CN110205373A - 用于检测atp7b基因位点突变的引物组及其应用和应用其的产品 - Google Patents

用于检测atp7b基因位点突变的引物组及其应用和应用其的产品 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生命科学和生物技术领域，具体而言，提供了一组用于检测ATP7B基因位点突变的引物组及其应用和应用其的产品。本发明提供用于检测ATP7B基因位点突变的引物组，包括16组检测物，每组检测物包括一组引物对和一组探针对。该引物组针对中国人群中主要突变热点进行设计，可以对ATP7B基因位点突变实现特异性检测，准确性高，检测结果覆盖WD患者绝大部分的致病突变。试剂和试剂盒含有上述引物组，因此可以快速、准确对ATP7B基因16种位点突变进行检测。

Description

用于检测ATP7B基因位点突变的引物组及其应用和应用其的 产品
技术领域
本发明涉及生命科学和生物技术领域，具体而言，涉及一组用于检测ATP7B基因位点突变的引物组及其应用和应用其的产品。
背景技术
肝豆状核变性(Wilson’s disease，WD)，是一种单基因遗传铜代谢障碍性疾病。1993年，WD的致病基因ATP7B被发现，其编码一种P型ATP酶，参与体内铜离子的转运。ATP7B基因发生突变后其编码的ATP7B蛋白无法将细胞内的铜离子转运至细胞外，大量铜离子沉积于各脏器导致患者发病。然而，WD是少数经治疗后病情可得到控制的神经遗传病之一，如能早期诊断并给予规范的治疗，患者预后良好。
肝豆状核变性是一种单基因遗传病。目前针对单基因遗传病基因检测，主要是以第三方基因检测公司推出的第二代测序技术(主要以捕获测序为主)进行检测，再运用Sanger测序进行验证确认。目标基因捕获测序，按需求个性化定制靶目标基因区域panel，全面对疾病相关基因进行检测，灵敏度高，适合于复杂临床及遗传异质性的疾病筛查。然而，二代测序技术具有局限性，检测周期长，费用高，对于具有热点突变倾向的单基因遗传病的突变筛查，捕获测序显然不是一个经济高效的检测方案。
ATP7B基因热点突变主要为单碱基变异型，仅有两个位点为单碱基的插入突变，因此在检测技术方法上，主要考虑以检测SNP分型为主的技术方法。目前，SNP分型的主要技术方法包括测序法、SNapShot(小测序)法、Taqman-探针分型法、质谱分析法及酶切法等。然而，现有技术中缺少针对肝豆状核变性进行准确快速突变筛查的产品和技术。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一组用于检测ATP7B基因位点突变的引物组，该引物组可以对ATP7B基因位点突变实现特异性检测，准确性高，检测结果覆盖WD患者ATP7B基因致病突变绝大部分的致病突变。
本发明的第二目的在于提供上述引物组在制备检测ATP7B基因位点突变的产品中的应用。
本发明的第三目的在于提供检测ATP7B基因位点突变的的试剂和试剂盒，以缓解现有技术中缺少针对肝豆状核变性进行突变筛查的快速诊断试剂和试剂盒。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一组用于检测ATP7B基因位点突变的引物组，包括如下16组检测物，每组检测物中包括一组引物对和一组探针对；
其中，每组检测物的探针对中的两个探针均含有荧光基团且两个探针的荧光基团互不相同；
每组检测物的探针对中的两个探针均含有淬灭基团；
第一检测物中包括：
ATP7B-1F：5’-CCATGCTCTTTGTGTTCATTGC-3’(SEQ ID NO.1)；
ATP7B-1R：5’-GCTGTTACCTTTGCCAAGTGTTC-3’(SEQ ID NO.2)；
ATP7B-1P-wt：5’-TGGGCCGGTGGCTG-3’(SEQ ID NO.3)；
ATP7B-1P-mut：5’-TGGGCCTGTGGCTG-3’(SEQ ID NO.4)；
第二检测物中包括：
ATP7B-2F：5’-TGATGAGGATGCCGTTCTG-3’(SEQ ID NO.5)；
ATP7B-2R：5’-CACGGTGCTGTGCATTGC-3’(SEQ ID NO.6)；
ATP7B-2P-wt：5’-CCGTGGGCGTGGC-3’(SEQ ID NO.7)；
ATP7B-2P-mut：5’-AGCCGTGAGCGTG-3’(SEQ ID NO.8)；
第三检测物中包括：
ATP7B-3F：5’-CAACACCAAAATCGATAAAA-3’(SEQ ID NO.9)；
ATP7B-3R：5’-TCCCATTTATCATCATCATG-3’(SEQ ID NO.10)；
ATP7B-3P-wt：5’-CCACCAACGTCAAA-3’(SEQ ID NO.11)；
ATP7B-3P-mut：5’-CCACCAACATCAAA-3’(SEQ ID NO.12)；
第四检测物中包括：
ATP7B-4F：5’-GTCTAGGAGAAGCCATGC-3’(SEQ ID NO.13)；
ATP7B-4R：5’-GAGCACAGAGCCATGTG-3’(SEQ ID NO.14)；
ATP7B-4P-wt：5’-ACCCCGCAATTACAGTG-3’(SEQ ID NO.15)；
ATP7B-4P-mut：5’-AGACCCCACAATTACAGT-3’(SEQ ID NO.16)；
第五检测物中包括：
ATP7B-5F：5’-CACTGACATCGCTAGAAATGGTTAAA-3’(SEQ ID NO.17)；
ATP7B-5R：5’-GCAGTCCCCCAGACCTTCTC-3’(SEQ ID NO.18)；
ATP7B-5P-wt：5’-TCACGGTTTCCAATCA-3’(SEQ ID NO.19)；
ATP7B-5P-mut：5’-CACGGTTTCCAGTCAG-3’(SEQ ID NO.20)；
第六检测物中包括：
ATP7B-6F：5’-AGGGAAGAAAGTCGCCATGGT-3’(SEQ ID NO.21)；
ATP7B-6R：5’-ATCCGTGCCGGTGCCAAT-3’(SEQ ID NO.22)；
ATP7B-6P-wt：5’-TGGGGTCAATGACTCC-3’(SEQ ID NO.23)；
ATP7B-6P-mut：5’-TGGGGTCAGTGACTCC-3’(SEQ ID NO.24)；
第七检测物中包括：
ATP7B-7F：5’-ATGGGCGTTCATCTCTTACCA-3’(SEQ ID NO.25)；
ATP7B-7R：5’-TGTGCATCCTGTGTGTCTAACATAGA-3’(SEQ ID NO.26)；
ATP7B-7P-wt：5’-TCTTTCTGCAGATTCCT-3’(SEQ ID NO.27)；
ATP7B-7P-mut：5’-TTCTTTCTACAGATTC-3’(SEQ ID NO.28)；
第八检测物中包括：
ATP7B-8F：5’-CCAAGGCATTCAACTTACAGGAA-3’(SEQ ID NO.29)；
ATP7B-8R：5’-TCCCATTTATCATCATCATGTCAAC-3’(SEQ ID NO.30)；
ATP7B-8P-wt：5’-TCGATAAAACCGATTACAAT-3’(SEQ ID NO.31)；
ATP7B-8P-mut：5’-TCGATAAAATCGATTACAATC-3’(SEQ ID NO.32)；
第九检测物中包括：
ATP7B-9F：5’-TTATTTTCATAGGCACCCATTCAG-3’(SEQ ID NO.33)；
ATP7B-9R：5’-TCCATACCACCAACGTCAAAGTT-3’(SEQ ID NO.34)；
ATP7B-9P-wt：5’-CACTAAACCGGTCAGCCAG-3’(SEQ ID NO.35)；
ATP7B-9P-mut：5’-CACTAAACCCGTCAGCCAG-3’(SEQ ID NO.36)；
第十检测物中包括：
ATP7B-10F：5’-TCTGGCTGTCTTCCGGTTGTC-3’(SEQ ID NO.37)；
ATP7B-10R：5’-TGCACACGCTGCAGAGCAT-3’(SEQ ID NO.38)；
ATP7B-10P-wt：5’-TCAGAACCACGTCCACACC-3’(SEQ ID NO.39)；
ATP7B-10P-mut：5’-TCAGAACCATGTCCACACC-3’(SEQ ID NO.40)；
第十一检测物中包括：
ATP7B-10F：5’-TCTGGCTGTCTTCCGGTTGTC-3’(SEQ ID NO.41)；
ATP7B-10R：5’-TGCACACGCTGCAGAGCAT-3’(SEQ ID NO.42)；
ATP7B-10P-wt：5’-TCAGAACCACGTCCACACC-3’(SEQ ID NO.43)；
ATP7B-10P-mut：5’-TCAGAACCATGTCCACACC-3’(SEQ ID NO.44)；
第十二检测物中包括：
ATP7B-12F：5’-CCATGCTCTTTGTGTTCATTGC-3’(SEQ ID NO.45)；
ATP7B-12R：5’-GCTGTTACCTTTGCCAAGTGTTC-3’(SEQ ID NO.46)；
ATP7B-12P-wt：5’-TGGGCCGGTGGCTG-3’(SEQ ID NO.47)；
ATP7B-12P-mut：5’-TGGGCCAGTGGCTG-3’(SEQ ID NO.48)；
第十三检测物中包括：
ATP7B-13F：5’-GTGATGACGGCCTCTTGGTT-3’(SEQ ID NO.49)；
ATP7B-13R：5’-GGTCCGGAAACTGCAAGGA-3’(SEQ ID NO.50)；
ATP7B-13P-wt：5’-CTGAGTGAGATTTTGACTCTC-3’(SEQ ID NO.51)；
ATP7B-13P-mut：5’-CTGAGTGAGATTTTTGACTCTC-3’(SEQ ID NO.52)；
第十四检测物中包括：
ATP7B-14F：5’-TTGTCCTCGTGAGTTTGGA-3’(SEQ ID NO.53)；
ATP7B-14R：5’-TCCTTGATCCTGGGTCTGT-3’(SEQ ID NO.54)；
ATP7B-14P-wt：5’-CCCTGTGATCTGCAACACA-3’(SEQ ID NO.55)；
ATP7B-14P-mut：5’-CCCTGTGATGTGCAACAC-3’(SEQ ID NO.56)；
第十五检测物中包括：
ATP7B-14F：5’-TTGTCCTCGTGAGTTTGGA-3’(SEQ ID NO.57)；
ATP7B-14R：5’-TCCTTGATCCTGGGTCTGT-3’(SEQ ID NO.58)；
ATP7B-14P-wt：5’-CCCTGTGATCTGCAACACA-3’(SEQ ID NO.59)；
ATP7B-14P-mut：5’-CCCTGTGATGTGCAACAC-3’(SEQ ID NO.60)；
第十六检测物中包括：
ATP7B-16F：5’-CCGTCAATAGCCACCAGGAT-3’(SEQ ID NO.61)；
ATP7B-16R：5’-GTTTAACCATTTCTAGCGATGTCAGT-3’(SEQ ID NO.62)；
ATP7B-16P-wt：5’-CTTTCATCTCGTGGTCTGT-3’(SEQ ID NO.63)；
ATP7B-16P-mut：5’-CCTTTCATCTTGTGGTCTGT-3’(SEQ ID NO.64)。
ATP7B基因突变以高频突变伴随广泛存在的罕见突变为特征，具有明显的地域及种族分布特征。通过前期研究统计表明，中国人群中，主要的突变热点和携带该突变患者百分比如下表1所示：
表1
共约85％基因确诊的中国肝豆状核变性患者携带此16种突变，可涵盖肝豆状核变性绝大部分的致病突变。因此，快速筛查中国WD患者热点突变，利于节约检测成本并及时诊断WD患者，为其规范化治疗带来保障。
本发明提供用于检测ATP7B基因位点突变的引物组，该引物组针对中国人群中主要突变热点进行设计，可以对ATP7B基因位点突变实现特异性检测，准确性高，检测结果覆盖WD患者绝大部分的致病突变。该引物组应用于实时荧光PCR技术，结合TaqMan探针，检测操作简单，周期短，准确度高。
需要说明的是，本发明中的16组检测物分别对应特异性检测表1中的16个突变位点，每组检测物中均含有一对扩增引物和一组探针对，其中，探针对中的两个探针一个为野生型检测探针，另一个为突变型检测探针。以第一检测物为例，以表1中序号1位点为检测位点，ATP7B-1F和ATP7B-1R为第一检测物中的上游引物和下游引物，ATP7B-1P-wt为野生型位点检测探针，ATP7B-1P-mut为突变位点检测探针，可以理解的是，其他检测物中的引物对和探针对具有类似的命名。
每组检测物中的野生型检测探针和突变型检测探针均含有荧光基团和淬灭基团，为了定性，野生型检测探针和突变型检测探针的荧光基团并不相同。
在优选地实施方式中，引物组涵盖16组检测物，对16种位点突变进行检测时，只需要16个单管即可完成检测，而且结果容易判读，直接根据荧光扩增曲线即可完成结果判读，省时省力。
在优选地实施方式中，荧光基团包括FAM、TET、JOE、HEX、CY3、CY5或VIC，野生型检测探针的荧光基团优选为FAM，突变型检测探针的荧光基团优选为VIC。野生型和突变型探针的荧光并不相同，可以直接从结果中准确快速得出结果。
在优选地实施方式中，淬灭基团包括TAMRA、MGB、BHQ1、NFQ或BHQ2，，野生型检测探针和突变型检测探针的淬灭基团均优选为MGB。MGB修饰基团本身不产生荧光，因此可以大大降低本底信号的强度，同时可以将探针的Tm值提高10℃左右，因此同样的Tm值，带有MGB修饰基团的探针可以比普通Taqman探针设计的更短，使得探针在识别具有单个核苷酸多态性位点时，特异性更强。
上述引物组在制备检测ATP7B基因位点突变的产品中的应用。其中，产品为试剂或试剂盒。
一种检测ATP7B基因位点突变的试剂或试剂盒，包括上述引物组。该试剂或试剂盒可以快速、准确对ATP7B基因16种位点突变进行检测，检测成本低，周期短，操作简单，准确度高，临床应用价值极大，具有非常开阔的市场推广前景。
在优选地实施方式中，试剂盒还包括2×qPCR Mix，50×ROX和无菌水。
为监测操作过程中是否存在污染以及荧光定量PCR反应是否正常进行，在优选地实施方式中，试剂盒还包括阳性质控品、阴性质控品和空白对照品。
在优选地实施方式中，阳性质控品包括含ATP7B基因16个位点突变的溶液，阴性质控品包括不含ATP7B基因16个位点突变的溶液，空白对照品包括生理盐水或无菌水。阳性质控品例如可以为但不限为，含ATP7B基因16个位点突变的重组质粒或人源的DNA阳性样本。
在优选地实施方式中，本发明提供的试剂盒检测程序为95℃-10min预变性；95℃-15s，62℃-1min，40个循环。若样本每个位点只产生一条扩增曲线，相对应的探针都为野生型，则样本判读为ATP7B基因突变阴性；若样本每个位点只产生一条扩增曲线，相对应的探针有一条或以上是突变型，则样本判读为ATP7B突变阳性纯合型；若样本有一个位点或以上产生两条扩增曲线，其他位点只有野生型探针起线，则样本判读为ATP7B突变阳性杂合型。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供用于检测ATP7B基因位点突变的引物组，该引物组针对中国人群中主要突变热点进行设计，可以对ATP7B基因位点突变实现特异性检测，准确性高，检测结果覆盖WD患者绝大部分的致病突变。该引物组应用于实时荧光PCR技术，结合TaqMan探针，检测操作简单，周期短，准确度高。
该试剂和试剂盒含有上述引物组，因此可以快速、准确对ATP7B基因16种位点突变进行检测，检测成本低，周期短，操作简单，准确度高，临床应用价值极大，具有非常开阔的市场推广前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例4样本A的Real-time PCR结果；
图2是实施例4样本B的Real-time PCR结果；
图3是实施例4样本C的Real-time PCR结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
本实施例提供一组用于检测ATP7B基因位点突变的引物组，引物组包括检测16个位点的引物对和探针对，具体序列如下：
第一检测物中包括：
第一引物对：ATP7B-1F(SEQ ID NO.1)和ATP7B-1R(SEQ ID NO.2)；第一探针对：ATP7B-1P-wt(SEQ ID NO.3)和ATP7B-1P-mut(SEQ ID NO.4)；
第二检测物中包括：
第二引物对：ATP7B-2F(SEQ ID NO.5)和ATP7B-2R(SEQ ID NO.6)；
第二探针对：ATP7B-2P-wt(SEQ ID NO.7)和ATP7B-2P-mut(SEQ ID NO.8)；
第三检测物中包括：
第三引物对：ATP7B-3F(SEQ ID NO.9)和ATP7B-3R(SEQ ID NO.10)；
第三探针对：ATP7B-3P-wt(SEQ ID NO.11)和ATP7B-3P-mut(SEQ ID NO.12)；
第四检测物中包括：
第四引物对：ATP7B-4F(SEQ ID NO.13)和ATP7B-4R(SEQ ID NO.14)；
第四探针对：ATP7B-4P-wt(SEQ ID NO.15)和ATP7B-4P-mut(SEQ ID NO.16)；
第五检测物中包括：
第五引物对：ATP7B-5F(SEQ ID NO.17)和ATP7B-5R(SEQ ID NO.18)；
第五探针对：ATP7B-5P-wt(SEQ ID NO.19)和ATP7B-5P-mut(SEQ ID NO.20)；
第六检测物中包括：
第六引物对：ATP7B-6F(SEQ ID NO.21)和ATP7B-6R(SEQ ID NO.22)；
第六探针对：ATP7B-6P-wt(SEQ ID NO.23)和ATP7B-6P-mut(SEQ ID NO.24)；
第七检测物中包括：
第七引物对：ATP7B-7F(SEQ ID NO.25)和ATP7B-7R(SEQ ID NO.26)；
第七探针对：ATP7B-7P-wt(SEQ ID NO.27)和ATP7B-7P-mut(SEQ ID NO.28)；
第八检测物中包括：
第八引物对：ATP7B-8F(SEQ ID NO.29)和ATP7B-8R(SEQ ID NO.30)；
第八探针对：ATP7B-8P-wt(SEQ ID NO.31)和ATP7B-8P-mut(SEQ ID NO.32)；
第九检测物中包括：
第九引物对：ATP7B-9F(SEQ ID NO.33)和ATP7B-9R(SEQ ID NO.34)；
第九探针对：ATP7B-9P-wt(SEQ ID NO.35)和ATP7B-9P-mut(SEQ ID NO.36)；
第十检测物中包括：
第十引物对：ATP7B-10F(SEQ ID NO.37)和ATP7B-10R(SEQ ID NO.38)；
第十探针对：ATP7B-10P-wt(SEQ ID NO.39)和ATP7B-10P-mut(SEQ ID NO.40)；
第十一检测物中包括：
第十一引物对：ATP7B-10F(SEQ ID NO.41)和ATP7B-10R(SEQ ID NO.42)；
第十一探针对：ATP7B-10P-wt(SEQ ID NO.43)和ATP7B-10P-mut(SEQ ID NO.44)；
第十二检测物中包括：
第十二引物对：ATP7B-12F(SEQ ID NO.45)和ATP7B-12R(SEQ ID NO.46)；
第十二探针对：ATP7B-12P-wt(SEQ ID NO.47)和ATP7B-12P-mut(SEQ ID NO.48)；
第十三检测物中包括：
第十三引物对：ATP7B-13F(SEQ ID NO.49)和ATP7B-13R(SEQ ID NO.50)；
第十三探针对：ATP7B-13P-wt(SEQ ID NO.51)和ATP7B-13P-mut(SEQ ID NO.52)；
第十四检测物中包括：
第十四引物对：ATP7B-14F(SEQ ID NO.53)和ATP7B-14R(SEQ ID NO.54)；
第十四探针对：ATP7B-14P-wt(SEQ ID NO.55)和ATP7B-14P-mut(SEQ ID NO.56)；
第十五检测物中包括：
第十五引物对：ATP7B-14F(SEQ ID NO.57)和ATP7B-14R(SEQ ID NO.58)；
第十五探针对：ATP7B-14P-wt(SEQ ID NO.59)和ATP7B-14P-mut(SEQ ID NO.60)；
第十六检测物中包括：
第十六引物对：ATP7B-16F(SEQ ID NO.61)和ATP7B-16R(SEQ ID NO.62)；
第十六探针对：ATP7B-16P-wt(SEQ ID NO.63)和ATP7B-16P-mut(SEQ ID NO.64)；
野生型检测探针的荧光基团为FAM，突变型检测探针的荧光基团为VIC，野生型检测探针和突变型检测探针的淬灭基团均为MGB。
实施例2
本实施例提供一种检测ATP7B基因位点突变的的试剂盒，包括：
反应试剂：2×qPCR Mix，50×ROX和灭菌水；
阳性质控品：含ATP7B基因16个位点突变溶液；
阴性质控品：不含ATP7B基因16个位点突变溶液
空白对照品：生理盐水；
实施例1中的引物组。
实施例3
本实施例提供试剂盒的使用方法：
1.抽提血液样本中的DNA
(1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。10000rpm离心1分钟(若离心机最高转速不允许，可3000rpm离心5min)，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。
(2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀后加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(3)加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
(5)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(6)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(7)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液。
(8)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(9)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
2.试剂配置：一例样本每个位点的Real-time PCR体系为25μl：2×qPCRMIX 12.5μl、引物各0.8ul、探针各0.2μl、灭菌水9.5μl、DNA模板1μl。
Real-time PCR反应程序：95℃-10min预变性；95℃-15s，62℃-1min，40个循环。
3.结果分析，具体为：若样本每个位点只产生一条扩增曲线，相对应的探针都为野生型，则样本判读为ATP7B基因突变阴性；若样本每个位点只产生一条扩增曲线，相对应的探针有一条或以上是突变型，则样本判读为ATP7B突变阳性纯合型；若样本有一个位点或以上产生两条扩增曲线，其他位点只有野生型探针起线，则样本判读为ATP7B突变阳性杂合型。
实施例4
临床样本检测
取待检的临床样本A、B、C，参照实施例3，采用实施例2中的试剂盒提取DNA、配制溶液并检测。
样本A的Real-time PCR结果如图1所示。由于各位点只产生一条扩增曲线且都为FAM标记的探针起线，因此A样本为野生型。
样本B的2号位点Real-time PCR结果如图2所示。由于2号位点一条扩增曲线，且为VIC标记的探针起线，因此B样本存在ATP7B基因的纯合突变
样本C的6号位点Real-time PCR结果如图3所示。由于6号位点产生两条扩增曲线，其他位点只产生一条扩增曲线，且为FAM标记的探针起线，因此C样本存在ATP7B基因的杂合突变。
实施例5
样本验证实验，选取临床已经进行sanger测序检测的病人样本共30例，其中测序阳性样本20例，阴性样本10例，进行实时荧光定量PCR检测，检测结果见下表2：
表2
从上述结果可以看出，本申请提供的引物组以及试剂盒可以准确快速的鉴定出待测样本的突变类型。
对比例
本对比例提供用于检测ATP7B基因16个位点突变的其他探针，其中，用于检测16位点的具体序列如下表3，其中，5'修饰FAM为野生型检测探针，5'修饰VIC为突变型检测探针：
表3
对于目标检测的16位点，分别采用上述探针进行检测，发现对比例中探针检测效果均不能达到良好的检测目的。其他15个位点均参照16位点的方法，用其他探针和引物对位点进行检测，结果发现，对比例中的探针和引物检测效果均不能达到良好的检测目的。说明发明提供的引物组相较于对比例中的探针具有更好的特异性和准确性。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学
<120> 用于检测ATP7B基因位点突变的引物组及其应用和应用其的产品
<160> 71
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccatgctctt tgtgttcatt gc 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gctgttacct ttgccaagtg ttc 23
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgggccggtg gctg 14
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgggcctgtg gctg 14
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgatgaggat gccgttctg 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cacggtgctg tgcattgc 18
<210> 7
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccgtgggcgt ggc 13
<210> 8
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agccgtgagc gtg 13
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
caacaccaaa atcgataaaa 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
caacaccaaa atcgataaaa 20
<210> 11
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ccaccaacgt caaa 14
<210> 12
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccaccaacat caaa 14
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gtctaggaga agccatgc 18
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gagcacagag ccatgtg 17
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
accccgcaat tacagtg 17
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
agaccccaca attacagt 18
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cactgacatc gctagaaatg gttaaa 26
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gcagtccccc agaccttctc 20
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tcacggtttc caatca 16
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cacggtttcc agtcag 16
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
agggaagaaa gtcgccatgg t 21
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
atccgtgccg gtgccaat 18
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tggggtcaat gactcc 16
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tggggtcagt gactcc 16
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
atgggcgttc atctcttacc a 21
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
tgtgcatcct gtgtgtctaa cataga 26
<210> 27
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tctttctgca gattcct 17
<210> 28
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ttctttctac agattc 16
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
ccaaggcatt caacttacag gaa 23
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
tcccatttat catcatcatg tcaac 25
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
tcgataaaac cgattacaat 20
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
tcgataaaat cgattacaat c 21
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
tcgataaaat cgattacaat c 21
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
tccataccac caacgtcaaa gtt 23
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
cactaaaccg gtcagccag 19
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
cactaaaccc gtcagccag 19
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
tctggctgtc ttccggttgt c 21
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
tgcacacgct gcagagcat 19
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
tcagaaccac gtccacacc 19
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
tcagaaccat gtccacacc 19
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
tctggctgtc ttccggttgt c 21
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
tgcacacgct gcagagcat 19
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
tcagaaccac gtccacacc 19
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
tcagaaccat gtccacacc 19
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
ccatgctctt tgtgttcatt gc 22
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
gctgttacct ttgccaagtg ttc 23
<210> 47
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
tgggccggtg gctg 14
<210> 48
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
tgggccagtg gctg 14
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
gtgatgacgg cctcttggtt 20
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
ggtccggaaa ctgcaagga 19
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
ctgagtgaga ttttgactct c 21
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
ctgagtgaga tttttgactc tc 22
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
ttgtcctcgt gagtttgga 19
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
tccttgatcc tgggtctgt 19
<210> 55
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
ccctgtgatc tgcaacaca 19
<210> 56
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
ccctgtgatg tgcaacac 18
<210> 57
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
ttgtcctcgt gagtttgga 19
<210> 58
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
tccttgatcc tgggtctgt 19
<210> 59
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
ccctgtgatc tgcaacaca 19
<210> 60
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
ccctgtgatg tgcaacac 18
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
ccgtcaatag ccaccaggat 20
<210> 62
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
gtttaaccat ttctagcgat gtcagt 26
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
ctttcatctc gtggtctgt 19
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
cctttcatct tgtggtctgt 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
cctttcatct tgtggtctgt 20
<210> 66
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
tctgtccttt catctcgtg 19
<210> 67
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
tcatctcgtg gtctgtca 18
<210> 68
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
tgtcctttca tcttgtg 17
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
tctgtccttt catcttgtgg 20
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
tgtctgtcct ttcatcttgt g 21
<210> 71
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
cctttcatct tgtggtctg 19

Claims (10)

1.一组用于检测ATP7B基因位点突变的引物组，其特征在于，所述引物组包括如下16组检测物，每组检测物包括一组引物对和一组探针对；
第一检测物中包括：
第一引物对：ATP7B-1F(SEQ ID NO.1)和ATP7B-1R(SEQ ID NO.2)；
第一探针对：ATP7B-1P-wt(SEQ ID NO.3)和ATP7B-1P-mut(SEQ ID NO.4)；
第二检测物中包括：
第二引物对：ATP7B-2F(SEQ ID NO.5)和ATP7B-2R(SEQ ID NO.6)；
第二探针对：ATP7B-2P-wt(SEQ ID NO.7)和ATP7B-2P-mut(SEQ ID NO.8)；
第三检测物中包括：
第三引物对：ATP7B-3F(SEQ ID NO.9)和ATP7B-3R(SEQ ID NO.10)；
第三探针对：ATP7B-3P-wt(SEQ ID NO.11)和ATP7B-3P-mut(SEQ ID NO.12)；
第四检测物中包括：
第四引物对：ATP7B-4F(SEQ ID NO.13)和ATP7B-4R(SEQ ID NO.14)；
第四探针对：ATP7B-4P-wt(SEQ ID NO.15)和ATP7B-4P-mut(SEQ ID NO.16)；
第五检测物中包括：
第五引物对：ATP7B-5F(SEQ ID NO.17)和ATP7B-5R(SEQ ID NO.18)；
第五探针对：ATP7B-5P-wt(SEQ ID NO.19)和ATP7B-5P-mut(SEQ ID NO.20)；
第六检测物中包括：
第六引物对：ATP7B-6F(SEQ ID NO.21)和ATP7B-6R(SEQ ID NO.22)；
第六探针对：ATP7B-6P-wt(SEQ ID NO.23)和ATP7B-6P-mut(SEQ ID NO.24)；
第七检测物中包括：
第七引物对：ATP7B-7F(SEQ ID NO.25)和ATP7B-7R(SEQ ID NO.26)；
第七探针对：ATP7B-7P-wt(SEQ ID NO.27)和ATP7B-7P-mut(SEQ ID NO.28)；
第八检测物中包括：
第八引物对：ATP7B-8F(SEQ ID NO.29)和ATP7B-8R(SEQ ID NO.30)；
第八探针对：ATP7B-8P-wt(SEQ ID NO.31)和ATP7B-8P-mut(SEQ ID NO.32)；
第九检测物中包括：
第九引物对：ATP7B-9F(SEQ ID NO.33)和ATP7B-9R(SEQ ID NO.34)；
第九探针对：ATP7B-9P-wt(SEQ ID NO.35)和ATP7B-9P-mut(SEQ ID NO.36)；
第十检测物中包括：
第十引物对：ATP7B-10F(SEQ ID NO.37)和ATP7B-10R(SEQ ID NO.38)；
第十探针对：ATP7B-10P-wt(SEQ ID NO.39)和ATP7B-10P-mut(SEQ ID NO.40)；
第十一检测物中包括：
第十一引物对：ATP7B-10F(SEQ ID NO.41)和ATP7B-10R(SEQ ID NO.42)；
第十一探针对：ATP7B-10P-wt(SEQ ID NO.43)和ATP7B-10P-mut(SEQ ID NO.44)；
第十二检测物中包括：
第十二引物对：ATP7B-12F(SEQ ID NO.45)和ATP7B-12R(SEQ ID NO.46)；
第十二探针对：ATP7B-12P-wt(SEQ ID NO.47)和ATP7B-12P-mut(SEQ ID NO.48)；
第十三检测物中包括：
第十三引物对：ATP7B-13F(SEQ ID NO.49)和ATP7B-13R(SEQ ID NO.50)；
第十三探针对：ATP7B-13P-wt(SEQ ID NO.51)和ATP7B-13P-mut(SEQ ID NO.52)；
第十四检测物中包括：
第十四引物对：ATP7B-14F(SEQ ID NO.53)和ATP7B-14R(SEQ ID NO.54)；
第十四探针对：ATP7B-14P-wt(SEQ ID NO.55)和ATP7B-14P-mut(SEQ ID NO.56)；
第十五检测物中包括：
第十五引物对：ATP7B-14F(SEQ ID NO.57)和ATP7B-14R(SEQ ID NO.58)；
第十五探针对：ATP7B-14P-wt(SEQ ID NO.59)和ATP7B-14P-mut(SEQ ID NO.60)；
第十六检测物中包括：
第十六引物对：ATP7B-16F(SEQ ID NO.61)和ATP7B-16R(SEQ ID NO.62)；
第十六探针对：ATP7B-16P-wt(SEQ ID NO.63)和ATP7B-16P-mut(SEQ ID NO.64)；
其中，每组检测物的探针对中的两个探针均含有荧光基团且两个探针的荧光基团互不相同；
每组检测物的探针对中的两个探针均含有淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、TET、JOE、HEX、CY3、CY5或VIC；
优选地，所述淬灭基团包括TAMRA、MGB、BHQ1、NFQ或BHQ2，优选为MGB。
3.权利要求1或2所述的引物组在制备检测ATP7B基因位点突变的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂或试剂盒。
5.一种检测ATP7B基因位点突变的试剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的用于检测ATP7B基因位点突变的引物组。
6.一种检测ATP7B基因位点突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的用于检测ATP7B基因位点突变的引物组或权利要求5所述的试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括2×qPCR Mix，50×ROX和无菌水。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性质控品、阴性质控品和空白对照品。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品包括含ATP7B基因16个位点突变的溶液；
优选地，所述空白对照品包括生理盐水或无菌水。
10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品包括不含ATP7B基因16个位点突变的溶液。
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CN116121347A (zh) * 2023-02-10 2023-05-16 合肥达徽基因科技有限公司 检测atp7b基因的引物探针组合及其应用
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