KR20190032374A

KR20190032374A - 엑소좀-안내 암 치료(exosome-guided treatment of cancer)

Info

Publication number: KR20190032374A
Application number: KR1020197001923A
Authority: KR
Inventors: 패트릭 순-시옹
Original assignee: 난트 홀딩스 아이피, 엘엘씨
Priority date: 2016-06-21
Filing date: 2017-06-21
Publication date: 2019-03-27
Also published as: CN109716135A; CA3027478A1; SG11201811070SA; IL263835A; AU2017280204A1; JP2019527343A; US20190234955A1; EP3472623A4; WO2017223186A1; EP3472623A1; MX2018015797A

Abstract

환자의 치료를 모니터링하는 방법들 및 시스템들은 엑소좀(exosome)들로부터 획득되는 정보를 이용하고, 종양으로부터 식별된 치료 타겟은 종양 외부의 생체 유체(biological fluid)에서의 엑소좀들에서 추적된다.

Description

엑소좀-안내 암 치료(EXOSOME-GUIDED TREATMENT OF CANCER)

본 발명의 분야는 엑소좀(exosome)들을 통해, 특히 엑소좀들의 단백질 분석을 통해 암의 치료를 모니터링하는 것에 관한 것으로, 여기서 단백질은 성장, 전이(metastasis), 및/또는 증식(proliferation)을 유도하는 것으로 알려진 돌연변이와 관련된다.

배경기술의 기술은 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 여기에 제공된 임의의 정보가 선행 기술이거나 또는 현재 청구되는 발명과 관련이 있거나, 또는 구체적으로 또는 암시적으로 참조되는 임의의 간행물이 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.

본 명세서의 모든 간행물들은 각각의 개별적인 간행물 또는 특허 출원이 참조로 통합되는 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 표시되는 것과 동등한 정도로 참조로서 통합된다. 통합되는 참조에서의 용어의 사용 또는 정의는 일관성이 없거나 또는 본 명세서에 제공되는 해당 용어의 정의와 상반되는 경우에는, 본 명세서에 제공되는 해당 용어의 정의가 적용되고 참조에서의 해당 용어의 정의는 적용되지 않는다.

오믹스 분석은 점차 다양한 질병들, 특히 암의 치료에서 임상적으로 관련된 타겟(target)들을 결정하기 위한 도구가 되었다. 오믹스 분석은 질병 조직(diseased tissue) 및 잠재적인 치료 옵션들에 대한 중요한 통찰력을 제공하지만, 치료 경과 또는 성공을 모니터링하는 것은 일반적으로 가능하지 않으며 이는 이러한 모니터링이 빈번하게 질병 조직을 리샘플링(re-sampling)하도록 요구하기 때문이다. 대안적으로, 암 세포들이 상당량의 엑소좀을 방출(shed)하는 것으로 알려져 있기 때문에 엑소좀들은 특정 환경들에서 생검(biopsy)에 대한 프록시(proxy)로서 용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제8021847호 및 미국 특허 제8476017호는 질병과 관련된 것으로 알려진 RNA 시퀀스(RNA sequence)들을 식별하기 위한 진단 도구로서 엑소좀들의 용도를 교시한다. 그러나, RNA 시퀀스가 비질병 조직에도 존재하는 경우 이러한 접근법은 유용성이 떨어지고 그리고 치료의 직접적인 기능 정보를 제공하지 못한다.

보다 최근에, 엑소좀들은 면역 반응들(예를 들어, Nat Rev Immunol 2014; 14(3):195-208 참조) 뿐만 아니라 종양 미세환경의 생명활동(예를 들어, Molecular Cancer 2016; 15:42, 또는 Semin Cell Dev Biol 2015;40:72-81 참조)에 영향을 주는 것으로 보고되기도 했다. 또한, 엑소좀들은 레트로트랜스포존(retrotransposon) 엘리먼트들 및 증폭되는 종양유전자 시퀀스(amplified oncogene sequence)들을 포함하는 것으로 보고되었다(Nat Commun 2011;2:180 참조).

따라서, 예를 들어 미국 특허 제2011/0053157호에 개시되는 바와 같은 치료 제제(therapeutic agent)들로서 엑소좀들이 제안되기도 했다. 그러나, 종양-유래 엑소좀들은 항원-특이적 T 및 B 세포 반응들을 유도하는, 동물 모델에서의 강력한 함암 백신인 것으로 나타났지만, 종양 유래 엑소좀들에 관한 보다 최근의 문헌은 소포(vesicle)들이 중요한 면역억제(immunosuppressive) 역할을 수행한다는 것을 강하게 시사한다(예를 들어, Vaccines 2015, 3, 1019-1051 참조). '157호 참조문헌은 또한 치료를 모니터링하는데 사용될 수 있는 잠재적인 치료 타겟들의 식별에서의 엑소좀 관련 RNA의 용도를 교시한다. 유사하게는, 다양한 엑소좀 관련 miRNA들이 잠재적인 마커들로 보고되었다(예를 들어, Molecular Cancer (2016) 15:42)

따라서, 엑소좀들의 분야가 상당한 연구 노력들로부터 이익을 얻었지만, 기능에서, 특히 질병 관련 기능에서 강한 관련성을 가지는 신뢰성있는 단백질 마커들은 아직 미지로 남아있다. 그러므로, 엑소좀들을 사용하여 치료의 검증 및 모니터링을 허용하는 시스템들 및 방법들에 관한 수요가 존재한다.

본 출원은 2016년 6월 21일 출원된, 미국 가출원 번호 제62/352753호에 대한 우선권을 주장한다.

본 발명의 주제는 질병의 치료에서 타겟들로 작용하는 하나 이상의 환자- 및 질병- 관련 단백질(patient- and disease-associated protein)을 이용하여 환자의 치료를 모니터링하는 다양한 시스템들 및 방법들에 관한 것이다. 유리하게는, 이러한 모니터링은 질병 및 환자에 매우 특이적이고, 그리고 치료의 효과에 관한 직접적인 정보를 제공하며, 특히 여기서 치료는 네오에피토프(neoepitope)들을 타겟팅하는 면역 요법이다.

본 발명의 주제의 일 양상에서, 본 발명자는 환자-특이적 질병-관련 단백질을 식별하기 위해 복수의 오믹스(omics) 데이터를 사용하는 단계를 포함하는 환자의 치료를 모니터링하는 방법을 고려한다. 또 다른 단계에서, 상기 환자-특이적 질병 관련 단백질(patient-specific disease associated protein)의 양 및/또는 존재는 제 1 엑소좀에서 결정되고, 상기 제 1 엑소좀은 치료 전 상기 환자의 생체 유체(biological fluid)로부터 획득되고, 그리고 상기 치료는 상기 환자-특이적 질병 관련 단백질을 타겟팅(target)한다. 또 다른 단계에서, 상기 환자-특이적 질병 관련 단백질의 양 및/또는 존재는 제 2 엑소좀에서 결정되고, 상기 제 2 엑소좀은 치료 이후 또는 치료 중에 상기 환자의 상기 생체 유체로부터 획득된다. 그리고 환자 기록은 상기 제 2 엑소좀에서의 상기 환자-특이적 질병 관련 단백질의 양 및 존재 중 적어도 하나의 결정에 기초하여 업데이트(update)된다.

보다 일반적으로, 복수의 오믹스 데이터는 전체 게놈 시퀀싱 데이터(whole genome sequencing data), 엑솜 시퀀싱 데이터(exome sequencing data), 전사체 시퀀싱 데이터(transcriptome sequencing data) 및 프로테옴 시퀀싱 데이터(proteome sequencing data)로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 그리고/또는 상기 복수의 오믹스 데이터는 질병 조직(diseased tissue)으로부터의 오믹스 데이터 및 매칭되는(matched) 정상 조직으로부터의 오믹스 데이터를 포함한다.

몇몇 실시예들에서, 상기 환자-특이적 질병 관련 단백질은 유리하게는 비-변이(non-mutated), 침묵(silenced), 과소발현, 또는 과발현된 유전자들의 식별을 허용할 경로 분석 알고리즘(예를 들어, 탈조절(deregulated) 또는 구조(rescue) 경로들을 식별하기 위해 패러다임(PARADIGM)을 사용)을 사용하여 식별될 수 있다. 다른 실시예들서, 상기 환자-특이적 질병 관련 단백질은, 전이(metastasis)에 관련하는 유전자들 또는 암 드라이버 유전자(cancer driver gene)들을 식별할 수 있는 변이되거나 또는 탈조절되는 유전자일 수 있다. 따라서, 고려되는 환자-특이적 질병 관련 단백질은 키나아제(kinase), 수용체(receptor), 성장 인자(growth factor), 전사 인자(transcription factor), 또는 신호 전달(signal transduction)-관련 단백질을 포함할 수 있다(예를 들어, 여기서 치료는 화학요법(chemotherapy을 포함함). 추가적인 실시예들에서, 상기 환자-특이적 질병 관련 단백질은 환자 및 종양-특이적 네오에피토프(patient and tumor-specific neoepitope)이다(예를 들어, 여기서 치료는 면역 요법(immune therapy)을 포함함). 또한, 상기 환자-특이적 질병 관련 단백질의 양 및 존재는 질량 분광 반응 모니터링(mass spectroscopic reaction monitoring) (예를 들어, 선택된 반응 모니터링(selected reaction monitoring), 연속적 반응 모니터링(consecutive reaction monitoring), 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring) 및 병렬 반응 모니터링(parallel reaction monitoring))을 사용하여 결정되는 것이 고려된다. 또한, 원하는 경우, 고려되는 방법들은 또한 순환 종양 핵산(circulating tumor nucleic acid)(예를 들어, ctRNA), 또는 상기 제 1 및/또는 제 2 엑소좀에 존재하는 핵산을 분석하는 단계를 포함할 수 있다.

엑소좀들은 비-특이적 포획(non-specific entrapment) 및/또는 항체-매개 포획(antibody-mediated capture)을 이용하여 분리(isolated)될 수 있고, 상기 생체 유체들은 일반적으로 전혈(whole blood), 혈청(serum), 혈장(plasma) 또는 소변(urine)들을 포함한다. 또한, 상기 제 2 엑소좀에서의 상기 환자-특이적 질병 관련 단백질의 양 및/또는 존재를 결정하는 단계는 적어도 한번 반복될 수 있고, 그리고 상기 환자 기록을 업데이트하는 단계는 치료를 수정하기 위한 권고를 포함할 것이다.

따라서, 본 발명자는 또한 치료를 모니터링하기 위해 엑소좀 마커(exosomal marker)를 선택하는 방법을 고려한다. 이러한 방법은 바람직하게는 환자-특이적 질병 관련 단백질을 식별하기 위해 복수의 오믹스 데이터를 사용하는 단계, 및 상기 환자-특이적 질병 관련 단백질을 타겟팅하는 치료 조성물을 식별하는 추가적인 단계를 포함한다. 상기 환자-특이적 질병 관련 단백질의 양 및 존재 중 적어도 하나는 엑소좀에서 결정되고, 상기 엑소좀은 치료 전 상기 환자의 생체 유체로부터 획득된다. 그리고, 상기 환자-특이적 질병 관련 단백질은 상기 질병 관련 단백질이 정량화에 충분한 양(예를 들어, 적어도 1 아토몰(attomol)인)으로 존재하는지의 결정에 대하여 치료를 모니터링하기 위해 선택된다.

보다 일반적으로, 상기 오믹스 데이터는 전체 게놈 시퀀싱 데이터, 엑솜 시퀀싱 데이터, 전사체 시퀀싱 데이터 및 프로테옴 시퀀싱 데이터로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 그리고/또는 상기 환자-특이적 질병 관련 단백질은 경로 분석 알고리즘(예를 들어, 패러다임(PARADIGM)을 이용함)을 이용하여 식별된다. 본 발명의 주제를 한정하는 것은 아니지만, 상기 오믹스 데이터는 질병 조직(diseased tissue)으로부터의 오믹스 데이터 및 매칭되는(matched) 정상 조직으로부터의 오믹스 데이터를 포함하고, 그리고 상기 질병은 암인 것이 일반적으로 바람직하다.

상기 환자-특이적 질병 관련 단백질에 관련하여, 상기 단백질은 화학요법으로 타겟팅될 수 있는 과발현 단백질 또는 돌연변이 단백질(예를 들어, 키나아제, 수용체, 성장 인자, 전사 인자, 또는 신호 전달-관련 단백질)일 수 있고, 그리고/또는 상기 환자-특이적 질병 관련 단백질은 면역 요법으로 타겟팅될 수 있는 환자 및 종양-특이적 네오에피토프일 수 있다는 점이 고려될 수 있다. 상기 환자-특이적 질병 관련 단백질의 양 및/또는 존재는 질량 분광 반응 모니터링을 사용하여 결정되는 것이 또한 추가적으로 고려된다.

상기 관점에서, 본 발명자는 또한 환자의 면역 요법 치료를 모니터링하는 방법을 고려한다. 바람직한 방법들은 제 1 엑소좀에서의 환자- 및 종양-특이적 네오에피토프(patient- and tumor-specific neoepitope)의 양 및/또는 존재를 결정하는 단계를 포함할 것이고, 여기서 상기 제 1 엑소좀은 치료 전에 상기 환자의 생체 유체로부터 획득되고, 그리고 여기서 상기 면역 요법 치료는 상기 환자- 및 종양-특이적 네오에피토프를 타겟팅한다. 다른 단계에서, 상기 환자- 및 종양-특이적 네오에피토프의 양 및/또는 존재는 제 2 엑소좀에서 결정되고, 여기서 상기 제 2 엑소좀은 치료 이후 또는 치료 중에 상기 환자의 생체 유체로부터 획득된다. 보다 바람직하게는, 상기 결정하는 단계들은 질량 분광 반응 모니터링(예를 들어, 선택된 반응 모니터링, 연속적 반응 모니터링, 다중 반응 모니터링 및 병렬 반응 모니터링)을 사용하여 수행된다.

예를 들어, 적합한 면역 요법 치료는 상기 환자- 및 종양-특이적 네오에피토프를 인코딩하는(encoding) 핵산을 포함하는 재조합 엔티티(recombinant entity)(예를 들어, 선택적으로 복제 결핍(replication deficient), 방사선조사(irradiated) 박테리아, 또는 방사선조사 효모인 아데노바이러스(adenovirus))의 투여를 포함할 수 있다. 또한, 고려되는 방법들은 상기 제 1 및 제 2 엑소좀 중 적어도 하나에 존재하는 핵산을 분석하는 단계 및/또는 상기 생체 유체에서의 순환 종양 RNA를 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 원하는 경우, 상기 면역 요법 치료는 체크포인트 억제제(checkpoint inhibitor) 및/또는 면역 자극 사이토킨(immune stimulatory cytokine)의 투여를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 주제의 다양한 목적들, 특징들, 양상들 및 장점들은 바람직한 실시예들에 대한 다음의 상세한 기술로부터 보다 명확해질 것이다.

환자의 다양한 치료들, 특히 암 치료가 환자-특이적이고 그리고 환자의 질병과 관련되는 하나 이상의 엑소좀 단백질들의 정량화 및/또는 검출에 의해 모니터링될 수 있다는 점을 본 발명자는 발견했다. 특히 바람직한 방법들에서, 상기 단백질들은 정성적으로 또는 정량적으로 결정되고 그리고 환자의 체액으로부터 분리되는 엑소좀 상에 그리고/또는 엑소좀 내에 있을 수 있다. 또한, 상기 단백질들은 바람직하게는 치료의 타겟(target)이고 따라서 치료 효능에 대한 직접적이고 구체적인 통찰력을 제공할 것이다. 고려되는 방법들은 실시간 또는 거의 실시간으로 환자의 치료 효과들을 추적(following)하는 것을 허용할 것이라는 점이 또한 인식되어야 한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "환자(patient)"는 "대상(subject)"및 "개체(individual)"의 용어들과 상호 교환가능하며, 그리고 엑소좀들을 가지는 것으로 기대되거나 또는 나타난 모든 동물들을 지칭한다. 예를 들어, 상기 환자는 포유류, 인간 또는 인간이 아닌 영장류, 개, 고양이, 말, 젖소, 다른 가축들, 또는 설치류일 수 있다.

본 발명의 주제의 일 예시적인 양상에서, 암으로 진단된 환자는 종양의 일부분이 일반적으로 전체 게놈 시퀀싱(whole genome sequencing), 전사체 시퀀싱(transcriptome sequencing) 및/또는 프로테오믹스 분석(proteomics analysis)을 사용하는, 오믹스 분석(omics analysis)들에 이용되는 종양 생검(biopsy)의 대상이 될 수 있다. 바람직하게는, 전체 게놈 시퀀싱 데이터는 매칭되는(matched) 정상 조직(즉, 혈액과 같은 동일한 환자로부터의 건강한 조직 또는 종양에 의해 영향을 받는 기관의 건강한 조직의 일부분)으로부터의 전체 게놈 시퀀싱 데이터와 함께 사용되어 또한 환자에 대해 특이적인 암-관련 변화들을 식별한다. 이러한 비교 분석을 위한 수많은 알고리즘들이 본 기술 분야에 널리 공지되어 있지만, 이러한 분석은 위치적 참조 정보(positional reference information)(예를 들어, BAM 포맷(BAM format), GAR 포맷(GAR format) 등)에 기초하여 구성되는 데이터 파일들의 동기 증분 정렬(synchronous incremental alignment)을 사용하여 수행되는 것이 특히 바람직하다. 예를 들어, 적합한 알고리즘들은 미국 특허 제2012/0059670호 및 미국 특허 제2012/0066001호에 기술되는 것들을 포함한다. 또한, 오믹스 데이터 (전사체학(transcriptomics) 및 프로테오믹스 데이터와 함께)는 경로 분석 알고리즘(pathway analysis algorithm)에도 사용되어 잠재적으로 약물 치료 가능한(druggable) 타겟들 또는 타겟 경로들을 식별하거나, 또는 의약에 대한 종양의 민감도를 회복시킬 수 있는 하나 이상의 치료들을 식별한다. 다른 적합한 경로 분석 도구들 중에서 특히 고려되는 경로 분석 알고리즘들은 국제공개공보 제2011/139345호, 국제공개공보 제2013/062505호, 및 국제공개공보 제2014/193982호에 교시된다.

쉽게 이해되는 바와 같이, 적합한 타겟들이 경로 분석들 및/또는 돌연변이 분석(mutational analysis)에 기초하여 식별되는 경우, 약물 치료 가능한 타겟을 타겟팅하거나 또는 의약 민감성 경로(drug sensitive pathway)를 타겟팅하는 하나 이상의 화학요법(chemotherapeutic) 제제들을 이용하여 환자가 치료될 수 있다. 상이한 관점으로 볼 때, 이렇게 식별되는 약물 치료 가능한 타겟들 및/또는 경로들은 암의 치료에 사용되는 환자-특이적 및 질병 관련 단백질(patient-specific and disease associated protein)들을 제공한다는 점이 인식되어야 한다. 유사하게는, 환자-특이적 및 질병 관련 단백질들은 발현 레벨(expression level) 및/또는 돌연변이 상태(즉, 예를 들어, 과-활성(over-activity) 또는 활성 상실(loss of activity)을 초래하는)에 기초하는 경로 알고리즘들을 사용하여 식별될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 오믹스 분석은 또한 암 백신을 이용하는 치료(예를 들어, 발현가능하고 그리고 MHC 제시가능한 형태로 네오에피토프를 인코딩하는 재조합 핵산을 전달하는 바이러스, 효모, 또는 재조합 박테리아 통한)에 적합한 하나 이상의 네오에피토프들의 존재를 밝힐 수 있다. 따라서, 환자-특이적 및 질병 관련 단백질들은 또한 하나 이상의 환자 및 종양 특이적 네오에피토프들을 포함한다.

환자-특이적 및 질병 관련 단백질은 치료(또는 이전 치료가 비효과적이었던 경우 새로운 치료 회차(round))의 시작 전에 확립(established)될 수 있고 그리고 질병 관련 단백질들의 식별은 직접적으로 효과적인 치료의 유형을 안내할 수 있다는 점이 특히 인식되어야 한다. 또한, 환자로부터의 생체 유체는 치료(또는 이전 치료가 비효과적이었던 경우 새로운 치료 회차)의 시작 전에 획득되고 그리고 환자-특이적 질병 관련 단백질의 양 및/또는 존재는 환자의 생체 유체에서의 엑소좀들에서 결정된다. 화학요법 및/또는 면역요법(immunotherapy)에 대한 치료를 확정하고 그리고 화학요법 및/또는 면역 요법의 타겟의 존재를 확정함으로써, 더 높은 성공 가능성을 가질 것으로 기대될 뿐만 아니라 또한 화학요법 및/또는 면역요법의 과정 중 및 그 이후에 직접적으로 검출 및 정량화될 수 있는 치료 방식들이 선택된다. 따라서, 치료 중 또는 그 이후의 나중에, 엑소좀들은 환자로부터 분리될 수 있고 그리고 질병 관련 단백질의 양 및/또는 존재는 실시간 또는 거의 실시간으로 질병 관련 단백질의 동적 변화들에 따라 결정된다.

이러한 맥락에서, 종양 세포들은 상당한 양의 엑소좀들을 방출하고, 그리고 종양 세포에서의 변화들은 엑소좀에서의 대응하는 변화들에 의해 직접적으로 반영된다는 점이 인식되어야 한다. 특히, 상기 변화들은 엑소좀들의 표면(이들은 일반적으로 단백질들일 것임) 상에서 그리고/또는 엑소좀들의 내강(이들은 siRNA, miRNA, mRNA, DNA, 미소쌍염색체(double minute chromosome)들, 단백질들, 대사물질(metabolite)들일 수 있음)에서 검출가능할 수 있다. 또한, 그리고 특히 타겟 단백질이 상대적으로 작은 양들로만 존재하는 경우, 엑소좀 타겟 식별 및 정량화는 상대적으로 빠른 방식으로 농축될 수 있는 증폭된 신호(엑소좀들 및/또는 엑소좀 단백질들의 농축에 의한)를 허용할 것이다.

복수의 오믹스 데이터에 관련하여 오믹스 데이터는 전체 게놈 시퀀싱 데이터(whole genome sequencing data), 엑솜 시퀀싱 데이터(exome sequencing data), 전사체 시퀀싱 데이터(transcriptome sequencing data) 및/또는 프로테옴 시퀀싱 데이터(proteome sequencing data)이고, 질병 관련 단백질은 바람직하게는 질병 관련 단백질이 신호발생(signaling) 또는 신호 전달 경로(signal transduction pathway)의 일부분인 경우 경로 분석 알고리즘(예를 들어, 패러다임(PARADIGM))을 이용하여 식별되거나 또는 네오에피토프일 수 있다는 점이 일반적으로 고려된다. 보다 일반적으로, 복수의 오믹스 데이터는 질환 조직(종양 생검)으로부터의 오믹스 데이터 및 매칭되는 정상 조직(예를 들어, 혈액)으로부터의 오믹스 데이터를 포함할 것이다. 질병은 암인 것이 일반적으로 바람직하지만, 수많은 다른 질병들이 또한 고려되고, 특히 유전성 질병들을 포함한다는 점이 인식되어야 한다.

예를 들어, 하나 이상의 네오에피토프들을 식별하기 위해 환자로부터 오믹스 정보를 획득하는 것에 관련하여 오믹스 데이터는 표준 조직 처리 프로토콜 및 시퀀싱 프로토콜들에 따라 하나 이상의 환자 생검 샘플들로부터 획득되는 것이 일반적으로 고려된다. 본 발명의 주제를 한정하는 것은 아니지만, 데이터는 환자 매칭 종양 데이터(예를 들어, 종양 대(versus) 동일한 환자 정상(normal))이고, 데이터 포맷은 SAM, BAM, GAR 또는 VCF 포맷인 것이 일반적으로 바람직하다. 그러나, 매칭 또는 비-매칭 대 다른 참조(예를 들어, 이전의 동일한 환자의 정상 또는 이전의 동일한 환자 종양, 또는 호모 세티티쿠스(homo statisticus))는 본 명세서에서의 용도에 적합하다고 간주된다. 따라서 오믹스 데이터는 이전 프로시저(또는 상이한 환자)로부터 획득되었던 오믹스 데이터 또는 '신선한(fresh)' 오믹스 데이터일 수 있다. 예를 들어, 네오에피토프들은 이렇게 획득되는 오믹스 정보의 위치-안내 동기화 비교(location-guided synchronous comparison)를 통해 종양 생검(또는 림프 생검 또는 전이 부위의 생검) 및 매칭되는 정상 조직(즉, 말초혈액(peripheral blood)과 같은 동일한 환자로부터의 비질병 조직)의 전체 게놈 및/또는 엑솜 분석에 의한 제 1 단계에서 환자 종양으로부터 식별될 수 있다.

다른 옵션들 중에서, 게놈 분석은 임의의 수의 분석 방법들에 의해 수행될 수 있지만, 특히 바람직한 분석 방법들은 초병렬 시퀀싱 방법(massively parallel sequencing method)들, 이온 토렌트 시퀀싱(ion torrent sequencing), 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 등과 같은 차세대 시퀀싱을 사용하는 종양 및 매칭되는 정상 샘플 양쪽 모두의 WGS(전체 게놈 시퀀싱) 및 엑솜 시퀀싱을 포함한다. 마찬가지로, 시퀀스 데이터의 컴퓨팅 분석은 다양한 방식으로 수행될 수 있다는 점이 인식되어야 한다. 그러나, 보다 바람직한 방법들에서, 예를 들어 BAM 파일들 및 BAM 서버들을 사용하는 미국 특허 제2012/0066001A1호 및 미국 특허 제2012/0059670A1호에 개시되는 바와 같이, 종양 및 정상 샘플들의 위치-안내 동기화 정렬에 의해 가상실험(in silico)에서 분석이 수행된다. 물론, 시퀀스 분석을 위한 대안적인 파일 포맷들(예를 들어, SAM, GAR, FASTA 등)도 본 명세서에서 명시적으로 고려된다.

컴퓨터를 가르키는 임의의 언어는 서버들, 인터페이스들, 시스템들, 데이터베이스들, 에이전트들, 피어들, 엔진들, 제어기들, 또는 개별적으로 또는 집합적으로 동작하는 다른 유형들의 컴퓨팅 디바이스들을 포함하는 컴퓨팅 디바이스들의 임의의 적합한 조합을 포함하도록 판독되어야 한다. 컴퓨팅 디바이스들은 유형의, 비-일시적 컴퓨터 판독가능 저장 매체(예를 들어, 하드 드라이브, 솔리드 스테이트 드라이브, RAM, 플래시, ROM 등) 상에 저장된 소프트웨어 명령들을 실행하도록 구성되는 프로세서를 포함하는 것을 인식해야 한다. 소프트웨어 명령들은 바람직하게는 개시된 장치와 관련하여 이하에서 논의되는 바와 같은 역할들, 신뢰성들 또는 다른 기능을 제공하도록 컴퓨팅 장치를 구성한다. 또한, 개시되는 기술들은 프로세서로 하여금 컴퓨터-기반 알고리즘들, 프로세스들, 방법들, 모듈들 또는 다른 명령들의 구현들과 관련된 개시되는 단계들을 실행하게 하는 소프트웨어 명령들을 저장하는 비-일시적 컴퓨터 판독가능 매체를 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품으로 구현될 수 있다. 또한, 이들 단계들 에 대한 기능들의 논리적 단위인 모듈들은 하나의 모듈이거나 또는 분리된 모듈로 고려될 수 있다. 특히 바람직한 실시예들에서, 다양한 서버들, 시스템들, 데이터베이스들, 또는 인터페이스들이 가능한 HTTP, HTTPS, AES, 공개-개인 키 교환들, 웹 서비스 API들, 공지된 금융 거래 프로토콜들, 또는 다른 전자적 정보 교환 방법들에 기초하는 표준화된 프로토콜들 또는 알고리즘을 사용하여 데이터를 교환한다. 디바이스들 간의 데이터 교환들은 패킷-교환망, 인터넷, LAN, WAN, VPN, 또는 다른 유형의 패킷 교환망; 회선 교환망; 셀 교환망; 또는 다른 유형의 망을 통해 수행될 수 있다.

물론, 다운스트림 분석(downstream analysis)이 암 및 환자 특이적 돌연변이에 기초하여 새로운 펩타이드 시퀀스를 유도하는 것들을 식별하기 위해 이렇게 식별되는 시퀀스 차이들에 대해 수행된다는 점이 인식되어야 한다. 따라서 네오에피토프들은 돌연변이의 영향(예를 들어, 논센스, 미스센스, 프레임시프트 등) 및 유형(예를 들어, 결손, 삽입, 변위, 전이, 전좌)을 고려함으로써 식별될 수 있고, 그리고 침묵 및 다른 비-연관(예를 들어, 비-발현) 돌연변이들이 제거되는 이를테면 컨텐츠 필터(content filter)로서 작용할 수 있다. 또한, 적합한 네오에피토프들에 대한 필터링은 임계값(일반적으로 매칭되는 정상적인 전사 및/또는 번역 값 이하) 이하에서 번역 및/또는 전사되는 유전자들을 제거하는 필터링 단계들을 포함할 수 있다.

또 다른 예에서, 오믹스 데이터는 변이, 과-발현 또는 과소-발현되어 질병에 기여하거나 또는 심지어 질병의 원인이 되는 유전자를 식별하기 위해 경로 분석 알고리즘들을 사용하여 분석될 수 있다. 다양한 경로 분석 알고리즘들이 본 기술 분야에 공지되고 본 명세서에서의 용도에 적합하다고 간주되지만, 특히 바람직한 경로 분석 알고리즘은 국제공개공보 제2017/033154호에서 기술되는 시스템들 및 방법들 및 국제공개공보 제2014/059036호, 국제공개공보 제2013062505호, 국제공개공보 제2011139345호에 기술되는 패러다임(PARADIGM)이다.

또한, 경로 분석 및 경로 모델 수정들은 조건(condition), 특히 신생물(neoplastic)의 질병치료-관련 파라미터(예를 들어, 특정 치료에 대한 약물 내성 및/또는 민감도)와 관련되거나 또는 이를 결정짓는 경로 엘리먼트들을 타겟팅하는 약물 치료를 시뮬레이트하거나 그리고/또는 약물 치료 옵션들을 식별하기 위해 가상실험에서 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 식별되는 경로 엘리먼트들은 원하는 효과가 달성될 수 있는지를 테스트하기 위한 경로 분석 시스템 및 방법을 사용하여 가상실험에서 변형되거나 또는 조절될 수 있다. 예를 들어, 약물 내성(drug resistance)에 대한 경로 모델이 특정 엘리먼트의 과-발현을 진전 조건(예를 들어, 특정 약물에 대한 약물 내성)에 중요한 것으로 식별한 경우, 이 엘리먼트의 발현 레벨이 가상실험에서 감소될 수 있어 가상실험에서 이 엘리먼트의 감소가 약물 민감성으로 세포를 반전시킬 수 있는지 여부를 동일한 경로 분석 시스템 및 방법에서 테스트한다. 이러한 접근법은 다수의 가능한 종양 변종들을 나타내는 다수의 세포주(cell line)들이 이미 이용가능한 경우 특히 가치있다. 이러한 경우, 경로 분석은 세포주-특이적 경로 모델들의 컬렉션(collection)을 획득하기 위해 각각의 세포주들에 대해 수행될 수 있다. 이러한 컬렉션은 환자 샘플로부터 획득되는 데이터와의 비교에 특히 유용한데, 이는 환자 샘플에 대한 데이터가 환자에 대한 치료 타겟들을 궁극적으로 허용하는, 컬렉션으로서 동일한 데이터 공간 내에서 분석될 수 있기 때문이다. 따라서, 다른 장점들 중에서, 고려되는 시스템들 및 방법들은 환자가 실제로 약물 치료를 받기 전에 다중-약물 치료를 식별하기 위한 종양 샘플로부터의 환자 데이터의 분석을 허용한다.

따라서, 상이한 관점에서 볼 때, 환자의 질병 세포들 및/또는 조직으로부터의 다양한 오믹스 데이터가 세포 및/또는 조직에 대한 민감도 프로파일(sensitivity profile)을 결정하기 위한 컴퓨팅 접근법(computational approach)에 사용될 수 있고, 여기서 프로파일은 다양한 유사 질병 세포들(예를 들어, 유방암 세포들)에서의 경로 엘리먼트들 및/또는 경로의 선험적(prior) 식별에 기초한다. 가장 바람직하게는, 선험적으로 식별되는 경로(들) 및/또는 경로 엘리먼트(들)는 특정한 약학적 중재(pharmaceutical intervention) 및/또는 치료 요법에 대한 민감도 및/또는 내성과 관련된다. 민감도 프로파일이 확립되는 경우, 치료는 선험적으로 식별되는 경로(들) 및/또는 경로 엘리먼트(들)로부터 직접적으로 예측될 수 있거나, 또는 식별되는 경로들 및/또는 경로 엘리먼트들이 공지된 경로 모델링 시스템 및 방법들을 사용하여 가상실험에서 조절될 수 있어 약학적 중재 및/또는 치료 요법에 대한 가능한 결과들을 예측하는데 도움이 된다. 이러한 접근법에 대한 적합한 시스템들 및 방법들이 국제공개공보 제2014/193982호에서 기술된다.

경로 모델들은 오믹스 데이터의 셋트로부터 생성될 수 있거나, 또는 이전 결정들로부터 획득될 수 있다. 따라서, 고려되는 시스템들 및 방법들은 오믹스 프로세싱 모듈에 결합되는 저장 모듈을 또한 포함할 수 있고, 여기서 저장 모듈은 하나 이상의 이전에 결정된 경로 모델들을 저장한다. 저장된 경로 모델들은 '정상' 조직 또는 질병 조직에 대응할 수 있다는 점이 인식되어야 한다. 경로 모델이 질병 조직으로부터인 경우, 질병 조직은 서브-형질(sub-trait)(예를 들어, 특정한 약물에 치료-내성인 서브-타입(sub-type), 전이 조직으로부터의 서브 타입, 등)을 특징으로 하는 특정한 서브-타입일 수 있다는 점이 또한 인식되어야 한다. 오믹스 데이터는 다양한 방식들의 인터페이스를 통해 제공될 수 있다는 점이 또한 고려된다. 예를 들어, 시퀀싱 분석 시스템 또는 시퀀싱 디바이스로부터, 또는 이전에 저장된 라이브러리(library)로부터, 서비스 제공자에 의해 제공될 수 있는, 별개의 파일들의 컬랙션으로, 또는 단일한 파일로 데이터가 제공될 수 있다. 따라서, 학습 엔진은 게놈 데이터베이스, BAM 서버, 또는 시퀀싱 디바이스에 결합될 수 있거나 또는 이들을 더 포함할 수 있다.

특정 경로에 따라, 경로 엘리먼트의 성질이 상당히, 그리고 조절 파라미터의 특성에 따라 변할 것이라는 점이 주목되어야 한다. 그러나, 일반적으로, 조절 파라미터는 경로 엘리먼트로부터 다운스트림 엘리먼트까지의 경로를 통해 신호의 흐름을 결정할 것이라는 점이 주목되어야 한다. 예를 들어, 경로 엘리먼트들이 DNA 시퀀스이거나 또는 이를 포함하는 경우, 고려되는 조절 파라미터들은 상기 DNA 시퀀스의 전사(또는 다른 역할)에 영향을 미치는 그 세포성 엔티티(cellular entity)들일 것이다. 따라서, DNA 시퀀스에 대한 고려되는 조절 파라미터들은 하나 이상의 전사 인자(transcription factor)들, 전사 활성인자(transcription activator)들, RNA 중합효소 서브유닛(RNA polymerase sub-unit)들, 시스-조절 엘리먼트(cis-regulatory element), 트랜스-조절 엘리먼트(trans-regulatory element)들, (디)아세틸화 히스톤((de)acetylated histone)들, (디)메틸화 히스톤((de)methylated histone)들 및/또는 억제인자(repressor)를 포함한다. 마찬가지로, 경로 엘리먼트가 RNA 시퀀스이거나 이를 포함하는 경우, 적합한 조절 파라미터는 RNA의 번역(또는 다른 활성)에 영향을 미치는 인자들을 포함하는 것으로 고려된다. 결과적으로, 이러한 조절 인자는 개시 인자(initiation factor)들, 번역 인자(translation factor)들, RNA 결합 단백질들, 리보솜 RNA 및/또는 단백질들, siRNA 및/또는 폴리A 결합 단백질(polyA binding protein)들을 포함한다. 동일한 방식으로, 경로 엘리먼트가 단백질이거나 또는 이를 포함하는 경우, 이 단백질의 활성화에 영향을 미치는 모든 인자들은 적합한 조절 파라미터들로 간주되고 따라서 다른 단백질들(예를 들어, 상이한 활성을 가지는 복합체 또는 활성화된 복합체를 형성하기 위한 단백질과 상호작용하는), 화학적 변형(예를 들어, 인산화, 아실화, 단백질가수분해성 분열(proteolytic cleavage) 등)을 포함할 수 있다.

따라서, 네오에피토프들 및/또는 다른 질병 관련 단백질들(예를 들어, 수용체(receptor), 키나아제(kinase), 포스파타아제(phosphatase), 전사 인자 등)을 식별하기 위해 오믹스 분석으로부터의 결과를 사용하여, 본 발명자는 또한 엑소좀 마커(exosomal marker)를 선택하는 방법을 고려한다. 이러한 방법에서, 환자로부터의 복수의 오믹스 데이터는 하나 이상의 질병 관련 단백질들을 식별하기 위해 사용되고, 그리고 약물이 질병 관련 단백질(예를 들어, 기나아제 억제제, 세포 신호 억제제(cell signaling inhibitor) 등)를 타겟팅하는 것으로 식별되며 여기서 치료법(therapy)는 화학요법(chemotherapy)이다. 마찬가지로, 치료가 면역 요법(immune therapy)인 경우, 환자로부터의 복수의 오믹스 데이터는 하나 이상의 네오에피토프들, 암 관련 항원들 및/또는 암 특이적 항원들을 식별하기 위해 사용된다. 또 다른 단계에서, 질병 관련 단백질이 엑소좀 상에 또는 이들 내에 존재함(예를 들어, 특정 양으로)이 검증된다. 보다 일반적으로, 이미 상술한 바와 같이, 엑소좀은 치료 전에 환자의 생체 유체로부터 획득된다. 쉽게 이해되는 바와 같이, 질병 관련 단백질이 정량화에 충분한 양으로 실제로 존재하는지의 확인 및 결정에 따라 하나 이상의 질병 관련 단백질들이 선택될 수 있다.

따라서, 상이한 관점으로 볼 때, 생화학 및 오믹스 분석의 모든 방식들이 적절하고, 적합한 질병 관련 단백질들이 하나 이상의 대사물질들, 하나 이상의 막 지질 컴포넌트(membrane lipid component)들, 막 관련 단백질(membrane associated protein)들, 막관통 단백질(transmembrane protein)들, 및 세포내 단백질들, 뿐만 아니라 다양한 핵산들을 포함하는 것이 고려된다. 결과적으로, 고려되는 식별하는 방법은 매우 다양하며 그리고 종양 조직의 생화학적 분석(예를 들어, 효소 활성을 정량화 또는 검출), 전체 게놈 및/또는 엑솜 시퀀싱(예를 들어, 네오에피토프들, 유전자 재배열들 등), 전사체 분석(예를 들어, 과-발현 또는 발현 부족), 및 프로테오믹스 분석(예를 들어, 번역 후 변형, 발현된 단백질의 양 등을 검출)을 포함할 것이다.

예를 들어, 질병 관련 단백질에 관련하여, 단백질은 과발현 또는 변이된 단백질(예를 들어, 키나아제(kinase), 수용체(receptor), 성장 인자(growth factor), 전사 인자(transcription factor) 또는 신호 전달-관련 단백질(signal transduction-associated protein)일 수 있다. 원하는 경우, 고려되는 방법들은 또한 제 1 및/또는 제 2 엑소좀에 존재할 수 있는 핵산을 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 핵산들은 후술되는 바와 같이 미소쌍염색체(double minute chromosome) 및 RNA를 포함한다.

보다 일반적으로, 특히 네오에피토프들, 약물 치료가능 경로 변경들(예를 들어, 시그널링의 과-활성, 또는 약물에 대한 민감성의 상실), 드라이버 유전자들/돌연변이들, 및 전이와 관련된 유전자들을 포함하는, 질병 관련 단백질들을 쉽게 식별할 조직 및 매칭되는 정상 샘플들로부터 BAMBAM 및/또는 패러다임(PARADIGM)을 사용하여 오믹스(게놈, 전사체 및/또는 프로테오믹스) 분석이 수행될 수 있다. 적절한 약물 또는 면역학적 요법(immunological regimen)을 이용하는 치료는 네오에피토프를 발현하는 세포들의 감소를 일으키고, 그리고 더 나아가, 네오에피토프들을 보유하는(bearing) 엑소좀들의 감소시킨다. 마찬가지로, 약물을 이용하는 치료는 암 세포 상의 수용체의 발현을 감소시키고, 그리고 더 나아가, 엑소좀들 상에 발현되는 수용체들의 양을 감소시킨다.

보다 구체적으로, 다른 적합한 타겟들 중, 오믹스 분석(및 덜 바람직한 양상들에서 유전자 패널 또는 다른 유전적 분석)은 드라이버 돌연변이들이 암에 존재하는 여부, 및/또는 전이와 관련된 유전자들이 암에서 억제되거나 또는 활성화되는지 여부를 식별하기 위해 활용될 수 있다. 예를 들어, 고려되는 드라이버 유전자 돌연변이들 및 드라이버 돌연변이들은 TP53, PIK3CA, KRAS, BRAF, PTEN, MLL3, APC, MLL2, ARID1A, NF1, FAT1, ANK3, MACF1, AHNAK, LAMA2, CDKN2A, EGFR, VHL, PBRM1, FAT2IDH1, NRAS, ATRX, ATM, RB1, NOTCH1, ARID2 등을 포함한다. 적합한 암 드라이버들을 식별하기 위한 추가적인 방법들 및 시스템들은 Nature Methods 2013, Vol.10 No.11, 1081-4에서 볼 수 있고, 그리고 고려되는 드라이버 유전자들 및 드라이버 돌연변이들의 추가적인 예시들은 Integrative Onco Genomics (Intogen.org)에서 공개된다.

유사하게는, 전이와 관련된 다수의 공지된 유전자들이 있고 그리고 모든 이러한 유전자들이 본 명세서의 사용에 적합한 것으로 간주되는 것이 고려된다. 예를 들어, 고려되는 유전자들은 AKAP12 (PKA 조절), BRMS1 (전사 조절), Caspase 8 (세포사멸), CDH1 (세포 부착(Cell adhesion)), CDH11(세포 부착), CD44 (히알루론산(Hyaluronic acid) 수용체), CRSP3 (전사 조절), DCC (세포 부착), DLC1 (Rho-GTPase 활성화), DRG1 (혈관신생(Angiogenesis)), GAS1 (세포사멸), 겔솔린(Gelsolin)(액틴 해중합(Actin depolymerization)), KAI1 (세포사멸), KISS1/KISS1R (종양 휴면 유지), KLF17 (전사 조절), LSD1 (크로모틴(Chromotin) 리모델링), MAP2K4 (MAPKK 시그널링), MKK4 (MAPK 시그널링), MAK7 (MAPK 시그널링), 마이크로RNA-335, 126 (SOX4, MERTK, PTPRN2, TNC의 억제), Nm23 (MAPK 시그널링), PEBP1 (라프 키나아제(Raf kinase) 저해), RhoGDI2 (Rho 시그널링), RRM1 (PTEN 상향 조절(upregulation)), TXNIP (산화환원 조절(Redox regulation))을 포함할 수 있다.

또한, 오믹스 분석은 증폭되는 시퀀스들 또는 유전자들을 식별할 수도 있다. 예를 들어, 간 전이를 가지는 대장 암 환자들의 원발성 종양(primary tumor) 샘플들은 염색체들 7p, 8q, 13q 및 20q의 증가 및 염색체 1p, 8p, 9p, 14q, 17p 및 22q의 손실을 나타냈다. 염색체 손실 부위들에 위치하는 유전자들은 MAP2K4, LLGL1, FBLN1, ELAC2, ALDH3A2, ALDH3A1, SHMT1, ARSA, WNT7B, TNFRSF13B, UPK3A, TYMP, RASD1, PEMT 및 TOP3A를 포함하고, 이들 모두는 잠재적으로 전이 억제유전자(suppressor)들로 역할한다.

질병 관련 단백질들 및 치료가 확립되는 경우, 환자의 생체 유체(예를 들어, 혈장(plasma), 혈청(serum), 또는 소변(urine))은 치료 전에 획득되어 엑소좀들이 본 기술 분야에 널리 공지된 방법들(예를 들어, 비-특이적 포획(non-specific entrapment) 및 이어지는 친화성 정제(affinity purification)을 통해)을 사용하여 생체 유체로부터 분리(isolated) 또는 농축(enriched)된다. 예를 들어, 엑소좀들은 일반적으로 환자의 체액(bodily fluid)으로부터 분리된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "체액"은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 객담, 척수액, 흉막액, 림프액, 호흡기관(respiratory)의 유체, 장액(intestinal tract), 루액(tear fluid), 타액(saliva), 모유, 복수액(ascitic fluid) 및 종양 낭종액(tumor cyst fluid)을 포함하는, 바람직하게는 말초 위치인, 환자(subject)의 신체의 임의의 위치에서 분리되는 액체의 샘플을 지칭한다.

전술한 바와 같이, CD9, CD63, CD81를 포함하는, 엑소좀 특이적 표면 마커들을 사용하여, 자기 분리(magnetic separation) 또는 면역 침전(immune precipitation), 및 엑소좀 아넥신 A5(exosomal Annexin A5)를 통한 GlcNAc-당질(GlcNAc-carbohydrate)들과의 공동 침전, 중합체 신경망(예를 들어, 시스템 바이오사이언시스(CA 94303, 팰로앨토, 엠바카데로 길, 2438)에 의해 시판 중인 ExoQuick?를 사용)내에서의 포획 및 초원심분리(ultracentrifugation) 와 같은 비-특이적 방법들을 포함하는 다수의 방식들로 엑소좀들의 분리가 수행될 수 있다. 물론, 모든 분리 방법들이 엑소좀들의 순도를 더욱 향상시키기 위해 조합(예를 들어, 이어지는 단백질 분석이 활용되는 경우)될 수 있다는 점이 인식되어야 한다. 그러나, 특히 상기 분석이 핵산 분석에 기초하는 경우, 포획을 통한 엑소좀의 농축만이 적합할 수 있다. 농축되거나 또는 분리된 경우, 엑소좀들은 질병 관련 단백질들의 양 및/또는 존재를 결정하기 위해 다양한 분석 프로세스들의 대상이 될 수 있다.

생체 유체로부터 엑소좀들을 분리하는 다른 방법들은 분별 원심분리(differential centrifugation), 초원심분리, 음이온 교환 및/또는 겔 투과 크로마토그래피, 나노막 초미세여과, 마이크로플루이딕스(microfluidics) 등을 사용하는 것들을 포함할 수 있다 (미국 특허 제6899863호, 미국 특허 제6812023호, 미국 특허 제7198923호 참조). 특히 바람직한 방법들에서, 엑소좀들은 침전 용액들(예를 들어, 막커리 네걸사(PA 18020, 베들레헴 에머릭로 2850)에 의해 시판 중인 독점적 용액인, 엑소좀 침전 용액™), 중합체 조성물들(예를 들어, ExoQuick®(시스템 바이오사이언시스(CA 94303, 팰로앨토, 엠바카데로 길, 2438)로부터 시판 중인 독점적 중합체))을 사용하여 비-특이적으로 분리될 수 있다. 마찬가지로, 적합한 원심분리 프로토콜들이 널리 알려져 있다 (예를 들어, Methods Mol Biol. 2015;1295:179-209; Scientific Reports 5, Article number: 17319 (2015) 참조).

또한, 엑소좀들은 특정 세포 유형, 예를 들어, 폐(lung), 췌장(pancreas), 위(stomach), 장(intestine), 방광(bladder), 신장(kidney), 난소(ovary), 고환(testis), 피부(skin), 결장(colorectal), 유방(breast), 전립선(prostate), 뇌(brain), 식도(esophagus), 간(liver), 태반(placenta) 등으로부터 유래한 것들에 대해 더 농축될 수 있다. 엑소좀은 종종 이들의 공여 세포(donor cell)들로부터의 표면 분자들/항원들을 운반하기 때문에, 표면 분자들/항원들이 특정 공여 세포 유형으로부터의 엑소좀들에 대해 농축, 분리, 및/또는 식별하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 별개의 세포군으로부터 유래된 엑소좀들은 이들의 단백질 및/또는 핵산 컨텐츠에 대해 분석될 수 있다. 예를 들어, 종양(악성 및 비악성) 엑소좀들은 종양-관련 또는 종양 특이적 표면 항원들을 운반할 것이고, 이들 항원들을 통해 농축, 분리, 및/또는 검출될 수 있다. 예를 들어, 적합한 항원들은 폐, 결장, 유방, 전립선, 두부경부(head and neck), 및 간장(hepatic) 기원이나, 혈액 세포 기원은 아닌 암종(carcinomas)으로부터의 엑소좀들에 특이적인 상피 세포 부착 분자(EpCAM)을 포함한다. 다른 예에서, 표면 항원은 소변 엑소좀들에 특이적인 당단백질인 CD24이다. 또 다른 예에서, 표면 항원은 CD70, 암배아 항원(CEA), EGFR, EGFRvIII, 파스 리간드(Fas ligand), 트레일(TRAIL), 트랜스페린(transferrin) 수용체, HSP72 등일 수 있다.

또한, 종양 특이적 엑소좀들은 특정 종양 및 환자에 특이적인 네오에피토피들을 기반으로 분리될 수도 있고, 여기서 네오에피토프의 식별은 상술한 바와 같은 오믹스 분석을 통해 수행된다. 이러한 엑소좀들은 항체들(보다 일반적으로 합성 항체들) 및 파지(phage) 디스플레이법, mRNA 디스플레이법 등에 의해 식별되는 것들과 같은 고 친화성 결합제(high affinity binder)들을 사용하여 분리될 수 있다. 네오에피토프들에 대한 고 친화성 결합제들을 생성하는 예시적인 방법은 국제공개공보 제2016/172722호에 개시된다.

또한, 특정 세포 유형들으로부터의 엑소좀들의 분리는 항체들, 압타머(aptamer)들, 압타머 유사체들, 또는 원하는 표면 항원에 특이적인 분자적으로 각인된(molecularly imprinted) 중합체를 사용하여 달성될 수도 있다. 일 실시예에서, 표면 항원은 암 유형에 특이적이다. 또 다른 실시예에서, 표면 항원은 반드시 암일 필요는 없는 세포 유형에 특이적이다. 세포 표면 항원에 기초하는 엑소좀 분리의 일 예시는 미국 특허 제7198923호에서 제공된다. 예를 들어, 미국 특허 제5840867호, 미국 특허 제5582981호 및 국제공개공보 제2003/050290호에 기술되는 바와 같이, 압타머들 및 이들의 유사체들은 특이적으로 표면 분자들에 결합하며 그리고 세포 유형에 특이적인 엑소좀들을 회수하기 위한 분리 도구로 사용될 수 있다. 분자적으로 각인된 중합체들은 예를 들어 미국 특허 제6525154호, 미국 특허 제7332553호 및 미국 특허 제7384589호에 기술되는 바와 같이 표면 분자들을 특이적으로 인식하고 그리고 세포 유형에 특이적인 엑소좀들을 분리하는데 적합하다.

엑소좀들이 환자의 생체 유체로부터 분리되는 경우, 단백질 및/또는 핵산 분석이 수행될 수 있다. 이와 관련하여, 단백질들은 엑소좀들의 표면 상에(예를 들어, 막 관통 단백질의 세포외도메인(ectodomain), 또는 막 관련 단백질로서), 또는 막에 결합하는, 엑소좀의 내강 내에 위치할 수 있다는 점이 인식되어야 한다. 따라서, 엑소좀은 용해되거나 또는 다양한 화학 제제들을 사용하여 처리될 수 있고, 특히 고려되는 제제들은 하나 이상의 계면활성제들, 카오트로픽 제제(chaotropic agent)들을 포함한다는 점이 주목되어야 한다. 마찬가지로, 엑소좀들은 막 결합 단백질들을 방출하기 위해 프로테아제로 처리될 수도 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 엑소좀들은 질병 관련 단백질들에 접근가능하게 하거나 또는 이들을 방출하기 위해 물리적 프로세스(예를 들어, 초음파처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 등)의 대상이 될 수도 있다. 한편, 엑소좀들은 추가적인 처리없이(예를 들어, 질병 관련 단백질이 엑소좀의 표면에 존재하고 그리고 검출가능한 라벨로 정량화되거나 검출되는 경우) 단백질 분석에 사용될 수도 있다.

보다 일반적으로, 질병 관련 단백질의 양 및 존재는 질량 분광 반응 모니터링(mass spectroscopic reaction monitoring)를 사용하여, 그리고 특히 선택된 반응 모니터링(selected reaction monitoring, SRM), 연속적 반응 모니터링(consecutive reaction monitoring, CRM), 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring, MRM) 또는 병렬 반응 모니터링(parallel reaction monitoring, PRM)을 사용하여 결정될 수 있다. 대안적으로, 엑소좀에 대한 단백질 분석은 웨스턴 블롯, 엘리사 테스트들, FACS용 자성 입자들로의 결합 또는 다른 광학적 분석, 및 다양한 질량 분광 기법들을 포함하는, 다양한 다른 방식들로 수행될 수 있고, 그리고 특정 질병 관련 단백질 및 유효한 엑소좀들의 양은 사용되는 분석의 유형을 적어도 부분적으로 지시할 것이다.

전술한 바와 같이, 질병 관련 단백질은 치료 (예를 들어, 화학요법 및/또는 면역요법) 전에 정량화되고 결정되는 것이 일반적으로 바람직하다. 질병 관련 단백질들의 이어지는 결정들에 관하여, 치료가 개시되면, 이러한 결정은 질병 관련 단백질들을 추적(following)하기에 적합한 임의의 스케쥴 하에서 수행될 수 있다는 점이 고려된다. 예를 들어, 정기적인 형식(예를 들어 매주 또는 한달에 한 두번)으로, 또는 다른 파라미터들에 따라(질병 관련 단백질을 타겟팅하는 약물의 투여 이후 12 or 24 시간, 및/또는 초음파, 방사선, 또는 다른 단층촬영(tomographical) 프로시저 이후의 보완 테스트로) 결정이 이루어 질 수 있다. 마찬가지로, 질병 관련 단백질들은 치료의 과정 동안 고정될 필요는 없지만, 관찰되는 치료 효과들, 생검 결과들, 후속 오믹스 분석, 등에 따라 달라질 수 있다.

추가적으로 고려되는 양상들에서, 엑소좀들로부터 핵산들(DNA, RNA, siRNA, shRNA, miRNA 등)을 추출하는 것이 유리하거나 또는 바람직할 수 있다. 핵산 분자들은 임의의 수의 프로시저들을 사용하여 엑소좀들로부터 분리될 수 있고, 이들 모두는 본 기술 분야에 잘 알려져 있으며 그리고 특정한 분리 프로시저는 특정한 생물학적 샘플 및 핵산의 유형에 의존할 것이다. 예를 들어, 핵산이 RNA인 경우, RNA는 추가적인 증폭 전에 상보적인 DNA로 역전사될 수 있다. 이러한 역전사는 단독으로 또는 증폭 단계와 함께 수행될 수 있다. 역전사 및 증폭 단계들을 결합하는 방법의 일 예는 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)이며, 이는 미국 특허 제5639606호에 기술되는 바와 같이 정량화될 수 있도록 추가적으로 수정될 수 있다. 다른 예시들은 특히 핵산 시퀀스가 알려지거나 또는 예상되는(suspected) 경우, 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)을 캡쳐(노던/서던 블롯)하기 위한 하이브리디제이션(hybridization)을 포함한다. 또한, 엑소좀들에서의 핵산의 분석은 정량적 또는 정성적일 수 있다. 정량적 분석을 위해, 엑소좀들 내에서 관심있는 특정 핵산들의, 상대적 또는 절대적인, 양들(발현 레벨들)이 본 기술 분야에 공지된 방법들로 측정될 수 있다. 정성적 분서을 위해, 엑소좀들 내에서 관심있는 특정 핵산들의 종들이, 야생형이거나 또는 변종들이든, 본 기술 분야에 공지된 방법들로 식별될 수도 있다.

또한, 체액은 하나 이상의 다음의 순환 핵산들: 순환 자유 RNA(cfRNA), 순환 종양 RNA(ctRNA), 순환 자유 DNA (cfDNA) 및 순환 종양 DNA(ctDNA)에 대해 분석될 수도 있다는 점이 고려된다. 이러한 분석은 유리하게는 엑소좀 단백질 분석에 부가적인 정보를 제공할 수 있고 그리고 동일한 생체 유체로부터 수행될 수 있다.

예를 들어, ctRNA는 엑소좀 단백질 분석과 함께 치료의 모니터링 및 진단을 위한 민감, 선택, 및 정량적 마커로 활용될 수 있고, 유리하게는 동일한 생체 유체로부터 환자의 반복 및 비침습적인 샘플링을 허용한다. 보다 일반적인 양상들에서, ctRNA는 세포의 무결성(용해되거나 또는 다른 손상 세포들로부터의 RNA로 오염되는 것을 방지)을 보존하고 그리고 ctRNA 및/또는 ctDNA를 안정화시키는 조건 하에서 처리되는 전혈로부터 분리된다. 비-핵산 컴포넌트들로부터 분리되면, 순환 핵산들은 바람직하게는 실시간 정량화 PCR를 사용하여 정량화된다(물론, 상술한 바와 같은 다른 순환 핵산들도 본 명세서에서의 사용에 적합하다).

보다 일반적으로, 생체 유체는 엑소좀이 분리되는 생체 유체와 동일하다. 그러나, 독립적인 샘플링도 본 명세서에서 고려된다. 따라서, 적합한 유체들은 타액, 복수액(ascites fluid), 척수액, 소변 등을 포함하고, 이는 신선 또는 보존/냉동된 것일 수 있다. 예를 들어, 적합한 분석을 위해, 표본은 각각 RNA 또는 DNA 안정제(stabilizer)들을 포함하는 셀-프리(cell-free) DNA BCT®튜브들 셀-프리 RNA BCT®튜브들 내로 흡입되는 전혈의 10 ml로 허용(accepted)될 수 있다. 유리하게는, ctRNA는 7일 동안 셀-프리 RNA BCT 튜브들에서의 전혈에서 안정적인 반면 ctDNA는 14일 동안 셀-프리 DNA BCT 튜브에서의 전혈에서 안정적이며, 이는 ctRNA 또는 ctDNA의 저하(degradation)없이 전세계의 위치들로부터 환자 샘플들을 운송하는 것을 허용한다. 또한, ctRNA는 혈구들을 용해시키지 않거나 또는 실질적으로 용해시키지 않는(예를 들어, 1% 이하, 또는 0.1% 이하, 또는 0.01% 이하, 또는 0.001% 이하) RNA 안정화 제제를 사용하여 분리되는 것이 일반적으로 바람직하다. 상이한 관점으로 볼 때, RNA 안정화 시약들은 시약들이 혈액과 혼합된 이후 혈장 또는 혈청에서의 RNA 양들의 실질적인 증가(예를 들어, 10% 이하, 또는 5% 이하, 또는 2% 이하, 또는 1% 이하의 전체 RNA의 증가)를 유도하지 않을 것이다. 물론, 수많은 다른 컬랙션 양식들이 또한 적합하다고 간주되며, ctRNA 및/또는 ctDNA는 적어도 부분적으로 정제되거나 고체상(solid phase)에 흡착되어 추가적인 프로세싱 전에 안정성을 증가시킬 수 있다는 점이 인식되어야 한다.

쉽게 인식될 수 있는 바와 같이, 혈장의 분별(fractionation) 및 ctDNA와 ctRNA의 추출은 다양한 방식들로 이루어질 수 있다. 예시적일 바람직한 양상에서, 10mL 튜브들에서의 전혈은 20분 동안 1600 rcf로 혈장을 분별하기 위해 원심분리된다. 이렇게 획득되는 혈장은 분리되고 그리고 10 분 동안 원심 분리되어 세포 파편들을 제거한다. 물론, 다양한 대안적인 원심분리 프로토콜이 원심분리가 실질적인 세포 용해를 유발하지 않는 한(예를 들어, 1% 이하, 또는 0.01% 이하, 또는 0.001%의 용해) 적합하다고 또한 간주된다. ctDNA 및 ctRNA는 퀴아젠 시약들을 사용하여 2mL의 혈장에서 추출된다. 추출 프로토콜은 바람직하게는 잠재적인 오염 혈액 세포들, 다른 불순물들을 제거하고, 그리고 추출 동안 핵산들의 안정성을 유지하도록 설계된다. 모든 핵산들은 cDNA로 역전사되어 -4 ℃에서 저장되거나 또는 -80 ℃에서 저장되는 RNA 및 -4 ℃에서 저장되는 DNA으로, 바코드 매트릭스 저장 튜브들에 보관되었다. 특히, 이렇게 분리된 ctRNA는 추가적인 처리 전에 동결될 수 있다.

분리된 ctRNA의 정량화는 다양한 방식들로 수행될 수 있지만, 분석물의 발현은 바람직하게는 각각의 유전자에 특이적인 프라이머들을 사용하여 ct-cDNA의 정량적인 실시간 PCR에 의해 측정된다. 예를 들어, 증폭은 2 μL cDNA, 프라이머들, 및 프루브(probe)을 포함하는 10 μL 반응 혼합물에서의 검정(assay)을 이용하여 수행될 수 있다. 베타-액틴(β-actin)은 ct-cDNA의 입력 레벨에 대한 내부 통제로 사용될 수 있다. 각 분석물의 농도들이 알려진 샘플들의 표준 곡선은 각각의 유전자에 대한 양성 및 음성 통제들 뿐만 아니라 각각의 PCR 플레이트에 포함될 수 있다. 델타 Ct (dCT)는 각각의 개별 환자의 혈액 샘플에 대한 베타-액틴의 Ct 값을 뺀 각각의 분석물에 대한 정량적 PCR(qPCR) 증폭으로부터 유도되는 Ct 값으로부터 계산되었다. 환자 표본들의 상대적인 발현은 유전자 발현값 10으로 설정된 보편 인간 참조 RNA(Universal Human Reference RNA)의 연속 희석법들의 델타 Cts의 표준 곡선을 사용하여 계산된다(델타 CT들이 각각의 분석물의 로그 농도에 대해 플롯팅되는 경우임).

적합한 타겟 핵산들과 관련하여, 적합한 타겟들은 질병 및/또는 질병의 치료와 관련있는 모든 유전자들를 포함한다는 점이 인식되어야 한다. 예를 들어, 질병 타겟들은 하나 이상의 암 관련 유전자들, 암 특이적 유전자들, 환자 및 종양-특이적 돌연변이들(네오에피토프들)를 가지는 유전자들, 암 드라이버 유전자들, 및 암에서 과발현되는 것으로 알려진 유전자들을 포함한다. 더 추가적으로 고려되는 타겟 핵산들은 질병 관련 단백질을 인코딩하는 것들을 포함한다. 따라서 적합한 타겟들은 '기능성' 단백질들(예를 들어, 효소들, 수용체들, 전사 인자들, 등) 및 '비-기능성' 단백질들(예를 들어, 구조 단백질들, 튜블린, 등), 뿐만 아니라 네오에피토프들을 인코딩하는 것들을 포함한다. 상이한 관점으로 볼 때, 적합한 타겟들은 또한 KRAS (예를 들어, G12V, G12D, G12C 등) 또는 BRAF (예를 들어, V600E), 네오에피토프들, 체크포인트 억제제 리간드들(예를 들어, PD-L1), 등 다양한 돌연변이들을 포함하는, 암 환자들에서 일반적으로 발견되는 타겟들, 또는 질병 세포 또는 기관에 특이적인 타겟들(예를 들어, PCA3, PSA 등)을 포함한다.

엑소좀들로부터의 질병 관련 단백질의 정량화 및/또는 검출과 함께 ctRNA의 정량화 및 검출을 위한 더 추가적인 적합한 타겟들은 하나 이상의 ABL1, ABL2, ACTB, ACVR1B, AKT1, AKT2, AKT3, ALK, AMER11, APC, AR, ARAF, ARFRP1, ARID1A, ARID1B, ASXL1, ATF1, ATM, ATR, ATRX, AURKA, AURKB, AXIN1, AXL, BAP1, BARD1, BCL2, BCL2L1, BCL2L2, BCL6, BCOR, BCORL1, BLM, BMPR1A, BRAF, BRCA1, BRCA2, BRD4, BRIP1, BTG1, BTK, EMSY, CARD11, CBFB, CBL, CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CD274, CD79A, CD79B, CDC73, CDH1, CDK12, CDK4, CDK6, CDK8, CDKN1A, CDKN1B, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2C, CEA, CEBPA, CHD2, CHD4, CHEK1, CHEK2, CIC, CREBBP, CRKL, CRLF2, CSF1R, CTCF, CTLA4, CTNNA1, CTNNB1, CUL3, CYLD, DAXX, DDR2, DEPTOR, DICER1, DNMT3A, DOT1L, EGFR, EP300, EPCAM, EPHA3, EPHA5, EPHA7, EPHB1, ERBB2, ERBB3, ERBB4, EREG, ERG, ERRFI1, ESR1, EWSR1, EZH2, FAM46C, FANCA, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCL, FAS, FAT1, FBXW7, FGF10, FGF14, FGF19, FGF23, FGF3, FGF4, FGF6, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FH, FLCN, FLI1, FLT1, FLT3, FLT4, FOLH1, FOXL2, FOXP1, FRS2, FUBP1, GABRA6, GATA1, GATA2, GATA3, GATA4, GATA6, GID4, GLI1, GNA11, GNA13, GNAQ, GNAS, GPR124, GRIN2A, GRM3, GSK3B, H3F3A, HAVCR2, HGF, HNF1A, HRAS, HSD3B1, HSP90AA1, IDH1, IDH2, IDO, IGF1R, IGF2, IKBKE, IKZF1, IL7R, INHBA, INPP4B, IRF2, IRF4, IRS2, JAK1, JAK2, JAK3, JUN, MYST3, KDM5A, KDM5C, KDM6A, KDR, KEAP, KEL, KIT, KLHL6, KLK3, MLL, MLL2, MLL3, KRAS, LAG3, LMO1, LRP1B, LYN, LZTR1, MAGI2, MAP2K1, MAP2K2, MAP2K4, MAP3K1, MCL1, MDM2, MDM4, MED12, MEF2B, MEN1, MET, MITF, MLH1, MPL, MRE11A, MSH2, MSH6, MTOR, MUC1, MUTYH, MYC, MYCL, MYCN, MYD88, MYH, NF1, NF2, NFE2L2, NFKB1A, NKX2-1, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NPM1, NRAS, NSD1, NTRK1, NTRK2, NTRK3, NUP93, PAK3, PALB2, PARK2, PAX3, PAX, PBRM1, PDGFRA, PDCD1, PDCD1LG2, PDGFRB, PDK1, PGR, PIK3C2B, PIK3CA, PIK3CB, PIK3CG, PIK3R1, PIK3R2, PLCG2, PMS2, POLD1, POLE, PPP2R1A, PREX2, PRKAR1A, PRKC1, PRKDC, PRSS8, PTCH1, PTEN, PTPN11, QK1, RAC1, RAD50, RAD51, RAF1, RANBP1, RARA, RB1, RBM10, RET, RICTOR, RIT1, RNF43, ROS1, RPTOR, RUNX1, RUNX1T1, SDHA, SDHB, SDHC, SDHD, SETD2, SF3B1, SLIT2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMARCA4, SMARCB1, SMO, SNCAIP, SOCS1, SOX10, SOX2, SOX9, SPEN, SPOP, SPTA1, SRC, STAG2, STAT3, STAT4, STK11, SUFU, SYK, T (BRACHYURY), TAF1, TBX3, TERC, TERT, TET2, TGFRB2, TNFAIP3, TNFRSF14, TOP1, TOP2A, TP53, TSC1, TSC2, TSHR, U2AF1, VEGFA, VHL, WISP3, WT1, XPO1, ZBTB2, ZNF217, ZNF703, CD26, CD49F, CD44, CD49F, CD13, CD15, CD29, CD151, CD138, CD166, CD133, CD45, CD90, CD24, CD44, CD38, CD47, CD96, CD 45, CD90, ABCB5, ABCG2, ALCAM, ALPHA-FETOPROTEIN, DLL1, DLL3, DLL4, ENDOGLIN, GJA1, OVASTACIN, AMACR, NESTIN, STRO-1 , MICL, ALDH, BMI-1, GLI-2, CXCR1, CXCR2, CX3CR1, CX3CL1, CXCR4, PON1, TROP1, LGR5, MSI-1, C-MAF, TNFRSF7, TNFRSF16, SOX2, PODOPLANIN, L1CAM, HIF-2 ALPHA, TFRC, ERCC1, TUBB3, TOP1, TOP2A, TOP2B, ENOX2, TYMP, TYMS, FOLR1, GPNMB, PAPPA, GART, EBNA1, EBNA2, LMP1, BAGE, BAGE2, BCMA, C10ORF54, CD4, CD8, CD19, CD20, CD25, CD30, CD33, CD80, CD86, CD123, CD276, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL17, CXCR3, CXCR5, CXCR6, CTAG1B, CTAG2, CTAG1, CTAG4, CTAG5, CTAG6, CTAG9, CAGE1, GAGE1, GAGE2A, GAGE2B, GAGE2C, GAGE2D, GAGE2E, GAGE4, GAGE10, GAGE12D, GAGE12F, GAGE12J, GAGE13, HHLA2, ICOSLG, LAG1, MAGEA10, MAGEA12, MAGEA1, MAGEA2, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA4, MAGEA5, MAGEA6, MAGEA7, MAGEA8, MAGEA9, MAGEB1, MAGEB2, MAGEB3, MAGEB4, MAGEB6, MAGEB10, MAGEB16, MAGEB18, MAGEC1, MAGEC2, MAGEC3, MAGED1, MAGED2, MAGED4, MAGED4B, MAGEE1, MAGEE2, MAGEF1, MAGEH1, MAGEL2, NCR3LG1, SLAMF7, SPAG1, SPAG4, SPAG5, SPAG6, SPAG7, SPAG8, SPAG9, SPAG11A, SPAG11B, SPAG16, SPAG17, VTCN1, XAGE1D, XAGE2, XAGE3, XAGE5, XCL1, XCL2, 및 XCR1을 인코딩하는 RNA들을 포함한다. 물론, 위의 유전자들은 이들 모두가 이러한 RNA로부터 발현되는 단백질에서 네오에피토프의 형성을 일으키거나 일으키지 않을 수 있는, 미스센스 또는 논센스 변이들, 삽입들, 결손들, 융합들, 및/또는 전좌들을 포함하는 돌연변이 형태 또는 야생형일 수 있다는 점이 인식되어야 한다. 이러한 식별된 ctRNA들은 이상에서 언급된 유전자 산물들을 타겟팅하는 약물을 이용하는 치료의 선택의 기초로서 작용할 수 있다. 또한, ctRNA의 정량적 또는 정성적 분석들을 포함하는 질병 관련 단백질들의 정량적 또는 정성적 분석들을 결합하는 것은 가능한 치료들에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라 보완적인 밴티지 포인트(vantage point)로부터 치료 효과 및/또는 질병 상태를 모니터링하도록 허용한다. 예를 들어, 생체 유체(예를 들어, 혈액)로부터의 오믹스 분석이 엑소좀 단백질 분석이 뒤따를 수 있는 약물 치료가능한 타겟을 식별할 수 있으면서, 동시에 동일한 생체 유체가 예를 들어, PD- L1 ctRNA의 검출 또는 다른 종양 특이적 마커들 상의 정보를 통해, 면역 상태의 정보를 제공할 수 있다.

엑소좀들로부터 획득되는 질병 관련 단백질들을 이용함으로써, 다양한 장점들이 실현된다는 점이 인식되어야 한다. 다른 여러가지들 중, 질병 관련 단백질이 돌연변이 단백질이 아니거나 및/또는 비-질병 세포들에 존재하지 않는 경우, 암 세포들이 건강한 세포들의 엑소좀들의 양들보다 현저히 많은 순환으로의 방출/생성하기 때문에 이러한 단백질들이 또한 정량화될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 청구되는 엑소좀들의 용도는 추가적인 종양 생검들을 획득할 필요없이 치료 효과의 검출을 실시간으로(즉, 생체 유채의 분리 또는 혈액 채취 후 몇 시간 또는 며칠) 허용한다. 또한, 종양 세포들 또는 다른 질병 세포들 세포내 단백질들은 종양 생검을 필요로 하지 않고 정량화되고 그리고 검출될 수 있다(엑소좀들을 통한 프록시에 의함). 이는 질병 관련 단백질이 관측되거나 획득될 수 없는 잔류 및/또는 순환 종양 세포들로부터 검출되는 경우에도 특히 유용하다.

특히 질병 관련 단백질들이 네오에피토프들인 경우, 검출/정량화되는 네오에피토프들은 면역 요법의 효과와 직접적으로 상관 관계가 있을 것이라는 점이 주목되어야 한다. 또한, 엑소좀 질병 관련 단백질들은 또한 클론 개체군(clonal population)들, 내성 및/또는 체크포인트 억제에 대한 감수성(susceptibility)을 식별하기 위해 사용될 수도 있다. 더 추가적으로 주목할만한 장점들로, 종양의 성장이 없는 경우에도 엑소좀 질환 관련 단백질들이 모니터링될 수 있다. 따라서, 엑소좀 질병 관련 단백질들은 종양이 치료 내성이거나 그리고/또는 다른 변화들을 겪는 경우에 특히 적합하다.

결과적으로, 본 발명자는 본 발명의 주제의 일 양상으로 복수의 오믹스 데이터가 먼저 하나 이상의 질병 관련 단백질들을 식별하기 위해 사용되는 암으로 진단된 환자의 진행 중인 치료를 모니터링하는 방법을 고려한다. 그리고 질병 관련 단백질들의 양 및/또는 존재는 질병 관련 단백질을 타겟팅하는 치료(예를 들어 키나아제, 수용체, 또는 수용체 리간드를 타겟팅하는 화학요법 또는 종양 관련 항원, 종양 특이적 항원, 또는 네오에피토프를 타겟팅하는 면역 요법, 등) 전에 환자의 생체 유체로부터 획득되는 제 1 엑소좀에서 결정된다. 이후에, 질병 관련 단백질들의 양 및/또는 존재는 치료 이후 또는 치료 중에 환자의 생체 유체로부터 획득되는 제 2 엑소좀에서 결정된다. 환자 기록은 제 2 엑소좀에서의 질환 관련 단백질의 양 및/또는 존재의 결정에 기초하여 업데이트된다(예를 들어, 치료를 수정하기 위한 권고를 포함하도록 함).

따라서, 상이한 관점으로 볼 때, 본 발명자는 또한 엑소좀 마커를 선택하는 방법을 고려한다. 특히 바람직한 선택 방법들은 하나 이상의 질병 관련 단백질들을 식별하기 위해 복수의 오믹스 데이터를 이용하고, 그리고 질병 관련 단백질들을 타겟팅하는 약물(또는 다른 치료)를 식별하는 단계를 포함한다. 또 다른 단계에서, 질병 관련 단백질의 양 및/또는 존재는 엑소좀에서 결정되고, 여기서 엑소좀은 치료 전에 환자의 생체 유체로부터 획득되고, 그리고 질병 관련 단백질은 질병 관련 단백질이 정량화에 충분한 양(예를 들어, 질량 분광학이 사용되는 질병 관련 단백질의 아토몰)으로 존재하는지의 결정에 따라 선택된다.

마찬가지로, 본 발명자는 따라서 환자의 치료를 모니터링하는 방법을 또한 고려한다. 이러한 방법은 바람직하게는 치료(예를 들어, 키나아제, 수용체, 또는 수용체 리간드를 타겟팅하는 화학 요법, 또는 종양 관련 항원, 종양 특이적 항원, 또는 네오에피토프를 타겟팅하는 면역 요법, 등) 전에 환자의 생체 유체로부터 획득되는 제 1 엑소좀에서의 하나 이상의 질병 관련 단백질들의 양 및/또는 존재를 결정하는 단계(여기서 상기 치료는 질병 관련 단백질들을 타겟팅함), 및 제 2 엑소좀에서의 질병 관련 단백질의 양 및/또는 존재를 결정하는 다른 단계(여기서 상기 제 2 엑소좀은 치료 이후 또는 치료 중에 환자의 생체 유체로부터 획득됨)를 포함한다. 보다 일반적으로, 상기 결정하는 단계들은 질량 분광 반응 모니터링을 이용하여 수행된다.

위의 관점에서, 엑소좀들이 일반적으로 환자의 생체 유체로부터 획득되는 경우, 환자의 치료는 사전-치료 결정에서의 엑소좀 상에서 또는 그 내에서의 질병 관련 단백질의 양 및 존재를 결정하는 단계에 의해 모니터링될 수 있고, 여기서 치료는 질병 관련 단백질을 타겟팅한다. 치료 이후 또는 치료 중에, 질병 관련 단백질의 양 및/또는 존재는 엑소좀(이는 환자의 생체 유체로부터 다시 분리되기도 함) 상에서 또는 그 내에서 한번 이상 결정된다. 보다 바람직하게는, 질병 관련 단백질의 결정은 질량 분광 반응 모니터링, 특히 선택된 반응 모니터링(SRM)을 이용하여 수행된다.

본 명세서에 기술된 모든 방법들은 본 명세서에서 달리 표시되거나 또는 문맥으로 명백하게 부인되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에서의 특정한 실시예들에 관한 임의의 또는 모든 예시들, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "이러한(such as)")는 단지 본 발명을 보다 잘 나타내도록 의도되며, 달리 청구되는 본 발명의 주제에 대한 제한을 나타내지 않는다. 본 명세서에서의 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 엘리먼트들을 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.

컴퓨터를 가르키는 임의의 언어는 서버들, 인터페이스들, 시스템들, 데이터베이스들, 에이전트들, 피어들, 엔진들, 제어기들, 또는 개별적으로 또는 집합적으로 동작하는 다른 유형의 컴퓨팅 디바이스들을 포함하는, 컴퓨팅 디바이스들의 임의의 적절한 조합을 포함하도록 판독되어야 한다는 점이 주목되어야 한다. 컴퓨팅 디바이스들은 유형의, 비-일시적 컴퓨터 판독가능 저장 매체(예를 들어, 하드 드라이브, 솔리드 스테이트 드라이브, RAM, 플래시, ROM, 등) 상에 저장되는 소프트웨어 명령을 실행하도록 구성되는 프로세스를 포함하는 것으로 인식할 것이다. 소프트웨어 명령들은 바람직하게는 개시되는 장치와 관련하여 후술되는 바와 같은 역할들, 신뢰성들, 또는 다른 기능을 제공하도록 컴퓨팅 디바이스를 구성한다. 특히 바람직한 실시예들에서, 다양한 서버들, 시스템들, 데이터베이스들, 또는 인터페이스들은 가능한 HTTP, HTTPS, AES, 공개- 개인 키 교환들, 웹 서비스 API들, 공지된 금융 거래 프로토콜들 또는 다른 전자적 정보 교환 방법들에 기초하는 표준화된 프로토콜들 또는 알고리즘들을 사용하여 데이터를 교환한다. 데이터 교환들은 패킷-교환망, 인터넷, LAN, WAN, VPN, 또는 다른 유형의 패킷 교환망을 통해 수행될 수 있다.

본 명세서에 개시되는 본 발명의 대안적인 엘리먼트들 또는 실시예들의 그룹들은 제한들로 해석되지 않는다. 각각의 그룹의 멤버는 개별적으로 또는 그룹의 다른 멤버들 또는 본 명세서에 있는 다른 엘리먼트들과의 임의의 조합으로 청구되거나 언급될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 멤버들은 특허성 및/또는 편의성의 이유들을 위해 그룹으로부터 삭제되거나 또는 이에 포함될 수 있다. 임의의 이러한 포함 또는 삭제가 발생하는 경우, 본 명세서는 수정된 그룹을 여기에 포함하는 것으로 간주되어 첨부되는 청구항들에서 사용되는 모든 마쿠시 그룹들의 기재된 기술들을 이행한다. 본 명세서의 설명 및 하기의 청구항들을 통해 사용되는 바와 같이, "a", "an" 및 "the"의 의미는 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 또한, 본 명세서의 기술에서 사용되는 바와 같이, "in"의 의미는 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한 "in" 및 "on"을 포함한다. 또한, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 그리고 문맥상 달리 지시되지 않는 한, 용어 "결합되는(coupled to)"은 직접적 결합(서로 다른 결합되는 두 개의 엘리먼트들이 서로 접촉함) 및 간접적 결합(적어도 하나의 추가적인 엘리먼트가 두 엘리먼트들 사이에 위치함) 양쪽 모두를 포함하도록 의도된다. 따라서, 용어 "결합되는" 및 "결합하는(coupled with)"은 동일하게 사용된다

이미 기술된 것들 이외의 많은 수정들이 본 명세서에서의 발명의 개념들을 벗어나지 않고 가능하다는 것이 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 주제는 첨부되는 청구항들의 범위를 제외하고는 제한되지 않는다. 또한, 명세서 및 청구항들 양쪽 모두를 해석함에 있어서, 모든 용어들은 문맥에 따라 가능한 가장 넓은 방식으로 해석되어야 한다. 특히, 용어 "포함하는(comprises)"및 "포함하는(comprising)"은 참조되는 엘리먼트들, 컴포넌트들, 또는 단계들이 명시적으로 참조되지 않는 다른 엘리먼트들, 컴포넌트들, 또는 단계들과 조합되거나, 사용되거나, 또는 존재하는 것을 나타내는, 비-배타적인 방식으로 엘리먼트들, 컴포넌트들, 또는 단계를 지칭하는 것으로 해석되어야 한다. 명세서의 청구항들이 A, B, C ... 및 N으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 어떠한 것을 지칭하는 경우, 문장은 A와 N, 또는 B와 N 등이 아닌, 그룹으로부터 오직 하나의 엘리먼트만을 요구하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

환자의 치료를 모니터링하는 키트로서,
환자-특이적 질병-관련 단백질(patient-specific disease-associated protein)을 식별하기 위해 복수의 오믹스(omics) 데이터를 사용하는 모듈;
제 1 엑소좀(exosome)에서의 상기 환자-특이적 질병 관련 단백질의 양 및 존재 중 적어도 하나를 결정하는 모듈-상기 제 1 엑소좀은 치료 전 상기 환자의 생체 유체(biological fluid)로부터 획득되고, 상기 치료는 상기 환자-특이적 질병 관련 단백질을 타겟팅(target)함-;
제 2 엑소좀에서의 상기 환자-특이적 질병 관련 단백질의 양 및 존재 중 적어도 하나를 결정하는 모듈-상기 제 2 엑소좀은 치료 이후 또는 치료 중에 상기 환자의 상기 생체 유체로부터 획득됨-; 및
상기 제 2 엑소좀에서의 환자-특이적 질병 관련 단백질의 양 및 존재 중 적어도 하나의 결정에 기초하여 환자 기록을 업데이트(update)하는 모듈;
을 포함하는,
키트.
제 1 항에 있어서,
상기 복수의 오믹스 데이터는 전체 게놈 시퀀싱 데이터(whole genome sequencing data), 엑솜 시퀀싱 데이터(exome sequencing data), 전사체 시퀀싱 데이터(transcriptome sequencing data) 및 프로테옴 시퀀싱 데이터(proteome sequencing data)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는,
키트.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 복수의 오믹스 데이터는 질병 조직(diseased tissue)으로부터의 오믹스 데이터 및 매칭되는(matched) 정상 조직으로부터의 오믹스 데이터를 포함하는,
키트.
제 1 항 있어서,
상기 환자-특이적 질병 관련 단백질은 경로 분석 알고리즘(pathway analysis algorithm)을 이용하여 식별되는,
키트.
제 4 항에 있어서,
상기 경로 분석 알고리즘은 패러다임(PARADIGM)인,
키트.
제 1 항에 있어서,
상기 환자-특이적 질병 관련 단백질은 과발현 단백질(overexpressed protein) 또는 돌연변이 단백질(mutated protein)인,
키트.
제 1 항에 있어서,
상기 환자-특이적 질병 관련 단백질은 키나아제(kinase), 수용체(receptor), 성장 인자(growth factor), 전사 인자(transcription factor), 및 신호 전달-관련 단백질(signal transduction-associated protein) 중 적어도 어느 하나이고, 상기 치료는 상기 키나아제, 상기 수용체, 상기 성장 인자, 상기 전사 인자, 및 상기 신호 전달-관련 단백질 중 적어도 하나를 타겟팅하는 화학요법(chemotherapy)을 포함하는,
키트.
제 1 항에 있어서,
상기 환자-특이적 질병 관련 단백질은 환자 및 종양-특이적 네오에피토프 (patient and tumor-specific neoepitope)이고, 그리고 상기 치료는 상기 환자 및 종양-특이적 네오에피토프를 타겟팅하는 면역 요법(immune therapy)을 포함하는,
키트.
제 1 항에 있어서,
상기 제 1 및 제 2 엑소좀 중 적어도 하나에 존재하는 핵산을 분석하는 단계를 더 포함하고, 상기 핵산은 미소쌍염색체(double minute chromosome)인,
키트.
제 1 항에 있어서,
상기 환자-특이적 질병 관련 단백질의 양 및 존재는 질량 분광 반응 모니터링(mass spectroscopic reaction monitoring)을 사용하여 결정되는,
키트.
제 10 항에 있어서,
상기 질량 분광 반응 모니터링은 선택된 반응 모니터링(selected reaction monitoring), 연속적 반응 모니터링(consecutive reaction monitoring), 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring) 및 병렬 반응 모니터링(parallel reaction monitoring)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는,
키트.
제 1 항에 있어서,
상기 엑소좀은 비-특이적 포획(non-specific entrapment) 및 항체-매개 포획(antibody-mediated capture) 중 적어도 하나를 이용하여 분리되는(isolated),
키트.
제 1 항에 있어서,
상기 생체 유체는 전혈(whole blood), 혈청(serum), 혈장(plasma) 또는 소변(urine)인,
키트.
제 1 항에 있어서,
상기 제 2 엑소좀에서의 상기 환자-특이적 질병 관련 단백질의 양 및 존재 중 적어도 하나를 결정하는 모듈의 동작은 적어도 한번 반복되는,
키트.
제 1 항에 있어서,
상기 환자 기록을 업데이트하는 모듈은 상기 치료를 수정하도록 권고하는,
키트.
치료를 모니터링하기 위해 엑소좀 마커(exosomal marker)를 선택하는 방법에 있어서,
환자-특이적 질병 관련 단백질을 식별하기 위해 복수의 오믹스 데이터를 사용하고, 그리고 상기 환자-특이적 질병 관련 단백질을 타겟팅하는 치료 조성물을 식별하는 단계;
엑소좀에서의 환자-특이적 질병 관련 단백질의 양 및 존재 중 적어도 하나를 결정하는 단계-상기 엑소좀은 치료 전 상기 환자의 생체 유체로부터 획득됨-; 및
상기 질병 관련 단백질이 정량화할 수 있는 양으로 존재하는지의 결정에 대하여 치료를 모니터링하기 위한 상기 환자-특이적 질병 관련 단백질을 선택하는 단계;
를 포함하는,
방법.
제 16 항에 있어서,
상기 복수의 오믹스 데이터는 전체 게놈 시퀀싱 데이터, 엑솜 시퀀싱 데이터, 전사체 시퀀싱 데이터 및 프로테옴 시퀀싱 데이터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는,
방법.
제 16 항 또는 제 17 항에 있어서,
상기 환자-특이적 질병 관련 단백질은 경로 분석 알고리즘을 이용하여 식별되는,
방법.
제 18 항에 있어서,
상기 경로 분석 알고리즘은 패러다임(PARADIGM)인,
방법.
제 16 항에 있어서,
상기 복수의 오믹스 데이터는 질병 조직(diseased tissue)으로부터의 오믹스 데이터 및 매칭되는(matched) 정상 조직으로부터의 오믹스 데이터를 포함하는,
방법.
제 16 항에 있어서,
상기 질병은 암인,
방법.
제 16 항에 있어서,
상기 환자-특이적 질병 관련 단백질은 과발현 단백질 또는 돌연변이 단백질인,
방법.
제 16 항에 있어서,
상기 환자-특이적 질병 관련 단백질은 키나아제, 수용체, 성장 인자, 전사 인자, 및 신호 전달-관련 단백질 중 적어도 어느 하나이고, 상기 치료는 상기 키나아제, 상기 수용체, 상기 성장 인자, 상기 전사 인자, 및 상기 신호 전달-관련 단백질 중 어느 하나를 타겟팅하는 화학요법을 포함하는,
방법.
제 16 항에 있어서,
상기 환자-특이적 질병 관련 단백질은 환자 및 종양-특이적 네오에피토프이고, 그리고 상기 치료는 상기 환자 및 종양 특이적 네오에피토프를 타겟팅하는 면역 요법을 포함하는,
방법.
제 16 항에 있어서,
상기 환자-특이적 질병 관련 단백질의 양 및 존재는 질량 분광 반응 모니터링을 사용하여 결정되는,
방법.
제 16 항에 있어서,
상기 정량화할 수 있는 양은 적어도 상기 질병 관련 단백질의 1 아토몰(attomol)인,
방법.
제 16 항에 있어서,
상기 복수의 오믹스 데이터는 차등 오믹스 데이터(differential omics data)인,
방법.
환자의 면역 요법 치료를 모니터링하는 방법으로서,
제 1 엑소좀에서의 환자- 및 종양-특이적 네오에피토프(patient- and tumor-specific neoepitope)의 양 및 존재 중 적어도 하나를 결정하는 단계-상기 제 1 엑소좀은 치료 전 상기 환자의 생체 유체로부터 획득되고, 그리고 상기 치료는 상기 환자- 및 종양-특이적 네오에피토프를 타겟팅함-; 및
제 2 엑소좀에서의 환자 및 종양-특이적 네오에피토프의 양 및 존재 중 적어도 하나를 결정하는 단계-상기 제 2 엑소좀은 치료 이후 또는 치료 중에 상기 환자의 상기 생체 유체로부터 획득됨-;
를 포함하고,
상기 결정하는 단계들은 질량 분광 반응 모니터링을 이용하여 수행되는,
방법.
제 28 항에 있어서,
상기 면역 요법 치료는 상기 환자- 및 종양-특이적 네오에피토프를 인코딩하는(encoding) 핵산을 포함하는 재조합 엔티티(recombinant entity)의 투여를 포함하는,
방법.
제 29 항에 있어서,
상기 재조합 엔티티는 복제 결핍(replication deficient)인 아데노바이러스(adenovirus)인,
방법.
제 29 항에 있어서,
상기 재조합 엔티티는 방사선조사(irradiated) 박테리아 또는 방사선조사 효모인,
방법.
제 28 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제 1 및 제 2 엑소좀 중 적어도 하나에 존재하는 핵산을 분석하는 단계를 더 포함하는,
방법.
제 28 항에 있어서,
상기 생체 유체에서의 순환 종양 RNA(circulating tumor RNA)를 분석하는 단계를 더 포함하는,
방법.
제 28 항에 있어서,
상기 질량 분광 반응 모니터링은 선택된 반응 모니터링, 연속적 반응 모니터링, 다중 반응 모니터링 및 병렬 반응 모니터링으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는,
방법.
제 28 항에 있어서,
상기 면역 요법 치료는 체크포인트 억제제(checkpoint inhibitor) 및 면역 자극 사이토킨(immune stimulatory cytokine) 중 적어도 하나의 투여를 포함하는,
방법.