CN112176061A - 一种血液肿瘤突变负荷参考品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种血液肿瘤突变负荷(bTMB)参考品及其应用，涉及ctDNA形式的高TMB值和低TMB值参考品，对DNA使用酶切或超声两种方法进行片段化。该参考品能够很好地模拟真实的血浆ctDNA检测样本形式，为bTMB的准确定值提供了参考。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤基因突变检测领域，具体涉及一种血液肿瘤突变负荷(bTMB)参考品及其制备方法。
背景技术
肿瘤突变负荷(Tumor Mutation Burden，TMB)是一种可定量的生物标志物，用来反映肿瘤细胞中所含有的突变数目，通常用肿瘤细胞基因组编码区的每百万碱基的突变数来衡量，简单来说就是肿瘤细胞携带的突变数量。非同义突变越多，肿瘤细胞产生的异常蛋白越多。肿瘤突变负荷越高，产生的新抗原也越多，有更大的可能性激活免疫系统对肿瘤的识别。
在多癌种中证实，TMB高的患者总体生存率也更高。研究表明，用来预测癌症治疗效果的TMB值，在不同的癌种中其实是不一样的，这也就意味着，可能不存在一个适用于所有癌种的TMB固定值。对不同种类的癌症和不同的用药方案分类分析结果显示，不同癌种TMB值差异较大。TMB是目前除PD-L1表达之外研究最为深入的免疫治疗疗效预测性生物标志物之一。因为肿瘤组织样本在取材、肿瘤异质性和动态监测等方面具有很大的局限性，不容易直接计算得出肿瘤组织的TMB值。而血液样本具有无创多次重复取样、克服肿瘤异质性、可实现动态监测和可提供肿瘤全景信息等优势，研究者们一直在探索基于血液样本计算的TMB值，即血液肿瘤突变负荷(bTMB)，从而提升TMB检测在肿瘤免疫治疗中的实用性。
随着bTMB更多的被临床认可和大规模应用，基于Panel检测的bTMB算法标准也有待建立，各临床研究中对于bTMB计算标准存在较大差异。因此，为验证及规范行业bTMB的检测及计算流程，有必要推出一种能够用于bTMB检测各个环节的参考品，尤其是具有配对样品的参考品，这对于bTMB的准确定值及临床应用极为重要，而目前市面上还没有相应的血液肿瘤突变负荷参考品。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种血液肿瘤突变负荷(bTMB)参考品及其应用，涉及循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)形式的高TMB值和低TMB值参考品，对DNA使用酶切或超声两种方法进行片段化，能很好地模拟真实的血浆ctDNA检测样本形式，为bTMB的准确定值提供了参考。
本发明提供一种血液肿瘤突变负荷参考品的制备方法，包括如下步骤：
(1)筛选配对细胞系：
所述配对细胞系包括肿瘤细胞系和其配对的细胞系；
(2)酶切法或超声打断法获得所述配对细胞系的ctDNA；
(3)配对细胞系的ctDNA提取、浓度测定；
(4)配对细胞系的ctDNA混合和质检，获得血液肿瘤突变负荷参考品；
(5)参考品的肿瘤突变负荷值检测和肿瘤突变负荷值计算。
进一步的，所述步骤(2)中所述酶切法使用的酶是微球菌核酸酶。
进一步的，所述步骤(4)中所述混合的比例为所述肿瘤细胞系的ctDNA所占的体积比为0.1％～10％，所述配对的细胞系的ctDNA所占的体积比为99.9％～90％。
进一步的，所述步骤(4)中所述质检采用微滴式数字PCR对原材料原始的突变频率进行确认。
进一步的，所述步骤(5)包括如下步骤：
(1)对所述参考品进行全外显子组测序；
(2)突变过滤：使用过滤参数对检测出的变异进行过滤；
(3)肿瘤突变负荷值计算：过滤后的体细胞突变/全外显子编码区大小＝肿瘤突变负荷值，单位为兆碱基。
本发明还提供一种血液肿瘤突变负荷参考品，由所述的制备方法获得。
进一步的，所述参考品包括但不限于以下八对配对细胞系的ctDNA：
组1：肿瘤细胞系NCI-H2009、配对细胞系NCI-BL2009；
组2：肿瘤细胞系NCI-H2126、配对细胞系NCI-BL2126；
组3：肿瘤细胞系NCI-H2087、配对细胞系NCI-BL2087；
组4：肿瘤细胞系HCC1395、配对细胞系HCC1395 BL；
组5：肿瘤细胞系NCI-H2171、配对细胞系NCI-BL2171；
组6：肿瘤细胞系COLO 829、配对细胞系COLO 829BL；
组7：肿瘤细胞系HCC1187、配对细胞系HCC1187 BL；
组8：肿瘤细胞系HCC1954、配对细胞系HCC1954 BL；
其中，组1～组4为高TMB组，组5～组8为低TMB组。选择4组高TMB组和4组低TMB组能够保证得到的检测结果可靠。设置分组太多，一方面会提高检测成本，另一方面是可供选择的适合的配对的细胞系数量本身很有限；设置分组太少，无法反映检测能力的稳定性。TMB检测中，一般认为>10为高，<10为低。
进一步的，所述肿瘤细胞系的ctDNA所占的体积比为0.1％～10％，所述配对的细胞系的ctDNA所占的体积比为99.9％～90％。
进一步的，所述参考品的肿瘤突变负荷检测值为3～23。
进一步的，所述配对细胞系的ctDNA长度为144～176bp。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
(1)本发明选择特定的肿瘤细胞系和配对的对照细胞系，两者形成成对的细胞系组合，与临床应用一致；
(2)本发明中的bTMB参考品，既包括TMB值的梯度，也包括肿瘤细胞ctDNA的浓度梯度；
(3)本发明中的bTMB参考品，可采用酶切法或超声打断的方法制得，两种方法均能很好地模拟真实的血浆ctDNA检测样本形式，为bTMB的准确定值提供了参考。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为酶切法获得的肿瘤细胞ctDNA片段分布。
图2超声打断法获得的肿瘤细胞ctDNA片段分布。
图3为肿瘤细胞系ctDNA比例为10％时TMB检测结果与不混合的实测值进行拟合度分析的示意图。
图4为肿瘤细胞系ctDNA比例为1％时TMB检测结果与不混合的实测值进行拟合度分析的示意图。
图5为肿瘤细胞系ctDNA比例为0.1％时TMB检测结果与不混合的实测值进行拟合度分析的示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)是人体血液循环系统中，含有不断流动的携带一定特征(包括突变，缺失，插入，重排，拷贝数异常，甲基化等)的，来自肿瘤基因组的DNA片段。这些DNA片段来源于四个部分：1、坏死的肿瘤细胞；2、凋亡的肿瘤细胞；3、循环肿瘤细胞；4、肿瘤细胞分泌的外排体。
ctDNA来源于肿瘤细胞，在很多肿瘤类型中都广泛存在，但是数量少而且能够检测到的突变位点所占的比例很低。ctDNA通常片段化为170bp左右，在手术摘除肿瘤或者化疗之后会快速清除。
研究者认为测试的ctDNA可被应用于癌症患者的不同时期，ctDNA在大多数肿瘤的早期和进展期都可以被检测到，提示对大多数患者来说它可以作为一种有效的筛选手段。血液中ctDNA水平的检测方法也可用于快速评估癌症患者所处的时期和存活几率。
总之，ctDNA是一个非常有效和有益的生物标志物。因为它存在于血液中，所以获取ctDNA是非侵入性的，因此风险也较低，可以作为监测肿瘤进展的重复肿瘤活检的替代方法。因为肿瘤组织样本在取材、肿瘤异质性和动态监测等方面具有很大的局限性，不容易直接计算得出肿瘤组织的TMB值。而血液样本具有无创多次重复取样、克服肿瘤异质性、可实现动态监测和可提供肿瘤全景信息等优势，所以基于血液样本计算TMB值，即血液肿瘤突变负荷(bTMB)，能够提升TMB检测在肿瘤免疫治疗中的实用性。但是从血液中取材制作参考品仍然耗时耗力，来源有限，不可能用于大规模生产。本发明中采用酶切法或者超声打断法获取ctDNA，两种方法均能最大限度的模拟真实的血浆ctDNA检测样本形式，为bTMB的准确定值提供了参考。
本发明还提供了一种bTMB参考品的制备方法，包括肿瘤细胞的ctDNA制备方法，以及来自于同一个体的正常细胞的ctDNA的制备方法，并使用正常细胞的ctDNA将肿瘤细胞的ctDNA进行稀释，使得肿瘤ctDNA的浓度呈现梯度变化，浓度范围为0.1％～10％。进一步地，这里所述的肿瘤细胞系，包含具有TMB值梯度的多株肿瘤细胞系，以及相应的对照细胞系，具体见下表：4株高TMB的肿瘤细胞(TMB≥10)，4株低TMB的肿瘤细胞(TMB<10)，以及相应的对照细胞。其中，组1～组4为高TMB组，组5～组8为低TMB组。选择4组高TMB组和4组低TMB组能够保证得到的检测结果可靠。设置分组太多，一方面会提高检测成本，另一方面是可供选择的适合的配对的细胞系数量本身很有限；设置分组太少，无法反映检测能力的稳定性。TMB检测中，一般认为>10为高，<10为低。
本发明中用到的肿瘤细胞系和对照细胞系，均购自美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)、欧洲细胞培养物集存库EuropeanCollection of Cell Cultures，ECACC)及日本癌症研究资源库(Japanese CancerResearch Resources Bank，JCRB)，细胞系信息如下表，但是需要注意的是上述库中并未直接给出细胞系的TMB值，所以细胞系的筛选不是能够直接获得的，细胞系的TMB值需要通过生物信息学分析和实验检测等一系列操作后才能够得到。
上述细胞，可分别按照实施例1和实施例2的方法进行处理，制得ctDNA。
实施例1酶切法获得ctDNA
该方法利用微球菌核酸酶(MNase)对DNA进行酶切处理，由于核小体DNA受到组蛋白的保护，因此该部分DNA免除酶切而被保留下来，即ctDNA；相对地，无组蛋白结合的DNA区域会被MNase酶切而降解。该过程与真实的ctDNA形成过程极为相似。
1.将肿瘤细胞系和对照细胞系分别准确计数，按照下表比例混合均匀：
| 肿瘤细胞系比例(％) | 对照细胞系比例(％) | |
| 梯度1 | 10 | 90 |
| 梯度2 | 1 | 99 |
| 梯度3 | 0.1 | 99.9 |
2.取密度为1×104混合好的细胞于1.5mL EP管内，在离心机中4℃，3000rpm离心5min。
3.吸弃上清，然后加入1mL 4℃预冷的1×PBS(pH 7.4)重悬细胞；
4.将重悬后的细胞放入离心机中，于4℃，3000rpm离心5min。
5.吸弃上清，加入200μL 0.5％Triton X-100，混匀后置于室温放置10min。
6.将EP管置于离心机，3000rpm离心5min。
7.吸弃上清，加入1mL PBS溶液，用移液器反复吹打将细胞沉淀打散。将EP管置于离心机，3000rpm离心5min。
8.离心结束后，吸弃上清，加入微球菌核酸酶(Micrococcal Nuclease，MNase)，重悬细胞，并将细胞悬液转移至200μL EP管；迅速将离心管置于PCR仪中，37℃孵育15min。
9.孵育完成后，向EP管中加入6μL 0.5M EDTA混匀，以终止酶反应；
10.加入100μL 10％SDS和10μL Proteinase K(20mg/mL)。
11.将离心管置于60℃，孵育30min。
12.在孵育过程中，取出Magmax cell free试剂盒，吸取1mL Lysis/BindingSolution至15mL离心管，向其中加入30μL磁珠，混匀。
13.将步骤10中孵育结束的粗提液放至4℃，冷却后取100μL加入到步骤12的离心管中，并补充900μL蒸馏水，涡旋振荡10min，充分混匀；剩余粗提液按照与此相同的方法进行操作。
14.取一支新的1.5mL离心管，插入磁力架中，吸取1mL步骤13中的混合液到离心管中，静置5min或直至溶液变得澄清，吸弃上清，注意不要碰到磁珠。
15.重复步骤14，至完成转移所有溶液，吸净离心管中残留的液体；此时，磁珠吸附于磁力架侧。
16.将离心管从磁力架上取下，加入1mL Wash Solution重悬磁珠。将离心管放回磁力架，静置5min或直至溶液变得澄清，吸弃上清(不要碰到磁珠)。
17.将离心管从磁力架上取下，加入1mL 80％乙醇溶液重悬磁珠。将离心管放回磁力架，静置5min或直至溶液变得澄清，吸弃上清(不要碰到磁珠)。
18.保持离心管于磁力架上，室温干燥3～5min。取下离心管，向管中加入50μL水，重悬磁珠。
19.将离心管放回磁力架，静置5min或直至溶液变得澄清，小心吸取清液至新的离心管。
20.使用Qubit dsDNA BR测定提取的DNA的浓度，使用Agilent TapeStation 4150仪器检测DNA片段的大小，制得的ctDNA的片段分布如图1所示，橫坐标为片段长度，纵坐标为浓度，由图1可见主带大小为144bp～176bp，品质合格。
实施例2超声打断法获得ctDNA
1.准备工作
(1)片段化处理使用Covaris M220非接触式超声波破碎仪，使用前检查固定在仪器顶部的电脑与机器的线路连接妥当，依次开启仪器电源、笔记本电脑和仪器控制软件，使其处于运行状态。
(2)确认水盘(Drip Tray)和合适的操作管支架(Tube Holder)正确地安装在仪器中。
(3)将操作管支架(Tube Holder)顶部的滑行砝码(Siding Weight)拉起并旋转90°，用水瓶(Wash Bottle)将约13mL蒸馏水或去离子水加入支架中心，水位到达Instrument Status-Water Level呈现绿色“√”状态或超过运行标记(“RUN”marker)且水位刚好完全接触到操作管支架(Tube Holder)。
(4)不同打断管容量对应不同的打断方法。根据所使用的打断管容量在仪器控制软件“Method”中选择指定的打断方法，其中使用到的打断方法有以下四种，分别是1000-method、500-method、130-method和50-method。关闭仪器舱门，待Instrument Status均为√时完成打断前准备工作。
2.放置样品
(1)将样品装进打断管中。将操作管支架(Tube Holder)顶部的滑行砝码(SlidingWeight)拉起并旋转90°。
(2)放入已装入样品的打断管，旋转并放下滑行砝码，使之压住样品管，然后关闭舱门。
3.启动程序
在RUN界面中点击“Run”按钮，运行程序。
4.仪器运行结束工作
(1)控制软件、笔记本电脑及仪器电源。
(2)器中卸下水盘(Drip Tray)和操作管支架(Tube Holder)，若水盘(Drip Tray)和操作管支架(Tube Holder)有水残留，需要使用无尘纸擦拭干净并置于指定位置。
(3)射器完全吸除水浴槽内的蒸馏水将其倒入水槽内，并用无尘纸擦干。
5.片段检测
使用Qubit dsDNA BR测定片段化后的DNA的浓度，使用Agilent TapeStation4150检测DNA片段的大小，结果如图2所示，橫坐标为片段长度，纵坐标为浓度，由图2可见获得的片段在35～500bp范围内，片段的平均大小为：144bp～176bp。
实施例3对细胞系ctDNA进行提取、混合和稀释
(1)DNA提取
采用Promega
16 Cell LEV Purification Kit(货号AS1140)及其说明书的使用方法对实施例1的酶切法和实施例2的超声打断法获得的ctDNA进行提取。
(2)浓度测定
a)使用分光光度计对提取的产物进行DNA浓度的测定。
b)浓度测定，应当连续进行3次重复检测，应满足如下条件：
浓度：平均浓度≥20.0ng/μL且≤60.0ng/μL。
OD260/280：测定值≥1.8且≤2.0，判定合格。
OD260/230：测定值≥1.5且≤5.0，判定合格。
(3)混合
a)将同一编码和批号细胞沉淀提取的ctDNA进行混合，混合前需确认：
待混合ctDNA为同一编码和批号的细胞沉淀提取的。
待混合ctDNA浓度测定的OD260/280、OD260/230结果合格。
b)选择合适体积的管子进行混合(≥1.6mL应当用50mL BD管进行混合)。
c)测定混合后的浓度及OD值。
(4)稀释
混合后进行浓度测定，目标稀释浓度为20～60ng/μL。
实施例4配对细胞系的ctDNA混合和质检
将实施例2制得的每对肿瘤细胞系/对照细胞系的ctDNA，按照下表中的比例进行混合来制备浓度梯度的参考品：
混合的比例采用数字PCR进行验证。
采用ddPCR(BIO-RAD QX200平台)对原材料原始的突变频率进行确认。具体的ddPCR实验流程如下：
①按照下表中的反应组分配置反应的预混液，每一个位点每个样本做三个复孔，考虑移液损耗，故每个位点每个样本配置3.3个反应的量。详细的配置组分及其加入量见下表：
②微滴发生。将上述配置的预混液加入到微滴发生卡的中层孔位中，每一个孔加入20μL，将70μL微滴生成油加入到卡的下排孔位中，在微滴生成卡的两侧套上橡胶皮套，将微滴生成卡移除操作间放置于微滴生成仪内，并关闭盖子，等待微滴生成完成。
③微滴转移。将适当量程的移液枪调至40μL，将生成的微滴非常小心的转移到96孔PCR反应板内。将枪头的位置保持在斜4度角防止卡的底部阻塞枪头。
④封膜。当所有样品的微滴转移完成以后，放置一片铝膜置于96孔板的表面，用热封仪进行封膜。
⑤PCR，将96孔板放置于PCR仪上，并关紧盖子，按照如下程序运行，仪器升降温速度调到2～3℃/s。
⑥信号收集。当PCR程序完成，将96孔板转移到QX200微滴读取仪上(需提前半小时开机预热)，在电脑上，打开“QuantaSoft”软件，并选择包含样品的孔，在相应的位置设置好每一个孔的名称,实验用的Supermix，对于SNP类型的实验，将实验类型设置为ABS，将“Assay 1”设置为“Mut”，“type”设置为“Ch1 Unknown”，将“Assay 2”设置为“WT”，“type”设置为“Ch2Unknown”，选择“RUN”。
⑦数据分析。当数据读取完成以后，打开要分析的实验数据，选择“Analyze”即可对结果进行分析。
根据检测结果，如下表所示：
实施例5参考品TMB值检测
将实施例4中混合后并质检后获得的参考品进行全外显子组测序，测序参数如下表所示：
通过以下生物信息学方法计算每对样品的TMB值。
优选地，所述片段化后的DNA根据高通量全外显子测序数据分析，所述的TMB检测包含突变过滤的步骤，使用下表的过滤参数对检测出的变异进行过滤：
所述TMB检测值＝过滤后的体细胞突变/全外显子编码区大小(兆碱基)。
梯度参考品，根据上述流程所测得在不进行肿瘤及正常细胞混合的TMB值如下：
检测限及重复性参考品，根据上述流程所测得在进行肿瘤及正常细胞混合的TMB值如下：
根据上表进行了TMB检测，肿瘤细胞系ctDNA比例分别为10％、1％、0.1％时TMB检测结果与不混合的实测值进行拟合度分析(分别参见附图3、4、5)，R2均大于0.97，说明拟合度表现良好，检测限及重复性参考品TMB检测能准确反馈梯度检测参考品的TMB值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种血液肿瘤突变负荷参考品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)筛选配对细胞系：
所述配对细胞系包括肿瘤细胞系和其配对的细胞系；
(2)酶切法或超声打断法获得所述配对细胞系的ctDNA；
(3)配对细胞系的ctDNA提取、浓度测定；
(4)配对细胞系的ctDNA混合和质检，获得血液肿瘤突变负荷参考品；
(5)参考品的肿瘤突变负荷值检测和肿瘤突变负荷值计算。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述酶切法使用的酶是微球菌核酸酶。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述混合的比例为所述肿瘤细胞系的ctDNA所占的体积比为0.1％～10％，所述配对的细胞系的ctDNA所占的体积比为99.9％～90％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述质检采用微滴式数字PCR对原材料原始的突变频率进行确认。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)包括如下步骤：
(1)对所述参考品进行全外显子组测序；
(2)突变过滤：使用过滤参数对检测出的变异进行过滤；
(3)肿瘤突变负荷值计算：过滤后的体细胞突变/全外显子编码区大小＝肿瘤突变负荷值，单位为兆碱基。
6.一种血液肿瘤突变负荷参考品，其特征在于，由权利要求1-5任一项所述的制备方法获得。
7.根据权利要求6所述的参考品，其特征在于，所述参考品包括但不限于以下八对配对细胞系的ctDNA：
组1：肿瘤细胞系NCI-H2009、配对细胞系NCI-BL2009；
组2：肿瘤细胞系NCI-H2126、配对细胞系NCI-BL2126；
组3：肿瘤细胞系NCI-H2087、配对细胞系NCI-BL2087；
组4：肿瘤细胞系HCC1395、配对细胞系HCC1395 BL；
组5：肿瘤细胞系NCI-H2171、配对细胞系NCI-BL2171；
组6：肿瘤细胞系COLO 829、配对细胞系COLO 829BL；
组7：肿瘤细胞系HCC1187、配对细胞系HCC1187 BL；
组8：肿瘤细胞系HCC1954、配对细胞系HCC1954 BL。
8.根据权利要求7所述的参考品，其特征在于，所述肿瘤细胞系的ctDNA所占的体积比为0.1％～10％，所述配对细胞系的ctDNA所占的体积比为99.9％～90％。
9.根据权利要求6所述的参考品，其特征在于，所述参考品的肿瘤突变负荷检测值为3～23。
10.根据权利要求7所述的参考品，其特征在于，所述配对细胞系的ctDNA长度为144～176bp。
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