNA测序产品性能评估中的应用。

3. 有益效果

本申请与现有技术相比，其有益效果在于：

目前多数SNV/Indel的检测都是在DNA水平上，但基于其技术本身的局限性，DNA测序不能很好的检测融合突变，因此多数DNA测序产品对基因突变类型的检测都很难做到全面。RNA检测的基因突变是在mRNA水平的表达，更具有针对性，表达量高，也更容易检测到。但目前没有关于SNV/Indel的RNA参考品。本申请提供的一种用于检测点突变、插入和缺失突变的RNA参考品及其制备方法与应用，以筛选的包括有目标基因突变位点突变的细胞系为来源，提取来源细胞系的RNA，该RNA或多种RNA的混合物，可以作为检测SNV/Indel突变类型的RNA测序产品研发过程中的参考品，有助于基于RNA检测的肿瘤基因变异检测产品的研发。本申请还针对用于多个目的基因突变位点突变的RNA测序检测的参考品，提供了混合参考品的稀释规则及制备方法，该稀释规则可以使得制备的混合参考品中各单点参考品的实际拷贝数在突变位点理论拷贝数的±30%范围之内，符合质量控制的要求。同时，本申请可以促进仅需一份样本就能够同时检测多种突变类型的RNA测序产品的研发，为更多病患家庭减轻经济负担，因此本发明具有很好的商业前景和临床应用前景。

附图说明

图1是单点参考品细胞系的突变位点在不同平台检测结果。

图2是SNV/Indel母液混合参考品ddPCR定量结果。

图3是SNV/Indel阳性、重复性、检测限混合参考品拷贝数定量结果。

图4是SNV/Indel阳性、重复性、检测限混合参考品NGS检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本申请进一步进行描述。

需要说明的是，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”等用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

如本文所使用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。如本文所使用，术语“......中的至少一个”旨在与“......中的一个或多个”同义。例如，“A、B和C中的至少一个”明确包括仅A、仅B、仅C以及它们各自的组合。浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字（诸如2、3、4）和子范围（诸如1至3、2至4等）。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。

实施例1

本实施例提供目标基因突变位点及与其对应的单点参考品的验证，本申请中单点参考品为提取自包括有目标基因突变位点突变的细胞系的RNA。

（1）目标基因及突变位点突变

本申请的单点参考品拟用于RNA测序检测点突变（SNV）、插入和缺失突变（Indel），因此选择了表1中所示的目标基因及突变位点（含突变类型），基本包括了目前已知的热点突变位点基因突变，具体如表1所示。

表1 目标基因及基因突变位点

（2）作为单点参考品来源的细胞系

单点参考品是来源于包括有目标基因突变位点突变的细胞系的RNA。通常首选来自天然病人的拷贝数高、编辑低的细胞系作为细胞系来源，但是天然细胞系相对较难获得，可以选择DNA拷贝突变阳性，拷贝数高的人工编辑的细胞系作为细胞系来源。在实施例中，提供表2中的20个细胞系作为单点参考品的来源细胞系，各细胞系分别包含对应的DNA水平的目标基因突变位点突变，本实施例中的所有细胞系均由南京科佰生物科技有限公司提供。

表2 单点参考品来源细胞系及其包含的突变位点

（3）单点参考品来源细胞系的突变位点在RNA水平的验证

在本实施例中，通过ddPCR和NGS双平台对表2中单点参考品来源细胞系的突变位点在RNA水平进行验证，其中：

ddPCR平台验证包括如下步骤：

首先，将含有目标基因突变位点的单点参考品来源细胞系进行细胞培养，包括：复苏细胞，快速从液氮里取出细胞冻存管，在37℃水浴锅中快速融化，转移至生物安全柜中；取1支15 mL离心管，标记细胞系名称，加入2 mL DPBS（Dulbecco's Phosphate-BufferedSaline，杜氏磷酸缓冲盐溶液），将悬浮液全部移至15 mL离心管，1200 rpm，离心5分钟，弃上清，加入5 mL对应新鲜培养基，移液器吹打混匀，转移至写好细胞系名称的培养瓶中，37℃ CO₂培养箱培养；细胞传代，贴壁细胞传代：弃掉培养基上清，加入2 mL 1×DPBS，均匀晃动每个角落，弃掉1×DPBS，加入1 mL 0.25% Trypsin-EDTA，在37℃下孵育2分钟，取出后加入4 mL完全培养基终止消化，移液器吹打均匀，1200 rpm，离心5分钟，弃上清；悬浮细胞传代：T25培养瓶直接加5 mL新鲜培养基，轻轻吹打混匀放入37℃培养箱；细胞计数，贴壁细胞：弃掉培养基上清，加入2 mL 1×DPBS，均匀晃动每个角落，弃掉1×DPBS，加入1mL 0.25%Trypsin-EDTA，在37℃下孵育2分钟，取出后加入4 mL 完全培养基终止消化，移液器吹打均匀，1200 rpm，离心5分钟，弃上清，用1 mL 1×DPBS重悬细胞沉淀后计数；悬浮细胞：取出细胞，混匀后转移至15 mL离心管中，1200 rpm，离心5分钟，弃上清，用1 mL 1×DPBS重悬细胞沉淀后计数。

其次，使用Biomiga公司的Tissue RNA Miniprep Kit(BW-R6311-01)提取单点参考品来源细胞系的RNA作为单点参考品，根据突变位点设计ddPCR所需的引物和探针序列，送引物合成公司（朗晶生物科技有限公司）进行引物和探针的合成，使用伯乐公司一步法数字PCR试剂盒（产品型号：1864022）对各单点参考品的突变位点进行拷贝数定量，拷贝数定量结果如表3所示。

表3 各单点参考品突变位点拷贝数定量结果

备注：插入突变（insertion）的野生型荧光信号VIC识别全部样本，故插入突变的频率=突变型/野生型×100%；点突变（SNV）和缺失突变（deletion）的频率=突变型/（突变型+野生型）×100%。

NGS平台验证包括如下步骤：

在本实施例中，使用臻悦生物科技江苏有限公司的人RNA变异检测试剂盒（货号：NCP-1001）对各单点参考品的突变位点在RNA水平进行NGS检测，结果如表4所示。

表4 各单点参考品NGS检测结果

备注：细胞系HT1080-816V-14的基因KIT c2447A>T突变在RNA水平表达量极低，NGS未检出，说明该位点在RNA层面上没有表达。

（4）单点参考品的突变位点在RNA水平与DNA水平比较

将南京科佰生物科技有限公司提供的来源细胞系DNA水平的结果与本实施例中使用ddPCR和NGS所得的RNA水平的结果进行比较，结果如表5和图1所示。除细胞系HT1080-816V-14，其基因KIT c2447A>T突变在RNA水平表达量低，NGS未检出，ddPCR检测突变拷贝数仅有0.2拷贝数/ng，其余样本DNA水平的结果和RNA水平的结果均较为一致。因此，表2中的细胞系，除细胞系HT1080-816V-14外，均可以作为单点参考品来源细胞系，提取的RNA可以用于RNA测序检测对应的点突变、插入和缺失突变（SNV/Indel）。

表5 单点参考品的突变位点在RNA水平与DNA水平比较

实施例2

本实施例提供实施例1中的单点参考品的应用。

实施例1中的单点参考品可以用于对应的目的基因突变位点突变的RNA测序检测，也可以根据预期用途，将几种单点参考品混合制备成混合参考品，用于多个目的基因突变位点突变的RNA测序检测。

本实施例中，以用于RNA测序检测表6中的目标基因突变为例，提供实施例1中的单点参考品的具体应用。

表6 目标基因突变位点

根据表6选择对应的单点参考品来源细胞系，提取其RNA作为单点参考品，制备成混合参考品。

（1）单点参考品的稀释

由于某些单点参考品的拷贝数较高，因此在制备混合参考品时，需要较少的量，而且残留在移液器吸头上的极少量液体可能会引起混合参考品中该突变位点拷贝数的不稳定，故需要使用阴性参考品对拷贝数较高的单点参考品进行稀释，将各单点参考品稀释至相接近的浓度再进行混合，单点参考品的稀释原则如表7所示。

表7 单点参考品稀释原则

备注：“/”代表该样本本身突变位点拷贝数较低无需进行稀释。

按照表7的单点参考品稀释原则将单点参考品细胞系PC9 RNA稀释2.5倍，并对稀释后的单点参考品细胞系PC9 RNA浓度进行Qubit定量，并对其包含的位点进行拷贝数定量，得到稀释后为904.0拷贝数/ng。

（2）混合参考品的制备

为了将混合后突变位点拷贝数均一化，以制备混合参考品的各单点参考品中拷贝数最高的为参照进行质量比的计算。在本实施例中，将单点参考品细胞系PC9 RNA的质量比定义为参照质量比1×，将单点参考品细胞系PC9 RNA的拷贝数定义为参照拷贝数，可按如下公式计算其他各单点参考品的质量比：单点参考品质量比=参照质量比×参照拷贝数/单点参考品拷贝数。

如单点参考品细胞系H1975 RNA，其单点参考品质量比=1×904.0/660.0=1.4。相同的，单点参考品细胞系RKO-719AN-118 RNA质量比=1×904.0/61.3=14.7；单点参考品细胞系SW1573 RNA质量比=1×904.0/281=3.2，如表8所示。需要注意的是，当一个单点参考品出现2个或以上突变时，按最低拷贝数进行计算，如来源细胞系H1975的单点参考品含有2种SNV突变，EGFR c.2573T>G和EGFR c.2369C>T，分别为818.0和660.0拷贝数/ng，则计算时按照拷贝数较低的EGFR c.2369C>T（660.0）计算。

表8 混合参考品中各单点参考品的比例

根据上述质量比及混合参考品需求量，计算每个单点参考品的使用量，配置成混合参考品。本实施例中，以混合参考品需求量为10 μg为例，则各单点参考品使用量为：

单点参考品细胞系PC9 RNA使用量=10/（1.4+1+14.7+3.2）=0.49 μg；

单点参考品细胞系H1975 RNA使用量=0.49×1.4=0.69 μg；

单点参考品细胞系RKO-719AN-118 RNA使用量=0.49×14.7=7.24 μg；

单点参考品细胞系SW1573 RNA使用量=0.49×3.2=1.58 μg。

（3）混合参考品的质检

对配制好的混合参考品进行Qubit浓度测定和ddPCR拷贝数定量，实际拷贝数应在各突变位点理论拷贝数的±30%范围之内；若差异较大，需要重新配制。

使用伯乐公司一步法数字PCR试剂盒对混合参考品的突变位点进行拷贝数定量，结果如表9和图2所示。

表9 混合参考品拷贝数定量结果

（4）阳性、重复性和检测限混合参考品的验证

使用阴性参考品将上述混合参考品稀释成拷贝数为20拷贝数/ng的阳性参考品、10拷贝数/ng的重复性参考品、3拷贝数/ng的检测限参考品。以混合参考品中突变拷贝数最低的位点进行计算，将其质量比定为1×，可按如下公式计算阴性参考品的质量比：阴性参考品的质量比=混合参考品中最低突变拷贝数×1/20（10、3）-1。

在本实施例中，单点参考品细胞系RKO-719AN-118 RNA的拷贝数最低，为44.5拷贝数/ng，则将细胞系RKO-719AN-118 RNA的质量比定义为1×，则：

阳性参考品的阴性参考品的质量比=（44.5×1/20-1）×=1.2×；

重复性参考品的阴性参考品的质量比=（44.5×1/10-1）×=3.5×；

检测限参考品的阴性参考品的质量比=（44.5×1/3-1）×=13.8×。

根据上述质量比及阳性、重复性和检测限混合参考品需求量，计算阴性参考品和混合参考品的使用量，配置成阳性、重复性和检测限混合参考品。本实施例中，以阳性混合参考品需求量为2 μg为例，则：

混合参考品的使用量=2/（1+1.2）=0.91 μg；

阴性参考品使用量=0.91×1.2=1.09 μg。

同理，计算重复性和检测限混合参考品中阴性参考品和混合参考品的使用量并配置成重复性和检测限混合参考品。

对配制好的阳性、重复性和检测限混合参考品进行Qubit浓度测定和ddPCR拷贝数定量，实际拷贝数应在各突变位点理论拷贝数的±30%范围之内；若差异较大，需要重新配制。

使用伯乐公司一步法数字PCR试剂盒对配制的阳性、重复性、检测限混合参考品的突变位点进行拷贝数定量，结果如表10和图3所示，参考品拷贝数均在各位点理论拷贝数的±30%范围之内。

表10 阳性、重复性、检测限混合参考品拷贝数定量结果

综上所述，参考品质检合格，可作为检测SNV/Indel突变类型的RNA测序产品研发过程中的内部质控。

对比例1

本对比例与实施例2基本相同，其区别在于，未按照表7的单点参考品稀释原则进行稀释，使用伯乐公司一步法数字PCR试剂盒对混合参考品的突变位点进行拷贝数定量，结果如表11和图2所示。

表11 混合参考品拷贝数定量结果

从表9和表11可以看出，按照表7样本稀释原则稀释后配制的混合参考品各位点的实际拷贝数均在理论拷贝数±30%范围之内，反之，未按照此规则稀释的母液参考品，有1个位点的实际拷贝数未在理论拷贝数±30%范围之内，位点拷贝数之间差异较大，说明在配制多位点混合参考品时，先对拷贝数较高的样本进行稀释，有利于混合后参考品各位点之间的均一化。

实施例3

本实施例提供实施例1中的单点参考品的应用，基本同实施例2，其区别在于目标基因突变位点及对应的单点参考品不同，具体如表12所示。

表12 目标基因突变位点

按照表7的单点参考品细胞系稀释原则将单点参考品细胞系HCC827 RNA稀释10倍、将单点参考品细胞系NOZ RNA稀释5倍、将单点参考品细胞系KYSE450 RNA稀释2.5倍，并对稀释后的单点参考品进行Qubit定量，并对其包含的位点进行拷贝数定量，得到稀释后单点参考品细胞系HCC827 RNA为1216.3拷贝数/ng、单点参考品细胞系NOZ RNA为1452.0拷贝数/ng、单点参考品细胞系KYSE450 RNA为1584.0拷贝数/ng。

根据实施例2计算各混合参考品中各单点参考品的质量比，如表13所示。

表13 混合参考品中各单点参考品细胞系质量比

根据上述质量比及混合参考品需求量，计算每个单点参考品细胞系的使用量，配置成混合参考品。以每个混合参考品需求量为10 μg为例，则各单点参考品使用量如表14所示。

表14 混合参考品中各单点参考品细胞系使用量

对配制好的混合参考品进行Qubit浓度测定和ddPCR拷贝数定量，实际拷贝数应在各突变位点理论拷贝数的±30%范围之内；若差异较大，需要重新配制。

使用伯乐公司一步法数字PCR试剂盒对混合参考品的突变位点进行拷贝数定量，结果如表15和图2所示。

表15 混合参考品拷贝数定量结果

按照实施例2将上述混合参考品稀释成拷贝数为20拷贝数/ng的阳性混合参考品、10拷贝数/ng的重复性混合参考品、3拷贝数/ng的检测限混合参考品。使用伯乐公司一步法数字PCR试剂盒对配制的阳性、重复性、检测限混合参考品的突变位点进行拷贝数定量，结果如表16和图3所示，参考品拷贝数均在各位点理论拷贝数的±30%范围之内。

表16 阳性、重复性、检测限混合参考品拷贝数定量结果

综上所述，参考品质检合格，可作为检测SNV/Indel突变类型的RNA测序产品研发过程中的内部质控。

实施例4

本实施例提供的本申请阳性、重复性、检测限混合参考品在RNA测序产品中的应用，用于RNA测序产品研发时的质量控制。

取上述质检合格的SNV/Indel阳性、重复性、检测限混合参考品，使用臻悦生物科技江苏有限公司的人RNA变异检测试剂盒（货号：NCP-1001）进行NGS检测（检测限为3拷贝数/ng），结果如表17和图4所示。

表17 阳性、重复性、检测限混合参考品NGS结果

从SNV/Indel阳性、重复性、检测限混合参考品检测结果可以看出：在实验条件（起始量和测序量）一致的情况下，参考品包含的位点均可检出，且阳性参考品呈现强阳性，重复性参考品呈现中阳性，检测限参考品呈现弱阳性。说明本发明中的混合参考品可用于RNA测序产品的性能验证。

Claims (10)

1.一种用于检测点突变、插入和缺失突变的RNA参考品，其特征在于，所述参考品提取自如下含有目的基因位点突变的细胞系的RNA中的一种或多种：

。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测点突变、插入和缺失突变的RNA参考品，其特征在于，所述参考品包括提取自细胞系H1975、PC9、RKO-719AN-118和SW1573的RNA。

3.根据权利要求1所述的一种用于检测点突变、插入和缺失突变的RNA参考品，其特征在于，所述参考品包括提取自细胞系HCC827、RKO-L861Q-N2-86和NOZ的RNA。

4.根据权利要求1所述的一种用于检测点突变、插入和缺失突变的RNA参考品，其特征在于，所述参考品包括提取自细胞系RKO-ASV-75和T3M4的RNA。

5.根据权利要求1所述的一种用于检测点突变、插入和缺失突变的RNA参考品，其特征在于，所述参考品包括提取自细胞系KYSE450、RKO-YVWA3-85和T84的RNA。

6.权利要求1-5任一所述的一种用于检测点突变、插入和缺失突变的RNA参考品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：根据预期用途，选取来源细胞系的RNA作为单点参考品，所述单点参考品是来源于包括有目标基因突变位点突变的细胞系的RNA；

S2：根据单点参考品的原始突变型拷贝数，使用阴性参考品对单点参考品进行稀释，将各单点参考品稀释至相接近的浓度再进行混合。

7.根据权利要求6所述的一种用于检测点突变、插入和缺失突变的RNA参考品的制备方法，其特征在于，所述使用阴性参考品对单点参考品进行稀释的规则如下：

当原始突变型拷贝数≤2000，不进行稀释；

当2001<原始突变型拷贝数≤5000，则使用阴性参考品将单点参考品稀释2.5倍；

当5001<原始突变型拷贝数≤10000，则使用阴性参考品将单点参考品稀释5倍；

当10001<原始突变型拷贝数≤20000，则使用阴性参考品将单点参考品稀释10倍；

当原始突变型拷贝数＞20001，则使用阴性参考品将单点参考品稀释20倍。

8.权利要求6或7所述的一种用于检测点突变、插入和缺失突变的RNA参考品的制备方法在制备RNA测序产品中的应用。

9.权利要求1-5任一所述的一种用于检测点突变、插入和缺失突变的RNA参考品在RNA测序产品性能评估中的应用。

10.权利要求6或7所述的一种用于检测点突变、插入和缺失突变的RNA参考品的制备方法在RNA测序产品性能评估中的应用。

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