CN109628595A - 用于基因检测的ffpe参考品、其制备方法及应用 - Google Patents

用于基因检测的ffpe参考品、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于基因检测的FFPE参考品、其制备方法及应用。该制备方法包括以下步骤：S1，对肿瘤细胞系进行细胞培养，收集细胞沉淀；S2，对细胞沉淀进行福尔马林固定，然后用琼脂糖凝胶包裹形成细胞团块，将细胞团块制作成细胞蜡块；S3，提取细胞蜡块中肿瘤细胞系的基因组DNA，并对肿瘤细胞系的基因组DNA进行基因突变频率测定；S4，把含有目标突变位点的肿瘤细胞系的基因组DNA混合成目标突变频率的DNA混合物，DNA混合物即为用于基因检测的FFPE参考品。应用本发明的技术方案，对肿瘤细胞系培养的细胞进行福尔马林固定石蜡包埋，可以更好地模拟临床样本的情况。

Description

用于基因检测的FFPE参考品、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及一种用于基因检测的FFPE参考品、其制备方法及应用。
背景技术
近年来，基因检测领域发展极为迅速，涉及癌症的早期筛查、诊断、辅助治疗及其它疾病个体化治疗的检测、分析等方面。目前主要使用的检测方法有二代测序、ARMS PCR、ddPCR技术等，相应地，市场上出现了很多此类基因检测试剂盒。
基于临床的基因检测试剂盒在研发过程中都需要用到参考品，参考品是验证和评价试剂盒检测的准确性、稳定性等性能的重要方法和指标。
临床样本多为福尔马林固定石蜡包埋的样本(FFPE样本，Formalin-Fixed andParaffin-Embedded样本)，而目前常见的参考品多是新鲜细胞制备的基因组DNA，不能很好地模拟临床样本的情况。虽然一些临床样本也被用来作为参考品，但是临床样本的稀有性及肿瘤组织的异质性导致很难收集到足够的有固定突变频率的临床样本进行大规模、多次重复验证，同时，单一临床样本的突变位点往往较为单一，不能满足检测试剂盒验证时同时验证多个目标基因位点的需求。
市场上没有稳定、有效、通用的福尔马林固定石蜡包埋标准品，这是亟待解决的问题。
发明内容
本发明旨在提供一种用于基因检测的FFPE参考品、其制备方法及应用，以解决现有技术中临床FFPE样本作为参考品数量少、频率及位点不固定的技术问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种用于基因检测的FFPE参考品的制备方法。该制备方法包括以下步骤：S1，对肿瘤细胞系进行细胞培养，收集细胞沉淀；S2，对细胞沉淀进行福尔马林固定，然后用琼脂糖凝胶包裹形成细胞团块，将细胞团块制作成细胞蜡块；S3，提取细胞蜡块中肿瘤细胞系的基因组DNA，并对肿瘤细胞系的基因组DNA进行基因突变频率测定；S4，把含有目标突变位点的肿瘤细胞系的基因组DNA混合成目标突变频率的DNA混合物，DNA混合物即为用于基因检测的FFPE参考品。
进一步地，S4包括：S41，把含有目标突变位点的肿瘤细胞系的基因组DNA进行预混合得到DNA预混合物，测定得到DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率；S42，将DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率与目标突变频率进行比较；S43，如果DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率等于目标突变频率，则DNA预混合物即为用于基因检测的FFPE参考品；如果DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率与目标突变频率不一致，则根据DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率的检测结果进一步细化调整混合比例，重复S41和S42直到得到的DNA混合物的目标突变位点基因突变频率与目标突变频率一致，获得用于基因检测的FFPE参考品。
进一步地，S43包括：采用目标突变位点基因突变频率为0的FFPE阴性细胞系DNA稀释用于基因检测的FFPE参考品，进一步得到更低期望目标突变位点基因突变频率的用于基因检测的FFPE参考品；优选的，FFPE阴性细胞系DNA为GM12878细胞系DNA。
进一步地，S43中DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率的检测结果为ddPCR和NGS的检测结果。
进一步地，S1中在对肿瘤细胞系进行细胞培养之后还包括对培养的肿瘤细胞系进行计数的步骤；优选的，当肿瘤细胞系的数目>2×106cells/mL时，收集细胞沉淀。
进一步地，S2中采用10％中性福尔马林对细胞沉淀进行固定，优选的，固定时间为2～4h；优选的，琼脂糖凝胶的浓度为1～5％；优选的，在用琼脂糖凝胶包裹细胞团块时，琼脂糖凝胶的温度为60℃，琼脂糖凝胶的体积为10`5μL；优选地，细胞团块制作成细胞蜡块前使用10％中性福尔马林固定1～4h。
进一步地，S3中采用ddPCR和高通量测序对肿瘤细胞系的基因组DNA进行基因突变频率测定；优选地，高通量测序包括illumina测序平台和/或ion torrent测序平台的测序。
进一步地，肿瘤细胞系包括选自由AMO-1、NCI-H929、A549、A-427、HCT116、THP-1、NCI-H2347、SK-HEP-1、PC-9、NCI-H1975、KYSE450、SW48、NCI-H2228、NCI-H3122、HCC78、NCI-N87、EBC-1、NCI-H1299、NCI-H460、SW948和GM12878组成的组中的一种或多种；优选的，S1中在对肿瘤细胞系进行细胞培养之前还包括对获得肿瘤细胞系进行验证的步骤，验证包括提取肿瘤细胞系的基因组DNA，用一代测序对基因突变位点进行验证；优选地，S3的基因突变频率测定中基因突变包括单一核苷酸变异、基因拷贝数变异和融合；优选地，目标突变位点为1个或多个；优选地，目标突变频率为检测验证所需的最低检测限频率或质控品所需的频率；更优选的，目标突变频率为5％、10％或15％。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于基因检测的FFPE参考品。该用于基因检测的FFPE参考品采用上述任一种制备方法制备而成。
根据本发明的再一方面，提供了一种上述用于基因检测的FFPE参考品在制备基因检测试剂盒中的应用。
应用本发明的技术方案，对肿瘤细胞系培养的细胞进行福尔马林固定石蜡包埋，可以更好地模拟临床样本的情况；根据对肿瘤细胞系的基因组DNA进行基因突变频率测定把含有目标突变位点的肿瘤细胞系的基因组DNA混合成目标突变频率的DNA混合物，此参考品可大规模地生产，从而能够实现用一个福尔马林固定石蜡包埋的参考品大批量、重复验证各临床检测检测或试剂盒检测的准确性和稳定性等性能的目的。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
针对现有技术中临床FFPE样本作为参考品数量少、频率及位点不固定，无法大批量、可重复地对试剂盒进行反复验证的不足，本发明提出了下列技术方案。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种用于基因检测的FFPE参考品的制备方法。该制备方法包括以下步骤：S1，对肿瘤细胞系进行细胞培养，收集细胞沉淀；S2，对细胞沉淀进行福尔马林固定，然后用琼脂糖凝胶包裹形成细胞团块，将细胞团块制作成细胞蜡块；S3，提取细胞蜡块中肿瘤细胞系的基因组DNA，并对肿瘤细胞系的基因组DNA进行基因突变频率测定；S4，把含有目标突变位点的肿瘤细胞系的基因组DNA混合成目标突变频率的DNA混合物，DNA混合物即为用于基因检测的FFPE参考品。
应用本发明的技术方案，对肿瘤细胞系培养的细胞进行福尔马林固定石蜡包埋，可以更好地模拟临床样本的情况；根据对肿瘤细胞系的基因组DNA进行基因突变频率测定把含有目标突变位点的肿瘤细胞系的基因组DNA混合成目标突变频率的DNA混合物，此参考品可大规模地生产，从而能够实现用一个福尔马林固定石蜡包埋的参考品大批量、重复验证各临床检测检测或试剂盒检测的准确性和稳定性等性能的目的。
根据本发明一种典型的实施方式，S4包括：S41，把含有目标突变位点的肿瘤细胞系的基因组DNA进行预混合得到DNA预混合物，测定得到DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率；S42，将DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率与目标突变频率进行比较；S43，如果DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率等于目标突变频率，则DNA预混合物即为用于基因检测的FFPE参考品；如果DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率与目标突变频率不一致，则根据DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率的检测结果进一步细化调整混合比例，重复S41和S42直到得到的DNA混合物的目标突变位点基因突变频率与目标突变频率一致，获得用于基因检测的FFPE参考品。通过上述操作可以较为简便的目标突变频率的用于基因检测的FFPE参考品。
根据本发明一种典型的实施方式，S43进一步包括：采用目标突变位点基因突变频率为0的FFPE阴性细胞系DNA稀释用于基因检测的FFPE参考品，进一步得到更低期望目标突变位点基因突变频率的用于基因检测的FFPE参考品；这样可以更加灵活的进行调整，得到更低期望目标突变位点基因突变频率的用于基因检测的FFPE参考品。优选的，FFPE阴性细胞系DNA为GM12878细胞系DNA。
优选的，S43中DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率的检测结果为ddPCR和NGS(高通量测序)的检测结果；利用ddPCR和高通量测序对混合DNA等位基因频率进行双重测定，确保突变频率的准确性。优选地，在获得所述用于基因检测的FFPE参考品后还可以包括用ddPCR和高通量测序对参考品的目标基因突变频率进行测定验证。
在本发明中，肿瘤细胞系全基因组DNA提取优选的采用全基因组提取试剂盒实现；在本发明具体实施过程中，可以采用德国QIAGEN公司的核酸提取试剂盒(QIAamp DNA MiniKit，货号：51304)。
根据本发明一种典型的实施方式，S1中在对肿瘤细胞系进行细胞培养之后还包括对培养的肿瘤细胞系进行计数的步骤；优选的，当肿瘤细胞系的数目>2×106cells/mL时，收集细胞沉淀。
根据本发明一种典型的实施方式，S2中采用10％中性福尔马林对细胞沉淀进行固定，优选的，固定时间为2～4h，优选2h；优选的，琼脂糖凝胶的浓度为1～5％，优选2％；优选的，在用琼脂糖凝胶包裹细胞团块时，琼脂糖凝胶的温度为60℃，琼脂糖凝胶的体积为10～50μL，优选30μL；优选地，细胞团块制作成细胞蜡块前使用10％中性福尔马林固定1～4h，优选的2h。
根据本发明一种典型的实施方式，S3中采用ddPCR和高通量测序对肿瘤细胞系的基因组DNA进行基因突变频率测定；优选地，高通量测序包括illumina测序平台和/或iontorrent测序平台的测序。
根据本发明一种典型的实施方式，在获得福尔马林固定石蜡包埋肿瘤细胞系的全基因组DNA后，利用ddPCR对肿瘤细胞系的全基因组进行基因突变频率测定。在本发明中，每个样品优选的重复测定三次。
在本发明中，肿瘤细胞系优选的为对临床检测具有明确参考意义的细胞系，根据本发明一种典型的实施方式，肿瘤细胞系包括选自由AMO-1、NCI-H929、A549、A-427、HCT116、THP-1、NCI-H2347、SK-HEP-1、PC-9、NCI-H1975、KYSE450、SW48、NCI-H2228、NCI-H3122、HCC78、NCI-N87、EBC-1、NCI-H1299、NCI-H460、SW948和GM12878组成的组中的一种或多种；上述肿瘤细胞系囊括肿瘤热点突变的9个基因，并且包含了单一核苷酸变异(SNV)、基因拷贝数变异(CNV)和融合多种常见的热点突变类型。
优选的，S1中在对肿瘤细胞系进行细胞培养之前还包括对获得肿瘤细胞系进行验证的步骤，验证包括提取肿瘤细胞系的基因组DNA，用一代测序对基因突变位点进行验证。通过对肿瘤细胞系的基因突变位点进行一代测序验证，最大程度地确保参考品的突变背景的准确性。
在本发明中，目标基因突变频率为确定肿瘤样品测序检测限所需等位基因突变频率或肿瘤样品测序的阳性质控品所需等位基因突变频率，也是为检测验证所需的最低检测限频率或质控品所需的频率。本发明中，检测限优选为1％；在本发明中，阳性质控品所需等位基因突变频率为5％、10％或15％，优选为5％。
根据本发明一种典型的实施方式，目标突变位点为1个或多个。
在本发明一种典型的实施方式中，肿瘤细胞系在离心后弃上清，收集细胞。用PBS清洗2-3次后用10％的福尔马林固定细胞1小时，离心收集细胞，弃掉福尔马林，用PBS清洗细胞2-3次后用琼脂糖凝胶包裹细胞沉淀形成细胞团块。琼脂糖凝胶优选的为2％的浓度，温度为60℃，体积为30μL。
在本发明一种典型的实施方式中，细胞蜡块的制作优选的用10％的中性甲醛固定细胞团块2个小时，按常规脱水程序处理。脱水程序进行完毕后，从自动化脱水机中取出组织块，优选的进行常规石蜡包埋。优选地将包埋好的细胞系蜡块放在冷冻台上冷冻，待蜡块凝固冷却后，把每块蜡块切成若干蜡卷。
在本发明一种典型的实施方式中，福尔马林固定石蜡包埋细胞系全基因组DNA提取优选的采用石蜡包埋组织样本DNA提取试剂盒实现；在本发明具体实施过程中，采用德国Jena公司的核酸提取试剂盒(blackPREP FFPE DNA kit，货号：845-BP-0020050)。
在本发明一种典型的实施方式中，优选地将含有目标突变位点的肿瘤细胞系DNA混合成较高频率的DNA混合物，可以混合成1个或多个混池(DNA混合物)，用ddPCR和NGS对DNA混合物进行频率测定，再用相应的目标突变位点基因突变频率为0的阴性细胞系DNA倍比稀释肿瘤细胞系DNA混合物。阴性细胞系优选为GM12878细胞。在获得DNA混合物目标突变位点基因突变频率后，将获得的混合DNA的目标突变位点基因突变频率与目标突变频率比较，如混合DNA的目标突变位点基因突变频率与目标突变频率一致，则获得参考品；若混合DNA的目标突变位点基因突变频率与目标突变频率不一致，则根据ddPCR和NGS的结果细化细胞系DNA的混合比例；重复上述步骤，直到混合DNA的目标突变位点基因突变频率与目标突变频率一致。
在本发明中，混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率一致中的“一致”允许存在偏差的范围为1‰～2％。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种用于基因检测的FFPE参考品。该用于基因检测的FFPE参考品采本发明的上述制备方法制备而成。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种上述用于基因检测的FFPE参考品在制备基因检测试剂盒中的应用。
下面结合实施例对本发明进行详细说明，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1
制备肺癌和肠癌热点突变福尔马林固定石蜡包埋参考品的方法，包括以下步骤：
1)对购买于南京科佰的细胞系进行培养，所涉及的21种细胞系如下：AMO-1，NCI-H929，A549，A-427，HCT116，THP-1，NCI-H2347，SK-HEP-1，PC-9，NCI-H1975，KYSE450，SW48，NCI-H2228，NCI-H3122，HCC78，NCI-N87，EBC-1，NCI-H1299，NCI-H460，SW948，GM12878。细胞系具体相关信息如下表1：
表1
2)把培养的细胞系进行基因组DNA提取，使用凯杰企业管理(上海)有限公司生产的QIAamp DNA Mini Kit(货号：51304)核酸提取试剂盒。
3)对提取的各肿瘤细胞系的DNA进行一代测序验证，从而明确细胞株的突变背景。
4)制备细胞系蜡块，具体方法如下：
(1)收集细胞
a.悬浮细胞
离心适当数目细胞(最大浓度：5×106cells/mL)，用15mL离心管300g离心5分钟，弃上清。
b.单层细胞
用胰酶消化贴壁细胞，加入PBS进行吹吸后取出置于15ml离心管中，离心机300g进行常温离心5min，弃上清。
(2)加适量PBS重悬，300g，离心5分钟，弃去上清。加入10％中性福尔马林固定细胞沉淀1小时，1小时后，将10％中性甲醛固定过的细胞300g，离心5分钟，弃去上清。加适量PBS重悬，300g，离心5分钟，弃去上清，重复一次。配制2％琼脂糖凝胶，加到1.5ml EP管中，静置待凝固。待EP管中的胶凝固后，取细胞沉淀到凝固的琼脂上，再加入琼脂糖凝胶，混合均匀，静置凝固，形成细胞团块。取出细胞团块，用10％的中性福尔马林固定2个小时，按常规脱水程序处理。脱水程序进行完毕后，从自动化脱水机中取出组织块，进行常规包埋。将包埋好的蜡块放在冷冻台上冷冻，待蜡块凝固冷却后，按要求把每块蜡块切成若干蜡卷，放进试管中。
5)提取福尔马林固定石蜡包埋细胞系蜡卷的全基因组DNA，采用德国Jena公司的核酸提取试剂盒(blackPREP FFPE DNA kit，货号：845-BP-0020050)。
6)使用ddPCR和NGS对福尔马林固定石蜡包埋的细胞系DNA进行突变频率测定，上述20种细胞的突变位点和基因突变结果见表2。
表2
7)根据参考品所需突变频率，如fusion、SNV是1％的突变频率，CNV为2.5的参考品，对各肿瘤细胞系基因组DNA进行混合。
8)对混合基因组DNA进行ddPCR和高通量测序进行突变频率测定，如果第一轮不能得到目标突变频率，则还需进行第二轮的细化。
重复7)和8)步进行混合和频率测定直至接近目标突变频率。
对步骤8)中的混合基因组进行三次以上突变频率测定，若果一致，则进行标准品的分装记录。
本实施例中各个细胞系基因组DNA具体稀释方案和稀释后的突变频率如表3所示。
表3.各个细胞系具体的倍比稀释方案和稀释后的突变频率
续表3
续表3(稀释后的突变频率)
综上所述，本发明对肿瘤细胞系进行福尔马林固定、石蜡包埋制备细胞系蜡块，进行一代测序确保参考品的突变背景的准确性，应用ddPCR和高通量测序双重验证，最大程度地保证参考品突变频率的准确性，从而在现有的常规实验室技术平台上实现了使用肿瘤细胞株制备出有效的、可批量生产的福尔马林固定石蜡包埋肿瘤测序参考品。
应用本发明的技术方案，通过对肿瘤细胞系的基因突变位点进行一代测序验证，最大程度地确保参考品的突变背景的准确性；对验证过的肿瘤细胞系进行福尔马林固定石蜡包埋，可以更好地模拟临床样本的情况；利用ddPCR和高通量测序对混合DNA等位基因频率进行双重测定，确保突变频率的准确性。此参考品可大规模地生产，从而能够实现用一个福尔马林固定石蜡包埋的参考品大批量、重复验证各临床检测试剂盒检测的准确性和稳定性等性能的目的。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于基因检测的FFPE参考品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，对肿瘤细胞系进行细胞培养，收集细胞沉淀；
S2，对所述细胞沉淀进行福尔马林固定，然后用琼脂糖凝胶包裹形成细胞团块，将所述细胞团块制作成细胞蜡块；
S3，提取所述细胞蜡块中肿瘤细胞系的基因组DNA，并对所述肿瘤细胞系的基因组DNA进行基因突变频率测定；
S4，把含有目标突变位点的所述肿瘤细胞系的基因组DNA混合成目标突变频率的DNA混合物，所述DNA混合物即为用于基因检测的FFPE参考品。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S4包括：
S41，把含有目标突变位点的所述肿瘤细胞系的基因组DNA进行预混合得到DNA预混合物，测定得到所述DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率；
S42，将所述DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率与目标突变频率进行比较；
S43，如果所述DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率等于所述目标突变频率，则所述DNA预混合物即为所述用于基因检测的FFPE参考品；
如果所述DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率与所述目标突变频率不一致，则根据所述DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率的检测结果进一步细化调整混合比例，重复所述S41和S42直到得到的DNA混合物的目标突变位点基因突变频率与所述目标突变频率一致，获得所述用于基因检测的FFPE参考品。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S43进一步包括：采用目标突变位点基因突变频率为0的FFPE阴性细胞系DNA稀释所述用于基因检测的FFPE参考品，进一步得到更低期望目标突变位点基因突变频率的用于基因检测的FFPE参考品；
优选的，所述FFPE阴性细胞系DNA为GM12878细胞系DNA。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S43中所述DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率的检测结果为ddPCR和NGS的检测结果。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S1中在对肿瘤细胞系进行细胞培养之后还包括对培养的肿瘤细胞系进行计数的步骤；
优选的，当所述肿瘤细胞系的数目>2×106cells/mL时，收集所述细胞沉淀。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S2中采用10％中性福尔马林对所述细胞沉淀进行固定，优选的，固定时间为2～4h；
优选的，所述琼脂糖凝胶的浓度为1～5％；
优选的，在用所述琼脂糖凝胶包裹所述细胞团块时，所述琼脂糖凝胶的温度为60℃，所述琼脂糖凝胶的体积为10～50μL；
优选地，所述细胞团块制作成所述细胞蜡块前使用10％中性福尔马林固定1～4h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S3中采用ddPCR和高通量测序对所述肿瘤细胞系的基因组DNA进行基因突变频率测定；
优选地，所述高通量测序包括illumina测序平台和/或ion torrent测序平台的测序。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述肿瘤细胞系包括选自由AMO-1、NCI-H929、A549、A-427、HCT116、THP-1、NCI-H2347、SK-HEP-1、PC-9、NCI-H1975、KYSE450、SW48、NCI-H2228、NCI-H3122、HCC78、NCI-N87、EBC-1、NCI-H1299、NCI-H460、SW948和GM12878组成的组中的一种或多种；
优选的，所述S1中在对所述肿瘤细胞系进行细胞培养之前还包括对获得肿瘤细胞系进行验证的步骤，所述验证包括提取所述肿瘤细胞系的基因组DNA，用一代测序对基因突变位点进行验证；
优选地，所述S3的基因突变频率测定中基因突变包括单一核苷酸变异、基因拷贝数变异和融合；
优选地，所述目标突变位点为1个或多个；
优选地，所述目标突变频率为检测验证所需的最低检测限频率或质控品所需的频率；
更优选的，所述目标突变频率为5％、10％或15％。
9.一种用于基因检测的FFPE参考品，其特征在于，采用如权利要求1至8中任一项所述的制备方法制备而成。
10.一种如权利要求9所述的用于基因检测的FFPE参考品在制备基因检测试剂盒中的应用。
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