CN113817717A - 循环肿瘤dna参考品的制备方法、产品及用途 - Google Patents

循环肿瘤dna参考品的制备方法、产品及用途 Download PDF

Info

Publication number
CN113817717A
CN113817717A CN202111029341.8A CN202111029341A CN113817717A CN 113817717 A CN113817717 A CN 113817717A CN 202111029341 A CN202111029341 A CN 202111029341A CN 113817717 A CN113817717 A CN 113817717A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
circulating tumor
tumor
apoptosis
dna reference
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111029341.8A
Other languages
English (en)
Inventor
钟果林
茅矛
李世勇
朱丹丹
陈彦
封裕敏
吴巍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhengzhou Siqin Biotechnology Co ltd
Shenzhen Siqin Medical Technology Co ltd
Original Assignee
Zhengzhou Siqin Biotechnology Co ltd
Shenzhen Siqin Medical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhengzhou Siqin Biotechnology Co ltd, Shenzhen Siqin Medical Technology Co ltd filed Critical Zhengzhou Siqin Biotechnology Co ltd
Priority to CN202111029341.8A priority Critical patent/CN113817717A/zh
Publication of CN113817717A publication Critical patent/CN113817717A/zh
Priority to US17/901,431 priority patent/US20230079748A1/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请提出了一种制备循环肿瘤DNA参考品的方法，该方法包括：将获得的肿瘤细胞进行诱导细胞凋亡，以便获得具有断裂DNA的肿瘤细胞；对所述具有断裂DNA的肿瘤细胞进行DNA提取，以便获得所述循环肿瘤DNA参考品。本申请所提出的参考品制备方法简单易行，适合于各种肿瘤细胞的循环肿瘤DNA参考品制备，并且其所保留的变异信息能够模拟动物体内循环肿瘤DNA的情况，利于检测方法的校正、评估。

Description

循环肿瘤DNA参考品的制备方法、产品及用途
技术领域
本申请属于生物技术领域，具体地，涉及循环肿瘤DNA参考品的制备方法、产品及用途。
背景技术
循环游离DNA(circulating cell-free DNA,cfDNA)是细胞凋亡或坏死后释放入血的，通常其长约150到200个碱基对，半衰期约0.5-1小时。在正常人体中，cfDNA含量极微，通常为10-15ng/mL，而肿瘤患者的cfDNA含量明显升高。肿瘤患者中，外周血所测得的肿瘤细胞所释放的DNA又称为循环肿瘤DNA(ctDNA，circulating tumor DNA)，ctDNA是cfDNA的一部分。肿瘤患者中，ctDNA占cfDNA的比例差异巨大，少至0.1％，多到超过90％。随着新一代测序技术(Next-Generation Sequencing，NGS)的出现，大规模平行测序成为可能，相较于第一代测序技术，NGS技术检测速度快、准确率高、成本低、覆盖度广。随着NGS技术的不断成熟，加上其具有传统测序技术所缺乏的精确、灵敏、价廉、平行大规模处理等优势，利用NGS检测cfDNA这一技术在肿瘤的早期诊断和筛查、用药指导、疗效和耐药监测、复发监测和预后判断等方面得到了广泛的应用。之前的研究关于cfDNA的研究主要侧重在不同类型变异(点突变、插入、缺失等)、拷贝数变异以及基因相关性和多态性进行分析。目前越来越多的研究表明cfDNA在基因组中的片段化模式在正常人和癌症患者中有着明显的差异，在不同组织来源的癌症中其模式也存在着差别。通过将cfDNA片段化模式纳入考量，可以评估受检者是否具有癌症信号，以及溯源癌症发生部位。
然而对于cfDNA的单核苷酸变异(single nucleotide variant,点突变)、结构变异(structural variation,SV)、拷贝数变异(CNV)以及片段化大小(fragment size)等变异信息的检测性能，需要建立参考物质。参考物质作为一把“标尺”，完成方法建立、方法优化和性能确认的过程，在方法应用于临床之前，体现方法检测的真实性能。此外，实验室进行室内质量控制，第三方机构开展室间质量评价、能力验证，均需要相应的参考物质来保证检测结果的可靠性。参考物质是实现高通量测序检测标准化、进行性能确认或性能验证、室内质量控制和室间质量评价最重要的前提物质条件。
理想的参考物质来源于临床样本，但临床样本都属于珍贵的研究材料，且数量有限，很难作为参考物质的长期来源。
由此，开发一种可以代替临床样本、与临床样本一致性高、制备简单的循环肿瘤DNA参考品至关重要。
发明内容
发明人发现，血浆中游离DNA来自凋亡的片段特征与人基因组DNA是完全不同的。以往制备cfDNA标准品通常采用超声或者片段化酶切等方法将人基因组DNA打断至100～200bp，但是片段含有的序列信息、片段长度和随机分布的特点均与真实样本不符。而目前最常用的是微球菌核酸酶(Micrococcal nuclease；MNase)酶切的方法。MNase是一种可以降解核小体连接区DNA的核酸酶，MNase消化染色质可以释放出一个个独立的核小体，这种方法得到的模拟cfDNA样本则片段长度为146bp左右，相对真实血浆样本中cfDNA组分长度(主峰分布在166bp)较短。并且MNase酶解法具有一定的局限性，首先，MNase偏向于切割A/T碱基位点，导致核小体在A/T富集区域的表达量低于真实情况；其次，MNase不能在核小体边界精确切割，这导致在确定染色质的开放位置与真实情况存在差异；而且，MNase偏向于消化脆性核小体。故MNase无法制备模拟cfDNA组分样本。因此，建立一种可以用于cfDNA变异信息检测的参考物质就显得尤为重要。
为此，在本发明的第一方面，提出了一种制备循环肿瘤DNA参考品的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将获得的肿瘤细胞进行诱导细胞凋亡处理，以便获得具有断裂DNA的肿瘤细胞；对所述具有断裂DNA的肿瘤细胞进行DNA提取，以便获得所述循环肿瘤DNA参考品。根据本发明实施例的方法简单易行，合成周期短，适用于各种肿瘤细胞的循环肿瘤DNA参考品制备，并且样本来源简单易行，成本低廉，适合大规模制备，能够大批量生产，以广泛应用于方法学验证、室内质量控制和室间质量评价，并且具有较好的重复性和一致性。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述诱导细胞凋亡处理包括：利用细胞凋亡诱导剂与所述肿瘤细胞进行接触培养，其中，所述细胞凋亡诱导剂包括在DNA复制过程中与拓扑异构酶DNA复合物结合，阻止DNA链重新组装而引起DNA双链断裂的细胞凋亡诱导剂。
根据本发明的实施例，所述接触培养的时间为2～8h。发明人经过大量的研究发现，诱导处理时间会对所制备的参考品具有影响，处理时间过长或过短均会导致参考品所保留的变异信息的偏差，造成其与所模拟的cfDNA的一致性降低，不能成为良好的参考品。
根据本发明的实施例，所述接触培养的时间为5h。
根据本发明的实施例，所述细胞凋亡诱导剂选自CPT、As2O3、Notopterol、Gracillin中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述细胞凋亡诱导剂为CPT。发明人经过大量的筛选发现，使用CPT具有更好的模拟效果，且该物质可以适配于多种肿瘤细胞，具有广谱性。
根据本发明的实施例，所述细胞凋亡诱导剂的浓度为5～15μM。所述细胞凋亡诱导剂的浓度为5～15μM。发明人经过大量的研究发现，利用特定药物诱导细胞的凋亡不会改变细胞内DNA点突变、拷贝数变异、结构变异等变异信息，可以很好地模拟动物体内cfDNA、的变异信息。发明人经过大量的研究发现，相比于超声破碎、全反式维甲酸诱导、血清饥饿处理和密集培养肿瘤细胞等方法，本申请的方法会引起DNA断裂形成类似于核小体单体及其复合物的产物，可以很好地模拟cfDNA片段化模式。
根据本发明的实施例，所述细胞凋亡诱导剂的浓度为10μM。发明人经过大量的研究发现，诱导剂的浓度对参考品的质量具有影响，过大或过低的浓度会影响制得的参考品中变异信息的保留，例如造成DNA断裂，形成类似于核小体单体及其复合物产物，或造成DNA片段过小或过大，DNA片段形式与所模拟的cfDNA的片段形式不同。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备循环肿瘤DNA参考品的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用CPT对肿瘤细胞进行接触培养，所述接触培养的时间为5h，所述CPT的浓度为10μM；对所述接触培养后的细胞进行DNA提取，以便获得循环肿瘤DNA参考品。根据本发明的实施例，利用本发明的方法能最大限度的模拟真实的血浆cfDNA片段化模式并且不影响点突变、拷贝数变异、结构变异的检出，用这种方法制备的DNA可以作为点突变、拷贝数变异、结构变异、DNA片段化大小检测的参考物质，且该方法操作简便，合成周期短，能够大批量生产。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种循环肿瘤DNA参考品，所述循环肿瘤参考品是通过上述方法制得的。根据本发明实施例的参考品可以作为点突变、拷贝数变异、结构变异、DNA片段化大小检测的参考物质，能最大限度的模拟真实的血浆cfDNA片段化模式、点突变、拷贝数变异、结构变异。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种评估循环肿瘤DNA参考品质量是否达标的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
1)对所述循环肿瘤DNA参考品源自的未进行诱导细胞凋亡处理的所述肿瘤细胞进行DNA提取，并进行DNA文库构建，以便获取所述肿瘤细胞中DNA的测序读段；
2)对权利要求7所述的循环肿瘤DNA参考品进行DNA文库构建，以便获取所述循环肿瘤DNA参考品的测序读段；
3)获取1)中所述肿瘤细胞的变异位点以及2)中所述循环肿瘤DNA参考品的变异位点；
4)将所述循环肿瘤DNA参考品的变异位点与所述肿瘤细胞的变异位点进行对比，所述循环肿瘤DNA参考品的变异位点与所述肿瘤细胞的变异位点一致，是所述循环肿瘤DNA参考品质量达标的指示。
根据本发明的实施例，所述环肿瘤DNA参考品变异位点包括下列至少之一：
单核苷酸变异、结构变异、拷贝数变异和片段化大小。
在本发明的第五方面，本发明提出了上述方法、循环肿瘤DNA参考品在构建肿瘤预测模型中的用途。根据本发明的实施例，利用本申请的方法所制备的循环肿瘤DNA参考品，可在构建肿瘤预测模型中用于模型准确性检测，还可用于筛选肿瘤预测模型的标准品。例如，构建泛癌种早筛方法或模型。正常人的cfDNA片段图谱更为稳定，癌症患者的cfDNA片段图谱相对杂乱，二者有明显的差异，利用该种差异作为癌症早期筛查的基础，采用cfDNA低深度全基因组测序加血浆肿瘤标志物检测，并且利用机器学习的方法构建多变量患癌风险值(MCRS)模型来区分癌症患者和正常人，实现多种癌症的早期筛查。MCRS模型是经过比较正常人群和癌症患者拷贝数变异(copy number variation,CNV)、FS(fragment size,片段大小)、protein markers三个维度指标的分布，并对所有量化的数值指标进行标准化转化，最后对每个标准化指标的患癌贡献度进行加权，得到受检者整体患癌风险分值CRS。对于cfDNA的单核苷酸变异(single nucleotide variant,点突变)、结构变异(structuralvariation,SV)、拷贝数变异(CNV)以及片段化大小(fragment size)等变异信息的检测性能，利用本申请的参考品作为参考物质，完成方法建立、方法优化和性能确认的过程，在方法应用于临床之前，体现方法检测的真实性能。
在本发明的第六方面，本发明提出了上述参考品在制备预测肿瘤的试剂盒中的用途。利用本申请的方法所制备的参考品用于预测肿瘤的试剂盒中。实验室进行室内质量控制，第三方机构开展室间质量评价、能力验证，均需要参考品来保证检测结果的可靠性。本申请的参考品可以实现高通量测序检测标准化、进行性能确认或性能验证、室内质量控制和室间质量评价。
根据本发明的实施例，检测样本来源于动物的组织、血液、肿瘤细胞等。
本发明第六方面提供一种预测肿瘤的试剂盒，其含有上述的循环肿瘤DNA参考品。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的不同DNA片段大小对比结果，其中，A为超声打断得到的DNA，B为诱导细胞凋亡得到的DNA，C为真实癌症患者血浆cfDNA；
图2是根据本发明实施例的不同细胞采用不同诱导凋亡方法制备片段化DNA，其中，A-D为HL-60resistance细胞分别按照CPT处理5h、ATRA处理3d、密集培养3d以及CPT处理24h得到的DNA片段分布图，E-G为NB-4细胞分别按照CPT处理5h、ATRA处理3d以及密集培养3d得到的DNA片段分布图；
图3是根据本发明实施例的实验组与对照组拷贝数变异一致性分析；
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本文中，所述“CPT(Camptothecin)”是指喜树碱，一种癌症治疗药物。在本文中，所述“单核苷酸变异”是指基因序列中单个核苷酸发生改变。
在本文中，所述“结构变异”是指染色体结构的大片段改变，包括重复(duplication)、缺失(deletion)、倒位(inversion)和易位(translocation)等。
在本文中，所述“拷贝数变异”是指基因拷贝数变异(copy-number variation,CNV)，是许多人类疾病(如癌症、遗传性疾病、心血管疾病)的一种重要分子机制。通常指基因组中长度在1Kb以上的DNA片段发生了基因组结构变异，包括显微水平(microscopic)和亚显微水平(submicroscopic)的DNA缺失、插入、重复。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例
1.实验方法
1.1.细胞培养以及诱导细胞凋亡
配置培养液
20％FBS+80％IMDM+庆大霉素(庆大霉素用量：4万单位/500mL)
CPT的配置与保存
CPT用DMSO溶解，最大溶解度是5mg/mL，配置成4mg/mL，使用时稀释至1mg/mL，溶解后的CPT用0.22μm的针头滤器过滤除菌，分装到1.5mL EP管内，然后放置在4℃冰箱存储。DMSO在4℃的条件下就会凝固，使用时提前拿出来解冻。
细胞准备：使用2–4x106个HL-60resistance细胞或者NB-4细胞采用75cm2培养瓶并加入20mL完全培养基37℃5％CO2培养箱进行细胞培养过夜，确保细胞进入对数生长期。分别做以下处理。
CPT：细胞培养过夜后，更换新的20mL培养液，并加入69.67ul CPT使终浓度为10μM，孵育5h或者24h后搜集细胞。
ATRA：细胞培养过夜后，更换新的20mL培养液，并加入ATRA使终浓度为10μM，孵育3d后搜集细胞。
密集培养：细胞培养过夜后，不更换培养液也不传代，密集培养3d后搜集细胞。
收集细胞：800rpm离心7min收集细胞沉淀。
提取细胞中DNA
收集的细胞中加入200μL PBS，轻轻吹散或弹散细胞，使细胞重悬于PBS中。
加入4μL RNase A，Vortex混匀。室温(15-25℃)放置3-5分钟。
加入20μL蛋白酶K，Vortex混匀。
加入200μL样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟。
加入200μL无水乙醇，Vortex混匀。
把上一步中的混合物加入到DNA纯化柱内。6000g(约8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
加入500μL洗涤液I，6000g(约8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
加入600μL洗涤液II，18000g(约12000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
再18000g(约12000rpm)离心1分钟，以去除残留的乙醇。
将DNA纯化柱置于一个洁净的1.5mL离心管上，加入50μL洗脱液。室温放置3分钟。12000rpm离心1分钟。所得液体即为纯化得到的总DNA。
取1μL DNA采用Qubit进行定量。
取1μL DNA采用agilent 2100进行片段大小测定。如果细胞发生凋亡，即可观察到典型的DNA ladder。
纯化后DNA建库
按起始量50ng标准计算每个样本所需要的DNA溶液体积，并取相应体积的DNA置于对应的200μL PCR管内。向每个200μL PCR管内加入适量的无核酸酶水，使终体积达到50μL。
末端修复&加A。按照表1所示，配制末端修复&加A反应体系。
表1：
Figure BDA0003242364510000071
向每个装有DNA的200μL PCR管内分别加入10μL上述末端修复&加A反应体系，混匀后低速离心，设定PCR仪，程序如表2所示。
表2
Figure BDA0003242364510000072
将反应体系从PCR仪中取出，放置在小黄板上，并进行接头连接反应，接头连接反应体系如表3所示。
表3：
Figure BDA0003242364510000073
向每个200μL PCR反应管中加入上述反应体系，混合均匀，并放入PCR仪中，设定温度20℃，反应15min。
DNA纯化:配制80％乙醇。将事先在室温平衡好的磁珠充分震荡混匀，并向每个1.5mL离心管中分装88μL磁珠。
将上述加了adapter的DNA与磁珠混匀。室温静置10min。将1.5mL样本管置于磁力架上，进行磁珠吸附，直至溶液澄清，小心移除上清液。
再加入200μL 80％乙醇，静置30s后弃上清液。此过程中离心管一直在磁力架上。
重复上一个步骤一次。
应将所有残留的乙醇溶液移除。打开管盖，常温下干燥磁珠，挥发乙醇，以免过多乙醇影响后续反应体系中酶的效果。注意：不可过分干燥磁珠，否则会导致DNA不容易从磁珠上洗脱下来，造成产量损失。当磁珠表面不再有光泽时即为干燥完成。
每个样本管内加入21μL Nuclease-Free water，重悬磁珠，充分混匀后室温静置5min。
准备一批新的200μL PCR管，管盖管壁标注对应的样本编号。将样本管置于磁力架，进行磁珠吸附，直至溶液澄清后，将上清液转移至对应编号的PCR管中，作为PCR实验的模板。
文库扩增：配制文库扩增反应体系如表4所示。
表4：
Figure BDA0003242364510000081
每个200μL样本管内加入30μL Pre-PCR扩增反应体系，温和混匀并低速离心，放入PCR仪中反应。
将PCR仪设定程序如表5所示。
表5：
Figure BDA0003242364510000082
PCR反应结束后，开始进行文库纯化。
文库纯化。准备相应数量的1.5mL样本管，并做好相应的标记。
将事先在室温平衡好的磁珠充分震荡混匀，并向每个管中分装50μL磁珠。将上述加了adapter的DNA与磁珠混匀。室温静置10min。将1.5mL样本管置于磁力架上，进行磁珠吸附，直至溶液澄清，小心移除上清液。
再加入200μL 80％乙醇，静置30s后弃上清液。此过程中离心管一直在磁力架上。
重复上一步骤一次。
应将所有残留的乙醇溶液移除。打开管盖，常温下干燥磁珠，挥发乙醇，以免过多乙醇影响后续反应体系中酶的效果。注意：不可过分干燥磁珠，否则会导致DNA不容易从磁珠上洗脱下来，造成产量损失。当磁珠表面不再有光泽时即为干燥完成。
每个样本管内加入35μL Nuclease-Free water，重悬磁珠，充分混匀后室温静置5min。
准备一批新的1.5mL离心管，并做好标记。将1.5mL样本管置于磁力架上，进行磁珠吸附，直至溶液澄清后，将上清液转移至对应的新的1.5mL离心管。
取1μL DNA采用Qubit进行定量。
取1μL DNA采用agilent 2100进行片段大小测定。
样本放入-20℃冰箱保存。
以下操作为gDNA采用超声打断回收得到的DNA与真实癌症患者血浆cfDNA进行对比
1.2.超声打断
使用Covaris M220非接触式超声波破碎仪进行DNA的片段化处理。
开机检查：(1)检查固定在仪器顶部的电脑与机器的线路连接妥当。(2)确认水盘(Drip Tray)放置在机器下方。(3)插入操作管支架(Tube Holder)。
依次开启仪器电源、笔记本电脑和仪器控制软件，使其处于运行状态。
将操作管支架(Tube Holder)顶部的滑行砝码(Siding Weight)拉起并旋转90°，用水瓶(Wash Bottle)将约15mL蒸馏水或去离子水加入支架中心，水位到达InstrumentStatus-Water Level呈现绿色“√”状态或超过运行标记(“RUN”marker)且水位刚好完全接触到操作管支架(Tube Holder)为宜。
在1.5mL的PCR管中将1μg样品使用1X Low TE Buffer定容为50μL。将稀释好的样品充分混匀，并小心地加入打断管中，避免过程中出现气泡。
将操作管支架(Tube Holder)顶部的滑行砝码(Sliding Weight)拉起并旋转90°。
将打断管放入打断仪中，旋转并放下滑行砝码，使之压住样品管，然后关闭安全门，参考表6打断程序运行打断仪。
表6：
设置 参考值
最高入射功率(W) 75
工作系数(％) 10
超声波能量传递的数目(cpb) 200
处理时间(sec) 210
在RUN界面中点击“Run”按钮，运行程序。
仪器运行结束后，用配套注射器清空水浴；若水盘(Drip Tray)有水，需倒掉并用无尘纸擦干。
关闭软件，然后关闭仪器主机，最后关闭电脑。
注意事项：(1)实验室的室温应保持在15-30℃，不宜过冷。(2)在没有水浴的情况下，禁止运转程序，以免损坏传感器。(3)水浴只能使用双蒸水或去离子水。(4)每天使用完毕，必须清空水浴，擦干水盘，以防藻类等微生物滋生。(5)操作时关闭安全门。(6)打断好的DNA如果不进行下一步试验，可将样本暂时存放在-20℃冰箱。
1.3.血浆cfDNA提取
准备好实验所需的仪器、试剂、耗材。打开水浴锅，并调节温度至60℃。打开金属浴，并调节温度至56℃。确认试剂盒有效期，buffer ACB是否加有合适量的异丙醇，bufferACW1以及buffer ACW1是否加有合适量的无水乙醇。
若是分离的新鲜血浆，则直接进行cfDNA提取。若血浆冻存在–80℃条件下，需将血浆样本解冻后，在16,000x g[固定角转头]的离心力以及+4℃的温度条件下离心5min以去除冷冻沉淀。
ACL混合液配置：3.5mL Buffer ACL加入5.6μL carrier RNA，轻轻颠倒混匀，防止产生气泡。
转移400μL Proteinase K至装有4mL血浆的50mL离心管中。间断涡旋30s以充分混匀。
加入3.2mL的Buffer ACL(含有1.0μg carrier RNA)。剧烈涡旋混匀15秒。确保离心管经剧烈涡旋，以保证样本和Buffer ACL的重复混匀，从而实现高效的裂解。
注意：此步完成后请不要中断实验并立即进行下步的裂解孵育步骤。
将离心管接着60℃水浴30分钟。
向上述反应液中加入7.2mL的Buffer ACB。盖上管盖，间断涡旋15s以充分混匀。
将含有Buffer ACB的裂解液至于冰上孵育或冷藏孵育5min。
组装抽滤装置：把VacValve插在24孔底上，再把VacConnectors插入VacValve中，再将QIAamp Mini硅胶膜柱连接到VacConnectors上，最后把20mL扩容管插入到硅胶模柱上。确保扩容管插入紧实以防止样本泄露。注意：将2mL收集管留下至后续空转时才使用。并在硅胶模柱上做好样本编号的标记。VacValve可调节流速，VacConnectors可以防止污染，QIAamp Mini硅胶膜柱用于吸附DNA，扩容管用于装大体积血浆。
把孵育完的混合物转移至扩容管中，打开真空泵，待离心柱中的裂解液完全抽干后，关闭真空泵，打开24孔底座一侧的排气阀将压力释放到0兆帕。小心地将扩容管拆下并丢弃。
向QIAamp Mini硅胶膜柱中加入600μL的Buffer ACW1，关闭排气阀，并打开真空泵，进行抽滤液体。当离心柱中Buffer ACW1被抽干后，关闭真空泵，打开24孔底座一侧的排气阀将压力释放到0兆帕。
向QIAamp Mini硅胶膜柱中加入750μL的Buffer ACW2，关闭排气阀，并打开真空泵，进行抽滤液体。当离心柱中Buffer ACW2被抽干后，关闭真空泵，打开24孔底座一侧的排气阀将压力释放到0兆帕。
向QIAamp Mini硅胶膜柱中加入750μL的无水乙醇溶液，关闭排气阀，并打开真空泵，进行抽滤液体。当离心柱中无水乙醇被抽干后，关闭真空泵，打开24孔底座一侧的排气阀将压力释放到0兆帕。关闭真空泵电源。
盖上QIAamp Mini硅胶膜柱并从真空支管上取下后放置到干净的2mL收集管中，将VacConnector丢弃。收集管在全速条件(20,000x g；14,000rpm)下离心3min。
将QIAamp Mini硅胶膜柱放置到新的2mL收集管中，开盖并置于56℃条件下的金属浴上干燥10min至硅胶膜彻底干燥。
将QIAamp Mini硅胶膜柱取出后放置到干净的1.5mL洗脱管(试剂盒自带)中，并将使用过的2mL的收集管丢弃。
向QIAamp Mini硅胶膜柱中硅胶膜的中央小心加入55μL的Nuclease-free water。盖上管盖后在室温孵育3min。
将洗脱管置于小型离心机中全速(20,000x g；14,000rpm)离心1min来洗脱cfDNA。
质量标准与评估
Qubit HS定量：取1μLcfDNA使用
Figure BDA0003242364510000111
dsDNA HS Assay Kit定量，记录浓度。
Agilent 2100检测：测定cfDNA片段分布。
2.实验结果
2.1不同方法制备片段化DNA，诱导细胞凋亡得到的DNA更接近于真实的cfDNA片段化模式
将NB4细胞的DNA用超声打断至200-300bp得到的DNA，其片段大小如图1A。将NB4细胞用CPT处理5h后提取得到的DNA，其片段大小如附图1B。从真实癌症患者血浆中提取得到cfDNA，其片段大小如图1C。通过比较三者的片段大小以及分布的差异，发现将超声方法打断的DNA，其片段长度与分布均与真实cfDNA样本相差较大。而诱导细胞凋亡得到的DNA与癌症患者血浆DNA片段类似。其片段分布都呈单个核小体DNA、双核小体DNA、三核小体DNA……顺序排布，与真实血浆中cfDNA的片段化模式类似，因此用该方法制备的DNA可以作为分析cfDNA片段化模式的参考品。
2.2不同细胞采用不同诱导凋亡方法制备片段化DNA，寻找最优实验条件
表7：
Figure BDA0003242364510000121
结果如附图2所示，可以看到CPT处理5h为最优反应条件，而CPT处理24h得到的DNA，由于处理时间过长，导致有非常多的非特异性断裂，使得片段分布更短。ATRA以及密集培养得到的DNA与真实的血浆样本中cfDNA片段长度有一定偏差。而HL-60resistance细胞和NB4细胞采用CPT处理5h，其片段分布都呈单个核小体DNA、双核小体DNA、三核小体DNA……顺序排布，与真实血浆中cfDNA的片段化模式类似，因此可以用于制备作为分析cfDNA片段化模式的参考品。
2.3诱导细胞凋亡得到的DNA其点突变、拷贝数变异、结构变异等变异信息与未处理的细胞组DNA一致性高
将NB4细胞分成2份进行培养，其中1份(实验组)用CPT处理5h诱导细胞凋亡后进行DNA提取、文库构建以及测序分析；而另外1份(对照组)细胞作为对照，不用药物处理，然后提取DNA、DNA超声打断、文库构建以及测序分析。这两个样本的文库都进行全基因组测序，测序深度为50x。然后对测序数据进行比对分析，结果如下。
2.3.1实验组与对照组DNA的拷贝数变异一致性高，其相关系数R2等于0.935
通过对药物诱导细胞凋亡产生的DNA以及对照组DNA拷贝数变异进行一致性分析，如附图3所示，可以看到，其相关系数R2等于0.935。表明二者在CNV变异方面有很好的一致性。药物诱导细胞不会改变细胞的拷贝数变异信息。
2.3.2实验组与对照组都检测到了典型的结构变异：PML/RARA基因融合
NB4细胞是一种急性早幼粒细胞白血病细胞，其具有典型的PML/RARA基因融合变异，通过分析发现在实验组和对照组中，都检测到了该融合基因，具体结果如表8所示。表明药物诱导细胞不会改变细胞结构变异信息。
表8：实验组与对照组结构变异分析
Figure BDA0003242364510000122
PR：pair reads(配对reads数)；SR：splicing reads；(Ref,Alt)：(野生型跨过断点的reads数，突变型跨过融合位点的reads数)
2.3.3实验组与对照组SNP一致性高
最后分析了实验组与对照组中高频SNP，实验组与对照组的一致性达到99.6％。表明药物诱导细胞不会改变细胞点突变信息。
因此，本发明中采用诱导细胞凋亡获取DNA，能最大限度的模拟真实的血浆cfDNA片段化模式并且不影响点突变、拷贝数变异、结构变异的检出，用这种方法制备的DNA可以作为点突变、拷贝数变异、结构变异、DNA片段化大小检测的参考物质，且该方法操作简便，合成周期短，能够大批量生产。因此可以广泛应用于方法学验证、室内质量控制和室间质量评价，并且具有较好的重复性和一致性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (12)

1.一种制备循环肿瘤DNA参考品的方法，其特征在于，包括：
将获得的肿瘤细胞进行诱导细胞凋亡处理，以便获得具有断裂DNA的肿瘤细胞；
对所述具有断裂DNA的肿瘤细胞进行DNA提取，以便获得所述循环肿瘤DNA参考品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导细胞凋亡处理包括：
利用细胞凋亡诱导剂与所述肿瘤细胞进行接触培养，其中，所述细胞凋亡诱导剂包括在DNA复制过程中与拓扑异构酶DNA复合物结合，阻止DNA链重新组装而引起DNA双链断裂的细胞凋亡诱导剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述接触培养的时间为2～8h；
优选地，所述接触培养的时间为5h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞凋亡诱导剂选自CPT、As2O3、Notopterol、Gracillin中的至少之一；
优选地，所述细胞凋亡诱导剂为CPT。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述细胞凋亡诱导剂的浓度为5～15μM；
优选地，所述细胞凋亡诱导剂的浓度为10μM。
6.一种制备循环肿瘤DNA参考品的方法，其特征在于，包括：
利用CPT对肿瘤细胞进行接触培养，所述接触培养的时间为5h，所述CPT的浓度为10μM；
对所述接触培养后的细胞进行DNA提取，以便获得循环肿瘤DNA参考品。
7.一种循环肿瘤DNA参考品，所述循环肿瘤DNA参考品是通过权利要求1～5任一项所述的方法或权利要求6所述的方法制备获得的。
8.一种评估权利要求7所述的循环肿瘤DNA参考品质量是否达标的方法，其特征在于，包括：
1)对所述循环肿瘤DNA参考品源自的未进行诱导细胞凋亡处理的所述肿瘤细胞进行DNA提取，并进行DNA文库构建，以便获取所述肿瘤细胞中DNA的测序读段；
2)对权利要求7所述的循环肿瘤DNA参考品进行DNA文库构建，以便获取所述循环肿瘤DNA参考品的测序读段；
3)获取1)中所述肿瘤细胞的变异位点以及2)中所述循环肿瘤DNA参考品的变异位点；
4)将所述循环肿瘤DNA参考品的变异位点与所述肿瘤细胞的变异位点进行对比，所述循环肿瘤DNA参考品的变异位点与所述肿瘤细胞的变异位点一致，是所述循环肿瘤DNA参考品质量达标的指示。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述循环肿瘤DNA参考品的变异位点包括下列至少之一：
单核苷酸变异、结构变异、拷贝数变异和片段化模式。
10.权利要求7所述的循环肿瘤DNA参考品、权利要求1～5任一项所述的方法或权利要求6所述的方法制备的循环肿瘤DNA参考品在构建肿瘤预测模型中的用途。
11.权利要求7所述的循环肿瘤DNA参考品、权利要求1～5任一项所述的方法或权利要求6所述的方法制备的循环肿瘤DNA参考品在制备预测肿瘤的试剂盒中的用途。
12.一种预测肿瘤的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求7所述的循环肿瘤DNA参考品、权利要求1～5任一项所述的方法或权利要求6所述的方法制备的循环肿瘤DNA参考品。
CN202111029341.8A 2021-09-01 2021-09-01 循环肿瘤dna参考品的制备方法、产品及用途 Pending CN113817717A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111029341.8A CN113817717A (zh) 2021-09-01 2021-09-01 循环肿瘤dna参考品的制备方法、产品及用途
US17/901,431 US20230079748A1 (en) 2021-09-01 2022-09-01 Preparation method, product, and application of circulating tumor dna reference samples

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111029341.8A CN113817717A (zh) 2021-09-01 2021-09-01 循环肿瘤dna参考品的制备方法、产品及用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113817717A true CN113817717A (zh) 2021-12-21

Family

ID=78923726

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111029341.8A Pending CN113817717A (zh) 2021-09-01 2021-09-01 循环肿瘤dna参考品的制备方法、产品及用途

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20230079748A1 (zh)
CN (1) CN113817717A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106845153A (zh) * 2016-12-29 2017-06-13 安诺优达基因科技(北京)有限公司 一种用于利用循环肿瘤dna样本检测体细胞突变的装置
CN108517360A (zh) * 2017-02-27 2018-09-11 北京医院 一种循环肿瘤游离dna突变检测质控品及其制备方法
CN109055487A (zh) * 2018-08-09 2018-12-21 苏州安可济生物科技有限公司 模拟血浆基质的循环肿瘤游离dna标准品的制备
CN109628595A (zh) * 2019-01-18 2019-04-16 臻悦生物科技江苏有限公司 用于基因检测的ffpe参考品、其制备方法及应用
CN112176061A (zh) * 2020-10-12 2021-01-05 菁良基因科技(深圳)有限公司 一种血液肿瘤突变负荷参考品及其制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106845153A (zh) * 2016-12-29 2017-06-13 安诺优达基因科技(北京)有限公司 一种用于利用循环肿瘤dna样本检测体细胞突变的装置
CN108517360A (zh) * 2017-02-27 2018-09-11 北京医院 一种循环肿瘤游离dna突变检测质控品及其制备方法
CN109055487A (zh) * 2018-08-09 2018-12-21 苏州安可济生物科技有限公司 模拟血浆基质的循环肿瘤游离dna标准品的制备
CN109628595A (zh) * 2019-01-18 2019-04-16 臻悦生物科技江苏有限公司 用于基因检测的ffpe参考品、其制备方法及应用
CN112176061A (zh) * 2020-10-12 2021-01-05 菁良基因科技(深圳)有限公司 一种血液肿瘤突变负荷参考品及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAN J等: "application of digital PCR for assessing DNA fragmentation in cytotoxicity response", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 1863, no. 8, pages 1235 - 1242, XP055647707, DOI: 10.1016/j.bbagen.2019.05.001 *
张美玲等: "改良BlockerPCR检测EGFR-TKI耐药后非小细胞肺癌血浆EGFRT790M突变的价值", 复旦学报（医学版）, vol. 45, no. 1, pages 45 - 51 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20230079748A1 (en) 2023-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11365450B2 (en) Group classification and prognosis prediction system based on biological characteristics of gastric cancer
Wang et al. Genome-wide DNA methylation and transcriptome analyses reveal genes involved in immune responses of pig peripheral blood mononuclear cells to poly I: C
CN109371139A (zh) 一种基于高通量测序技术用于检测甲状腺癌致病相关基因变异的引物及其应用
CN107893116A (zh) 用于检测基因突变的引物对组合、试剂盒以及构建文库的方法
IL296316A (en) Systems and methods for deconvolution of expression data
CN110880356A (zh) 对卵巢癌进行筛查、诊断或风险分级的方法和装置
Tuteja et al. Serial analysis of gene expression (SAGE): unraveling the bioinformatics tools
CN106811517A (zh) 一种用于检测c-MET基因外显子14跳读突变的组合物及试剂盒
CN105209642A (zh) 基因组测序和表观遗传分析的方法
CN106337058B (zh) Cryl1-ift88融合基因及其在原发性肝细胞癌诊断和治疗中的应用
CN117100747A (zh) Foxo蛋白抑制剂在制备治疗胃腺癌肿瘤药物中的用途
CN115786501B (zh) 一种与结直肠癌早期筛查和辅助诊断相关的增强子功能位点及其应用
CN108998532B (zh) 一种直肠腺癌的诊治标志物
CN103911439A (zh) 系统性红斑狼疮羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法和应用
CN113817717A (zh) 循环肿瘤dna参考品的制备方法、产品及用途
CN110628914A (zh) 与乳腺癌相关的lncRNA标志物及其检测引物和应用
CN113106160B (zh) 评估肝谱系细胞成熟度的标志物、双组学试剂盒及构建方法
CN116334223A (zh) 可变剪接功能性位点rs61746794的检测试剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用
Arora et al. Comparative methylation and RNA-seq expression analysis in CpG context to identify genes involved in Backfat vs. Liver diversification in Nanchukmacdon Pig
CN113981079A (zh) Csf2rb及编码蛋白在女性非吸烟肺癌保护中的应用
JP2010502179A (ja) 予後診断方法
CN112029833A (zh) 一种用于肿瘤类器官培养条件选择的ctnnb1基因突变的快速鉴定方法
Ghorbanpour et al. Innovative molecular testing strategies for adjunctive investigations in hemostasis and thrombosis
CN108866198B (zh) 标志物loc105376380在直肠腺癌诊断和治疗中的应用
CN116144772B (zh) 一种Hsa_circ_0006117在制备治疗肺腺癌药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination