CN113249483B - 一种检测肿瘤突变负荷的基因组合、系统及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肿瘤突变负荷的检测基因组合、系统及应用。本发明公开的肿瘤突变负荷的检测基因组合为824个基因组合，系统包括基于824个基因组合的肿瘤突变负荷的计算模块以及检测这824个基因组合中各基因突变的试剂和/或对高通量测序结果进行分析的模块或软件，计算模块用于计算肿瘤突变负荷TMB，TMB=s/n，s为824个基因组合中外显子编码区符合筛选阈值的变异位点总个数，n为824个基因组合覆盖的编码区碱基兆数。本发明基于824个基因组合的肿瘤突变负荷TMB和全外显子测序（WES）的TMB结果高度一致，并在真实世界中有比较理想的临床预测效果，具有很好的应用前景。

Description

一种检测肿瘤突变负荷的基因组合、系统及应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种检测肿瘤突变负荷的基因组合、系统及应用。

背景技术

随着对分子生物学的不停探索，恶性肿瘤的治疗越来越趋向于精准化和个体化，免疫治疗有效持续时间长，不良反应少，近年来，在恶性肿瘤治疗中的地位越来越不可忽视，免疫检查点抑制剂(Immune Checkpoint Inhibitors, ICIs)已在多种肿瘤治疗中获得显著的临床疗效。但免疫治疗价格昂贵，有效率较低，仍有约高至80%被选择的肿瘤患者对PD-1或PD-L1抑制剂无应答，给患者的治疗带来了一定的困难，故如何准确地筛选出ICIs获益人群、减轻患者负担尤为重要。

通过免疫组化(immunohistochemistry，IHC)检测到在肿瘤细胞上表达的PD-L1已作为一种生物标志物用于筛选非小细胞肺癌免疫治疗获益人群，并被FDA批准作为伴随诊断测试(companion diagnostic test，CDx), 然而使用PD-L1作为生物标志物仍然有一定局限性，故迫切需要探寻更可靠的生物标志物。近年来，肿瘤突变负荷(Tumor MutationBurden, TMB)成为研究热点，它是一种具有广阔前景的、独立的预测生物标志物，有望为肿瘤免疫治疗进入精准医疗时代开辟道路。

肿瘤突变负荷(TMB)表示一份肿瘤样本中，基因组上的外显子编码区每兆碱基中发生置换、插入、缺失的体细胞突变总数。已有临床试验表明，具有较高水平的TMB肿瘤细胞更容易被免疫系统识别，因此能对免疫检查点抑制剂有更强的免疫应答。如肿瘤突变负荷越大，对免疫治疗药物(PD-1/PD-L1) Nivolumab, Pembrolizumab, Atezolizumab可能会有较好应答。目前FDA已批准针对实体类组织样本的TMB检测：Pembrolizumab获批用于治疗肿瘤突变负荷高(TMB-H)[≥10 muts/Mb]，且既往治疗后疾病进展的且无其他优选治疗方案的无法切除或转移性部分实体瘤患者。

尽管TMB已作为独立预测指标用于预测实体肿瘤患者ICIs治疗效果，但其仍存在许多局限性，如各研究结果的cut-off值不明确，且TMB检测没有标准化，检测Panel大小、基因选择、样本类型、算法模型等因素都会影响TMB检测的准确性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可以预测实体肿瘤患者ICIs治疗效果的基因组合。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测肿瘤突变负荷的基因组合，所述基因组合由如下824个基因组成：

A2M、ABCB4、ABL1、ABL2、ACTL6A、ACTL6B、ACVR1、ACVR1B、ACVR2A、AGO2、AIP、AKAP9、 AKT1、AKT2、AKT3、ALB、ALK、ALOX12B、AMER1、ANGPT1、ANGPT2、ANKRD11、APC、APCDD1、APLNR、 APOB、AR、ARAF、ARFRP1、ARID1A、ARID1B、ARID2、ARID5B、ASCL2、ASCL4、ASXL1、ASXL2、ATF1、 ATIC、ATM、ATR、ATRX、AURKA、AURKB、AXIN1、AXIN2、AXL、B2M、B4GALT3、BACH1、BAI1、BAI2、 BAI3、BAK1、BAP1、BARD1、BCL10、BCL2、BCL2A1、BCL2L1、BCL2L11、BCL2L2、BCL6、BCOR、 BCORL1、BCR、BIRC3、BLM、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRD7、BRIP1、BTG1、BTG2、BTK、 BUB1B、C1QA、C1R、C1S、CALR、CARD11、CARM1、CASP8、CBFB、CBL、CBLB、CBR1、CCND1、CCND2、 CCND3、CCNE1、CD22、CD274、CD276、CD70、CD74、CD79A、CD79B、CDC25C、CDC42、CDC73、CDH1、 CDH23、CDK12、CDK2、CDK4、CDK6、CDK8、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、 CDX2、CEBPA、CENPA、CFH、CFHR1、CFHR2、CFLAR、CHD2、CHD4、CHD7、CHEK1、CHEK2、CHUK、CIC、 CRBN、CREBBP、CRIPAK、CRKL、CRLF2、CROT、CSDE1、CSF1R、CSF3R、CTCF、CTLA4、CTNNA1、 CTNNB1、CUL3、CUL4A、CUL4B、CXCR4、CYLD、CYP17A1、CYSLTR2、DAPK1、DAXX、DCUN1D1、DDB2、 DDR1、DDR2、DDX3X、DICER1、DIS3、DIS3L2、DNAJB1、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DOT1L、DPYD、 DROSHA、DUSP4、DUSP6、E2F3、EDNRA、EED、EGFL7、EGFR、EGR3、EIF1AX、EIF4A2、EIF4E、ELAC2、 ELANE、ELF3、EML4、EMSY、EP300、EPAS1、EPCAM、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA7、EPHB1、 EPHB2、EPHB4、EPHB6、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ERF、ERG、 ERRFI1、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EWSR1、EXT1、EXT2、EZH1、EZH2、EZR、F8、FAM135B、 FAM175A、FAM46C、FAM58A、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCL、 FANCM、FAS、FAT1、FAT3、FAT4、FBXW7、FCGR1A、FCGR2A、FCGR2B、FCGR2C、FCGR3A、FCGR3B、FGA、 FGF10、FGF12、FGF14、FGF19、FGF23、FGF3、FGF4、FGF6、FGF7、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、 FHIT、FLCN、FLT1、FLT3、FLT4、FNTA、FOXA1、FOXA2、FOXL2、FOXO1、FOXP1、FRK、FUBP1、FYN、 FZR1、GAB2、GABRA6、GALNT12、GATA1、GATA2、GATA3、GATA4、GATA6、GDF1、GDF15、GEN1、GID4、 GJB2、GLI1、GLI3、GNA11、GNA13、GNAQ、GNAS、GNRHR、GPC3、GPR101、GPR124、GPS2、GREM1、 GRIN2A、GRM3、GSK3B、H3F3A、H3F3B、H3F3C、HCK、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC8、HDAC9、 HES1、HGF、HIF1A、HIST1H1C、HIST1H2BD、HIST1H3A、HIST1H3B、HIST1H3C、HIST1H3D、 HIST1H3E、HIST1H3F、HIST1H3G、HIST1H3H、HIST1H3I、HIST1H3J、HIST2H3C、HIST2H3D、 HIST3H3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HMBS、HNF1A、HNF4A、HOXB13、HRAS、HRH2、HSD17B3、HSD3B1、 HSD3B2、HSP90AA1、HSPA4、HUWE1、ICOSLG、ID3、IDH1、IDH2、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、 IGF1、IGF1R、IGF2、IGF2R、IKBKB、IKBKE、IKZF1、IL10、IL6R、IL6ST、IL7R、INHA、INHBA、 INPP4A、INPP4B、INPPL1、INSR、IRF2、IRF4、IRS1、IRS2、ITGB2、ITK、JAK1、JAK2、JAK3、JUN、 KAT6A、KDM5A、KDM5C、KDM6A、KDR、KEAP1、KEL、KIF1B、KIF5B、KIT、KLF4、KLF5、KLHL6、KMT2A、 KMT2B、KMT2C、KMT2D、KMT2E、KNSTRN、KRAS、LASP1、LATS1、LATS2、LCK、LIMK1、LMO1、LRP1B、 LTK、LYN、LZTR1、MACF1、MAF、MALT1、MAML1、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K3、MAP2K4、MAP3K1、 MAP3K13、MAP3K14、MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK8IP1、MAPKAP1、MAX、MC1R、MCL1、MDC1、MDM2、 MDM4、MECOM、MED12、MEF2B、MEN1、MERTK、MET、MGA、MITF、MKNK1、MLH1、MLH3、MPL、MRE11A、 MS4A1、MSH2、MSH3、MSH4、MSH5、MSH6、MSI1、MSI2、MSR1、MST1、MST1R、MTAP、MTOR、MTUS1、 MUC1、MUTYH、MYB、MYBL1、MYC、MYCL、MYCL1、MYCN、MYD88、MYH9、MYOD1、NAB2、NAT1、NAT2、NBN、 NCOA3、NCOR1、NCOR2、NEGR1、NEK11、NF1、NF2、NFATC2、NFE2L1、NFE2L2、NFE2L3、NFKBIA、 NKX2-1、NKX3-1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、NPM1、NR3C1、NRAS、NRG1、NRG3、NSD1、 NT5C2、NTHL1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUBPL、NUF2、NUP93、NUTM1、P2RY8、PAK1、PAK3、PAK7、 PALB2、PALLD、PARK2、PARP1、PARP2、PARP3、PARP4、PAX5、PBRM1、PCBP1、PDCD1、PDCD1LG2、 PDE11A、PDE4DIP、PDGFRA、PDGFRB、PDK1、PDPK1、PGR、PHF20L1、PHF6、PHOX2B、PIGF、PIK3C2B、 PIK3C2G、PIK3C3、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PIM1、PLCG1、 PLCG2、PLK1、PLK2、PMAIP1、PMS1、PMS2、PNRC1、POLD1、POLE、POLH、POT1、PPARG、PPM1D、 PPP2R1A、PPP2R2A、PPP4R2、PPP6C、PRDM1、PRDM14、PREX2、PRKAA1、PRKACA、PRKACB、PRKAR1A、 PRKCA、PRKCB、PRKCG、PRKCI、PRKD1、PRKDC、PROKR2、PRSS1、PRSS8、PSMB1、PSMB2、PSMB5、 PTCH1、PTCH2、PTEN、PTK2、PTP4A1、PTP4A3、PTPN11、PTPN13、PTPRB、PTPRD、PTPRO、PTPRS、 PTPRT、QKI、RAB35、RAC1、RAC2、RAD21、RAD50、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD52、 RAD54L、RAF1、RARA、RARB、RARG、RASA1、RB1、RBL1、RBM10、RECQL、RECQL4、REL、RELA、RET、 RFWD2、RGPD3、RHBDF2、RHEB、RHOA、RICTOR、RIT1、RNASEL、RNF43、ROBO1、ROCK1、ROS1、RPA1、 RPL22、RPL5、RPS14、RPS6KA3、RPS6KA4、RPS6KB1、RPS6KB2、RPTOR、RRAGC、RRAS、RRAS2、 RSPO2、RTEL1、RUNX1、RUNX1T1、RUNX3、RXRA、RXRB、RXRG、RYBP、SBDS、SDC4、SDHA、SDHAF2、 SDHB、SDHC、SDHD、SEMA3A、SEMA3E、SERPINB3、SERPINB4、SESN1、SESN2、SESN3、SETBP1、 SETD2、SETD8、SF1、SF3B1、SGK1、SH2B3、SH2D1A、SHOC2、SHQ1、SIX1、SLAMF7、SLC34A2、 SLC4A1、SLIT2、SLX4、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD7、SMARCA1、SMARCA2、SMARCA4、SMARCAL1、 SMARCB1、SMARCC1、SMARCC2、SMARCD1、SMARCE1、SMC1A、SMC3、SMCHD1、SMO、SMYD3、SNCAIP、 SOCS1、SOS1、SOX17、SOX2、SOX9、SPEN、SPOP、SPRED1、SPRY4、SPTA1、SRC、SRCAP、SRD5A2、 SRSF2、SSTR2、STAG2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、STK11、STK19、 STK40、SUFU、SUZ12、SYK、TACC3、TAF1、TAP1、TAP2、TBL1XR1、TBX3、TCEB1、TCF12、TCF3、 TCF7L2、TEK、TERC、TERT、TET1、TET2、TFG、TGFBR1、TGFBR2、THADA、TIPARP、TLR4、TMEM127、 TMPRSS2、TNFAIP3、TNFRSF14、TNFRSF8、TNFSF11、TNFSF13B、TOP1、TOP2A、TOP3A、TP53、 TP53BP1、TP63、TP73、TPM3、TPMT、TRAF2、TRAF7、TRPS1、TRRAP、TSC1、TSC2、TSHR、TSHZ2、 TTF1、TUBA1A、TUBB、TUBD1、TUBE1、TUBG1、TYR、TYRO3、U2AF1、UGT1A1、UPF1、UROD、USHBP1、 USP12、USP48、USP8、VEGFA、VEGFB、VEZF1、VHL、VTCN1、WAS、WEE1、WHSC1、WHSC1L1、WISP3、 WNT10A、WNT10B、WNT7B、WRN、WT1、WWTR1、XIAP、XPA、XPC、XPO1、XRCC1、XRCC2、XRCC3、YAP1、 YES1、ZFHX3、ZNF148、ZNF217、ZNF521、ZNF703、ZNRF3、ZRSR2。

本发明还提供了检测肿瘤突变负荷的系统，包括：肿瘤突变负荷的计算模块，所述计算模块用于计算肿瘤突变负荷TMB，TMB=s/n，s为所述824个基因组合中外显子编码区非同义体细胞变异位点总个数，n为824个基因组合覆盖的编码区碱基兆数；

所述外显子编码区非同义体细胞变异位点为发生单核苷酸位点突变(SNV)和插入缺失突变的位点。

上述系统中，所述外显子编码区非同义体细胞变异位点不包括高频突变位点。所述高频突变位点可为COSMIC（Catalogue of Somatic Mutations in Cancer）数据库中有不小于20个样本包含的变异位点。

上述系统中，所述变异位点还可不包括1）-3）：1）突变频率小于5%的变异位点，2）reads支持数小于5的变异位点，3）样本测序深度小于20X的变异位点。

上述系统还可包括检测所述824个基因组合中各基因突变的试剂和/或对高通量测序结果进行分析的模块或软件。

上述系统中，所述检测所述824个基因组合中各基因突变的试剂可为检测所述824个基因组合序列时进行建库、捕获所述824个基因组合和/或测序所需的试剂和/或仪器和/或模块或软件；

所述对高通量测序结果进行分析的模块或软件为对所述824个基因组合的测序结果进行过滤、序列比对、去重、变异提取和/或变异过滤所需的模块或软件。

所述变异提取和所述变异过滤软件可为UVC分析软件。

检测所述824个基因组合序列时进行建库、捕获所述824个基因组合所需的试剂可为人825基因突变检测试剂盒（联合探针锚定聚合测序法）（北京泛生子基因科技有限公司产品，货号为RSN022）。

上述系统可仅由所述肿瘤突变负荷的计算模块组成，还可由所述肿瘤突变负荷的计算模块与所述检测所述824个基因组合中各基因突变的试剂组成，还可由所述肿瘤突变负荷的计算模块与所述对高通量测序结果进行分析的模块或软件组成，还可由所述肿瘤突变负荷的计算模块、所述检测所述824个基因组合中各基因突变的试剂与所述对高通量测序结果进行分析的模块或软件组成。

所述824个基因组合，也属于本发明的保护范围。

所述824个基因组合可用于计算TMB。

本发明还提供了基于配对样本的肿瘤突变负荷检测系统，包括：

1. 样本处理模块

用于对来源于同一患者的肿瘤样本和对照样本进行基因组DNA提取，然后进行建库、捕获；

2. 测序模块

用于对待测样本的DNA进行高通量测序，获得测序结果；

3. 数据过滤模块

用于对测序所得原始下机的FASTQ文件进行数据处理，得到过滤后数据；

4. 比对模块

用于对高通量测序的下机数据进行处理，并将数据比对至参考基因组上，获得比对结果；

5. 原始变异结果提取模块

用于对所述比对结果进行变异位点检测，得到原始变异结果；

6. 变异位点筛选模块

用于对原始变异位点结果进行筛选，得到符合筛选阈值的体细胞突变位点；

7. 计算模块

用于计算肿瘤突变负荷TMB，TMB=s/n； n为824基因组合覆盖的编码区碱基兆数，s为符合筛选阈值的体细胞突变位点总个数。

所述过滤用于过滤测序数据中的接头序列以及末端低质量碱基，对过滤后数据的最小读长长度(MINLEN)进行筛选，选择符合设定阈值的数据；

所述比对模块包括质控单元，用于对比对结果进行排序和去重处理；

所述原始变异结果提取模块包括质控单元，用于对原始变异位点进行过滤，筛选可靠的变异检测结果；

所述变异位点筛选模块包括数据库注释单元，用于对原始变异位点进行注释；

所述变异位点筛选模块包括还包括体细胞突变位点筛选单元，用于过滤变异类型为非编码区变异的位点，过滤突变频率小于5%的变异位点，过滤reads支持数小于5的变异位点，过滤824基因组合外显子编码区覆盖区之外的变异位点，过滤肿瘤样本或对照样本测序深度小于20X的变异位点，过滤同义突变位点，过滤高频突变位点。

本发明还提供了检测所述824个基因组合中各基因突变的系统，所述系统包括：检测所述824个基因组合中各基因序列时进行建库、捕获所述基因组合和/或测序所需的试剂和/或仪器和/或模块或软件。

所述检测所述824个基因组合中各基因突变的系统为能够特异检测所述基因组合中各个基因序列突变的物质。

所述检测所述824个基因组合中各基因突变的系统可为检测所述824个基因组合中各基因序列时进行建库、捕获所述基因组合和/或测序所需的试剂和/或仪器和/或模块或软件。

检测所述824个基因组合中各基因序列时进行建库和捕获所述824个基因组合所需的试剂可为人825基因突变检测试剂盒（联合探针锚定聚合测序法）（北京泛生子基因科技有限公司产品，货号为RSN022）。

所述824个基因组合在制备预测或辅助预测（或计算或辅助计算）肿瘤突变负荷产品中的应用，也属于本发明的保护范围。

所述检测所述824个基因组合中各基因突变的系统在制备预测或辅助预测肿瘤患者肿瘤突变负荷产品中的应用，也属于本发明的保护范围。

所述检测肿瘤突变负荷的系统或所述检测所述824个基因组合中各基因突变的系统在制备预测或辅助预测肿瘤患者免疫检查点抑制剂治疗效果产品中的应用，也属于本发明的保护范围。

所述检测肿瘤突变负荷的系统或所述检测所述824个基因组合中各基因突变的系统在制备筛查或辅助筛查免疫检查点抑制剂治疗获益肿瘤患者产品中的应用，也属于本发明的保护范围。

本发明中，所述肿瘤患者可为实体瘤患者。实体瘤即有形瘤，可通过临床检查如x线摄片、CT扫描，B超、或触诊扪及到的有形肿块称实体瘤。本发明的实体瘤范围包括但不限于：肺癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、食管癌、鼻咽癌等。

本发明在824个基因组合中排除了与肿瘤发生发展相关高频突变位点，并不纳入同义突变，使得基于824个基因组合的肿瘤突变负荷TMB和全外显子测序（WES）的TMB结果高度一致，并在真实世界中有比较理想的临床预测效果。本发明具有以下优点：

1. 所用样本可为50ng石蜡包埋样本（FFPE），样本中肿瘤突变细胞含量可以低至20%（病理学通过HE切片确认肿瘤含量百分比），降低样本起始量的要求，帮助更多晚期肿瘤进入TMB检测通道，提供更多的治疗选择。

2. 本发明的基因组合：去除了人类高频突变基因，通过同义突变和非同义突变数据分析，优选不包含同义突变的分析方法，实现更为准确的检测和分析。

3. 选用UVC分析软件获取变异信息，极大减少了人工复核的过程，提高了自动化程度的同时，保持了高度的敏感性和特异性。

与WES检测表现出更高的一致性。

附图说明

图1为包含同义突变（情况A）与去除同义突变（情况B）两种情况下824基因组合的TMB值与国家参考品说明书TMB标准值一致性。从上至下分别为重复1、重复2和重复3的结果。

图2为17例临床样本824基因组合TMB值和WES TMB值之间的相关性。

图3 为27例临床样本824基因组合TMB值和WES TMB值之间的相关性。

图1-3横纵坐标单位均为：突变数/百万碱基。

具体实施方式

本发明中的部分定义或术语如下：

1.肿瘤突变负荷(Tumor Mutation Burden, TMB)：肿瘤突变负荷是用来反映肿瘤细胞中总的基因突变程度的一个指标。TMB的计算方法是，所评估基因的外显子编码区每兆碱基中发生置换和插入/缺失突变的总数。本发明中的突变位点包括单核苷酸位点突变(SNV)和插入缺失突变(INDEL)，并去除高频突变位点和同义突变，所评估区域为824个基因组合覆盖基因的外显子编码区。

2.单核苷酸位点突变(SNV)：单个核苷酸发生置换，本发明中只考虑导致编码氨基酸发生变化的突变位点。

3.插入缺失突变(INDEL)：多个核苷酸插入或缺失导致编码氨基酸的增加/减少，这些类型的突变可能是“框内的”，导致蛋白质中氨基酸的加入或减少，如EGFR基因19号外显子缺失；或可导致“移码”，通常导致蛋白质的过早截短。

4.胚系突变(germline mutation)：发生在生殖细胞中，生殖细胞突变可以遗传给后代，遗传的突变将存在于后代身体的每个细胞中。

5.体细胞突变(somatic mutation)：体细胞突变为获得性突变，由于环境因素的影响或者在DNA复制过程中发生突变，可表现在RNA、氨基酸和蛋白质水平，产生的新抗原、新表位或新蛋白片段，在肿瘤细胞中比较常见。

6.同义突变(synonymous mutation)：指核苷酸的变化并不造成编码氨基酸的改变的突变，本发明中计算TMB时予以排除。

7.非同义突变(nonsynonymous mutation)：指核苷酸的变化造成编码的氨基酸发生改变的突变。

高频突变位点：在肿瘤发生发展中高频率发生突变的位点，包驱动基因的激活突变和抑癌基因的失活突变。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、824基因组合检测TMB值准确性验证

1. 待测样本：

肿瘤突变负荷国家参考品11对配对细胞系，来源于中国食品药品检定研究院，具体信息如下：

样本1：TMB-1-0%，配对TMB-1号样本的对照样本；

样本2：TMB-1-1%，TMB-1号样本稀释到1%的肿瘤含量；

样本3：TMB-1-2%，TMB-1号样本稀释到2%的肿瘤含量；

样本4：TMB-1-5%，TMB-1号样本稀释到5%的肿瘤含量；

样本5：TMB-1-10%，TMB-1号样本稀释到10%的肿瘤含量；

样本6：TMB-2-0%，配对TMB-2号样本的对照样本；

样本7：TMB-2-1%，TMB-2号样本稀释到1%的肿瘤含量；

样本8：TMB-2-2%，TMB-2号样本稀释到2%的肿瘤含量；

样本9：TMB-2-5%，TMB-2号样本稀释到5%的肿瘤含量；

样本10：TMB-2-10%，TMB-2号样本稀释到10%的肿瘤含量；

样本11：TMB-4-0%，配对TMB-4号样本的对照样本；

样本12：TMB-4-1%，TMB-4号样本稀释到1%的肿瘤含量；

样本13：TMB-4-2%，TMB-4号样本稀释到2%的肿瘤含量；

样本14：TMB-4-5%，TMB-4号样本稀释到5%的肿瘤含量；

样本15：TMB-4-10%，TMB-4号样本稀释到10%的肿瘤含量；

样本16：TMB-5-0%，配对TMB-5号样本的对照样本；

样本17：TMB-5-1%，TMB-5号样本稀释到1%的肿瘤含量；

样本18：TMB-5-2%，TMB-5号样本稀释到2%的肿瘤含量；

样本19：TMB-5-5%，TMB-5号样本稀释到5%的肿瘤含量；

样本20：TMB-5-10%，TMB-5号样本稀释到10%的肿瘤含量；

样本21：TMB-6-0%，配对TMB-6样本的对照样本；

样本22：TMB-6-1%，TMB-6号样本稀释到1%的肿瘤含量；

样本23：TMB-6-2%，TMB-6号样本稀释到2%的肿瘤含量；

样本24：TMB-6-5%，TMB-6号样本稀释到5%的肿瘤含量；

样本25：TMB-6-10%，TMB-6号样本稀释到10%的肿瘤含量；

样本26：TMB-7-0%，配对TMB-7样本的对照样本；

样本27：TMB-7-1%，TMB-7号样本稀释到1%的肿瘤含量；

样本28：TMB-7-2%，TMB-7号样本稀释到2%的肿瘤含量；

样本29：TMB-7-5%，TMB-7号样本稀释到5%的肿瘤含量；

样本30：TMB-7-10%，TMB-7号样本稀释到10%的肿瘤含量；

样本31：TMB-8-0%，配对TMB-8样本的对照样本；

样本32：TMB-8-1%，TMB-8号样本稀释到1%的肿瘤含量；

样本33：TMB-8-2%，TMB-8号样本稀释到2%的肿瘤含量；

样本34：TMB-8-5%，TMB-8号样本稀释到5%的肿瘤含量；

样本35：TMB-8-10%，TMB-8号样本稀释到10%的肿瘤含量；

样本36：TMB-9-0%，配对TMB-9样本的对照样本；

样本37：TMB-9-1%，TMB-9号样本稀释到1%的肿瘤含量；

样本38：TMB-9-2%，TMB-9号样本稀释到2%的肿瘤含量；

样本39：TMB-9-5%，TMB-9号样本稀释到5%的肿瘤含量；

样本40：TMB-9-10%，TMB-9号样本稀释到10%的肿瘤含量；

样本41：TMB-11-0%，配对TMB-11样本的对照样本；

样本42：TMB-11-1%，TMB-11号样本稀释到1%的肿瘤含量；

样本43：TMB-11-2%，TMB-11号样本稀释到2%的肿瘤含量；

样本44：TMB-11-5%，TMB-11号样本稀释到5%的肿瘤含量；

样本45：TMB-11-10%，TMB-11号样本稀释到10%的肿瘤含量；

样本46：TMB-12-0%，配对TMB-12样本的对照样本；

样本47：TMB-12-1%，TMB-12号样本稀释到1%的肿瘤含量；

样本48：TMB-12-2%，TMB-12号样本稀释到2%的肿瘤含量；

样本49：TMB-12-5%，TMB-12号样本稀释到5%的肿瘤含量；

样本50：TMB-12-10%，TMB-12号样本稀释到10%的肿瘤含量；

样本51：TMB-13-0%，配对TMB-13样本的对照样本；

样本52：TMB-13-1%，TMB-13号样本稀释到1%的肿瘤含量；

样本53：TMB-13-2%，TMB-13号样本稀释到2%的肿瘤含量；

样本54：TMB-13-5%，TMB-13号样本稀释到5%的肿瘤含量；

样本55：TMB-13-10%，TMB-13号样本稀释到10%的肿瘤含量。

2. 样本测序

2.1 DNA提取

提取各待测样本基因组总DNA，对提取的DNA进行浓度检测，DNA总量不低于50ng。

2.2 文库构建、杂交捕获

采用人825基因突变检测试剂盒（联合探针锚定聚合测序法）（北京泛生子基因科技有限公司，货号：RSN022）进行文库构建和杂交捕获。

具体涉及以下的824个基因（记为824基因组合）：

A2M、ABCB4、ABL1、ABL2、ACTL6A、ACTL6B、ACVR1、ACVR1B、ACVR2A、AGO2、AIP、AKAP9、 AKT1、AKT2、AKT3、ALB、ALK、ALOX12B、AMER1、ANGPT1、ANGPT2、ANKRD11、APC、APCDD1、APLNR、 APOB、AR、ARAF、ARFRP1、ARID1A、ARID1B、ARID2、ARID5B、ASCL2、ASCL4、ASXL1、ASXL2、ATF1、 ATIC、ATM、ATR、ATRX、AURKA、AURKB、AXIN1、AXIN2、AXL、B2M、B4GALT3、BACH1、BAI1、BAI2、 BAI3、BAK1、BAP1、BARD1、BCL10、BCL2、BCL2A1、BCL2L1、BCL2L11、BCL2L2、BCL6、BCOR、 BCORL1、BCR、BIRC3、BLM、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRD7、BRIP1、BTG1、BTG2、BTK、 BUB1B、C1QA、C1R、C1S、CALR、CARD11、CARM1、CASP8、CBFB、CBL、CBLB、CBR1、CCND1、CCND2、 CCND3、CCNE1、CD22、CD274、CD276、CD70、CD74、CD79A、CD79B、CDC25C、CDC42、CDC73、CDH1、 CDH23、CDK12、CDK2、CDK4、CDK6、CDK8、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、 CDX2、CEBPA、CENPA、CFH、CFHR1、CFHR2、CFLAR、CHD2、CHD4、CHD7、CHEK1、CHEK2、CHUK、CIC、 CRBN、CREBBP、CRIPAK、CRKL、CRLF2、CROT、CSDE1、CSF1R、CSF3R、CTCF、CTLA4、CTNNA1、 CTNNB1、CUL3、CUL4A、CUL4B、CXCR4、CYLD、CYP17A1、CYSLTR2、DAPK1、DAXX、DCUN1D1、DDB2、 DDR1、DDR2、DDX3X、DICER1、DIS3、DIS3L2、DNAJB1、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DOT1L、DPYD、 DROSHA、DUSP4、DUSP6、E2F3、EDNRA、EED、EGFL7、EGFR、EGR3、EIF1AX、EIF4A2、EIF4E、ELAC2、 ELANE、ELF3、EML4、EMSY、EP300、EPAS1、EPCAM、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA7、EPHB1、 EPHB2、EPHB4、EPHB6、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ERF、ERG、 ERRFI1、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EWSR1、EXT1、EXT2、EZH1、EZH2、EZR、F8、FAM135B、 FAM175A、FAM46C、FAM58A、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCL、 FANCM、FAS、FAT1、FAT3、FAT4、FBXW7、FCGR1A、FCGR2A、FCGR2B、FCGR2C、FCGR3A、FCGR3B、FGA、 FGF10、FGF12、FGF14、FGF19、FGF23、FGF3、FGF4、FGF6、FGF7、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、 FHIT、FLCN、FLT1、FLT3、FLT4、FNTA、FOXA1、FOXA2、FOXL2、FOXO1、FOXP1、FRK、FUBP1、FYN、 FZR1、GAB2、GABRA6、GALNT12、GATA1、GATA2、GATA3、GATA4、GATA6、GDF1、GDF15、GEN1、GID4、 GJB2、GLI1、GLI3、GNA11、GNA13、GNAQ、GNAS、GNRHR、GPC3、GPR101、GPR124、GPS2、GREM1、 GRIN2A、GRM3、GSK3B、H3F3A、H3F3B、H3F3C、HCK、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC8、HDAC9、 HES1、HGF、HIF1A、HIST1H1C、HIST1H2BD、HIST1H3A、HIST1H3B、HIST1H3C、HIST1H3D、 HIST1H3E、HIST1H3F、HIST1H3G、HIST1H3H、HIST1H3I、HIST1H3J、HIST2H3C、HIST2H3D、 HIST3H3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HMBS、HNF1A、HNF4A、HOXB13、HRAS、HRH2、HSD17B3、HSD3B1、 HSD3B2、HSP90AA1、HSPA4、HUWE1、ICOSLG、ID3、IDH1、IDH2、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、 IGF1、IGF1R、IGF2、IGF2R、IKBKB、IKBKE、IKZF1、IL10、IL6R、IL6ST、IL7R、INHA、INHBA、 INPP4A、INPP4B、INPPL1、INSR、IRF2、IRF4、IRS1、IRS2、ITGB2、ITK、JAK1、JAK2、JAK3、JUN、 KAT6A、KDM5A、KDM5C、KDM6A、KDR、KEAP1、KEL、KIF1B、KIF5B、KIT、KLF4、KLF5、KLHL6、KMT2A、 KMT2B、KMT2C、KMT2D、KMT2E、KNSTRN、KRAS、LASP1、LATS1、LATS2、LCK、LIMK1、LMO1、LRP1B、 LTK、LYN、LZTR1、MACF1、MAF、MALT1、MAML1、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K3、MAP2K4、MAP3K1、 MAP3K13、MAP3K14、MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK8IP1、MAPKAP1、MAX、MC1R、MCL1、MDC1、MDM2、 MDM4、MECOM、MED12、MEF2B、MEN1、MERTK、MET、MGA、MITF、MKNK1、MLH1、MLH3、MPL、MRE11A、 MS4A1、MSH2、MSH3、MSH4、MSH5、MSH6、MSI1、MSI2、MSR1、MST1、MST1R、MTAP、MTOR、MTUS1、 MUC1、MUTYH、MYB、MYBL1、MYC、MYCL、MYCL1、MYCN、MYD88、MYH9、MYOD1、NAB2、NAT1、NAT2、NBN、 NCOA3、NCOR1、NCOR2、NEGR1、NEK11、NF1、NF2、NFATC2、NFE2L1、NFE2L2、NFE2L3、NFKBIA、 NKX2-1、NKX3-1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、NPM1、NR3C1、NRAS、NRG1、NRG3、NSD1、 NT5C2、NTHL1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUBPL、NUF2、NUP93、NUTM1、P2RY8、PAK1、PAK3、PAK7、 PALB2、PALLD、PARK2、PARP1、PARP2、PARP3、PARP4、PAX5、PBRM1、PCBP1、PDCD1、PDCD1LG2、 PDE11A、PDE4DIP、PDGFRA、PDGFRB、PDK1、PDPK1、PGR、PHF20L1、PHF6、PHOX2B、PIGF、PIK3C2B、 PIK3C2G、PIK3C3、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PIM1、PLCG1、 PLCG2、PLK1、PLK2、PMAIP1、PMS1、PMS2、PNRC1、POLD1、POLE、POLH、POT1、PPARG、PPM1D、 PPP2R1A、PPP2R2A、PPP4R2、PPP6C、PRDM1、PRDM14、PREX2、PRKAA1、PRKACA、PRKACB、PRKAR1A、 PRKCA、PRKCB、PRKCG、PRKCI、PRKD1、PRKDC、PROKR2、PRSS1、PRSS8、PSMB1、PSMB2、PSMB5、 PTCH1、PTCH2、PTEN、PTK2、PTP4A1、PTP4A3、PTPN11、PTPN13、PTPRB、PTPRD、PTPRO、PTPRS、 PTPRT、QKI、RAB35、RAC1、RAC2、RAD21、RAD50、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD52、 RAD54L、RAF1、RARA、RARB、RARG、RASA1、RB1、RBL1、RBM10、RECQL、RECQL4、REL、RELA、RET、 RFWD2、RGPD3、RHBDF2、RHEB、RHOA、RICTOR、RIT1、RNASEL、RNF43、ROBO1、ROCK1、ROS1、RPA1、 RPL22、RPL5、RPS14、RPS6KA3、RPS6KA4、RPS6KB1、RPS6KB2、RPTOR、RRAGC、RRAS、RRAS2、 RSPO2、RTEL1、RUNX1、RUNX1T1、RUNX3、RXRA、RXRB、RXRG、RYBP、SBDS、SDC4、SDHA、SDHAF2、 SDHB、SDHC、SDHD、SEMA3A、SEMA3E、SERPINB3、SERPINB4、SESN1、SESN2、SESN3、SETBP1、 SETD2、SETD8、SF1、SF3B1、SGK1、SH2B3、SH2D1A、SHOC2、SHQ1、SIX1、SLAMF7、SLC34A2、 SLC4A1、SLIT2、SLX4、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD7、SMARCA1、SMARCA2、SMARCA4、SMARCAL1、 SMARCB1、SMARCC1、SMARCC2、SMARCD1、SMARCE1、SMC1A、SMC3、SMCHD1、SMO、SMYD3、SNCAIP、 SOCS1、SOS1、SOX17、SOX2、SOX9、SPEN、SPOP、SPRED1、SPRY4、SPTA1、SRC、SRCAP、SRD5A2、 SRSF2、SSTR2、STAG2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、STK11、STK19、 STK40、SUFU、SUZ12、SYK、TACC3、TAF1、TAP1、TAP2、TBL1XR1、TBX3、TCEB1、TCF12、TCF3、 TCF7L2、TEK、TERC、TERT、TET1、TET2、TFG、TGFBR1、TGFBR2、THADA、TIPARP、TLR4、TMEM127、 TMPRSS2、TNFAIP3、TNFRSF14、TNFRSF8、TNFSF11、TNFSF13B、TOP1、TOP2A、TOP3A、TP53、 TP53BP1、TP63、TP73、TPM3、TPMT、TRAF2、TRAF7、TRPS1、TRRAP、TSC1、TSC2、TSHR、TSHZ2、 TTF1、TUBA1A、TUBB、TUBD1、TUBE1、TUBG1、TYR、TYRO3、U2AF1、UGT1A1、UPF1、UROD、USHBP1、 USP12、USP48、USP8、VEGFA、VEGFB、VEZF1、VHL、VTCN1、WAS、WEE1、WHSC1、WHSC1L1、WISP3、 WNT10A、WNT10B、WNT7B、WRN、WT1、WWTR1、XIAP、XPA、XPC、XPO1、XRCC1、XRCC2、XRCC3、YAP1、 YES1、ZFHX3、ZNF148、ZNF217、ZNF521、ZNF703、ZNRF3、ZRSR2。

2.3上机前处理

根据定量出的每个文库的浓度，将所有的肿瘤样本和对照样本DNA文库按5:1（质量比）比例混合，总量≥200ng。

2.4 测序

根据测序反应通用试剂盒（北京泛生子基因科技有限公司，RSN018）说明书进行操作，完成变性、环化以及DNB制备过程，经仪器清洗、加载文库、试剂准备、装载芯片后，完成上机测序过程，得到测序数据。

3. 对测序反应得到的数据进行处理

肿瘤样本和对照样本均按照以下所述步骤进行相同的测序数据处理：

3.1 测序数据过滤

使用Trimmomatic(v0.39)软件对测序所得原始下机的FASTQ文件进行数据处理，去除测序接头序列，去除低质量序列，具体为去除末尾测序质量＜3的碱基；以 4bp为窗口大小进行滑窗，去除窗口平均碱基质量＜15的碱基，得到过滤数据。通过碱基质量过滤后，保留长度≥36bp的reads。

3.2 序列对比及质控

将步骤3.1中过滤后产生的测序数据使用BWA(v0.7.10)软件(bwa mem命令)比对至人类参考基因hg19(GRCh37)上，生成初始BAM文件，并利用samtools(v1.6)软件对初始BAM文件按照坐标进行排序(samtools sort命令)并生成索引文件(samtools index 命令)。

排序后的BAM文件使用GATK(v4.1.3)软件对PCR重复进行去除(GATKMarkDuplicates命令)，得到去重后的BAM文件，并使用samtools(v1.6)软件生成索引文件(samtools index 命令)。

为保证后续分析质量，去重后的样本需满足以下条件：

（1）肿瘤样本需满足：去重后覆盖目标区域测序深度≥200X核苷酸占比在85%以上，去重后的平均测序深度≥400X；

（2）对照样本需满足：去重后覆盖目标区域测序深度≥50X核苷酸占比在85%以上，去重后的平均测序深度≥60X。

若不满足上述要求则不能进行后续分析。

3.3 变异位点检测

对步骤3.2中质控后的比对结果进行变异位点检测。使用UVC软件将肿瘤样本和对照样本的比对结果作为输入文件，对824基因组合覆盖区域检测变异位点进行检测，包括单核苷酸位点突变(SNV)和插入缺失突变(INDEL)。过滤掉胚系变异（即在肿瘤样本的变异中过滤掉对照样本的变异），根据内部相应算法计算每个位点的变异质量，最终以压缩后的VCF文件格式输出初始变异文件。

初始变异文件中还包括每个突变的位点、突变类型、位点深度、突变频率以及过滤判断类型等一系列突变位点的相关信息。其中，不同的变异质量值对应不同的过滤判断值，位点的变异质量越大，该位点为假阳性的概率就越小。UVC将变异质量＞60的位点标记为PASS，筛选标记为PASS的位点作为可靠的变异检测结果。

3.4 体细胞突变位点注释

将步骤3.3获得的可靠变异位点拆分为SNV和INDEL的注释结果，并且处理成注释所需要的格式，使用ENSEMBEL数据库提供的Variant Effect Predictor(VEP v98)对变异位点进行人群数据库注释，获得更详细的突变信息，包括基因名称、转录本号、cDNA变化、蛋白质变化、dbSNP数据库(v150)、千人基因组计划数据库等。根据VEP(v98)提供的基因组转录本(GRCh37.p13)进行注释，结果中含有一种突变有多个转录本与其对应的情况，选用COSMIC（Catalogue of Somatic Mutations in Cancer）数据库(v86)中汇总的相关基因组的转录本信息对VEP(v98)初始注释结果进行筛选，以得到和肿瘤突变相关的转录本信息。

将SNV注释结果、INDEL注释结果与突变位点深度，变异频率信息进行合并，产生最终的注释文件。

3.5 体细胞变异位点筛选

按照以下要求对步骤3.4产生的位点进行进一步筛选。

（1）过滤824基因组合外显子非编码区覆盖的变异位点；

（2）过滤突变频率小于5%的变异位点，过滤reads支持数小于5条的变异位点，过滤肿瘤样本或对照样本深度小于20X的变异位点；

（3）过滤824基因组合外显子编码区覆盖区域外的位点；

（4）过滤824基因组合外显子编码区的同义突变位点；

（5）过滤常见的高频突变位点，高频突变位点包括2种：驱动基因的激活突变和抑癌基因的失活突变，均可能引起肿瘤发生发展，并且这些变异发生具有规律性，发生频率较高。由于发生频率较高，无法代表整个基因组的变异情况，在计算肿瘤突变负荷时如果纳入可能引起较大偏差，因此予以排除，只保留随机发生的肿瘤突变。根据注释结果，若在COSMIC（Catalogue of Somatic Mutations in Cancer）数据库（v86）中有≥20个样本包含该变异位点(CNT≥20)，则被认为是高频突变位点，在计算TMB时予以排除。

4. 根据数据处理结果计算肿瘤突变负荷

824基因组合肿瘤突变负荷计算公式为，TMB=s/n。

其中，s为步骤3.5得到的824基因组合的外显子编码区非同义体细胞变异位点个数（即去除同义突变和高频突变后得到的SNV和INDEL两种突变位点数），n为824基因组合外显子编码区碱基兆数（2.12Mb）。

5. 检测结果

将待测样本均分别按照步骤2-4分别进行DNA提取、建库、捕获、测序、计算TMB值，共检测44对样本（每个对照样本分别与其对应的样本稀释到1%、2%、5%、10%的样本组对），实验重复三次。

对于TMB的计算统计，采用的位点考虑了以下两种情况：

A. 去除高频突变位点，包含同义突变；

B. 去除高频突变位点，去除同义突变。

对于三次重复实验均分别按照上述A，B两种情况计算得到的TMB值与国家参考品说明书TMB值进行一致性分析，如图1所示。

从结果中可以看出不包含同义突变（情况B）的结果与包含同义突变（情况A）的结果相比具有更好的一致性。

实施例2、824基因组合TMB值与WES TMB值一致性验证

根据实施例1的结果，最后确定TMB计算方法中采用的位点去除同义突变。为了进一步验证实际临床中进行TMB分析的准确性，本实施例纳入了某免疫治疗临床试验样本，进一步分析824基因组合TMB值和WES TMB值检测的一致性。

1. 17例临床样本验证

选取临床上诊断为肿瘤的17个患者（经患者知情同意）的肿瘤样本与其非肿瘤样本（即同一患者的非肿瘤组织，外周血或癌旁组织），然后采用两种方法分别进行检测，一种是全外显子测序（WES），计算全基因组外显子TMB值，记为WES TMB值。一种根据本发明实施例1中824基因组合检测，按照实施例1的步骤分别进行建库、捕获、测序，去除同义突变，计算采用824基因组合捕获得到的TMB值，记为824基因组合TMB值。

17例临床样本的TMB值如下：

患者1：直肠癌，WES TMB值7.467，824基因组合TMB值9.906；

患者2：食管鳞癌，WES TMB值3.882，824基因组合TMB值4.245；

患者3：胆管癌，WES TMB值2.895，824基因组合TMB值6.132；

患者4：胶质瘤，WES TMB值26.546，824基因组合TMB值31.132；

患者5：肺腺癌，WES TMB值8.092，824基因组合TMB值10.377；

患者6：肺癌脑转移，WES TMB值5.132，824基因组合TMB值5.660；

患者7：肺腺癌，WES TMB值2.928，824基因组合TMB值3.302；

患者8：胃癌，WES TMB值72.862，824基因组合TMB值72.642；

患者9：肺腺鳞癌，WES TMB值17.171，824基因组合TMB值14.151；

患者10：肺鳞癌，WES TMB值5.0，824基因组合TMB值6.132；

患者11：胃食管交界处癌，WES TMB值26.941，824基因组合TMB值15.566；

患者12：黑色素瘤，WES TMB值1.776，824基因组合TMB值2.830；

患者13：直肠癌，WES TMB值3.421，824基因组合TMB值3.302；

患者14：胶质瘤，WES TMB值0.954，824基因组合TMB值1.415；

患者15：胃癌，WES TMB值4.079，824基因组合TMB值4.245；

患者16：肺鳞癌，WES TMB值28.092，824基因组合TMB值38.208；

患者17：结肠癌，WES TMB值59.474，824基因组合TMB值72.642。

选取的17例临床样本TMB值的大小覆盖低、中、高区域。

按照肿瘤突变负荷国家参考盘说明书（批号360042-201901）描述的方法，对17例临床样本的824基因组合TMB值和WES TMB值建立了线性回归方程，并对两组数据的Pearson、Spearman相关性进行了计算，如图2所示。从模型的相关性结果来看（Spearman相关性为0.95，Pearson相关性为0.98），824基因组合TMB值和WES TMB值具有较好的线性关系。

2. 27例临床样本验证

为进一步验证本发明方法的准确性，又增加了27例临床试验的样本，采用两种方法分别进行检测，一种是全外显子测序（WES），一种根据本发明实施例1中824基因组合检测，去除同义突变，并计算824基因组合TMB值和WES TMB值，而后对两种TMB进行一致性分析，如图3所示，结果具有较好的一致性。

27例临床试验的样本的TMB值如下：

样本18：结肠腺癌，WES TMB值61.645，824基因组合TMB值66.038；

样本19：胃腺癌，WES TMB值41.579，824基因组合TMB值48.113；

样本20：直肠腺癌，WES TMB值36.020，824基因组合TMB值41.038；

样本21：胃癌，WES TMB值27.204，824基因组合TMB值36.792；

样本22：结肠腺癌，WES TMB值32.138，824基因组合TMB值36.321；

样本23：盲肠腺癌，WES TMB值22.401，824基因组合TMB值27.830；

样本24：肺腺癌，WES TMB值14.309，824基因组合TMB值15.566；

样本25：肺鳞癌，WES TMB值9.868，824基因组合TMB值12.264；

样本26：喉癌，WES TMB值7.697，824基因组合TMB值10.377；

样本27：肺腺癌，WES TMB值8.421，824基因组合TMB值8.491；

样本28：肺癌，WES TMB值4.803，824基因组合TMB值6.604；

样本29：肝癌，WES TMB值3.520，824基因组合TMB值6.132；

样本30：肺鳞癌，WES TMB值3.125，824基因组合TMB值4.717；

样本31：直肠腺癌，WES TMB值2.072，824基因组合TMB值4.245；

样本32：直肠腺癌，WES TMB值4.572，824基因组合TMB值4.717；

样本33：直肠癌，WES TMB值7.434，824基因组合TMB值16.509；

样本34：结肠癌，WES TMB值38.750，824基因组合TMB值51.415；

样本35：肺鳞癌，WES TMB值7.697，824基因组合TMB值8.491；

样本36：肺鳞癌，WES TMB值17.007，824基因组合TMB值17.453；

样本37：结肠癌，WES TMB值49.112，824基因组合TMB值53.774；

样本38：结肠腺癌，WES TMB值47.401，824基因组合TMB值64.623；

样本39：肝细胞癌，WES TMB值2.763，824基因组合TMB值2.358；

样本40：结肠腺癌，WES TMB值102.467，824基因组合TMB值84.434；

样本41：胃腺癌，WES TMB值37.763，824基因组合TMB值53.774；

样本42：肝癌，WES TMB值27.270，824基因组合TMB值39.151；

样本43：肺腺癌，WES TMB值6.711，824基因组合TMB值5.660；

样本44：肺腺癌，WES TMB值3.289，824基因组合TMB值1.415。

本发明对目标检测区域的具体位点进行优化，排除了人群中肿瘤发生发展相关高频突变位点，并且不纳入同义突变，使得基于824基因组合和全外显子测序的TMB结果高度一致，并在真实世界中有比较理想的临床预测效果。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (7)

1.检测肿瘤突变负荷的系统，包括：肿瘤突变负荷的计算模块，所述计算模块用于计算肿瘤突变负荷TMB，TMB=s/n，s为824个基因组合中外显子编码区非同义体细胞变异位点总个数，n为824个基因组合覆盖的编码区碱基兆数；

所述824个基因组合由如下基因组成：

A2M、ABCB4、ABL1、ABL2、ACTL6A、ACTL6B、ACVR1、ACVR1B、ACVR2A、AGO2、AIP、AKAP9、AKT1、AKT2、AKT3、ALB、ALK、ALOX12B、AMER1、ANGPT1、ANGPT2、ANKRD11、APC、APCDD1、APLNR、APOB、AR、ARAF、ARFRP1、ARID1A、ARID1B、ARID2、ARID5B、ASCL2、ASCL4、ASXL1、ASXL2、ATF1、ATIC、ATM、ATR、ATRX、AURKA、AURKB、AXIN1、AXIN2、AXL、B2M、B4GALT3、BACH1、BAI1、BAI2、BAI3、BAK1、BAP1、BARD1、BCL10、BCL2、BCL2A1、BCL2L1、BCL2L11、BCL2L2、BCL6、BCOR、BCORL1、BCR、BIRC3、BLM、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRD7、BRIP1、BTG1、BTG2、BTK、BUB1B、C1QA、C1R、C1S、CALR、CARD11、CARM1、CASP8、CBFB、CBL、CBLB、CBR1、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD22、CD274、CD276、CD70、CD74、CD79A、CD79B、CDC25C、CDC42、CDC73、CDH1、CDH23、CDK12、CDK2、CDK4、CDK6、CDK8、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CDX2、CEBPA、CENPA、CFH、CFHR1、CFHR2、CFLAR、CHD2、CHD4、CHD7、CHEK1、CHEK2、CHUK、CIC、CRBN、CREBBP、CRIPAK、CRKL、CRLF2、CROT、CSDE1、CSF1R、CSF3R、CTCF、CTLA4、CTNNA1、CTNNB1、CUL3、CUL4A、CUL4B、CXCR4、CYLD、CYP17A1、CYSLTR2、DAPK1、DAXX、DCUN1D1、DDB2、DDR1、DDR2、DDX3X、DICER1、DIS3、DIS3L2、DNAJB1、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DOT1L、DPYD、DROSHA、DUSP4、DUSP6、E2F3、EDNRA、EED、EGFL7、EGFR、EGR3、EIF1AX、EIF4A2、EIF4E、ELAC2、ELANE、ELF3、EML4、EMSY、EP300、EPAS1、EPCAM、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA7、EPHB1、EPHB2、EPHB4、EPHB6、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ERF、ERG、ERRFI1、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EWSR1、EXT1、EXT2、EZH1、EZH2、EZR、F8、FAM135B、FAM175A、FAM46C、FAM58A、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCL、FANCM、FAS、FAT1、FAT3、FAT4、FBXW7、FCGR1A、FCGR2A、FCGR2B、FCGR2C、FCGR3A、FCGR3B、FGA、FGF10、FGF12、FGF14、FGF19、FGF23、FGF3、FGF4、FGF6、FGF7、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FHIT、FLCN、FLT1、FLT3、FLT4、FNTA、FOXA1、FOXA2、FOXL2、FOXO1、FOXP1、FRK、FUBP1、FYN、FZR1、GAB2、GABRA6、GALNT12、GATA1、GATA2、GATA3、GATA4、GATA6、GDF1、GDF15、GEN1、GID4、GJB2、GLI1、GLI3、GNA11、GNA13、GNAQ、GNAS、GNRHR、GPC3、GPR101、GPR124、GPS2、GREM1、GRIN2A、GRM3、GSK3B、H3F3A、H3F3B、H3F3C、HCK、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC8、HDAC9、HES1、HGF、HIF1A、HIST1H1C、HIST1H2BD、HIST1H3A、HIST1H3B、HIST1H3C、HIST1H3D、HIST1H3E、HIST1H3F、HIST1H3G、HIST1H3H、HIST1H3I、HIST1H3J、HIST2H3C、HIST2H3D、HIST3H3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HMBS、HNF1A、HNF4A、HOXB13、HRAS、HRH2、HSD17B3、HSD3B1、HSD3B2、HSP90AA1、HSPA4、HUWE1、ICOSLG、ID3、IDH1、IDH2、IFNAR1、IFNAR2、IFNGR1、IFNGR2、IGF1、IGF1R、IGF2、IGF2R、IKBKB、IKBKE、IKZF1、IL10、IL6R、IL6ST、IL7R、INHA、INHBA、INPP4A、INPP4B、INPPL1、INSR、IRF2、IRF4、IRS1、IRS2、ITGB2、ITK、JAK1、JAK2、JAK3、JUN、KAT6A、KDM5A、KDM5C、KDM6A、KDR、KEAP1、KEL、KIF1B、KIF5B、KIT、KLF4、KLF5、KLHL6、KMT2A、KMT2B、KMT2C、KMT2D、KMT2E、KNSTRN、KRAS、LASP1、LATS1、LATS2、LCK、LIMK1、LMO1、LRP1B、LTK、LYN、LZTR1、MACF1、MAF、MALT1、MAML1、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K3、MAP2K4、MAP3K1、MAP3K13、MAP3K14、MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK8IP1、MAPKAP1、MAX、MC1R、MCL1、MDC1、MDM2、MDM4、MECOM、MED12、MEF2B、MEN1、MERTK、MET、MGA、MITF、MKNK1、MLH1、MLH3、MPL、MRE11A、MS4A1、MSH2、MSH3、MSH4、MSH5、MSH6、MSI1、MSI2、MSR1、MST1、MST1R、MTAP、MTOR、MTUS1、MUC1、MUTYH、MYB、MYBL1、MYC、MYCL、MYCL1、MYCN、MYD88、MYH9、MYOD1、NAB2、NAT1、NAT2、NBN、NCOA3、NCOR1、NCOR2、NEGR1、NEK11、NF1、NF2、NFATC2、NFE2L1、NFE2L2、NFE2L3、NFKBIA、NKX2-1、NKX3-1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、NPM1、NR3C1、NRAS、NRG1、NRG3、NSD1、NT5C2、NTHL1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUBPL、NUF2、NUP93、NUTM1、P2RY8、PAK1、PAK3、PAK7、PALB2、PALLD、PARK2、PARP1、PARP2、PARP3、PARP4、PAX5、PBRM1、PCBP1、PDCD1、PDCD1LG2、PDE11A、PDE4DIP、PDGFRA、PDGFRB、PDK1、PDPK1、PGR、PHF20L1、PHF6、PHOX2B、PIGF、PIK3C2B、PIK3C2G、PIK3C3、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PIM1、PLCG1、PLCG2、PLK1、PLK2、PMAIP1、PMS1、PMS2、PNRC1、POLD1、POLE、POLH、POT1、PPARG、PPM1D、PPP2R1A、PPP2R2A、PPP4R2、PPP6C、PRDM1、PRDM14、PREX2、PRKAA1、PRKACA、PRKACB、PRKAR1A、PRKCA、PRKCB、PRKCG、PRKCI、PRKD1、PRKDC、PROKR2、PRSS1、PRSS8、PSMB1、PSMB2、PSMB5、PTCH1、PTCH2、PTEN、PTK2、PTP4A1、PTP4A3、PTPN11、PTPN13、PTPRB、PTPRD、PTPRO、PTPRS、PTPRT、QKI、RAB35、RAC1、RAC2、RAD21、RAD50、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD52、RAD54L、RAF1、RARA、RARB、RARG、RASA1、RB1、RBL1、RBM10 、RECQL、RECQL4、REL、RELA、RET、RFWD2、RGPD3、RHBDF2、RHEB、RHOA、RICTOR、RIT1、RNASEL、RNF43、ROBO1、ROCK1、ROS1、RPA1、RPL22、RPL5、RPS14、RPS6KA3、RPS6KA4、RPS6KB1、RPS6KB2、RPTOR、RRAGC、RRAS、RRAS2、RSPO2、RTEL1、RUNX1、RUNX1T1、RUNX3、RXRA、RXRB、RXRG、RYBP、SBDS、SDC4、SDHA、SDHAF2、SDHB、SDHC、SDHD、SEMA3A、SEMA3E、SERPINB3、SERPINB4、SESN1、SESN2、SESN3、SETBP1、SETD2、SETD8、SF1、SF3B1、SGK1、SH2B3、SH2D1A、SHOC2、SHQ1、SIX1、SLAMF7、SLC34A2、SLC4A1、SLIT2、SLX4、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD7、SMARCA1、SMARCA2、SMARCA4、SMARCAL1、SMARCB1、SMARCC1、SMARCC2、SMARCD1、SMARCE1、SMC1A、SMC3、SMCHD1、SMO、SMYD3、SNCAIP、SOCS1、SOS1、SOX17、SOX2、SOX9、SPEN、SPOP、SPRED1、SPRY4、SPTA1、SRC、SRCAP、SRD5A2、SRSF2、SSTR2、STAG2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、STK11、STK19、STK40、SUFU、SUZ12、SYK、TACC3、TAF1、TAP1、TAP2、TBL1XR1、TBX3、TCEB1、TCF12、TCF3、TCF7L2、TEK、TERC、TERT、TET1、TET2、TFG、TGFBR1、TGFBR2、THADA、TIPARP、TLR4、TMEM127、TMPRSS2、TNFAIP3、TNFRSF14、TNFRSF8、TNFSF11、TNFSF13B、TOP1、TOP2A、TOP3A、TP53、TP53BP1、TP63、TP73、TPM3、TPMT、TRAF2、TRAF7、TRPS1、TRRAP、TSC1、TSC2、TSHR、TSHZ2、TTF1、TUBA1A、TUBB、TUBD1、TUBE1、TUBG1、TYR、TYRO3、U2AF1、UGT1A1、UPF1、UROD、USHBP1、USP12、USP48、USP8、VEGFA、VEGFB、VEZF1、VHL、VTCN1、WAS、WEE1、WHSC1、WHSC1L1、WISP3、WNT10A、WNT10B、WNT7B、WRN、WT1、WWTR1、XIAP、XPA、XPC、XPO1、XRCC1、XRCC2、XRCC3、YAP1、YES1、ZFHX3、ZNF148、ZNF217、ZNF521、ZNF703、ZNRF3、ZRSR2；

所述外显子编码区非同义体细胞变异位点为发生单核苷酸位点突变(SNV)和插入缺失突变的位点。

2.根据权利要求1所述系统，其特征在于：所述外显子编码区非同义体细胞变异位点不包括1）-4）：1）突变频率小于5%的变异位点，2）reads支持数小于5的变异位点，3）样本测序深度小于20X的变异位点，4）高频突变位点，所述高频突变位点为COSMIC数据库中有不小于20个样本包含的变异位点，所述COSMIC数据库的版本为v86。

3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：所述系统还包括检测权利要求1中所述824个基因组合中各基因突变的试剂和/或对高通量测序结果进行分析的模块或软件。

4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于：所述检测权利要求1中所述824个基因组合中各基因突变的试剂为检测所述824个基因组合序列时进行建库、捕获所述824个基因组合和/或测序所需的试剂和/或仪器和/或模块或软件；

所述对高通量测序结果进行分析的模块或软件为对所述824个基因组合的测序结果进行过滤、序列比对、去重、变异提取和/或变异过滤所需的模块或软件。

5.权利要求1-4所述的系统在制备预测或辅助预测肿瘤患者肿瘤突变负荷产品中的应用。

6.权利要求1- 4中任一所述的系统在制备预测或辅助预测肿瘤患者免疫检查点抑制剂治疗效果产品中的应用。

7.权利要求1- 4中任一所述的系统在制备筛查或辅助筛查免疫检查点抑制剂治疗获益肿瘤患者产品中的应用。

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