CN111334505A - 一种泛肿瘤基因检测的标准品及其制备方法和应用 - Google Patents
一种泛肿瘤基因检测的标准品及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种泛肿瘤基因检测的标准品,包含了微滴式数字PCR(ddPCR)验证的13个突变位点,以及500X高通量全外显子测序验证位点信息,有大于330个基因的700多个变异位点,也包含了常见的基因SNV和碱基插入缺失等癌症基因组常见结构变异,其对应的突变位点频率从1%到100%不等,适用场景和平台广泛。可以用于评估从样本提取到生物信息分析的工作流程的稳定性、特异性和灵敏性,评估各样本处理方法,检测平台之间的性能差异。属于业内的重大创新,具有广泛的应用前景和巨大的产业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤基因检测领域,具体涉及一种泛肿瘤基因检测的标准品及其制备方法和和应用。
背景技术
近年来,肿瘤的个体化治疗基因检测已在临床广泛应用,通过检测肿瘤患者生物样本中生物标志物的基因的核苷酸多态性、插入或缺失和拷贝数变异来预测药物疗效和评价预后,指导临床个体化治疗。但是由于检测及分析方法的不同存在检测出假阳性和假阴性的风险,例如下一代测序(Next Generation Sequencing,NGS),检测灵敏度和测序深度相关,一般来说,NGS在肿瘤体细胞突变检测时,检测灵敏度为10%,已知的与肿瘤相关驱动基因数量有限,疾病表型和基因型的关系还有赖于生物信息的解读,而目前NGS应用于肿瘤细胞突变检测的标准化和质量控制尚未形成共识。扩增阻碍突变系统(AmplificationRefractory Mutation System,ARMS)是PCR技术应用的发展,也称等位基因特性PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)等只能检测已知的突变类型,不能发现一些新的、未知的突变,如果检测的突变位点或类型较多,则随着引物数目增加出现非特异性结合的概率也相应增加,当检测位点较多时,对DNA样本量的需求增加。这个时候就需要标准品的存在去优化校准检测系统,检测标准品的建立是为了提高实验室检测结果的可靠性和可重复性。一般情况下,针对发现罕见的基因突变、实验运行异常、新批次的试剂与上一批次试剂的比对、储存条件或反应温度发生改变后的样本和试剂、验证整体测试可靠性的样本等,都应合理设置标准品。因此,建立一种可以通用于多种不同平台的泛肿瘤基因突变检测的标准品就显得尤为重要。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的问题,本发明的一个目的在于提供一种泛肿瘤基因检测的标准品,所述标准品含有13种经修饰的细胞系的基因组DNA(gDNA),其质量份数配比如下表:
优选地,所述细胞系选择为肿瘤细胞系KBM-7,虽然肿瘤细胞系已经包含众多肿瘤突变相关基因突变位点,但是在实际检测中往往存在一些较低频率的肿瘤相关基因突变位点,这些位点不容易被检测到,为了最大程度模拟检测场景、提高本发明的试剂盒的精确度和准确度并扩大本发明的试剂盒的检测范围,选择了上表7个肿瘤突变相关基因的13个位点进行基因编辑以此来获得这些较低频率的肿瘤相关基因突变位点,所述修饰为基因编辑。
优选地,所述基因包括肿瘤相关基因;较佳地,所述基因包括EGFR、KRAS、NRAS、BRAF、HER2、ALK、KIT、FLT3、PIK3CA等。
本发明的另一个目的在于提供一种泛肿瘤基因检测标准品的制备方法,包括如下步骤:
(1)选择肿瘤细胞系进行基因编辑:
a、针对目标基因的目标位点,设计特异的向导RNA(gRNA),并构建gRNA的表达载体,设计并合成单链DNA,用作基因编辑修复的模板;
b、将gRNA的表达载体和单链DNA共转染至目标细胞;
c、待细胞状态良好时,将其进行单细胞克隆;
d、细胞克隆形成后,取部分克隆进行sanger测序,确定基因编辑成功;
(2)gDNA提取:采用试剂盒进行gDNA提取;
(3)DNA浓度测定:
使用分光光度计对提取的产物进行DNA浓度的测定,浓度测定,应当连续进行3次重复检测,应满足如下条件:
浓度:平均浓度20.0ng/μL≤x≤60.0ng/μL,
OD260/280:测定值1.8≤x≤2.0,判定合格,
OD260/230:测定值1.5≤x≤5.0,判定合格;
(4)混合和稀释
①将同一编码和批号细胞沉淀提取的gDNA进行混合,混合前需确认:
待混合gDNA为同一编码和批号的细胞沉淀提取的;
待混合gDNA浓度测定的OD260/280、OD260/230结果合格;
②选择合适体积的管子进行混合;
③测定混合后的浓度及OD值;
④稀释:混合后进行浓度测定,目标稀释浓度为20-60ng/μL;
(5)混合:经过质检合格的gDNA依照下表所示的特定质量份数进行混合,获得泛肿瘤基因检测标准品待检测样品:
(6)检测及测序分析:经过上述步骤(5)所述混合后的所述待检测样品通过微滴式数字PCR(ddPCR)检测及全外显子高通量测序(WES)分析,合格后获得泛肿瘤基因检测标准品。
优选地,所述细胞系为KBM-7,所述基因包括肿瘤相关基因;较佳地,所述基因包括EGFR、KRAS、NRAS、BRAF、HER2、ALK、KIT、FLT3、PIK3CA等。
优选地,所述步骤c中,所述单细胞克隆的方法包括如下步骤:
C1.待细胞的汇合度达到70%~90%时,消化并收集细胞;
C2.对细胞准确计数,按照倍比稀释的方法,用培养基将活细胞稀释至5个/mL,并将细胞混匀;
C3.取10mL细胞悬液,均匀分到一块96孔板中;
C4.待细胞克隆形成时,标记有克隆的孔,加入少量胰蛋白酶消化细胞,取部分细胞进行PCR,用作sanger测序,剩余细胞继续培养。
优选地,所述步骤(6)中所述ddPCR检测对下表中的基因位点中的一种或多种进行基因频率的检测:
优选地,所述ddPCR检测过程中采用的引物和/或探针选自下表中一种或多种:
优选地,上述ddPCR检测的方法包括如下步骤:
①配置反应的预混液如下:
②微滴发生:将上述配置的预混液加入到微滴发生卡的中层孔位中,微滴生成油加入到卡的下排孔位中,在微滴生成卡的两侧套上橡胶皮套,将微滴生成卡移除操作间放置于微滴生成仪内,并关闭盖子,等待微滴生成完成;
③微滴转移:用移液枪将生成的微滴转移到96孔PCR反应板内,将枪头的位置保持在一定倾斜度角防止卡的底部阻塞枪头;
④封膜:当所有样品的微滴转移完成以后,放置一片铝膜置于96孔板的表面,用热封仪进行封膜;
⑤PCR:将96孔板放置于PCR仪上,并关紧盖子,仪器升降温速度调到2-3℃/s,按照如下程序运行:
⑥信号收集:当PCR程序完成,将96孔板转移到QX200微滴读取仪上,在电脑上,打开“QuantaSoft”软件,并选择包含样品的孔,在相应的位置进行设置;
⑦数据分析:当数据读取完成以后,打开要分析的实验数据,选择“Analyze”对结果进行分析。
优选地,所述步骤(6)中所述全外显子高通量测序分析包括如下步骤:
①数据质控:使用Fastp(https://github.com/OpenGene/fastp)对低质量的数据进行过滤;
②比对参考基因组:使用BWA(http://bio-bwa.sourceforge.net/)比对参考基因组(GRCh37/hg19);
③数据处理:数据使用samtools(http://samtools.sourceforge.net/)和gencore(https://github.com/OpenGene/gencore)进行sort和去除duplicate;
④变异检测:使用VarScan 2(http://dkoboldt.github.io/varscan/);
⑤突变注释:使用ANNOVAR(http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)对突变进行注释;
⑥突变过滤及突变频率计算:所述高通量测序所检测基因如下表所示:
GRIN2A | NCOR2 | PTPRT | CSF3R | CDH5 | PMS2 | DEK | IRF2 |
TRRAP | GLI2 | PHOX2B | PAX5 | CDH11 | BRIP1 | RNASEL | KLHL6 |
DPYD | TRIM33 | RRM1 | CDKN1A | RPS6KA4 | FANCL | TPMT | FGFR3 |
BLNK | LAMP1 | FOXP4 | SLX4 | AXIN2 | ERBB3 | FLT4 | GEN1 |
TMEM127 | CSMD3 | MKL1 | SRC | BCL11A | RNF43 | GID4 | FGFR4 |
MAML2 | SMC3 | THBS1 | NFKBIA | CDH20 | MAP3K1 | DDX41 | SDHB |
EPHA7 | BCL2L11 | PLCG1 | FANCE | GLI1 | EGFR | NSD1 | SPEN |
CHD2 | SH2B3 | top2A | NUTM1 | PLK2 | PDGFRA | RPS6KA2 | NTRK1 |
SAMD9 | RANBP2 | SOX10 | BRCA2 | NUP93 | AURKA | PBX1 | PTPRO |
TRIP11 | FOXO3 | FOXA1 | WT1 | DST | HRAS | TCF3 | NOTCH3 |
AKAP9 | NFKB2 | PGAP3 | NRG1 | PDCD1LG2 | KDM5C | MAP3K4 | ESR1 |
USP7 | NFKB1 | ITGA9 | GNA11 | MMP2 | PBRM1 | GABRA6 | CSF1R |
ANKRD11 | UBR5 | STK40 | WRN | NLRP1 | ZNF217 | IGF2R | RECQL4 |
AFF1 | DNMT1 | MYH9 | ASXL1 | ICK | PARP3 | SPTA1 | ATR |
TSPAN4 | HSP90AA1 | DUSP22 | CCNE1 | PTPRS | MSH2 | ACVR1 | XPC |
PTPRD | CUX1 | LMO2 | ALK | PKHD1 | EPCAM | MYH11 | NOTCH1 |
LMO1 | PGR | DNMT3B | CARD11 | NCOA4 | SETD2 | EBF1 | TSC1 |
PLCG2 | AFF3 | FUS | NF1 | NIN | RAD54L | RIT1 | EPHB1 |
TSHR | IGF1R | HLA-A | FLT1 | DCC | ERCC1 | MUC1 | ABL1 |
PER1 | PTCH1 | ZMYND11 | FLT3 | USP6 | ERCC2 | SYNE1 | POLE |
MTRR | SYK | HIST1H3J | TEK | MST1R | FGF6 | KMT2C | TERT |
RNF213 | NBN | ANKRD26 | SLC34A2 | MST1 | SDC4 | ZBTB2 | BCORL1 |
CAMTA1 | FAS | HIST1H3G | DNMT3A | KMT2D | TP53BP1 | LATS1 | SMO |
MAGI2 | FANCA | HIST1H1C | KRAS | COL1A1 | RET | BCL9 | ETS1 |
KAT6B | FANCI | HIST1H3C | ID3 | MBD1 | TMPRSS2 | ITGA10 | GATA2 |
BIRC5 | EPHA3 | CDH2 | BCR | TAL1 | CIC | PDE4DIP | PROC |
SRSF2 | NTRK3 | NCOA1 | SDHA | DDB2 | KDM5A | LRP1B | CHEK1 |
PML | AURKB | DHX15 | PARP1 | HOXB13 | EML4 | ETV1 | FGFR2 |
ZFHX3 | MSH3 | MTR | CUL3 | LTF | AXL | BRD3 | HNF1A |
INSR | RPTOR | ZNF521 | DOT1L | ITGB2 | SMOX | STAG1 | NOTCH2 |
SHQ1 | TP53 | PAX3 | MTAP | MARK4 | EP300 | RALGDS | HSD3B1 |
YES1 | RHBDF2 | FGF9 | BARD1 | ITGB3 | BRCA1 | NUP214 | FAM46C |
GPS2 | DIS3 | MLLT10 | ERBB4 | HSP90AB1 | BUB1B | EP400 | ROS1 |
NEGR1 | SOX9 | FN1 | PARP2 | GLIS2 | MYCL | PPP6C | MET |
KDM4C | FGF3 | LATS2 | IKBKE | ADAMTS20 | BCOR | RSPO3 | MTOR |
TET1 | CDH1 | CTLA4 | PIK3C2B | MAP3K14 | AXIN1 | PIK3CG | MERTK |
FRS2 | PIK3R1 | HDAC9 | CASP8 | SETBP1 | RICTOR | TET2 | LDLR |
PREX2 | AR | CRTC1 | SF3B1 | CYP2D6 | ERBB2 | CYP17A1 | APC |
SMAD3 | CD70 | LPP | CFH | MGA | MLH1 | SUFU | IRS2 |
RPS6KB2 | JAK1 | FAT1 | TFRC | HLA-B | ATM | RAD52 | MMAB |
CHD4 | MEN1 | PIK3R2 | BCL6 | CRLF1 | PRDM1 | EPHB4 | RSPO2 |
EPHA5 | CD79B | DCUN1D1 | PIK3C2G | ACVR2A | KLF4 |
突变频率计算:基因突变频率=突变序列测序深度/突变位置序列总深度。
本发明的另一个目的在于提供含有上述标准品或含有上述方法制备的标准品的试剂盒。
本发明的另一个目的在于提供上述标准品或上述试剂盒的应用,所述应用选自如下任一种或多种:
(1)作为泛肿瘤基因检测的标准品的应用;
(2)评价肿瘤基因检测的产品或平台的应用;
(3)校准肿瘤基因检测结果的应用;
(4)优化肿瘤基因检测方法或体系的应用。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明的泛肿瘤基因检测的标准品,包含了ddPCR验证的13个突变位点,和500X全外显子验证位点信息,有大于330个基因的700多个变异位点,也包含了常见的基因SNV和碱基插入缺失等癌症基因组常见结构变异,其对应的突变位点频率从1%到100%不等,应用场景多种多样。本发明的标准品的使用方法基于使用的试剂盒及平台不同,在具体操作中将该标准品作为一个样本,与其他实验样本以相同的技术和实验操作流程进行处理,本发明的标准品的实验结果与理论预期值的差异可反应整个操作流程和其他实验样本结果是否可信。本发明的标准品适用基于PCR技术的qPCR、ddPCR等平台,以及测序技术为基础的一代测序,二代测序(NGS)等平台;可以用于评估从样本提取到生物信息分析的工作流程的稳定性、特异性和灵敏性,评估各样本处理方法,检测平台之间的性能差异。本发明还分别对该标准品检测位点进行了稳定性测试,结果显示,在三次重复检测中,ddPCR检测结果与预期值的R2可达0.98以上,表明拟合度良好。在使用高通量测序检测的位点中,高通量测序检测基因列表中的基因均能被检测,也表明了该分析流程的稳定性良好。
综上,本发明成功建立了一种可以通用于多种不同平台的泛肿瘤基因检测的标准品,属于业内的重大创新,克服了目前国内并没有关于泛肿瘤基因检测的标准品的窘境,为肿瘤基因检测标准的统一及相关基因检测领域的标准技术建立和立法奠定了基础,具有广泛的应用前景和巨大的产业应用价值。
附图说明
图1是本发明的全外显子高通量测序分析方法流程图。
图2是实施例4中稳定性测试结果,ddPCR检测结果的实际检测值1与预期值的R2,横坐标位点预期基因突变位点突变频率,纵坐标为实际检测基因突变位点突变频率。
图3是实施例4中稳定性测试结果,ddPCR检测结果的实际检测值2与预期值的R2,横坐标位点预期基因突变位点突变频率,纵坐标为实际检测基因突变位点突变频率。
图4是实施例4中稳定性测试结果,ddPCR检测结果的实际检测值3与预期值的R2,横坐标位点预期基因突变位点突变频率,纵坐标为实际检测基因突变位点突变频率。
图5是本发明的泛肿瘤基因检测标准品在不同测序平台的性能检测结果,其中X轴为突变位点所处基因组上的位置,Y轴为突变频率。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明,以使本领域技术人员能够更好地理解本发明并予以实施,但实施例并不作为本发明的限定。
本发明的标准品来源于美国模式培养物集存库(American type culturecollection,ATCC)特定培养的细胞系KBM-7,经过基因编辑后,将各细胞系分别进行培养并进行DNA提取得到相应的基因组DNA(genomic DNA,gDNA)作为原料。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1基因编辑及单细胞克隆
本发明中所述的基因编辑方法,可以获得绝大多数临床上热门的肿瘤基因突变位点,例如表皮生长因子受体基因(EGFR)等,如下表所示:
在本发明的一个或多个实施方式中,具体的方法是:
a、针对目标基因的目标位点,设计特异的向导RNA(guide RNA,gRNA),并构建向导RNA的表达载体。同时,设计并合成单链DNA,用作基因编辑修复的模板。
b、将向导RNA的表达载体和单链DNA共转染至目标细胞。
c、待细胞状态良好时,将其进行单细胞克隆。
d、细胞克隆形成后,取部分克隆进行sanger测序,确定基因编辑成功。
在基因编辑步骤a中,相关基因包括但不仅限于肿瘤基因,所述肿瘤基因包括但不限于EGFR、KRAS、NRAS、BRAF、人类表皮生长因子受体2(HER2)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)等。
步骤c中,采用单克隆技术和sanger测序技术筛选出具有目标基因突变和遗传稳定的单克隆细胞株。在本发明的一个或多个实施方式中,具体的方法是:
C1.待细胞的汇合度达到70%~90%时,消化并收集细胞。
C2.对细胞准确计数,按照倍比稀释的方法,用培养基将活细胞稀释至5个/mL,并将细胞混匀。
C3.取10mL细胞悬液,均匀分到一块96孔板中。
C4.待细胞克隆形成时,标记有克隆的孔,加入少量胰蛋白酶(~20μL)消化细胞:取部分细胞进行PCR,用作sanger测序;剩余细胞继续培养。
实施例2泛肿瘤基因检测标准品待检测样品的制备
(1)基因组DNA提取
(2)浓度测定
①使用分光光度计对提取的产物进行DNA浓度的测定。
②浓度测定,应当连续进行3次重复检测,应满足如下条件:
浓度:平均浓度20.0ng/μL≤x≤60.0ng/μL;
OD260/280:测定值1.8≤x≤2.0,判定合格;
OD260/230:测定值1.5≤x≤5.0,判定合格。
(3)混合
①将同一编码和批号细胞沉淀提取的gDNA进行混合,混合前需确认:
待混合gDNA为同一编码和批号的细胞沉淀提取的;
待混合gDNA浓度测定的OD260/280、OD260/230结果合格;
②选择合适体积的管子进行混合(≥1.6mL应当用50mLBD管进行混合);
③测定混合后的浓度及OD值。
(4)稀释
混合后进行浓度测定,目标稀释浓度为20-60ng/μL。
(5)混合:经过质检合格的gDNA依照下表所示的特定质量份数进行混合,获得泛肿瘤基因检测标准品待检测样品:
实施例3泛肿瘤基因检测标准品待检测样品的检测
(1)ddPCR检测
实施例2获得的泛肿瘤基因检测标准品待检测样品通过ddPCR对下表的基因位点进行基因频率的检测,采用ddPCR(BIO-RAD QX200平台)对原材料原始的突变频率进行确认,获得ddPCR验证突变位点变异信息。
具体的ddPCR实验流程如下:
①按照下表中的反应组分配置反应的预混液,每一个位点每个样本做2至4个复孔,考虑移液损耗,故每个位点每个扩增孔配置1.1个反应的量。详细的配置组分及其加入量见下表:
②微滴发生。将上述配置的预混液加入到微滴发生卡的中层孔位中,每一个孔加入20μL,将70μL微滴生成油加入到卡的下排孔位中,在微滴生成卡的两侧套上橡胶皮套,将微滴生成卡移除操作间放置于微滴生成仪内,并关闭盖子,等待微滴生成完成。
③微滴转移。将适当量程的移液枪调至40μL,将生成的微滴非常小心的转移到96孔PCR反应板内。将枪头的位置保持在斜4度角防止卡的底部阻塞枪头。
④封膜。当所有样品的微滴转移完成以后,放置一片铝膜置于96孔板的表面,用热封仪进行封膜。
⑤PCR,将96孔板放置于PCR仪上,并关紧盖子,按照如下程序运行,仪器升降温速度调到2-3℃/s。
⑥信号收集。当PCR程序完成,将96孔板转移到QX200微滴读取仪上(需提前半小时开机预热),在电脑上,打开“QuantaSoft”软件,并选择包含样品的孔,在相应的位置设置好每一个孔的名称,实验用的Supermix,对于SNP类型的实验,将实验类型设置为ABS,将“Assay 1”设置为“Mut”,“type”设置为“Ch1 Unknown”,将“Assay 2”设置为“WT”,“type”设置为“Ch2 Unknown”,选择“RUN”。
⑦数据分析。当数据读取完成以后,打开你要分析的实验数据,选择“Analyze”即可对结果进行分析。
下表是ddPCR检测过程中涉及的引物及探针:
(2)全外显子高通量测序分析
将上述检测合格的标准品待测样品再进行全外显子高通量测序,并进行变异检测。测序信息如下表显示高通量测序信息:
测序平台 | Illumina Hiseq X Ten |
全外显子捕获平台 | IDT xGen Exome Research Panel V1.0 |
数据量 | 80G以上 |
深度 | 500X以上 |
全外显子高通量测序分析方法流程如附图1所示,具体如下:
①数据质控:使用Fastp(https://github.com/OpenGene/fastp)对低质量的数据进行过滤。
fastp-i read1.fastq–I read2.fastq-f 1-F 1-t 1-T 1-3-M 25–o read1_trimed.fastq–O read2_trimed.fastq。
②比对参考基因组:使用BWA(http://bio-bwa.sourceforge.net/)比对参考基因组(GRCh37/hg19)。
bwa mem[-pP][-t nThreads][-k 32][-w 100][-d 100][-r 1.5][-A1][-B 0][-O 6][-E 1][-L 5][-U 9][-v 3]ref.fasta read1_trimed.fastq read1_trimed.fastq>sample1_map.sam。
③数据处理:数据使用samtools(http://samtools.sourceforge.net/)和gencore(https://github.com/OpenGene/gencore)进行sort和去除duplicate。
samtools view-bS sample1_map.sam>sample1_map.bam,
samtools sort-o sort.bam sample1_map.bam,
gencore-i sample1_map_sort.bam-o sample1_map_sort._gencore.bam-rhg19.fa-s 1-j gencore.json–h gencore.html。
④变异检测:使用VarScan 2(http://dkoboldt.github.io/varscan/)。
⑤突变注释:使用ANNOVAR(http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)对突变进行注释。
table_annovar.pl wes.vcf/annovar/humandb/-buildver hg19-out wes.anno-remove-protocolrefGene,cytoBand,genomicSuperDups,esp6500siv2_all,1000g2015aug_all,1000g2015aug_afr,operation g,r,r,f,f,f,f,f,f,f,f,f-nastring.-vcfinput
⑥突变过滤及突变频率计算:基因突变频率=突变序列测序深度/突变位置序列总深度。
高通量测序检测基因列表
全外显子高通量测序突变位点检测结果如下表所示,经ddPCR检测及WES分析确认正确后的gDNA混合样品为可以作为本发明的泛肿瘤基因检测标准品。
高通量测序突变位点检测结果列表
实施例4泛肿瘤基因检测标准品的稳定性检测
采用实施例2中的ddPCR的检测方法,分别对本发明的标准品检测位点进行了稳定性测试,结果如下表及图2-4所示,在3次重复检测中,ddPCR实际检测结果与预期值的R2可达0.98以上,表明拟合度良好。在使用高通量测序检测的位点中,高通量测序检测基因列表中的基因均能被检测,也表明了该分析流程的稳定性良好。
实施例5泛肿瘤基因检测标准品的在不同测序平台的性能检测
采用实施例3中的高通量测序的方法,使用与其相同的捕获平台进行市面上主流测序平台的测序。其中Illumina的测序平台采用NEB文库构建试剂盒进行捕获后文库构建;而MGI的测序平台采用MGIEasy通用DNA文库制备试剂盒进行捕获后文库构建;得到的原始测序数据采用实施例3中相同的生物信息分析流程进行分析,所得所有基因突变位点实测基因突变频率结果在不同测序平台的比较如附图5所示。
图5中X轴为突变位点所处基因组上的位置,而Y轴为突变频率。根据检测结果,所有高通量测序检测位点均能被检测,且检测突变频率相近。由此可见,本发明的泛肿瘤标准品适用于市面主流测序平台及其建库试剂盒。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
2.一种泛肿瘤基因检测标准品的制备方法,包括如下步骤:
(1)选择肿瘤细胞系进行基因编辑:
a、针对目标基因的目标位点,设计特异的gRNA,并构建gRNA的表达载体,设计并合成单链DNA,用作基因编辑修复的模板;
b、将gRNA的表达载体和单链DNA共转染至目标细胞;
c、待细胞状态良好时,将其进行单细胞克隆;
d、细胞克隆形成后,取部分克隆进行测序,确定基因编辑成功;
(2)gDNA提取:采用试剂盒进行gDNA提取;
(3)DNA浓度测定:
使用分光光度计对提取的产物进行DNA浓度的测定,浓度测定,应当连续进行重复检测,应满足如下条件:
浓度:平均浓度20.0ng/μL≤x≤60.0ng/μL;
OD260/280:测定值1.8≤x≤2.0,判定合格;
OD260/230:测定值1.5≤x≤5.0,判定合格;
(4)混合和稀释
①将同一编码和批号细胞沉淀提取的gDNA进行混合,混合前需确认:
待混合gDNA为同一编码和批号的细胞沉淀提取的;
待混合gDNA浓度测定的OD260/280、OD260/230结果合格;
②选择合适体积的管子进行混合;
③测定混合后的浓度及OD值;
④稀释:混合后进行浓度测定,目标稀释浓度为20-60ng/μL;
(5)混合:经过质检合格的gDNA依照下表所示的特定质量份数进行混合,获得泛肿瘤基因检测标准品待检测样品:
(6)检测及测序分析:经过上述步骤(5)所述混合后的所述待检测样品通过ddPCR检测及全外显子高通量测序分析,合格后获得泛肿瘤基因检测标准品。
3.根据权利要求1所述的标准品或权利要求2所述的方法,所述细胞系为KBM-7,所述修饰为基因编辑;较佳地,所述基因包括肿瘤相关基因;更佳地,所述基因包括EGFR、KRAS、NRAS、BRAF、HER2、ALK、KIT、FLT3、PIK3CA等。
4.根据权利要求2或3所述的方法,所述步骤c中,所述单细胞克隆的方法包括如下步骤:
C1.待细胞的汇合度达到70%~90%时,消化并收集细胞;
C2.对细胞计数,按照倍比稀释的方法,用培养基将活细胞稀释至5个/mL,并将细胞混匀;
C3.取10mL细胞悬液,均匀分到一块96孔板中;
C4.待细胞克隆形成时,标记有克隆的孔,加入少量胰蛋白酶消化细胞,取部分细胞进行PCR,用作测序,剩余细胞继续培养。
7.根据权利要求2或3所述的方法,所述步骤(6)中所述ddPCR的检测步骤包括如下:
①配置反应的预混液如下:
②微滴发生:将上述配置的预混液加入到微滴发生卡的中层孔位中,微滴生成油加入到卡的下排孔位中,在微滴生成卡的两侧套上橡胶皮套,将微滴生成卡移除操作间放置于微滴生成仪内,并关闭盖子,等待微滴生成完成;
③微滴转移:用移液枪将生成的微滴转移到96孔PCR反应板内,将枪头的位置保持在一定倾斜度角防止卡的底部阻塞枪头;
④封膜:当所有样品的微滴转移完成以后,放置一片铝膜置于96孔板的表面,用热封仪进行封膜;
⑤PCR:将96孔板放置于PCR仪上,并关紧盖子,仪器升降温速度调到2-3℃/s,按照如下程序运行:
⑥信号收集:当PCR程序完成,将96孔板转移到QX200微滴读取仪上,在电脑上,打开“QuantaSoft”软件,并选择包含样品的孔,在相应的位置进行设置;
⑦数据分析:当数据读取完成以后,打开要分析的实验数据,选择“Analyze”对结果进行分析。
8.根据权利要求2或3所述的方法,所述步骤(6)中所述全外显子高通量测序分析包括如下步骤:
①数据质控:使用Fastp对低质量的数据进行过滤;
②比对参考基因组:使用BWA比对参考基因组;
③数据处理:数据使用samtools和gencore进行sort和去除duplicate;
④变异检测:使用VarScan 2;
⑤突变注释:使用ANNOVAR对突变进行注释;
⑥突变过滤及突变频率计算:所述高通量测序所检测基因选自下表:
突变频率计算:基因突变频率=突变序列测序深度/突变位置序列总深度。
9.含有权利要求1或3所述标准品,或含有权利要求2-8任一项所述方法制备的标准品的试剂盒。
10.权利要求1或3所述标准品、或权利要求2-8任一项所述方法制备的标准品、或权利要求9所述的试剂盒的应用,所述应用选自如下任一种或多种:
(1)作为泛肿瘤基因检测的标准品的应用;
(2)评价肿瘤基因检测的产品或平台的应用;
(3)校准肿瘤基因检测结果的应用;
(4)优化肿瘤基因检测方法或体系的应用。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112143733A (zh) * | 2020-09-30 | 2020-12-29 | 南京基蛋生物医药有限公司 | Ca15-3编码基因、ca15-3蛋白及其制备方法和应用 |
CN112210553A (zh) * | 2020-09-14 | 2021-01-12 | 菁良基因科技(深圳)有限公司 | 一种同源重组修复检测参考品的制备及应用 |
CN112226509A (zh) * | 2020-09-14 | 2021-01-15 | 菁良基因科技(深圳)有限公司 | 高肿瘤突变负荷和微卫星不稳定参考品的制备方法及应用 |
CN112708676A (zh) * | 2020-12-29 | 2021-04-27 | 南京科佰基因科技有限公司 | 一种用于dna同源重组修复基因检测的标准品及其制备方法 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108342480A (zh) * | 2018-03-05 | 2018-07-31 | 北京医院 | 一种基因变异检测质控物及其制备方法 |
CN108728516A (zh) * | 2018-06-22 | 2018-11-02 | 安徽鼎晶生物科技有限公司 | 一种肿瘤样品测序参考品的制备方法 |
CN109055487A (zh) * | 2018-08-09 | 2018-12-21 | 苏州安可济生物科技有限公司 | 模拟血浆基质的循环肿瘤游离dna标准品的制备 |
CN109762878A (zh) * | 2017-11-29 | 2019-05-17 | 铭时基因科技(上海)有限公司 | 一种肺癌EGFR L858R位点的ddPCR检测方法及应用 |
CN110656175A (zh) * | 2019-09-12 | 2020-01-07 | 上海药明康德医学检验所有限公司 | 靶向测序gDNA对照品及其制备方法 |
US20200032294A1 (en) * | 2013-11-28 | 2020-01-30 | Horizon Discovery Limited | Somatic haploid human cell line |
CN112210553A (zh) * | 2020-09-14 | 2021-01-12 | 菁良基因科技(深圳)有限公司 | 一种同源重组修复检测参考品的制备及应用 |
-
2020
- 2020-03-18 CN CN202010192048.2A patent/CN111334505B/zh active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20200032294A1 (en) * | 2013-11-28 | 2020-01-30 | Horizon Discovery Limited | Somatic haploid human cell line |
CN109762878A (zh) * | 2017-11-29 | 2019-05-17 | 铭时基因科技(上海)有限公司 | 一种肺癌EGFR L858R位点的ddPCR检测方法及应用 |
CN108342480A (zh) * | 2018-03-05 | 2018-07-31 | 北京医院 | 一种基因变异检测质控物及其制备方法 |
CN108728516A (zh) * | 2018-06-22 | 2018-11-02 | 安徽鼎晶生物科技有限公司 | 一种肿瘤样品测序参考品的制备方法 |
CN109055487A (zh) * | 2018-08-09 | 2018-12-21 | 苏州安可济生物科技有限公司 | 模拟血浆基质的循环肿瘤游离dna标准品的制备 |
CN110656175A (zh) * | 2019-09-12 | 2020-01-07 | 上海药明康德医学检验所有限公司 | 靶向测序gDNA对照品及其制备方法 |
CN112210553A (zh) * | 2020-09-14 | 2021-01-12 | 菁良基因科技(深圳)有限公司 | 一种同源重组修复检测参考品的制备及应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
STENZINGER A等: "Tumor mutational burden standardization initiatives: Recommendations for consistent tumor mutational burden assessment in clinical samples to guide immunotherapy treatment decisions", 《GENES CHROMOSOMES CANCER》 * |
生物谷: "菁良基因发布泛肿瘤800 gDNA标准品", 《HTTP://WWW.BIOON.COM.CN/SUB/SHOWARTICLE.ASP?NEWSID=84122》 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112210553A (zh) * | 2020-09-14 | 2021-01-12 | 菁良基因科技(深圳)有限公司 | 一种同源重组修复检测参考品的制备及应用 |
CN112226509A (zh) * | 2020-09-14 | 2021-01-15 | 菁良基因科技(深圳)有限公司 | 高肿瘤突变负荷和微卫星不稳定参考品的制备方法及应用 |
CN112226509B (zh) * | 2020-09-14 | 2023-12-19 | 菁良科技(深圳)有限公司 | 高肿瘤突变负荷和微卫星不稳定参考品的制备方法及应用 |
CN112143733A (zh) * | 2020-09-30 | 2020-12-29 | 南京基蛋生物医药有限公司 | Ca15-3编码基因、ca15-3蛋白及其制备方法和应用 |
CN112708676A (zh) * | 2020-12-29 | 2021-04-27 | 南京科佰基因科技有限公司 | 一种用于dna同源重组修复基因检测的标准品及其制备方法 |
CN112708676B (zh) * | 2020-12-29 | 2024-05-14 | 南京科佰基因科技有限公司 | 一种用于dna同源重组修复基因检测的标准品及其制备方法 |
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