CN112980834B - 一种同源重组修复缺陷参考品及其制备方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同源重组修复缺陷参考品及其制备方法和试剂盒，所述参考品以10对配对细胞系提取的基因组DNA按照一定比例混合而成，并通过全基因组测序对梯度参考品进行测序，经过特定的生物信息算法计算出相应梯度参考品的同源重组修复缺陷值；而检测限参考品则通过使用配对样品中的正常细胞样品稀释肿瘤细胞样品，并使用微滴式数字PCR的方法验证稀释比例，确保混合符合预期，以此最大程度模拟临床样品的复杂性及检验检测系统的特异及灵敏性；本参考品可以用于同源重组修复缺陷检测产品的性能评价，也可以用于同源重组修复缺陷的算法优化或检测流程优化，适用于高通量中的核苷酸多态性基因芯片、靶向基因组或全基因组的测序策略。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种同源重组修复缺陷参考品及其制备方法和试剂盒。
背景技术
近年来，受国家政策的大力推动和技术的不断更替，分子诊断尤其是基因检测领域发展极为迅速，基因检测涉及无创产前检测、肿瘤易感预测、肿瘤早期诊断、个体化用药、术后监测以及消费型基因检测等。由于市场容量巨大，近年来，市场上出现了越来越多的此类基因检测的试剂盒。
同源重组修复缺陷（Homologous recombination deficiency，HRD）作为一个潜在的生物标志物出现，业内公司争相推出相关检测。同源重组修复缺陷定义为一份肿瘤样本中，基因组中杂合性缺失（LOH）、端粒等位基因不平衡（TAI）以及大片段迁移（LST）事件的次数之和或加权之和。HRD检测的临床意义主要体现在风险评估、预后判断、指导治疗三个方面。在PRIMA研究中凸显出HRD检测对指导卵巢癌治疗的重要作用，尼拉帕利单药一线维持治疗超半数HRD+患者显著获益。基于PRIMA的研究结果，2020版《NCCN卵巢癌指南》将尼拉帕利纳入一线维持治疗的推荐，另外HRD在乳腺癌及前列腺癌都有作为用药标志物的潜力。但是如何准确报告同源重组修复缺陷是一直困扰相关检测行业的一大难题。
目前HRD检测经过临床验证且获FDA批准的有两个产品，Myriad HRD和FoundationFoucusTM CDx BRCA LOH，分别检测组织BRCA1/2和LOH、LST、TAI及血液gBRCA1/2基因突变和gLOH，国内相关企业也在着手研发对应的检测试剂盒，从检测手段来看，分别有使用panel测序和基因芯片方法进行的检测；从受检样品来看，既有组织也有血液。目前针对HRD的检测存在诸多争议，比如应该选择靶向基因组还是核苷酸多态性基因芯片来进行HRD的计算，LOH、TAI和LST的各类事件是否应进行统一定义及合成计算，不同样品的类型、处理方法和不同的生物信息学算法也影响HRD值。除此之外，在实验部分分析流程的差异也有可能导致结果的偏差。如何在各种影响检测结果的因素中准确地报告HRD值一直困扰着许多检测试剂盒开发厂家。目前市面上并没有较为合适同源重组修复相关的参考品去帮助厂家校准或监测HRD的检测流程，HRD检测亟需一个标准化的参考品去校准及优化。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明的一个目的在于提供一种同源重组修复缺陷（HRD）检测的参考品，所述参考含有如下10对配对细胞系的基因组DNA（genomicDNA，gDNA）：
其中，细胞系编号GW-PX-T和GW-PX-N中“X”代表上述十对细胞系中的任意一对，“T”代表肿瘤细胞，“N”代表配对细胞；
所述的参考品包含同源重组修复缺陷梯度参考品、检测限参考品、重复性参考品。
参考品需要最大限度模拟临床样本的实际情况，因为临床取样的样本不会是100%的肿瘤细胞，因此本发明的参考品将肿瘤细胞与正常配对细胞按照不同比例进行混合，以最大限度模拟临床样品客观情况。所述同源重组修复缺陷梯度参考品的同源重组修复缺陷检测值为29~103，由所述10对配对细胞系的基因组DNA组成：GW-P7-T和GW-P7-N、GW-P8-T和GW-P8-N、GW-P9-T和GW-P9-N、GW-P10-T和GW-P10-N、GW-P11-T和GW-P11-N、GW-P12-T和GW-P12-N、GW-P13-T和GW-P13-N、GW-P14-T和GW-P14-N、GW-P15-T和GW-P15-N、GW-P16-T和GW-P16-N。
所述检测限参考品和/或重复性参考品的所述GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例为10%~90%，所述GW-PX-T基因组DNA所占的体积比例为90%~10%，总体积为1，由所述10对配对细胞系的基因组DNA组成：GW-P7-T和GW-P7-N、GW-P8-T和GW-P8-N、GW-P9-T和GW-P9-N、GW-P10-T和GW-P10-N、GW-P11-T和GW-P11-N、GW-P12-T和GW-P12-N、GW-P13-T和GW-P13-N、GW-P14-T和GW-P14-N、GW-P15-T和GW-P15-N、GW-P16-T和GW-P16-N。
本发明的另一个目的在于提供一种重组修复缺陷梯度参考品的制备方法，包括如下步骤：
（1）筛选配对细胞系
选择如下GW-P7~GW-P16的十对配对细胞系：
其中，细胞系编号GW-PX-T和GW-PX-N中“X”代表上述十对细胞系中的任意一对，“T”代表肿瘤细胞，“N”代表配对细胞；
（2）每株细胞系首先进行STR分型鉴定，以确认细胞类型符合预期；然后，提取gDNA；
（3）DNA浓度测定
使用分光光度计对提取的gDNA产物进行DNA浓度的测定，应当连续进行3次重复检测，应满足如下条件：
浓度：平均浓度20.0 ng/μL≤x≤60.0 ng/μL；
OD260/280：测定值1.8≤x≤2.0，判定合格；
OD260/230：测定值1.5≤x≤5.0，判定合格。
（4）混合和稀释
①将同一编码和批号细胞沉淀提取的gDNA进行混合，混合前需确认：
待混合gDNA为同一编码和批号的细胞沉淀提取的；
待混合gDNA浓度测定的OD260/280、OD260/230结果合格；
②选择合适体积的管子进行混合；
③测定混合后的浓度及OD值；
④稀释：混合后进行浓度测定，目标稀释浓度为25 ng/μL；
（5）配对细胞系的混合和质检，将上述10对细胞系的基因组DNA按照不同体积比例进行混合，根据高通量全基因组测序数据的分析结果，每一对细胞挑选一个突变位点设计特异性的探针和引物，基因突变位点、引物和探针的序列信息如下表所示：
基因突变位点：
引物序列：
探针序列：
采用微滴式数字PCR对原材料原始的突变频率进行确认；
（6）参考品同源重组修复缺陷值检测和计算。
进一步的，所述步骤（5）中所述混合的比例为所述GW-PX-T基因组DNA所占的体积比例为10%~90%，所述GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例为90%~10%，总体积为1。
进一步的，所述同源重组修复缺陷参考品包含同源重组修复缺陷梯度参考品、检测限参考品及重复性参考品；所述同源重组修复缺陷梯度参考品的同源重组修复缺陷检测值为29~103；所述检测限参考品和/或重复性参考品的GW-PX-T基因组DNA所占的体积比例为10%~90%，GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例为90%~10%，总体积为1。
进一步的，所述步骤（5）中所述微滴式数字PCR的检测步骤包括如下：
①配置反应的预混液如下：
②微滴发生：将上述配置的预混液加入到微滴发生卡的中层孔位中，微滴生成油加入到卡的下排孔位中，在微滴生成卡的两侧套上橡胶皮套，将微滴生成卡移除操作间放置于微滴生成仪内，并关闭盖子，等待微滴生成完成；
③微滴转移：用移液枪将生成的微滴转移到PCR反应板内，将枪头的位置保持在一定倾斜度角防止卡的底部阻塞枪头；
④封膜：当所有样品的微滴转移完成以后，放置一片铝膜置于PCR反应板的表面，用热封仪进行封膜；
⑤ PCR：将PCR反应板放置于PCR仪上，并关紧盖子，仪器升降温速度调到2~3℃/s，按照如下程序运行：
⑥信号收集：当PCR程序完成，将PCR反应板转移到微滴读取仪上，在电脑上，打开“QuantaSoft”软件，并选择包含样品的孔，在相应的位置进行设置；
⑦数据分析：当数据读取完成以后，打开要分析的实验数据，选择“Analyze”对结果进行分析。
进一步的，所述步骤（6）包括如下步骤：
S1：GW-P7~GW-P16按照下表进行全基因组测序：
S2：数据处理
①数据质控：使用Fastp对低质量的数据进行过滤；
②比对参考基因组：使用BWA比对参考基因组；
③数据处理：数据使用samtools和gencore进行sort和去除duplicate；
④使用scarHRD对杂合性缺失、端粒等位基因不平衡及大片段迁移进行注释及统计；
杂合性缺失判定标准：（1）缺失片段长于15Mb；（2）短于整个染色体的长度；
端粒等位基因不平衡判定标准：（1）缺失或重复片段区域延长至端粒；（2）缺失或重复片段区域不穿过着丝粒；
大片段迁移判定标准：（1）断点间距小于3Mb的染色体；（2）断裂两端相邻区域大于10 Mb，且不位于着丝粒区域；
⑤同源重组修复缺陷值计算：杂合性缺失的数量+端粒等位基因不平衡的数量+大片段迁移的数量=同源重组修复缺陷值。
本发明的另一个目的在于提供含有上述同源重组修复缺陷参考品制备的试剂盒。
本发明的另一个目的在于提供上述参考品或上述试剂盒的应用，所述应用选自如下任意一种或多种：
（1）作为制备同源重组修复缺陷检测参考品的应用；
（2）制备评价同源重组修复缺陷检测产品或平台的产品的应用；
（3）制备校准同源重组修复缺陷检测结果的产品的应用；
（4）制备优化同源重组修复缺陷检测方法或体系的产品的应用。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
目前认配对样品可以有效检测出胚系突变，而检测方案则推荐使用全基因组测序数据计算的HRD值。本参考品原料以10对配细胞系提取的DNA按照一定比例混合而成，并通过全基因组测序对梯度参考品进行测序，经过特定的生物信息算法计算出相应梯度参考品的同源重组修复缺陷值；而检测限参考品则通过使用配对样品中的正常细胞样品稀释肿瘤细胞样品，并使用数字PCR的方法验证稀释比例，确保混合符合预期，以此最大程度模拟临床样品的复杂性及检验检测系统的特异及灵敏性；本发明所设计探针位点能反馈出肿瘤与正常细胞的占比，能充分模拟不同临床条件下的肿瘤纯度；本发明的参考品检测出的HRD值与市面多家HRD检测供应商检测的HRD值的线性关系的拟合度良好。本参考品可以用于同源重组修复缺陷检测产品的性能评价，也可以用于同源重组修复缺陷的算法优化或检测流程优化。适用于高通量中的核苷酸多态性基因芯片、靶向基因组或全基因组的测序策略。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明的10对配对细胞系对应的10对探针检测出的突变频率。
图2是本发明的梯度参考品检测出的HRD值与市面五家主流检测供应商联合标定值关系的拟合度。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1筛选配对细胞系、配对细胞鉴定及其基因组DNA提取
本发明的各组分的基因组DNA（genomic DNA，gDNA）来源于美国模式培养物集存库（American type culture collection，ATCC）特定培养的细胞系。细胞系对应列表如下所示：
在配对细胞系的筛选过程中，十分重要的步骤是获得特定配对细胞系的HRD值，以此作为选择的参考。美国癌症基因体图谱计划TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库只是提供了常用细胞系的序列信息，并不提供HRD值信息，本发明把TCGA数据库的所有序列信息下载下来，经过一系列实验操作和生物信息学方法分析得到HRD的值，从而由TCGA数据库中海量的配对细胞系中筛选出能覆盖29~103HRD值范围的配对细胞系组合，上述的生物信息学分析数据量庞大，且所用的生物信息学分析方法为本发明独创，并非简单从数据库中简单挑选就可以实现的。细胞系的选择依据也不是基于它属于什么类型的细胞，是否是常规的细胞系，而是它的HRD值大小，所以细胞系的选择并非常规选择，而是决定参考品检测梯度范围的关键选择。而且针对于不同的参考品，需要选择不同的配对细胞系，本发明的配对细胞系就是从乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌等有癌种偏好的细胞系中筛选出来的，才能够很好的指征同源重组修复缺陷这个参数，故针对不同的参考品配对细胞系的选择不是简单可以获得的。
购买的细胞会经过单克隆技术挑选遗传稳定的单克隆细胞株。具体的方法是：待细胞的汇合度达到70%~90%时，消化并收集细胞。对细胞准确计数，按照倍比稀释的方法，用培养基将活细胞稀释至5个/mL，并将细胞混匀。取10mL细胞悬液，均匀分到一块96孔板中。待细胞克隆形成时，即获得单克隆细胞株。每株细胞系进行了STR分型鉴定，以确认细胞类型符合预期。
（1）基因组DNA制备
gDNA的提取使用Promega Maxwell® 16 Cell LEV Purification Kit（货号AS1140）试剂盒说明书中推荐的提取方法进行提取。
（2）浓度测定
①使用分光光度计对提取的产物进行DNA浓度的测定。
②浓度测定，应当连续进行3次重复检测，应满足如下条件：
浓度：平均浓度20.0 ng/μL≤x≤60.0 ng/μL；
OD260/280：测定值1.8≤x≤2.0，判定合格；
OD260/230：测定值1.5≤x≤5.0，判定合格。
（3）混合
①将同一编码和批号细胞沉淀提取的gDNA进行混合，混合前需确认：
待混合gDNA为同一编码和批号的细胞沉淀提取的；
待混合gDNA浓度测定的OD260/280、OD260/230结果合格；
②选择合适体积的管子进行混合（≥1.6mL应当用50mLBD管进行混合）；
③测定混合后的浓度及OD值。
（4）稀释
混合后进行浓度测定，目标稀释浓度为25 ng/μL。
实施例2配对细胞系的基因组DNA混合和质检
本发明的检测限参考品及重复性参考品的混合和质检的方法如下：
将上述10对细胞系的基因组DNA按照不同体积比例进行混合，混合时，肿瘤细胞GW-PX-T（X代表10对细胞系中的任意一对）基因组DNA所占的体积比例为10%~90%，配对的正常细胞GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例分别为90%~10%。根据高通量全基因组测序数据的分析结果，每一对细胞挑选一个突变位点设计特异性的探针和引物，采用微滴式数字PCR（BIO-RAD QX200平台）对原材料原始的突变频率进行确认。根据高通量全基因组测序数据的分析结果，每一对细胞挑选一个突变位点设计特异性的探针和引物，基因突变位点、引物和探针的序列信息如下表所示：
基因突变位点：
引物序列：
探针序列：
采用微滴式数字PCR（BIO-RAD QX200平台）对原材料原始的突变频率进行确认。具体的微滴式数字PCR实验流程如下：
①按照下表中的反应组分配置反应的预混液，每一个位点每个样本做三个复孔，考虑移液损耗，故每个位点每个样本配置3.3个反应的量。详细的配置组分及其加入量见下表：
②微滴发生。将上述配置的预混液加入到微滴发生卡的中层孔位中，每一个孔加入20μL，将70μL微滴生成油加入到卡的下排孔位中，在微滴生成卡的两侧套上橡胶皮套，将微滴生成卡移除操作间放置于微滴生成仪内，并关闭盖子，等待微滴生成完成。
③微滴转移。将适当量程的移液枪调至40μL，将生成的微滴非常小心的转移到96孔PCR反应板内。将枪头的位置保持在斜4度角防止卡的底部阻塞枪头。
④封膜。当所有样品的微滴转移完成以后，放置一片铝膜置于96孔板的表面，用热封仪进行封膜。
⑤PCR。将96孔板放置于PCR仪上，并关紧盖子，按照如下程序运行，仪器升降温速度调到2-3℃/s。
⑥信号收集。当PCR程序完成，将96孔板转移到QX200微滴读取仪上（需提前半小时开机预热），在电脑上，打开“QuantaSoft”软件，并选择包含样品的孔，在相应的位置设置好每一个孔的名称,实验用的Supermix，对于SNP类型的实验，将实验类型设置为ABS，将“Assay 1”设置为“Mut”，“type”设置为“Ch1 Unknown”，将“Assay 2”设置为“WT”，“type”设置为“Ch2 Unknown”，选择“RUN”。
⑦数据分析。当数据读取完成以后，打开要分析的实验数据，选择“Analyze”即可对结果进行分析。
每一对细胞系选取一个特异性的基因位点用于微滴数字PCR验证，检测得到的对应细胞系含有的突变位点及频率如下表所示：
将上述10对细胞系的基因组DNA按照肿瘤细胞GW-PX-T（X代表10对细胞系中的任意一对）基因组DNA所占的体积比例分别为10%~90%，本实施例中选用80%，配对的正常细胞GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例分别为90%~10%，本实施例中选用20%，再使用每对细胞系对应的探针进行检测（编号为1~10，探针序列详见探针表格），结果如图1所示，所测突变频率均能落在80%±5%的区间内，表明所设计探针位点能反馈出肿瘤与正常细胞的占比，能充分模拟不同临床条件下的肿瘤纯度。
实施例3参考品同源重组修复缺陷值检测
（1）GW-P7~GW-P16按照下表进行全基因组测序：
（2）分析方法及参数
①数据质控：使用Fastp( https://github.com/OpenGene/fastp)对低质量的数据进行过滤。
②比对参考基因组：使用BWA(http://bio-bwa.sourceforge.net/)比对参考基因组(GRCh37/hg19)
③数据处理：数据使用samtools(http://samtools.sourceforge.net/)和gencore(https://github.com/OpenGene/gencore)进行sort和去除duplicate
④LOH、LST及TAI进行注释及统计scarHRD(https://github.com/sztup/scarHRD)
杂合性缺失（Loss of Heterozygosity，LOH）：1）缺失片段长于15Mb；2）短于整个染色体的长度，满足其中之一即被统计为一个LOH；
端粒等位基因不平衡（Telomeric Allelic Imbalance，TAI）：1）缺失或重复片段区域延长至端粒；2）缺失或重复片段区域不穿过着丝粒，满足其中之一即被统计为一个TAI；
大片段迁移（Large-scale State Transitions，LST）：1）断点间距小于3Mb的染色体；2）断裂两端相邻区域大于10 Mb，且不位于着丝粒区域；满足其中之一即被统计为一个LST；
⑤HRD值计算：杂合性缺失的数量（Number of LOHs）+端粒等位基因不平衡的数量（Number of LSTs）+大片段迁移的数量（Number of TAIs）=同源重组修复缺陷值（HRD）。
实施例4 同源重组修复缺陷参考品的组分
本发明的HRD参考品包括HRD梯度参考品、检测限参考品及重复性参考品。上述参考品以已混合好的混合物形式存在。HRD梯度参考品设置从29至103的HRD值梯度，可以作为研发HRD检测流程的参考，提高HRD检测流程的准确性，而检测限及重复性参考品不仅能模拟临床样品的真实情况，有助于确定HRD检测流程的检测限及稳定性，而且也是体外诊断试剂盒开发和申报过程中向监管机构提供的必备原料之一。
HRD梯度参考品，由下表配对细胞系的基因组DNA组成：
采用细胞系的全基因组测序数据按照实施例3中的生物信息学分析方法得出HRD实测值，将实施例1中提取配对细胞的gDNA分配给五家主流检测供应商，按照检测商自行建立的测序及分析方法进行检测并报告每个配对样品的HRD值，得出联合标定值，再将实测值及联合标定值进行拟合度比较。图2展示的是该参考品检测出的HRD实测值与五家主流检测供应商联合标定值关系的拟合度，圆形、三角形、正方形、菱形、横线中每一种图形代表每一家检测供应商测量出的HRD结果，R2为0.8909，拟合度表现良好，说明实施例3中的测序及分析方法可以准确测量对应配对参考品的HRD值，本发明的HRD梯度参考品可以准确测量样品的HRD值。
检测限参考品及重复性参考品，由下表配对细胞系的基因组DNA组成：
不同混合比例的检测限参考品和/或重复性参考品是针对于不同客户的定制化产品，基于客户的检测平台的检测限给予相应的混合比例的参考品，满足不同客户的不同需要。参考品需要最大限度模拟临床样本的实际情况，因为临床取样的样本不会是100%的肿瘤细胞，因此本发明的参考品将肿瘤细胞与正常配对细胞按照不同比例进行混合，以最大限度模拟临床样品客观情况。
实施例5本发明的检测限及重复性参考品的性能检测
本实施例是验证检测限及重复性参考品检测的实施例。在本发明宣称的范围内，挑选了上述10对细胞系的基因组DNA按照不同体积比例进行混合并检测，测序及分析方法按照实施例3所述，本实施例中选用其中肿瘤细胞GW-PX-T基因组DNA所占的体积比例为10%、30%、60%、90%时的具体HRD检测值及其拟合度R2值，具体组分配比及实测值如表1~表4所示：
表1 肿瘤细胞gDNA所占的体积比为10%时
表2 肿瘤细胞gDNA所占的体积比为30%时
表3 肿瘤细胞gDNA所占的体积比为60%时
表4 肿瘤细胞gDNA所占的体积比为90%时
根据以上实施例进行了HRD值检测，其HRD检测结果与实施例4中的实测值进行拟合度分析，R2均大于0.9，说明拟合度表现良好，检测限及重复性参考品HRD检测能准确反馈梯度检测参考品的HRD值。
本发明的同源重组修复缺陷参考品包含HRD梯度参考品、检测限参考品、重复性参考品，可在此基础上添加其他组分，如血浆，Tris-EDTA溶液等溶剂，制备成试剂盒，可以作为同源重组修复缺陷的参考品试剂盒，添加其他组分的参考品试剂盒同样包含在本发明的保护范围之内。
综合以上实施例，本发明公开了一种同源重组修复缺陷参考品及其制备方法和试剂盒，本发明的参考品包含同源重组修复缺陷梯度参考品、检测限参考品、重复性参考品。所述梯度参考品以10对配对细胞系提取的基因组DNA按照一定比例混合而成，并通过全基因组测序对梯度参考品进行测序，经过特定的生物信息算法计算出相应梯度参考品的同源重组修复缺陷值；而检测限参考品则通过使用配对样品中的正常细胞样品稀释肿瘤细胞样品，并使用微滴式数字PCR的方法验证稀释比例，确保混合符合预期，以此最大程度模拟临床样品的复杂性及检验检测系统的特异及灵敏性；同时通过实验验证了本发明所设计探针位点能反馈出肿瘤与正常细胞的占比，能充分模拟不同临床条件下的肿瘤纯度，本发明的参考品检测出的HRD值与市面多家HRD检测供应商检测的HRD值的线性关系的拟合度良好，说明本发明的参考品是同源重组修复缺陷的良好参考品，本参考品可以用于同源重组修复缺陷检测产品的性能评价，也可以用于同源重组修复缺陷的算法优化或检测流程优化，适用于高通量中的核苷酸多态性基因芯片、靶向基因组或全基因组的测序策略。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种同源重组修复缺陷参考品，其特征在于，所述参考品由十对配对细胞系的基因组DNA组成：
细胞系编号GW-P7-T：细胞系名称NCI-H1770；
细胞系编号GW-P7-N：细胞系名称NCI-BL1770；
细胞系编号GW-P8-T：细胞系名称NCI-H1184；
细胞系编号GW-P8-N：细胞系名称NCI-BL1184；
细胞系编号GW-P9-T：细胞系名称NCI-H128；
细胞系编号GW-P9-N：细胞系名称NCI-BL128；
细胞系编号GW-P10-T：细胞系名称NCI-H2171；
细胞系编号GW-P10-N：细胞系名称NCI-BL2171；
细胞系编号GW-P11-T：细胞系名称HCC1937；
细胞系编号GW-P11-N：细胞系名称HCC1937BL；
细胞系编号GW-P12-T：细胞系名称COLO 829；
细胞系编号GW-P12-N：细胞系名称COLO 829BL；
细胞系编号GW-P13-T：细胞系名称NCI-H209；
细胞系编号GW-P13-N：细胞系名称NCI-BL209；
细胞系编号GW-P14-T：细胞系名称HCC1954；
细胞系编号GW-P14-N：细胞系名称HCC1954 BL；
细胞系编号GW-P15-T：细胞系名称HCC1187；
细胞系编号GW-P15-N：细胞系名称HCC1187 BL；
细胞系编号GW-P16-T：细胞系名称HCC1395；
细胞系编号GW-P16-N：细胞系名称HCC1395 BL；
其中，细胞系编号GW-PX-T和GW-PX-N中“X”代表上述十对细胞系中的任意一对，“T”代表肿瘤细胞，“N”代表配对细胞；
所述的参考品包含同源重组修复缺陷梯度参考品、检测限参考品、重复性参考品；
所述同源重组修复缺陷梯度参考品的同源重组修复缺陷检测值为29~103，由所述10对配对细胞系的基因组DNA组成：GW-P7-T和GW-P7-N、GW-P8-T和GW-P8-N、GW-P9-T和GW-P9-N、GW-P10-T和GW-P10-N、GW-P11-T和GW-P11-N、GW-P12-T和GW-P12-N、GW-P13-T和GW-P13-N、GW-P14-T和GW-P14-N、GW-P15-T和GW-P15-N、GW-P16-T和GW-P16-N；
所述检测限参考品和/或重复性参考品的所述GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例为10%~90%，所述GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例为90%~10%，总体积为1，由所述10对配对细胞系的基因组DNA组成：GW-P7-T和GW-P7-N、GW-P8-T和GW-P8-N、GW-P9-T和GW-P9-N、GW-P10-T和GW-P10-N、GW-P11-T和GW-P11-N、GW-P12-T和GW-P12-N、GW-P13-T和GW-P13-N、GW-P14-T和GW-P14-N、GW-P15-T和GW-P15-N、GW-P16-T和GW-P16-N。
2.一种同源重组修复缺陷参考品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）筛选配对细胞系
选择如下GW-P7~GW-P16的十对配对细胞系：
细胞系编号GW-P7-T：细胞系名称NCI-H1770；
细胞系编号GW-P7-N：细胞系名称NCI-BL1770；
细胞系编号GW-P8-T：细胞系名称NCI-H1184；
细胞系编号GW-P8-N：细胞系名称NCI-BL1184；
细胞系编号GW-P9-T：细胞系名称NCI-H128；
细胞系编号GW-P9-N：细胞系名称NCI-BL128；
细胞系编号GW-P10-T：细胞系名称NCI-H2171；
细胞系编号GW-P10-N：细胞系名称NCI-BL2171；
细胞系编号GW-P11-T：细胞系名称HCC1937；
细胞系编号GW-P11-N：细胞系名称HCC1937 BL；
细胞系编号GW-P12-T：细胞系名称COLO 829；
细胞系编号GW-P12-N：细胞系名称COLO 829BL；
细胞系编号GW-P13-T：细胞系名称NCI-H209；
细胞系编号GW-P13-N：细胞系名称NCI-BL209；
细胞系编号GW-P14-T：细胞系名称HCC1954；
细胞系编号GW-P14-N：细胞系名称HCC1954 BL；
细胞系编号GW-P15-T：细胞系名称HCC1187；
细胞系编号GW-P15-N：细胞系名称HCC1187 BL；
细胞系编号GW-P16-T：细胞系名称HCC1395；
细胞系编号GW-P16-N：细胞系名称HCC1395 BL；
其中，细胞系编号GW-PX-T和GW-PX-N中“X”代表上述十对细胞系中的任意一对，“T”代表肿瘤细胞，“N”代表配对细胞；
（2）每株细胞系首先进行STR分型鉴定，以确认细胞类型符合预期；然后，提取gDNA；
（3）DNA浓度测定；
（4）混合和稀释；
（5）配对细胞系的混合和质检，将上述10对细胞系的基因组DNA按照不同体积比例进行混合，所述混合的比例为所述GW-PX-T基因组DNA所占的体积比例为10%~90%，所述GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例为90%~10%，总体积为1；根据高通量全基因组测序数据的分析结果，每一对细胞挑选一个突变位点设计特异性的探针和引物，采用微滴式数字PCR对原材料原始的突变频率进行确认；基因突变位点、引物和探针的序列信息如下表所示：
引物序列：
探针序列：
（6）参考品同源重组修复缺陷值检测和计算；
所述同源重组修复缺陷参考品包含同源重组修复缺陷梯度参考品、检测限参考品及重复性参考品；所述同源重组修复缺陷梯度参考品的同源重组修复缺陷检测值为29~103，由所述GW-P7~GW-P16十对配对细胞系的基因组DNA组成；所述检测限参考品和/或重复性参考品由所述GW-P7~GW-P16十对配对细胞系的基因组DNA组成，GW-PX-T基因组DNA所占的体积比例为10%~90%，GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例为90%~10%，总体积为1。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中所述微滴式数字PCR的检测步骤包括如下：
①配置反应的预混液；
②微滴发生；
③微滴转移：用移液枪将生成的微滴转移到PCR反应板内；
④封膜；
⑤ PCR；
⑥信号收集；
⑦数据分析。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（6）包括如下步骤：
S1：GW-P7~GW-P16进行全基因组测序；
S2：数据处理；
①数据质控：使用Fastp对低质量的数据进行过滤；
②比对参考基因组：使用BWA比对参考基因组；
③数据处理：数据使用samtools和gencore进行sort和去除duplicate；
④使用scarHRD对杂合性缺失、端粒等位基因不平衡及大片段迁移进行注释及统计；
杂合性缺失判定标准：（1）缺失片段长于15Mb；（2）短于整个染色体的长度；
端粒等位基因不平衡判定标准：（1）缺失或重复片段区域延长至端粒；（2）缺失或重复片段区域不穿过着丝粒；
大片段迁移判定标准：（1）断点间距小于3Mb的染色体；（2）断裂两端相邻区域大于10Mb，且不位于着丝粒区域；
⑤同源重组修复缺陷值计算：杂合性缺失的数量+端粒等位基因不平衡的数量+大片段迁移的数量=同源重组修复缺陷值。
5.含有权利要求1所述同源重组修复缺陷参考品制备的试剂盒。
6.权利要求1所述同源重组修复缺陷参考品、或权利要求5所述试剂盒的应用，所述应用选自如下任意一种或多种：
（1）作为制备同源重组修复缺陷检测参考品的应用；
（2）制备评价同源重组修复缺陷检测产品或平台的产品的应用；
（3）制备校准同源重组修复缺陷检测结果的产品的应用；
（4）制备优化同源重组修复缺陷检测方法或体系的产品的应用。
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