CN115216520A - 一种用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品、制备方法及其应用 - Google Patents

一种用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请提出了一种用于泛肿瘤ctDNA‑MRD检测的质控品、制备方法及其应用，涉及微小病灶残留检测技术领域。该制备方法包括细胞系培养，STR鉴定，DNA纯化，WES测序，引物和探针的设计开发与验证，肿瘤细胞与白细胞DNA精确混合，DNA的片段化等步骤。通过该制备方法能得到稳定的泛肿瘤ctDNA‑MRD检测质控品，可解决市面上各家ctDNA‑MRD检测机构标准不统一，检测限无法评估，检测结果假阴性频出和无可用的MRD质控品这些难题。该质控品能很好的应用于市面上所有的基于数字PCR或NGS平台的多种癌种的ctDNA‑MRD检测试剂盒的性能评估和临床诊断，具有良好的应用前景。

Description

一种用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品、制备方法及其应用
技术领域
本申请涉及微小病灶残留检测技术领域，具体而言，涉及一种用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品、制备方法及其应用。
背景技术
微小残留病(Minimal Residual Disease，MRD)是指白血病/淋巴瘤/骨髓瘤患者经治疗缓解后，体内仍残留少量癌细胞的状态，最终可能会引起疾病复发。因残留的癌细胞数量较少，不易察觉，因此需要更准确和灵敏地方法才能检测到。注意的是，现在NCCN指南和欧洲专家共识中MRD有时也指Measurable Residual Disease，即可测量残留病灶。
MRD是一种生物标志物，医生可使用MRD来衡量治疗的有效性，并预测哪些患者有复发的风险：可帮助医生动态监测和确认疾病的缓解情况，早期发现复发迹象，并尽早开始治疗；MRD阳性意味着癌症治疗后仍可检测到残留(剩余)病灶，MRD阴性表示癌症治疗后未检测到残留(剩余)病灶。MRD的检测主要有以下几大主流技术：1)流式细胞术(FC，通过检测细胞表面是否存在某些蛋白质标记物来评估某个细胞的技术)；2)数字PCR(ddPCR，可以根据其特有的遗传变异，如突变或染色体变异识别恶性肿瘤细胞)；3)二代测序(NGS，主要为tumor-informed与tumor-agnostic的ctDNA-MRD检测)。近年来，随着基于ctDNA作为MRD标记物的检测技术迅速发展，从根本上改变了对术后辅助治疗的风险评估方法，早期结直肠癌的研究现已得到证实ctDNA检测对术后预后评估优于临床病理诊断标准。尽管ctDNA越来越多的被科学研究者和临床专家所认可，但是ctDNA的评估可能因实验室和用于检测ctDNA的技术而不同，这可能导致不同的结果。许多临床实验室开发了自己的流程方案，可能会影响ctDNA的测量和检测。目前基于ctDNA检测的MRD技术存在以下几个主要问题：1、市面上缺乏超低突变频率(十万分之五甚至更低)突变位点的质控品来对各家检测流程进行校正；2、缺乏相应的质控品来评估检测方法的检测LOD，造成部分样本检测出现假阴性；3、没有可用于长期监测ctDNA-MRD检测技术的质控品；4、各检测机构缺乏统一的质控标准，无法判断出哪家的检测结果更准确可靠，检测结果存在不确定性。因此，ctDNA-MRD检测流程的标准化将迫在眉睫，ctDNA-MRD检测质控品的出现是迈向标准化的第一步，只有标准化以后，这项前沿技术才能够在监管环境中更好地被广泛应用。
发明内容
本申请的目的在于提供一种具有明确肿瘤含量、基因突变位点和突变频率的泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品的制备方法，以解决现有检测流程中缺乏统一、稳定、可重复生产且安全性高的质控品这一难题。
本申请的另一目的在于提供一种用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品，该质控品包含多种癌种来源的基因突变位点，应用范围广，可有效评估MRD检测试剂盒的检测限。
本申请的再一目的在于提供一种用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品在MRD临床诊断、实验室日常质控和室间质评中的应用。
本申请的再一目的在于提供一种用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品在MRD检测试剂盒性能评价中的应用，所述评价包括检测限评价、特异性评价、灵敏度评价、准确性评价和稳定性评价中的一种或者多种。
本申请解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
一方面，本申请实施例提供一种用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品的制备方法，其包括以下步骤：
将配对的人源细胞系，经STR验证后进行扩大培养和DNA纯化；
将纯化后的人源细胞系DNA进行WES测序以及测序数据分析，设计开发验证引物和探针；
所述配对的人源细胞系包括肿瘤来源的细胞系和从同一个体来源的配对的白细胞系，将肿瘤细胞系DNA和配对白细胞系DNA进行混合，得到DNA混合液；
数字PCR标定肿瘤细胞DNA含量，将标定后的DNA混合液进行DNA的片段化操作，制备ctDNA，所述ctDNA即为所述质控品。
另一方面，本申请实施例提供一种用上述制备方法制备的用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品。
再一方面，本申请实施例提供一种用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品在MRD临床诊断、实验室日常质控和室间质评中的应用。
再一方面，本申请实施例提供一种用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品MRD检测试剂盒性能评价中的应用，所述评价包括检测限评价、特异性评价、灵敏度评价、准确性评价和稳定性评价中的一种或者多种。
相对于现有技术，本申请的实施例至少具有如下优点或有益效果：
1、本申请提供的一种用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品包含多种癌种来源的基因突变位点，并可在此基础上向其中添加任何其他癌种的突变，适用于市面上所有癌种的MRD检测试剂盒的性能评价，包括tumor-informed和tumor-agnostic两种策略都适用，应用范围广。
2、该质控品中，最低肿瘤含量低至十万分之五，可有效评估MRD检测试剂盒的检测限。
3、该质控品，可提供上千个突变位点信息，可基于此突变信息，进行MRD测序PANEL的二次开发和优化。
4、该质控品，能很好的应用于MRD检测试剂盒研发、性能评价、出厂检验、效期监测、检测流程监控以及结果保证等方面，能很好的解决ctDNA-MRD各家检测机构标准不统一，检测结果不可信，检测假阴性频发等问题。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本申请。
一种用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品的制备方法，其包括以下步骤：
将配对的人源细胞系，经STR验证后进行扩大培养和DNA纯化；
将培养好的人源细胞系DNA进行WES测序以及测序数据分析，设计开发验证引物和探针；
上述配对的人源细胞系包括肿瘤来源的细胞系和从同一个体来源的配对的白细胞系，将肿瘤细胞系DNA和配对白细胞系DNA进行混合，得到DNA混合液；
数字PCR标定肿瘤细胞DNA含量，将标定后的DNA混合液进行DNA的片段化操作，制备ctDNA，上述ctDNA即为上述质控品。
在本申请的一些实施例中，上述人源细胞系为人类白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌等中的一种或者多种。
在本申请的一些实施例中，上述人源细胞系STR验证结果与数据库100％一致。确保细胞系癌种来源正确，无其他细胞系污染，确保了癌种的正确性。
在本申请的一些实施例中，上述测序深度不低于500X，有效数据量不低于80G。保证了突变丰度≥5％的突变位点能够被准确测定，保证了WES测序的准确性。
在本申请的一些实施例中，上述设计开发验证引物和探针的过程中，先过滤配对白细胞系来源的胚系突变，留下仅为肿瘤来源的突变，并以此突变列表为基础，进行数字PCR引物和探针的设计开发验证。
在本申请的一些实施例中，上述探针包括野生型探针和突变型探针，上述突变型探针的荧光标记基团为FAM或6-FAM，上述野生型探针的荧光标记基团为HEX或VIC，上述野生型探针和上述突变型探针的荧光猝灭基团包括BHQ1、TAMRA和MGB。
在本申请的一些实施例中，上述混合具体为：将肿瘤细胞系DNA和配对白细胞系DNA按照特定的DNA质量比例进行精确混合。质量是计算肿瘤含量最直接有效的方式，采用质量比进行混合，可以很精确的对肿瘤丰度进行控制，能有利于后续对肿瘤丰度进行标定，也能更加直观反应肿瘤丰度。
在本申请的一些实施例中，上述混合采用的是梯度稀释的方法，分步进行混合，上述肿瘤细胞DNA含量包括以下梯度：0％、0.5％、0.05％、0.005％、0.001％和100％。梯度稀释的方法能最大可能性的去减少人为操作带来的误差，使混合的质量比更准确更可靠，也能最大可能的去减少批间差，使产品性能更加稳定。
一种用上述质控品的制备方法所制备的用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品。
一种用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品在MRD检测试剂盒性能评价中的应用。
在本申请的一些实施例中，上述评价包括检测限评价、特异性评价、灵敏度评价、准确性评价和稳定性评价中的一种或者多种。
一种用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品在MRD临床诊断、实验室日常质控和室间质评中的应用。
以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例
一种用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品的制备方法，其包括以下步骤：
1、通过ATCC官网(https://www.atcc.org)购买肺癌来源的NCI-H2171和NCI-BL2171配对细胞系。
2、少量培养细胞，用Qiagen的基因组抽提试剂盒提取DNA，采用21-STR扩增方案扩增，在ABI 3730XL型遗传分析仪上对STR位点和性别基因Amelogenin进行检测，确保STR图谱100％正确。
3、按照细胞培养说明书上指定的培养条件，对细胞系NCI-H2171和NCI-BL2171进行扩大培养，每个细胞系收集细胞沉淀2*108个。
4、将步骤3中的细胞沉淀采用Qiagen的基因组抽提试剂盒提取DNA，采用
Figure BDA0003778529940000071
EZ DNA Library Preparation Module v2文库构建试剂盒，采用NovaSeq测序平台进行WES测序，有效测序深度大于500X，数据量≥80G。
5、WES数据分析时，采用配对的白细胞NCI-BL2171测序数据作为参照，过滤去掉胚系突变，筛选得到仅为肿瘤细胞NCI-H2171来源的突变列表，根据突变列表筛选出具有代表性的突变位点ADAMTS20 G1888S作为质控肿瘤DNA含量占比的marker，根据该maker设计探针和引物序列，并进行特异性验证，该基因突变位点在NCI-H2171中的突变频率为100％，在NCI-BL2171中的突变频率为0％，该基因突变位点的探针和引物序列如表1所示。
表1探针和引物序列
名称 碱基序列和修饰基团
ADAMTS20 G1888S_F TCTTCCGATTTTCAGGATGGAACT
ADAMTS20 G1888S_R CCCCTCTTTAGGGCATACTTCCCCC
ADAMTS20 G1888S_-wtprobe HEX-TCGGCAAATGTGGAGGGTACTGT-MGB
ADAMTS20 G1888S_-mutprobe FAM-TCAGCAAATGTGGAGGGTACTGT-MGB
6、肿瘤细胞系NCI-H2171 DNA和配对白细胞系NCI-BL2171 DNA按照特定的肿瘤比例进行精确混合，由于MRD检测在临床上的检测极限往往会低至万分之五甚至十万分之五，将肿瘤含量占比最低设置到十万分之五，可精确模拟出较多的突变频率为十万分之五的基因突变位点，很好的满足了临床上真实样本的实际情况；另外，在实际检测过程中，需要有较高突变频率的突变位点来作为阳性对照，甄别测出的突变为真突变还是假阳性突变，另外还需要阴性对照样本，来作为实验的对照。故本参考品制备过程中将肿瘤梯度设置最高为100％，最低为0％，来满足实际检测的需求。具体肿瘤混合比例如表2所示。
表2肿瘤混合比例
Figure BDA0003778529940000081
Figure BDA0003778529940000091
7、采用步骤5中的引物和探针序列对S01-S05这5个样本进行数字PCR的标定，进而判断肿瘤含量是否准确，具体AF实测值如表3所示。
表3 PCR的标定结果
样本名称 理论突变频率 可接受下限 可接受上限 AF实测值
S01 100％ 90％ 100％ 100％
S02 0.5％ 0.25％ 0.75％ 0.596％
S03 0.05％ 0.025％ 0.075％ 0.059％
S04 0.005％ 0.0025％ 0.0075％ 0.005％
S05 0％ 0％ 0.001％ 0.000％
通过突变频率(AF值)就能判定肿瘤含量是否准确，考虑到仪器和实验本身的系统误差，一般情况下，如果AF值在可接受范围下限和可接受范围上限之间，则表明AF值符合要求，肿瘤含量是准确的。由表3可知，S01-S05这5个样本的AF值都在可接受范围之内，表明这5个样本的肿瘤含量符合预期。
8、标定后的DNA混合液S01-S05通过Covaris M220进行超声打断，通过Agilent4150对片段化后的DNA进行质检，确保片段平均大小与真实临床样本接近，片段平均大小可接受范围为144bp-176bp，该区域的面积占比≥95％，打断后的平均片段大小和该区域的面积占比如表4所示。
表4打断后的平均片段大小和该区域的面积占比
样本名称 平均片段大小 该区域面积占比
S01 148 97.4％
S02 149 95.7％
S03 151 95.3％
S04 146 96.8％
S05 147 97.2％
从表4的数据可以看出，制备的ctDNA的片段大小均在144-176bp之间，且该区域的面积占比均大于95％，表明通过该工艺制备出的MRD ctDNA质控品符合要求。
9、根据步骤5中的WES测序结果，选用了与肿瘤细胞系NCI-H2171来源的突变列表重合度较高的肿瘤大panel NanOnco Plus Panel v3.0进行深度测序。平均测序深度达到20000X以上(未去重)，有效测序深度达到10000X以上(去重后)。每个样本的上样量为500ng且必须保持一致，采用PCR-free的方法进行文库构建，测序数据总量差异<20％，测序平台为NovaSeq。
10、根据步骤9中的测序数据，在数据进行分析时，需将测序reads数进行归一化处理，即：将每个样本的总突变reads数除以该样本的平均测序深度，得到该样本的突变reads数。定义S01样本的测序突变reads数作为TAF＝100％，其他各个样本的TAF＝该样本的突变reads数/S01样本的测序突变reads数*100％，各个样本的实测TAF值如表5所示。
表5各个样本的实测TAF值
Figure BDA0003778529940000101
Figure BDA0003778529940000111
TAF，即Total Allelic Frequency，代表的是整个样本中，所有规定范围内突变位点被测量到的reads数的一个集合。样本经深度测序后每个样本的数据进行分析之前，需将样本的总突变reads数进行归一化处理，即：将每个样本的突变总reads数除以该样本的平均测序深度，得到该样本的突变reads数。定义：肿瘤细胞占比100％样本的测序突变reads数作为TAF＝100％，其他各个样本的TAF＝该样本的突变reads数/肿瘤细胞占比100％样本的测序突变reads数*100％。
定义x值的含义为肿瘤含量，y值为TAF，通过S02、S03和S04这3组包含TAF值与肿瘤含量的数据对它们进行线性方程拟合。表5的结果显示，TAF值与肿瘤含量呈现良好的线性关系，线性表达式为：y＝0.7912x+7E-05，R2值为0.9995。由此可见：TAF值随着肿瘤含量的变化而变化，二者呈现良好的线性关系，TAF值能够很好的反应该质控品中的突变位点总集，可进行ctDNA-MRD的检测性能评估。
综上所述，本申请实施例提供了一种用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品的制备方法，其包括以下步骤：将配对的人源细胞系，经STR验证后进行扩大培养和DNA纯化；将纯化后的人源细胞系DNA进行WES测序以及测序数据分析，设计开发验证引物和探针；所述配对的人源细胞系包括肿瘤来源的细胞系和从同一个体来源的配对的白细胞系，将肿瘤细胞系DNA和配对白细胞系DNA按照特定比例进行混合；数字PCR标定肿瘤细胞DNA含量，将标定后的DNA混合液进行DNA的片段化操作，制备ctDNA，所述ctDNA即为所述质控品；最后，根据WES测序结果，选用合适的肿瘤大PANEL，进行深度测序；经过数据分析后，获得最终数据集。通过该制备方法能得到稳定的泛肿瘤ctDNA-MRD检测质控品。该质控品包含多种癌种来源的基因突变位点，并可在此基础上向其中添加任何其他癌种的突变，适用于市面上所有癌种的MRD检测试剂盒的性能评价；该质控品中，最低肿瘤含量低至十万分之五，可有效评估MRD检测试剂盒的检测限；该质控品还可提供上千个突变位点信息，可基于此突变信息，进行MRD测序PANEL的二次开发和优化。该质控品解决了市面上各家ctDNA-MRD检测机构标准不统一，检测限无法评估，检测结果假阴性频出和无可用的MRD质控品这些难题。该质控品能很好的应用于市面上所有的基于数字PCR或NGS平台的多种癌种的ctDNA-MRD检测试剂盒的性能评估和临床诊断，具有良好的应用前景。
以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

Claims (10)

1.一种用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
将配对的人源细胞系，经STR验证后进行扩大培养和DNA纯化；
将纯化后的人源细胞系DNA进行WES测序以及测序数据分析，设计开发验证引物和探针；
所述配对的人源细胞系包括肿瘤来源的细胞系和从同一个体来源的配对的白细胞系，将肿瘤细胞系DNA和配对白细胞系DNA进行混合，得到DNA混合液；
数字PCR标定肿瘤细胞DNA含量，将标定后的DNA混合液进行DNA的片段化操作，制备ctDNA，所述ctDNA即为所述质控品。
2.根据权利要求1所述的一种用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品的制备方法，其特征在于，所述人源细胞系为人类白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌等中的一种或者多种。
3.根据权利要求1所述的一种用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品的制备方法，其特征在于，所述人源细胞系STR验证结果与数据库100％一致。
4.根据权利要求1所述的一种用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品的制备方法，其特征在于，所述测序深度不低于500X，有效数据量不低于80G。
5.根据权利要求1所述的一种用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品的制备方法，其特征在于，所述设计开发验证引物和探针的过程中，先过滤配对白细胞系来源的胚系突变，留下仅为肿瘤来源的突变，并以此突变列表为基础，进行数字PCR引物和探针的设计开发验证。
6.根据权利要求1所述的一种用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品的制备方法，其特征在于，所述混合具体为：将肿瘤细胞系DNA和配对白细胞系DNA按照特定的DNA质量比例进行精确混合。
7.根据权利要求6所述的一种用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品的制备方法，其特征在于，所述混合采用的是梯度稀释的方法，分步进行混合，所述肿瘤细胞DNA含量包括以下梯度：0％、0.5％、0.05％、0.005％、0.001％和100％。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品的制备方法所制备的质控品。
9.一种如权利要求8所述的用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品在MRD检测试剂盒性能评价中的应用，所述评价包括检测限评价、特异性评价、灵敏度评价、准确性评价和稳定性评价中的一种或者多种。
10.一种如权利要求8所述的用于泛肿瘤ctDNA-MRD检测的质控品在MRD临床诊断、实验室日常质控和室间质评中的应用。
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