TW201918560A - 一種用於檢測、預測和監測癌症的循環rna - Google Patents

Abstract

ct/cfRNA用於鑒定及量化各種基因的表現量，並且能夠非侵入式地監測這些基因的變化。另外，基於是否存在循環游離RNA（cfRNA）或循環腫瘤RNA（ctRNA），ct/cfRNA（及ct/cfDNA）的分析能夠檢測、預測和監測癌症的狀態，以進一步鑒定或確定治療及對治療的反應。

Description

一種用於檢測、預測和監測癌症的循環RNA

本發明涉及通過檢測和/或量化癌症相關基因的循環腫瘤RNA和/或循環細胞游離RNA來確定癌症狀態的系統和方法。

背景描述中包括一些有助於理解本發明的資訊。這裡不承認在此文中提供的所有資訊是現有技術或與現有要求保護的發明相關，或者任何明確或隱含引用的公開是現有技術。

所有公開及專利申請通過引用併入到本文中，其引用程度就如同每個單獨的公開或專利申請被具體和單獨地提及以通過引用併入本文。當被併入的文獻中所限定或使用的術語與本發明提供的術語的限定不一致或相反時，則本發明所提供的術語的界定是適用的，文獻中所限定的術語是不適用的。

改善癌症治療的努力主要集中在篩選、開發新的抗癌劑、多種藥物組合以及改善放射療法。一種更新的方法是精準醫療，其通過考慮個體差異性來設計個性化治療方案。精準醫療的一個重要的目標是通過分析治療效果和預後所涉及的因素來確定分子標記物，所述分子標記物表示治療選擇。至今為止，這種資訊已經可以通過分析從癌組織活檢取得的基因和蛋白質而獲得。

然而，組織活檢的使用存在許多問題，包括可能發生的採樣偏差和在治療過程中監測患者體內的腫瘤標記物的能力有限。1977年，Leon等人發現了在某些癌症患者體內的血清循環腫瘤DNA（ctDNA）表現量較高，表明癌症患者體內存在來源於其腫瘤的額外血清DNA。隨後的研究證實了該猜想並確定了ctDNA至少在某些情況下可以揭示與腫瘤中發現的患者遣傳資訊相同的資訊而不需要通過侵入性的組織活檢。進一步的研究表明，液體活檢的遺傳資訊可能來自於各種來源，包括循環癌細胞（CTC）和外泌體（exosomes）。

雖然很多研究已經使用ctDNA來研究癌症基因組及監測或診斷癌症，然而使用ctRNA的研究相當少。有利的是，ctRNA可能至少潛在地包含與ctDNA相同的突變資訊，但僅存在於實際表達的基因中。而且，ctRNA還可以至少概念性地提供關於基因可量化的表現量（即轉錄成mRNA的量）的資訊。然而，RNA已知是非常不穩定的，至少由於這個原因沒有受到太多的研究。因此，大多數的與RNA相關的工作側重於活檢材料和相關治療方案上，以檢測和/或量化在這種材料中的RNA，包括RNAseq，RNA雜交板等。不幸的是，活檢經常是不容易獲得的且使患者遭受額外的風險。

為了避免這種的困難，選擇的cfRNA測試集中在檢測對某些腫瘤具有特異性的已知標記物上。例如，Kuslich發明的美國專利No.9,469,876以及Shelton發明的美國專利No.8,597,892討論了與血液中的循環囊泡相關的循環微小RNA生物標記物，用於診斷特定類型的癌症（例如前列腺癌等）。在另一個例子中，Kopreski發明的美國專利No.8440396公開了編碼腫瘤相關抗原的基因循環mRNA片段的檢測，已知所述腫瘤相關抗原為一些類型的腫瘤標記物（例如黑色素瘤、白血病等）。但是，這種方法通常僅限於提供關於癌症預後的零碎資訊，因此，例如無法與與癌細胞間接相關或間接由癌細胞引起的癌症狀態及許多癌症症狀進行關聯（例如病灶轉移的存在、癌症幹細胞的存在、免疫抑制性腫瘤微環境的存在、免疫活性細胞對癌症的活性的增加或降低等）。

因此，即使本領域已知眾多來自生物流體的核酸分析辦法，但其全部或幾乎全部都具有各種缺點。因此，對於改進分離循環核酸的系統和方法仍然是需要的，特別是通過ctRNA來確定與癌細胞間接相關或由癌細胞間接引起的狀態及其他症狀。

本發明的主題涉及基於血液的RNA表達測試相關的系統和方法，其識別和/或定量表達，並且允許非侵入性監測疾病驅動因素的變化或疾病組織的微環境的條件或圍繞疾病組織的微環境的條件，其迄今為止只有通過基於蛋白質的活檢組織分析才能得到。有利的是，這種方法允許識別或預測與癌細胞間接相關或間接由癌細胞引起的癌症狀態及其他癌症症狀。

優選的RNA表達測試是通過檢測和/或量化循環腫瘤RNA（ctRNA）和/或循環游離RNA（cfRNA）來進行的，所述循環腫瘤RNA（ctRNA）和/或循環游離RNA（cfRNA）是通過檢測和/或量化循環腫瘤DNA（ctDNA）和/或循環游離DNA（cfDNA）而獲得（在某些情況下被替換而成）的。所述RNA表達通常基於或包括疾病相關基因，其中這些基因可能是野生型、突變的（例如患者-特異性突變，包括SNPs、新表位、融合等）和/或剪接的變體形式。

因此，應該認識到，所考慮的系統和方法有利地允許檢測疾病的發作和/或進展，允許檢測及分析腫瘤微環境的條件，允許檢測及分析腫瘤細胞的分子改變，允許識別可能與各種治療方式出現的耐藥性相關聯的藥物靶點的變化，或允許預測使用各種治療方式的可能療治結果。另外，所考慮的系統和方法有利地與其他生物組分析平臺相結合，特別是GPS癌症，並且建立一個強大的初始分析/監測組合工具，其中通過生物組平臺識別的改變是非侵入性的，通過本文提供的系統和方法進行分子監測。

在本發明目的的一方面，發明人考慮確定患有癌症或懷疑患有癌症的個體的癌症狀態的方法。在該方法中，獲得個體的體液樣品並確定cfRNA和ctRNA中的至少一種在該樣品中的量。最優選的是，所述cfRNA和ctRNA源自癌症相關的基因。然後，將cfRNA和ctRNA中的至少一種的量與癌症狀態相關聯。

在優選的方面，癌症相關的基因選自：ABL1、ABL2、ACTB、ACVR1B、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、AMER11、APC、AR、ARAF、ARFRP1、ARID1A、ARID1B、ASXL1、ATF1、ATM、ATR、ATRX、AURKA、AURKB、AXIN1、AXL、BAP1、BARD1、BCL2、BCL2L1、BCL2L2、BCL6、BCOR、BCORL1、BLM、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BTG1、BTK、EMSY、CARD11、CBFB、CBL、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD274、CD79A、CD79B、CDC73、CDH1、CDK12、CDK4、CDK6、CDK8、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CEA、CEBPA、CHD2、 CHD4、CHEK1、CHEK2、CIC、CREBBP、CRKL、CRLF2、CSF1R、CTCF、CTLA4、CTNNA1、CTNNB1、CUL3、CYLD、DAXX、DDR2、DEPTOR、DICER1、DNMT3A、DOT1L、EGFR、EP300、EPCAM、EPHA3、EPHA5、EPHA7、EPHB1、ERBB2、ERBB3、ERBB4、EREG、ERG、ERRFI1、ESR1、EWSR1、EZH2、FAM46C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCL、FAS、FAT1、FBXW7、FGF10、FGF14、FGF19、FGF23、FGF3、FGF4、FGF6、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FLCN、FLI1、FLT1、FLT3、FLT4、FOLH1、FOXL2、FOXP1、FRS2、FUBP1、GABRA6、GATA1、GATA2、GATA3、GATA4、GATA6、GID4、GLI1、GNA11、GNA13、GNAQ、GNAS、GPR124、GRIN2A、GRM3、GSK3B、H3F3A、HAVCR2、HGF、HNF1A、HRAS、HSD3B1、HSP90AA1、IDH1、IDH2、IDO、IGF1R、IGF2、IKBKE、IKZF1、IL7R、INHBA、INPP4B、IRF2、IRF4、IRS2、JAK1、JAK2、JAK3、JUN、MYST3、KDM5A、KDM5C、KDM6A、KDR、KEAP、KEL、KIT、KLHL6、KLK3、MLL、MLL2、MLL3、KRAS、LAG3、LMO1、LRP1B、LYN、LZTR1、MAGI2、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MCL1、MDM2、MDM4、MED12、MEF2B、MEN1、MET、MITF、MLH1、MPL、MRE11A、MSH2、MSH6、MTOR、MUC1、MUTYH、MYC、MYCL、MYCN、MYD88、MYH、NF1、NF2、NFE2L2、NFKB1A、NKX2-1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NPM1、NRAS、NSD1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUP93、PAK3、PALB2、PARK2、PAX3、PAX、PBRM1、PDGFRA、PDCD1、PDCD1LG2、PDGFRB、PDK1、PGR、PIK3C2B、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PLCG2、PMS2、POLD1、POLE、PPP2R1A、PREX2、PRKAR1A、PRKC1、PRKDC、PRSS8、PTCH1、PTEN、PTPN11、QK1、RAC1、RAD50、RAD51、RAF1、RANBP1、RARA、RB1、RBM10、RET、RICTOR、RIT1、RNF43、ROS1、RPTOR、RUNX1、RUNX1T1、SDHA、SDHB、SDHC、SDHD、SETD2、SF3B1、SLIT2、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMO、SNCAIP、SOCS1、SOX10、SOX2、SOX9、SPEN、SPOP、SPTA1、SRC、STAG2、STAT3、STAT4、STK11、SUFU、SYK、T (BRACHYURY)、TAF1、TBX3、TERC、TERT、TET2、TGFRB2、TNFAIP3、TNFRSF14、TOP1、TOP2A、TP53、TSC1、TSC2、TSHR、U2AF1、VEGFA、VHL、WISP3、WT1、XPO1、ZBTB2、ZNF217、ZNF703、CD26、CD49F、CD44、CD49F、CD13、CD15、CD29、CD151、CD138、CD166、CD133、CD45、CD90、CD24、CD44、CD38、CD47、CD96、CD 45、CD90、ABCB5、ABCG2、ALCAM、ALPHA-FETOPROTEIN、DLL1、DLL3、DLL4、ENDOGLIN、GJA1、OVASTACIN、AMACR、NESTIN、STRO-1 、MICL、ALDH、BMI-1、GLI-2、CXCR1、CXCR2、CX3CR1、CX3CL1、CXCR4、PON1、TROP1、LGR5、MSI-1、C-MAF、TNFRSF7、TNFRSF16、SOX2、PODOPLANIN、L1CAM、HIF-2 ALPHA、TFRC、ERCC1、TUBB3、TOP1、TOP2A、TOP2B、ENOX2、TYMP、TYMS、FOLR1、GPNMB、PAPPA、GART、EBNA1、EBNA2、LMP1、BAGE、BAGE2、BCMA、C10ORF54、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD30、CD33、CD80、CD86、CD123、CD276、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL17、CXCR3、CXCR5、CXCR6、CTAG1B、CTAG2、CTAG1、CTAG4、CTAG5、CTAG6、CTAG9、CAGE1、GAGE1、GAGE2A、GAGE2B、GAGE2C、GAGE2D、GAGE2E、GAGE4、GAGE10、GAGE12D、GAGE12F、GAGE12J、GAGE13、HHLA2、ICOSLG、LAG1、MAGEA10、MAGEA12、MAGEA1、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA4、MAGEA5、MAGEA6、MAGEA7、MAGEA8、MAGEA9、MAGEB1、MAGEB2、MAGEB3、MAGEB4、MAGEB6、MAGEB10、MAGEB16、MAGEB18、MAGEC1、MAGEC2、MAGEC3、MAGED1、MAGED2、MAGED4、MAGED4B、MAGEE1、MAGEE2、MAGEF1、MAGEH1、MAGEL2、NCR3LG1、SLAMF7、SPAG1、SPAG4、SPAG5、SPAG6、SPAG7、SPAG8、SPAG9、SPAG11A、SPAG11B、SPAG16、SPAG17、VTCN1、XAGE1D、XAGE2、XAGE3、XAGE5、XCL1、XCL2、XCR1、DCC、UNC5A、導蛋白和 IL8一種或多種。當然，應當理解的是，上述基因可以是野生型或突變型，包括錯義或無義突變、插入、缺失、融合和/或易位，所有這些可能會或不會導致由這種RNA表達的蛋白質中形成新表位。

關於癌症狀態，考慮適用的狀態包括癌症的類型（例如實體癌），癌症的解剖學定位，癌症細胞的克隆性進化，癌症對藥物治療的易感性，在個體中存在或缺失癌症，病灶轉移的存在，癌症幹細胞的存在，免疫抑制性腫瘤微環境的存在及免疫活性細胞對癌症的活性的增加或減少。而且，通常考慮癌症相關基因是癌症關聯基因、癌症特異性基因、癌症驅動基因或編碼患者和腫瘤特異性抗原表位的基因。例如，所述癌症相關的基因編碼是檢查點抑制相關基因、上皮-間質轉換相關基因、免疫抑制相關基因。

在一些實施例中，適合的癌症相關的基因可以具有患者-特異性突變或患者-和腫瘤-特異性突變，以及ctRNA或cfRNA可以是編碼患者-特性異和癌症-特異性抗原表位的癌症相關的基因的轉錄的一部分。在其他變化中考慮的突變包括錯義突變、插入、缺失、易位、融合，所有的這些可能會在由cfRNA或ctRNA編碼的蛋白質中產生新表位。

最典型地，量化步驟將包括在一定條件下來分離cfRNA和/或ctRNA（例如從血液、血清、血漿或尿液中），並使用RNA穩定劑用於大體上避免細胞裂解。另外，可以考慮的是，量化步驟將包括從cfRNA和/或ctRNA製備的cDNA中即時定量PCR。在進一步的優選方法中，關聯步驟包括將癌症指定為可用藥物治療或將癌症指定為治療抗性的步驟。

根據需要，進一步可考慮的是本發明中的所述的方法還可以包括確定所有或基本上所有ctRNA和ctRNA在樣品中的總量的步驟，以及可選擇地將確定的總量與癌症的存在與否相關聯的步驟。另外，還可以考慮的是所述方法可以進一步包括確定在樣品中的腫瘤相關的胜肽（例如可溶解的NKG2D）的存在和數量中的至少一種的步驟。

可選擇地，所述方法還包括確定樣品中cfRNA及ctRNA中的至少兩種的量，其中cfRNA和ctRNA中的至少兩種來自一癌症相關的基因。在這種方法中，可以確定ctRNA和ctRNA中的至少兩種之間量的比率以及可以將確定的比率與癌症狀態相關聯。在一些實施例中，所述cfRNA和ctRNA中的至少兩種包括所述樣品中的至少一種cfRNA和至少一種ctRNA，其中所述至少一種ctRNA源自免疫細胞（例如抑制免疫細胞等）。

更進一步地，所述方法還包括確定ctRNA和ctRNA中的至少一種的核酸序列的步驟。在該方法中，cfDNA和ctDNA中的至少一種來自於與cfRNA和ctRNA中的至少一種相同的基因。在一些實施例中，可以確定cfDNA和ctDNA中的至少一種的核酸序列中的突變，以及可以將cfRNA和ctRNA中的至少一種的突變和量與癌症狀態相關聯。

此外，所述方法還可以包括根據癌症狀態選擇治療方案的步驟。在該方法中，所述治療方案包括當源自癌症相關的基因的cfRNA和ctRNA中的至少一種的量增長時，一種靶向被癌症相關的基因編碼的胜肽的一部分的治療。如果所述cfRNA和ctRNA中的至少一種是miRNA的話，則考慮治療方案是抑制miRNA的製劑。

在本發明相關主題的另一方面，發明人還考慮了一種治療癌症的方法。在該方法中，確定患者血液樣品中的第一和第二標記物基因的各cfRNA和ctRNA中的至少一種。優選地，所述第一標記物基因是一癌症相關基因，以及第二標記物基因是檢查點抑制相關基因。然後，利用來自第一或第二標記物基因的cfRNA或ctRNA的量，分別確定使用第一或第二藥物組合物的治療。優選地，所述第二藥物組合物包括檢查點抑制劑。最典型地，癌症相關的基因選自：ABL1、ABL2、ACTB、ACVR1B、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、AMER11、APC、AR、ARAF、ARFRP1、ARID1A、ARID1B、ASXL1、ATF1、ATM、ATR、ATRX、AURKA、AURKB、AXIN1、AXL、BAP1、BARD1、BCL2、BCL2L1、BCL2L2、BCL6、BCOR、BCORL1、BLM、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BTG1、BTK、EMSY、CARD11、CBFB、CBL、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD274、CD79A、CD79B、CDC73、CDH1、CDK12、CDK4、CDK6、CDK8、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CEA、CEBPA、CHD2、 CHD4、CHEK1、CHEK2、CIC、CREBBP、CRKL、CRLF2、CSF1R、CTCF、CTLA4、CTNNA1、CTNNB1、CUL3、CYLD、DAXX、DDR2、DEPTOR、DICER1、DNMT3A、DOT1L、EGFR、EP300、EPCAM、EPHA3、EPHA5、EPHA7、EPHB1、ERBB2、ERBB3、ERBB4、EREG、ERG、ERRFI1、ESR1、EWSR1、EZH2、FAM46C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCL、FAS、FAT1、FBXW7、FGF10、FGF14、FGF19、FGF23、FGF3、FGF4、FGF6、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FLCN、FLI1、FLT1、FLT3、FLT4、FOLH1、FOXL2、FOXP1、FRS2、FUBP1、GABRA6、GATA1、GATA2、GATA3、GATA4、GATA6、GID4、GLI1、GNA11、GNA13、GNAQ、GNAS、GPR124、GRIN2A、GRM3、GSK3B、H3F3A、HAVCR2、HGF、HNF1A、HRAS、HSD3B1、HSP90AA1、IDH1、IDH2、IDO、IGF1R、IGF2、IKBKE、IKZF1、IL7R、INHBA、INPP4B、IRF2、IRF4、IRS2、JAK1、JAK2、JAK3、JUN、MYST3、KDM5A、KDM5C、KDM6A、KDR、KEAP、KEL、KIT、KLHL6、KLK3、MLL、MLL2、MLL3、KRAS、LAG3、LMO1、LRP1B、LYN、LZTR1、MAGI2、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MCL1、MDM2、MDM4、MED12、MEF2B、MEN1、MET、MITF、MLH1、MPL、MRE11A、MSH2、MSH6、MTOR、MUC1、MUTYH、MYC、MYCL、MYCN、MYD88、MYH、NF1、NF2、NFE2L2、NFKB1A、NKX2-1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NPM1、NRAS、NSD1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUP93、PAK3、PALB2、PARK2、PAX3、PAX、PBRM1、PDGFRA、PDCD1、PDCD1LG2、PDGFRB、PDK1、PGR、PIK3C2B、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PLCG2、PMS2、POLD1、POLE、PPP2R1A、PREX2、PRKAR1A、PRKC1、PRKDC、PRSS8、PTCH1、PTEN、PTPN11、QK1、RAC1、RAD50、RAD51、RAF1、RANBP1、RARA、RB1、RBM10、RET、RICTOR、RIT1、RNF43、ROS1、RPTOR、RUNX1、RUNX1T1、SDHA、SDHB、SDHC、SDHD、SETD2、SF3B1、SLIT2、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMO、SNCAIP、SOCS1、SOX10、SOX2、SOX9、SPEN、SPOP、SPTA1、SRC、STAG2、STAT3、STAT4、STK11、SUFU、SYK、T (BRACHYURY)、TAF1、TBX3、TERC、TERT、TET2、TGFRB2、TNFAIP3、TNFRSF14、TOP1、TOP2A、TP53、TSC1、TSC2、TSHR、U2AF1、VEGFA、VHL、WISP3、WT1、XPO1、ZBTB2、ZNF217、ZNF703、ERCC1、TUBB3、TOP1、TOP2A、TOP2B、ENOX2、TYMP、TYMS、FOLR1、GPNMB、PAPPA、GART、EBNA1、EBNA2、LMP1、BAGE、BAGE2、BCMA、C10ORF54、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD30、CD33、CD80、CD86、CD123、CD276、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL17、CXCR3、CXCR5、CXCR6、CTAG1B、CTAG2、CTAG1、CTAG4、CTAG5、CTAG6、CTAG9、CAGE1、GAGE1、GAGE2A、GAGE2B、GAGE2C、GAGE2D、GAGE2E、GAGE4、GAGE10、GAGE12D、GAGE12F、GAGE12J、GAGE13、HHLA2、ICOSLG、LAG1、MAGEA10、MAGEA12、MAGEA1、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA4、MAGEA5、MAGEA6、MAGEA7、MAGEA8、MAGEA9、MAGEB1、MAGEB2、MAGEB3、MAGEB4、MAGEB6、MAGEB10、MAGEB16、MAGEB18、MAGEC1、MAGEC2、MAGEC3、MAGED1、MAGED2、MAGED4、MAGED4B、MAGEE1、MAGEE2、MAGEF1、MAGEH1、MAGEL2、NCR3LG1、SLAMF7、SPAG1、SPAG4、SPAG5、SPAG6、SPAG7、SPAG8、SPAG9、SPAG11A、SPAG11B、SPAG16、SPAG17、VTCN1、XAGE1D、XAGE2、XAGE3、XAGE5、XCL1、XCL2、XCR1、DCC、UNC5A、Netrin、CXCR1、CXCR2、和IL8。

例如，所述第二標記物基因可以是那些編碼PD-1或PD-L1的基因，所述第一藥物組合物可以是一免疫療法組合物或一化學療法組合物。考慮的方法可以進一步包括確定患者血液樣品中cfRNA和ctRNA中的至少一種的所有總量的步驟。優選地，確定的步驟包括在一定條件下分離cfRNA和ctRNA中的至少一種，並且使用RNA穩定劑以基本上避免細胞裂解。如上所述的，考慮的方法還可以包括對在患者血液樣品中與癌症相關基因的cfDNA和ctDNA中的至少一種進行定量的步驟。

在本發明主題的又一方面中，包括一種生成或更新患有癌症或懷疑患有癌症的個體的病歷的方法。在該方法中，獲得個體的體液樣品並確定該樣品中cfRNA和ctRNA中的至少一種的量。優選地，所述cfRNA和ctRNA中的至少一種源自癌症相關的基因。然後，將cfRNA和ctRNA中的至少一種的量與癌症狀態相關聯。從而可以根據癌症狀態生成或更新患者病歷。最典型地，癌症相關的基因選自：ABL1、ABL2、ACTB、ACVR1B、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、AMER11、APC、AR、ARAF、ARFRP1、ARID1A、ARID1B、ASXL1、ATF1、ATM、ATR、ATRX、AURKA、AURKB、AXIN1、AXL、BAP1、BARD1、BCL2、BCL2L1、BCL2L2、BCL6、BCOR、BCORL1、BLM、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BTG1、BTK、EMSY、CARD11、CBFB、CBL、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD274、CD79A、CD79B、CDC73、CDH1、CDK12、CDK4、CDK6、CDK8、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CEA、CEBPA、CHD2、 CHD4、CHEK1、CHEK2、CIC、CREBBP、CRKL、CRLF2、CSF1R、CTCF、CTLA4、CTNNA1、CTNNB1、CUL3、CYLD、DAXX、DDR2、DEPTOR、DICER1、DNMT3A、DOT1L、EGFR、EP300、EPCAM、EPHA3、EPHA5、EPHA7、EPHB1、ERBB2、ERBB3、ERBB4、EREG、ERG、ERRFI1、ESR1、EWSR1、EZH2、FAM46C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCL、FAS、FAT1、FBXW7、FGF10、FGF14、FGF19、FGF23、FGF3、FGF4、FGF6、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FLCN、FLI1、FLT1、FLT3、FLT4、FOLH1、FOXL2、FOXP1、FRS2、FUBP1、GABRA6、GATA1、GATA2、GATA3、GATA4、GATA6、GID4、GLI1、GNA11、GNA13、GNAQ、GNAS、GPR124、GRIN2A、GRM3、GSK3B、H3F3A、HAVCR2、HGF、HNF1A、HRAS、HSD3B1、HSP90AA1、IDH1、IDH2、IDO、IGF1R、IGF2、IKBKE、IKZF1、IL7R、INHBA、INPP4B、IRF2、IRF4、IRS2、JAK1、JAK2、JAK3、JUN、MYST3、KDM5A、KDM5C、KDM6A、KDR、KEAP、KEL、KIT、KLHL6、KLK3、MLL、MLL2、MLL3、KRAS、LAG3、LMO1、LRP1B、LYN、LZTR1、MAGI2、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MCL1、MDM2、MDM4、MED12、MEF2B、MEN1、MET、MITF、MLH1、MPL、MRE11A、MSH2、MSH6、MTOR、MUC1、MUTYH、MYC、MYCL、MYCN、MYD88、MYH、NF1、NF2、NFE2L2、NFKB1A、NKX2-1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NPM1、NRAS、NSD1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUP93、PAK3、PALB2、PARK2、PAX3、PAX、PBRM1、PDGFRA、PDCD1、PDCD1LG2、PDGFRB、PDK1、PGR、PIK3C2B、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PLCG2、PMS2、POLD1、POLE、PPP2R1A、PREX2、PRKAR1A、PRKC1、PRKDC、PRSS8、PTCH1、PTEN、PTPN11、QK1、RAC1、RAD50、RAD51、RAF1、RANBP1、RARA、RB1、RBM10、RET、RICTOR、RIT1、RNF43、ROS1、RPTOR、RUNX1、RUNX1T1、SDHA、SDHB、SDHC、SDHD、SETD2、SF3B1、SLIT2、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMO、SNCAIP、SOCS1、SOX10、SOX2、SOX9、SPEN、SPOP、SPTA1、SRC、STAG2、STAT3、STAT4、STK11、SUFU、SYK、T (BRACHYURY)、TAF1、TBX3、TERC、TERT、TET2、TGFRB2、TNFAIP3、TNFRSF14、TOP1、TOP2A、TP53、TSC1、TSC2、TSHR、U2AF1、VEGFA、VHL、WISP3、WT1、XPO1、ZBTB2、ZNF217、ZNF703、ERCC1、TUBB3、TOP1、TOP2A、TOP2B、ENOX2、TYMP、TYMS、FOLR1、GPNMB、PAPPA、GART、EBNA1、EBNA2、LMP1、BAGE、BAGE2、BCMA、C10ORF54、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD30、CD33、CD80、CD86、CD123、CD276、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL17、CXCR3、CXCR5、CXCR6、CTAG1B、CTAG2、CTAG1、CTAG4、CTAG5、CTAG6、CTAG9、CAGE1、GAGE1、GAGE2A、GAGE2B、GAGE2C、GAGE2D、GAGE2E、GAGE4、GAGE10、GAGE12D、GAGE12F、GAGE12J、GAGE13、HHLA2、ICOSLG、LAG1、MAGEA10、MAGEA12、MAGEA1、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA4、MAGEA5、MAGEA6、MAGEA7、MAGEA8、MAGEA9、MAGEB1、MAGEB2、MAGEB3、MAGEB4、MAGEB6、MAGEB10、MAGEB16、MAGEB18、MAGEC1、MAGEC2、MAGEC3、MAGED1、MAGED2、MAGED4、MAGED4B、MAGEE1、MAGEE2、MAGEF1、MAGEH1、MAGEL2、NCR3LG1、SLAMF7、SPAG1、SPAG4、SPAG5、SPAG6、SPAG7、SPAG8、SPAG9、SPAG11A、SPAG11B、SPAG16、SPAG17、VTCN1、XAGE1D、XAGE2、XAGE3、XAGE5、XCL1、XCL2、XCR1、DCC、UNC5A、Netrin、CXCR1、CXCR2、和IL8。

在本發明涉及的主題的另一方面，發明人考慮到一種方法，能夠確定對患有癌症的個體的免疫療法的成功的可能性。在該方法中，獲得個體的體液樣品並確定該樣品中cfRNA和ctRNA中的至少一種的量。優選地，cfRNA和ctRNA源自上皮-間質轉換相關基因及免疫抑制相關基因中的至少一種。然後，將cfRNA和ctRNA中的至少一種的量與腫瘤微環境狀態相關聯。可以根據免疫療法的類型及腫瘤微環境的狀態確定免疫療法成功的可能性或免疫療法對癌症的可治療性。

典型地，腫瘤微環境狀態至少是癌症幹細胞的存在、免疫抑制性腫瘤微環境的存在、及免疫活性細胞對癌症活性的增加或減少中的一種。因此，免疫治療的類型可以包括基於新表位的免疫治療、檢查點抑制劑、調節性T細胞抑制劑、細胞因數或趨化因數的結合分子，以及細胞因數或趨化因數，抑制上皮-間質轉換的miRNA。在一些實施例中，當cfRNA和ctRNA中的至少一種的量低於預定的閾值時，免疫療法被確定為具有極高的成功的可能性，而且，所述方法還可以包括當所述cfRNA和ctRNA中的至少一種低於預定的閾值時，將免疫療法施用於個體的步驟。

本發明主題的各種目的、特徵、方面以及優點將通過詳細描述下列優選實施例以及附圖而更加清晰。

本發明考慮腫瘤細胞和/或一些免疫細胞相互作用，或圍繞腫瘤細胞釋放cfRNA，更特別地向患者體液釋放ctRNA，因此與健康的個體相比在患者體液中可能會增加特定ctRNA的量。因此，發明人現已經發現ctRNA和/或cfRNA可以作為靈敏的、可選擇的及可量化的標記物，用於特定腫瘤微環境或細胞狀態中的診斷、指示和/或變化、監測治療、識別或建議成功性高的治療，以及甚至作為允許對患者進行重複性及非侵入性採樣的發現工具。在本文中，應當注意到的是，總cfRNA包括ctRNA，其中ctRNA可能具有患者和腫瘤特異性突變，因此區別於健康細胞的相應cfRNA，或其中ctRNA可能在腫瘤細胞中可選擇地表達而不是在相應的健康細胞中表達。

因此，從不同的角度來看，發明人發現可以選擇不同的核酸，特別地為一種cfDNA/多種cfRNA，或更特別地為一種ctDNA/多種ctRNA，可以用於檢測和/或監測腫瘤的症狀，更具體地用於檢測和/或監測腫瘤細胞和/或腫瘤微環境的分子或細胞狀態、腫瘤預後、合適的治療和治療計畫的推薦以及在特定患者中的治療方案的治療反應/效果。

因此，在本發明提供的主題的一特別優選的方面，發明人考慮了一種確定或監測患有癌症或懷疑患有癌症的個體的癌症狀況的方法。在該方法中，獲取個體的體液樣品，在該體液樣品中確定cfRNA和ctRNA中的至少一種的量。

如本文所使用的術語「腫瘤」指的是可以用以下一種或多種替代使用：癌症細胞、癌症組織、惡性腫瘤細胞、或惡性腫瘤組織等可以存在或被發現於人體中的一處或多處解剖位置中。應當注意到的是，本文所使用的術語「患者」包括被診斷患有病症（例如癌症）的個體以及為了檢測或識別病症而進行檢查和/或測試的個體。因此，患有腫瘤的患者指的是包括被診斷患有癌症的個體以及懷疑患有癌症的個體。如本文所使用的術語「提供」或「供有」指的是包括製造、生成、放置、能夠使用、轉移或準備使用的任何行為。

更典型地，獲得cfDNA/cfRNA的合適的體液包括全血，其優選地提供有血漿或血清。因此，在優選的實施例中，cfDNA/cfRNA從全血樣品中提取，所述提取在保持細胞cfDNA/cfRNA的整體性及穩定性的條件下進行。可選擇地，應當注意到的是，各種其他體液也可以被認為是合適的，只要ctRNA和/或cfRNA存在於這種液體中。合適的液體包括唾液、腹水、脊髓液、尿液或任何其他類型的體液，其可以是新鮮的、被化學保存的、冷藏的或冰凍的。

取決於生物組分析的目的，患者體液可以在任何需要的一個時間點或多個時間點獲得。例如，患者體液可以在患者被確認為患有腫瘤前和/或在患者被確認為患有腫瘤後和/或之確認患有腫瘤後定期地（例如每週、每月等）獲得，以便將ctDNA和/或ctRNA資料與癌症預後相關聯。在一些實施例中，患者體液可以從患者接受癌症治療前和接受癌症治療後（例如化學療法、放射療法、藥物療法、癌症免疫療法等）得到。雖然其可能根據治療的類型和/或癌症的類型而變化，但患者體液在癌症治療後至少24小時、至少3天、至少7天可以獲得。為了更準確地比較，在癌症治療開始前少於1小時、少於6小時、少於24小時、少於一週可以獲取患者體液。另外，多個患者體液的樣品可以在開始癌症治療之前和/或癌症治療結束之後的一段期間內（例如在24小時之後的7天之內的每天一次等）獲取。

另外或可選地，可以獲得健康個體的體液以比較cfDNA和/或cfRNA序列的序列/修飾和/或cfRNA的量/亞型表達。如本文中所使用的一個健康個體指的是一個未患腫瘤的個體。優選地，所述健康個體可以從和患者具有相同特徵的群體中選擇（例如年齡、性別、種族、飲食、生活環境、家族史等）。

考慮了用於分離細胞游離DNA/RNA的任何合適的方法。例如，在一個分離DNA的示例性的方法中，將抽取至試管的10 ml全血作為樣本。細胞游離DNA可以使用磁珠從其他單核小體及雙核小體複合物中分離，所述磁珠可以將尺寸在100-300bps範圍內的細胞游離DNA分離出來。另一個例子，在一個示例性的分離RNA的方法中，可以將10 ml抽取至分別含有RNA穩定劑的細胞游離RNA BCT®管或細胞游離DNA BCT®管中的全血作為樣本。有利的是，在全血中的細胞游離RNA在細胞游離RNA BCT®管中在7天內是穩定的，然而在全血中的細胞游離RNA在細胞游離DNA BCT®管中在14天內是穩定的，從而在時間上允許從世界各地輸送患者樣本而不降解細胞游離RNA。

通常優選使用RNA穩定試劑分離cfRNA。雖然可以考慮任何合適的RNA穩定試劑，但是優選的RNA穩定試劑包括核酸抑制劑、防腐劑、代謝抑制劑和/或螯合劑中的一種或多種。例如，考慮的核酸抑制劑可以包括諸如焦碳酸二乙酯、乙醇、金精三羧酸（ATA）、甲醯胺、氧釩-核糖核苷複合物、矽藻土、肝磷脂、膨潤土、硫酸銨、二硫蘇糖醇（DTT）、β-巰基乙醇、二硫赤蘚糖醇、三（2-羧乙基）膦乙烯鹽酸鹽的RNA酶抑制劑，最典型的量在0.5-2.5wt%之間。防腐試劑可以包括二唑烷基脲（DU）、咪唑烷基脲、二甲基醇-5、5-二甲基乙內醯脲、二羥甲基脲、2-溴-2-硝基丙烷-1、3-二醇、惡唑烷、羥甲基甘氨酸鈉、5-羥甲氧基甲基-1-1氮雜-3、7-二氧雜雙環[3.3.0]辛烷、5-羥甲基-1-1氮雜-3、7-二氧雜二環[3.3.0]辛烷、5-羥基聚[亞甲氧基]甲基-1-1-氮雜-3、7-二氧雜雙環 [3.3.0]辛烷、季金剛烷或其任何組合。在大部分示例中，防腐試劑存在的量大約在5-30wt%範圍內。而且，通常考慮到的是防腐劑不含離液劑和/或去汙劑以減少或避免與防腐劑接觸的細胞分裂。

合適的代謝抑制劑可以包括甘油醛、二羥丙酮磷酸鹽、甘油醛3-磷酸鹽、1,3-雙磷酸甘油酸鹽、3-磷酸甘油酸鹽、磷酸烯醇丙酮酸鹽、丙酮酸鹽和甘油二羥基乙酸酯、以及氟化鈉、其濃度通常在0.1-10wt％的範圍內。優選的螯合劑可以包括二價陽離子的螯合劑，例如乙二胺四乙酸（EDTA）和/或乙二醇-雙（β-氨乙基醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA），其濃度為通常在1-15wt％的範圍內。

另外，RNA穩定劑還可以包括蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和/或多胺。因此，用於收集和穩定全血中ctRNA的示例性組合物可以包括金精三羧酸，雙咪唑烷基脲，甘油醛/氟化鈉和/或EDTA。在美國專利No.8304187和美國專利No.8586306中描述的更多用於ctRNA的分離的化合物和方法均通過引用併入本文。

最優選地，用於穩定ctRNA的這種考慮的RNA穩定劑置於適於血液收集，儲存，運輸和/或離心的試管內。因此，在大多數典型的方面，收集管構造成真空的血液收集管，所述真空血液收集管還包括一種或多種血清分離物質以幫助全血分離成含有細胞的和基本上無細胞的相（不超過存在的所有細胞的1%）。通常，RNA穩定劑優選不溶血細胞或基本不溶血細胞（例如等於或小於1％，或等於或小於0.1％，等於或小於0.01％，等於或小於0.001％等 ）。從不同的角度來，RNA穩定劑在穩定劑與血液結合後不會導致在血清或血漿中的RNA的量的實質性增加（例如，增加的量不會超過總RNA的10%，或不超過5%、或不超過2%、或不超過1%）。同樣，這些試劑也將保持血液中細胞的物理完整性，以減少甚至消除血細胞中發現的細胞RNA的釋放。這種保存可以是以採集的血液的形式，所述血液可能已經被分離或可能沒有被分離。在一些方面，考慮的試劑可以穩定收集的組織中的ctRNA而不是血液中的ctRNA2天，更優選地至少5天，最優選地至少7天。當然，應該意識到的是，許多其他的除了收集試管（例如測試板、晶片、收集紙、盒等）之外的收集模式也被認為是合適的，並且ctDNA和/或ctRNA可以至少部分地純化或吸附到固相上以在進一步處理之前增加穩定性。

將容易理解的是，血漿的分餾以及cfDNA和/或cfRNA的提取可以以多種方式完成。在一個示例性的優選方面，將10 ml試管中的全血離心，以1600 rcf分餾血漿20分鐘。然後將得到的澄清的血漿部分分離，以16000 rcf離心10分鐘以除去細胞碎片。當然，只要離心不會導致大量的細胞裂解（例如裂解不超過1％，或不超過0.1％，或不超過0.01％，或不超過 所有細胞的0.001％），各種替代的離心方案也被認為是合適的。使用市售的Qiagen試劑從2 ml的血漿中提取ctDNA和ctRNA。例如，在分離了cfRNA的情況下，發明人使用了含有保留在過濾材料中的DNase的第二個容器。值得注意的是，cfRNA還包括miRNA（及其他調節RNA，如shRNA、siRNA以及基因內含子RNA）。因此，應當理解的是，所設想的組合物和方法也適用於分析來自全血的miRNA以及其他RNA。

而且，還應當認識到的是，設計的提取方案的目的是在提取過程中去除潛在的污染血細胞、其他雜質以及維持核酸的穩定性。將所有核酸保存在條形基質儲存管中，其中ctDNA儲存在-4℃並且ctRNA儲存在-80℃或逆轉錄為cDNA（例如使用諸如Maxima或Superscript VILO的商用逆轉錄酶），然後儲存在-4℃或冷藏在+ 2-8℃。值得注意的是，如此分離的ctRNA可以在進一步加工之前冷凍。

可預期的是，cfDNA和cfRNA可以包括源於或來自腫瘤細胞的任何類型DNA/RNA，所述腫瘤細胞在人的體液中循環而不被封閉在細胞體或細胞核中。雖然不希望受到特定理論的束縛，但可預期的是當腫瘤細胞與免疫細胞相互作用或當腫瘤細胞經歷細胞死亡（例如壞死、細胞凋亡、自噬等）時，cfDNA/cfRNA的釋放會增加。因此，在一些實施例中，cfDNA/cfRNA可以被封閉在泡狀結構（例如通過細胞質物質的外泌體釋放）中，從而能夠使其免於遭受某些類型的體液中的核酸酶（例如RNA酶）的活性。然而，也可預期的是在其他方面中，cfDNA/cfRNA是不被任何膜結構包封的裸DNA/RNA，但其本身可能是穩定的形式或通過與一個或多個非核苷酸分子（例如任何RNA結合蛋白等）相互作用而變成穩定的。

因此，cfDNA可包括任何完整或片段化的基因組DNA或線粒體DNA，並且cfRNA可包括mRNA、tRNA、微RNA、小干擾RNA（siRNA）、長鏈非編碼RNA（lncRNA）。最典型地，細胞游離DNA通常具有至少50鹼基對（bp）、100 bp、200 bp、500 bp或1 kbp長度的片段化DNA。此外，可預期的是，cfRNA是mRNA的全長或片段（例如至少全長的70％，至少全長的50％，至少全長的30％等）。在一些實施例中，ctDNA和ctRNA是可以對應於與基因部分相同或基本相似的片段（例如ctRNA序列的至少50％、至少70％、至少90％是與ctDNA序列互補等等）。在其他實施例中，ctDNA和ctRNA片段可以對應於基因的不同部分（例如，小於ctRNA序列的50％、小於ctRNA序列的30％、小於ctRNA序列的20％是與ctDNA序列互補等等）。儘管不那麼優選，但也可預期的是，可以從腫瘤細胞的不同基因得到ctDNA和細胞游離RNA。在一些實施例中，還考慮到ctDNA和cfRNA可以來自不同類型細胞的不同基因（例如來自腫瘤細胞的ctDNA和來自NK細胞的cfRNA等）。

雖然cfDNA/cfRNA可以包括編碼任何細胞、胞外蛋白質或非蛋白質分子的任何類型的DNA/RNA，但優選地，cfDNA/cfRNA中的至少一些編碼一種或多種癌症相關蛋白質，炎症相關蛋白質，DNA修復相關蛋白或RNA修復相關蛋白，所述蛋白質的突變、表現和/或功能可直接或間接與腫瘤形成、病灶轉移、免疫抑制性腫瘤微環境的形成、免疫躲避、上皮-間質轉換或在腫瘤細胞上的患者-特異性及腫瘤-特異性新表位的存在相關聯。還可預期的是，cfDNA / cfRNA可以源自一種或多種編碼細胞機械或結構蛋白的基因，包括但不限於看家基因、轉錄因數、阻遏物、RNA剪接機制或分子、轉譯因子、tRNA合成酶、RNA結合蛋白、核糖體蛋白、線粒體核糖體蛋白、RNA聚合酶、與蛋白質加工相關的蛋白、熱休克蛋白、細胞週期相關蛋白、與碳水化合物代謝有關的分子、脂質、檸檬酸循環、氨基酸代謝、NADH脫氫酶、細胞色素c氧化酶、ATP酶、溶酶體、蛋白酶體、細胞骨架蛋白和細胞器合成。因此，例如cfDNA/cfRNA可以源自下列基因，包括但不限於：ABL1、ABL2、ACTB、ACVR1B、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、AMER11、APC、AR、ARAF、ARFRP1、ARID1A、ARID1B、ASXL1、ATF1、ATM、ATR、ATRX、AURKA、AURKB、AXIN1、AXL、BAP1、BARD1、BCL2、BCL2L1、BCL2L2、BCL6、BCOR、BCORL1、BLM、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BTG1、BTK、EMSY、CARD11、CBFB、CBL、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD274、CD79A、CD79B、CDC73、CDH1、CDK12、CDK4、CDK6、CDK8、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CEA、CEBPA、CHD2、 CHD4、CHEK1、CHEK2、CIC、CREBBP、CRKL、CRLF2、CSF1R、CTCF、CTLA4、CTNNA1、CTNNB1、CUL3、CYLD、DAXX、DDR2、DEPTOR、DICER1、DNMT3A、DOT1L、EGFR、EP300、EPCAM、EPHA3、EPHA5、EPHA7、EPHB1、ERBB2、ERBB3、ERBB4、EREG、ERG、ERRFI1、ESR1、EWSR1、EZH2、FAM46C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCL、FAS、FAT1、FBXW7、FGF10、FGF14、FGF19、FGF23、FGF3、FGF4、FGF6、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FLCN、FLI1、FLT1、FLT3、FLT4、FOLH1、FOXL2、FOXP1、FRS2、FUBP1、GABRA6、GATA1、GATA2、GATA3、GATA4、GATA6、GID4、GLI1、GNA11、GNA13、GNAQ、GNAS、GPR124、GRIN2A、GRM3、GSK3B、H3F3A、HAVCR2、HGF、HNF1A、HRAS、HSD3B1、HSP90AA1、IDH1、IDH2、IDO、IGF1R、IGF2、IKBKE、IKZF1、IL7R、INHBA、INPP4B、IRF2、IRF4、IRS2、JAK1、JAK2、JAK3、JUN、MYST3、KDM5A、KDM5C、KDM6A、KDR、KEAP、KEL、KIT、KLHL6、KLK3、MLL、MLL2、MLL3、KRAS、LAG3、LMO1、LRP1B、LYN、LZTR1、MAGI2、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MCL1、MDM2、MDM4、MED12、MEF2B、MEN1、MET、MITF、MLH1、MPL、MRE11A、MSH2、MSH6、MTOR、MUC1、MUTYH、MYC、MYCL、MYCN、MYD88、MYH、NF1、NF2、NFE2L2、NFKB1A、NKX2-1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NPM1、NRAS、NSD1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUP93、PAK3、PALB2、PARK2、PAX3、PAX、PBRM1、PDGFRA、PDCD1、PDCD1LG2、PDGFRB、PDK1、PGR、PIK3C2B、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PLCG2、PMS2、POLD1、POLE、PPP2R1A、PREX2、PRKAR1A、PRKC1、PRKDC、PRSS8、PTCH1、PTEN、PTPN11、QK1、RAC1、RAD50、RAD51、RAF1、RANBP1、RARA、RB1、RBM10、RET、RICTOR、RIT1、RNF43、ROS1、RPTOR、RUNX1、RUNX1T1、SDHA、SDHB、SDHC、SDHD、SETD2、SF3B1、SLIT2、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMO、SNCAIP、SOCS1、SOX10、SOX2、SOX9、SPEN、SPOP、SPTA1、SRC、STAG2、STAT3、STAT4、STK11、SUFU、SYK、T (BRACHYURY)、TAF1、TBX3、TERC、TERT、TET2、TGFRB2、TNFAIP3、TNFRSF14、TOP1、TOP2A、TP53、TSC1、TSC2、TSHR、U2AF1、VEGFA、VHL、WISP3、WT1、XPO1、ZBTB2、ZNF217、ZNF703、CD26、CD49F、CD44、CD49F、CD13、CD15、CD29、CD151、CD138、CD166、CD133、CD45、CD90、CD24、CD44、CD38、CD47、CD96、CD 45、CD90、ABCB5、ABCG2、ALCAM、ALPHA-FETOPROTEIN、DLL1、DLL3、DLL4、ENDOGLIN、GJA1、OVASTACIN、AMACR、NESTIN、STRO-1 、MICL、ALDH、BMI-1、GLI-2、CXCR1、CXCR2、CX3CR1、CX3CL1、CXCR4、PON1、TROP1、LGR5、MSI-1、C-MAF、TNFRSF7、TNFRSF16、SOX2、PODOPLANIN、L1CAM、HIF-2 ALPHA、TFRC、ERCC1、TUBB3、TOP1、TOP2A、TOP2B、ENOX2、TYMP、TYMS、FOLR1、GPNMB、PAPPA、GART、EBNA1、EBNA2、LMP1、BAGE、BAGE2、BCMA、C10ORF54、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD30、CD33、CD80、CD86、CD123、CD276、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL17、CXCR3、CXCR5、CXCR6、CTAG1B、CTAG2、CTAG1、CTAG4、CTAG5、CTAG6、CTAG9、CAGE1、GAGE1、GAGE2A、GAGE2B、GAGE2C、GAGE2D、GAGE2E、GAGE4、GAGE10、GAGE12D、GAGE12F、GAGE12J、GAGE13、HHLA2、ICOSLG、LAG1、MAGEA10、MAGEA12、MAGEA1、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA4、MAGEA5、MAGEA6、MAGEA7、MAGEA8、MAGEA9、MAGEB1、MAGEB2、MAGEB3、MAGEB4、MAGEB6、MAGEB10、MAGEB16、MAGEB18、MAGEC1、MAGEC2、MAGEC3、MAGED1、MAGED2、MAGED4、MAGED4B、MAGEE1、MAGEE2、MAGEF1、MAGEH1、MAGEL2、NCR3LG1、SLAMF7、SPAG1、SPAG4、SPAG5、SPAG6、SPAG7、SPAG8、SPAG9、SPAG11A、SPAG11B、SPAG16、SPAG17、VTCN1、XAGE1D、XAGE2、XAGE3、XAGE5、XCL1、XCL2、XCR1、DCC、UNC5A、Netrin和IL-8。

在另一個實例中，cfDNA/cfRNA可以源自編碼一種或多種炎症相關蛋白質的基因，包括但不限於HMGB1、HMGB2、HMGB3、MUC1、VWF、MMP、CRP、PBEF1、TNF-α、TGF-β、PDGFA、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、Eotaxin、FGF、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IP-10、MCP-1、PDGF和hTERT，並且在另一個實例中，ctRNA編碼HMGB1的全長或片段。

還是在另一個實施例中，cfDNA/cfRNA可以源自編碼DNA修復相關蛋白或RNA修復相關蛋白的基因。表1提供了本文考慮的主要RNA修復基因及其相關修復途徑的示例性集合，但應認識到，本文還明確涵蓋與DNA修復和修復途徑相關的許多其他基因，表2和表3顯示了其他用於分析的示例性基因和它們在DNA修復中的相關功能。 表1 表2 表3

在另一個實例中，cfDNA / cfRNA可以源自與疾病不相關的基因（例如看家基因），所述基因包括與轉錄因數（例如ATF1、ATF2、ATF4、ATF6、ATF7、ATFIP、BTF3、E2F4、ERH、HMGB1、ILF2、IER2、JUND、TCEB2等），阻遏物（例如PUF60），RNA剪接（例如BAT1、HNRPD、HNRPK、PABPN1、SRSF3等），轉譯因子（EIF1，EIF1AD 、EIF1B、EIF2A、EIF2AK1、EIF2AK3、EIF2AK4、EIF2B2、EIF2B3、EIF2B4、EIF2S2、EIF3A等），tRNA合成酶（例如AARS、CARS、DARS、FARS、GARS、HARS、IARS、KARS、MARS等），RNA結合蛋白（例如ELAVL1等），核糖體蛋白（例如RPL5、RPL8、RPL9、RPL10、RPL11、RPL14、RPL25等），粒線體核糖體蛋白（例如MRPL9、MRPL1、MRPL10、MRPL11 、MRPL12、MRPL13、MRPL14等），RNA聚合酶（例如POLR1C、POLR1D、POLR1E、POLR2A、POLR2B、POLR2C、POLR2D、POLR3C等），蛋白質加工（例如PPID、PPI3、PPIF、CANX、CAPN1 、NACA、PFDN2、SNX2、SS41、SUMO1等），熱休克蛋白（例如HSPA4、HSPA5、HSBP1等），組蛋白（例如HIST1HSBC、H1FX等），細胞週期（例如ARHGAP35、RAB10、RAB11A、CCNY、CCNL、PPP1CA、RAD1、RAD17等），碳水化合物代謝（例如ALDOA、GSK3A、PGK1、PGAM5等），脂質代謝（例如HADHA），檸檬酸循環（例如SDHA、SDHB等），氨基酸代謝（例如COMT等） ，NADH脫氫酶（例如NDUFA2等），細胞色素c氧化酶（例如COX5B、COX8、COX11等），ATP酶（例如ATP2C1、ATP5F1等），溶酶體（例如CTSD，CSTB、LAMP1等），蛋白酶體（例如PSMA1、UBA1等），細胞骨架蛋白（例如ANXA6、ARPC2等）和細胞器合成（例如BLOC1S1、AP2A1等）相關。進一步設想，cfDNA/cfRNA可以來自對患病細胞或器官特異性的基因（例如PCA3、PSA等）或通常在癌症患者中發現的基因，包括KRAS中的各種突變（例如G12V、G12D、G12C等）或BRAF（例如V600E等）。

還可預期的是，ctDNA/ctRNA或cfRNA可以以修飾形式或不同的亞型存在。例如，ctDNA可能以甲基化或羥基甲基化存在，一些基因（例如GSTP1、p16、APC等）的甲基化水準可能是特定類型癌症的標誌（例如結腸直腸癌等）。ctRNA可以存在於與不同細胞類型和/或位置相關的多種亞型中（例如剪接變體等）。優選地，ctRNA的不同亞型可以是特定組織（例如腦、腸、脂肪組織、肌肉等）的標誌，或者可以是癌症的標誌（例如與對應的正常細胞相比，癌細胞中存在不同的亞型或在癌細胞中的不同亞型的比例與相應的正常細胞相比是不同的等）。例如，編碼HMGB1的mRNA可以存在於18種不同的可變剪接變體和2種未剪接形式中。所期望的那些亞型在患者身體的不同組織/位置表達（例如亞型A對前列腺具有特異性，亞型B對腦具有特異性，亞型C對脾具有特異性等）。因此，在這些實施例中，鑒定患者體液中ctRNA的亞型可以提供關於ctRNA的來源（例如細胞類型、組織類型等）的資訊。

或者或另外，本發明人考慮到ctRNA可包含調節性非編碼RNA（例如微RNA，小干擾RNA，長鏈非編碼RNA（lncRNA）），其量和/或亞型（或子類型）可因腫瘤的存在或針對腫瘤的免疫應答而改變或波動。不希望受任何具體理論的束縛，癌症患者體液中調節性非編碼RNA的不同表達可能是由於癌細胞的遺傳修飾（例如染色體部分的缺失，易位等）和/或免疫系統在癌組織發生炎症（例如通過啟動干擾素訊號和/或病毒感染來調節miR-29家族等）。因此，在一些實施例中，ctRNA可以是調節非編碼的RNA，其調節編碼癌症相關蛋白或炎症相關蛋白（例如HMGB1、HMGB2、HMGB3、MUC1、VWF，MMP、CRP、PBEF1、TNF-α、TGF-β、PDGFA、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL- 8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、Eotaxin、FGF、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IP-10、MCP- PDGF、hTERT等）的mRNA的表達（例如下調、沉默等）。

還可預期的是，一些細胞游離調控的非編碼的RNA可以存在於可能與不同細胞類型和/或位置相關的多種亞型或成員（例如miR-29家族的成員等）中。優選地，調控的非編碼的RNA的不同亞型或成員可以是特定組織（例如腦、腸、脂肪組織、肌肉等）的標誌，或可以是癌症的標誌（例如不同的亞型與相應的正常細胞相比存在於癌細胞中，或與相應的正常細胞相比存在於癌細胞中的不同亞型的比率是不同的等）。例如，在體液中miR-155的高表現量可以與乳腺癌相關聯，以及miR-155的減少的表現量可以與乳腺癌的尺寸減少相關聯。因此，在這些實施例中，鑒定患者體液中細胞游離調控非編碼的RNA的亞型可以提供關於細胞游離調控非編碼的RNA的來源（例如細胞類型、組織類型等）的資訊。

因此，應該理解的是，可針對特定疾病（例如不同類型的腫瘤或癌症等），疾病階段（早期階段，病灶轉移等），疾病狀態（例如內皮-間質轉化、免疫抑制、免疫應答喪失、腫瘤細胞分子譜改變、克隆性改變等），特異性突變，或者甚至基於個體突變譜或表達的新表位的存在選擇一種或多種所需的cfDNA/cfRNA。或者，在需要發現或觀測特定基因表達的新突變或變化的情況下，即時定量PCR可被RNAseq取代或添加以涵蓋至少部分患者轉錄組。此外，應該理解的是，分析可以靜態地進行或在一段時間內通過重複採樣以獲得動態畫面而不需要對腫瘤或病灶轉移進行活組織檢查。

一旦分離出cfDNA/fRNA，就可以使用任何合適的方法獲得各種類型的組學資料。DNA序列資料不僅包括與癌症或炎症相關的基因存在或不存在，而且還考慮基因突變的突變資料，拷貝數（例如以鑒別重複，等位基因缺失或雜合性缺失）和表觀遺傳狀態（例如甲基化，組蛋白磷酸化，核小體定位等）。關於RNA序列資料，應該注意的是，所考慮的RNA序列資料包括mRNA序列資料、剪接變體資料、聚腺苷酸化資訊等。此外，通常優選RNA序列資料還包括轉錄強度度量（例如每百萬總轉錄物中損傷修復基因的轉錄物數量，每個損傷修復基因的轉錄物總數的損傷修復基因的數量，每個肌動蛋白或其他家庭基因RNA的轉錄數量的損傷修復基因的轉錄物數量等）以及轉錄穩定性（例如聚合物A尾巴的長度等）。

關於轉錄強度（表現量），可以通過定量ctRNA或cfRNA來檢查cfRNA的轉錄強度。可以以多種方式進行cfRNA的定量，然而，優選通過利用每種基因特異性引物即時定量cfRNA的RT-PCR來測量分析物的表達。例如，可以使用含有2μL cfRNA，引物和探針的10μL反應混合物中的測定進行擴增。α-肌動蛋白或β-肌動蛋白的mRNA可以用作cfRNA輸入水準的內部對照。每個PCR板包含已知濃度的每個分析物的樣本標準曲線以及每個基因的陽性和陰性對照。通過在含有核酸的基質管上掃描2D條碼來識別測試樣品。通過將每個個體患者血液樣品的肌動蛋白Ct值減去每個分析物的定量PCR（qPCR）擴增得到的Ct值得到δCt（dCT）。患者樣本的相對表達使用RNA標準品UHRR(Universal Human Reference RNA)的系列稀釋物δCts標準曲線或已知用於表達感興趣基因設定為基因表達值10或一合適整數的另一種對照來計算，所述範圍允許特定患者樣本結果的範圍約為1至1000（當δCTs與每種分析物的對數濃度作圖對比時）。備選地和/或另外地，每個基因測試的δCts對log10相對基因表達（標準曲線）可以在數百個PCR反應板（歷史反應）上捕獲。可以對每個測定進行線性回歸分析，並用線性回歸分析來計算原始標準曲線前進中的每個點的基因表達。

可選地或另外地，在需要發現或觀測特定基因表達的新突變或改變的情況下，即時定量PCR可被RNAseq取代或添加以涵蓋至少部分患者轉錄組。此外，應該理解的是，分析可以靜態地進行或在一段時間內通過重複採樣以獲得動態畫面而不需要對腫瘤或病灶轉移進行活組織檢查。因此，除了RNA定量之外，可以進行cfRNA的RNA測序（直接或通過逆轉錄）以驗證同一性和/或鑒定轉錄後修飾，剪接變異和/或RNA編輯。為此目的，可以優選使用同步定位指導分析（例如使用美國專利公開號2012/0059670和/或2012/0066001等中的BAMBAM），將序列資訊與同一患者（另一患者，或參考RNA）的先前RNA序列進行比較。這樣的分析是特別有利的，因為這種被識別的突變可以針對患者特有的存在於患者的MHC I和/或II複合物中的新表位進行過濾，並且因此用作治療靶標。此外，還可以使用途徑模型和患者-和腫瘤-特異性突變來推斷腫瘤的生理參數來進一步表徵合適的突變。例如，特別合適的途徑模型包括PARADIGM（參見例如WO2011/139345、WO2013/062505）和類似模型（參見例如WO2017/033154）。而且，合適的突變對於癌細胞的亞群也可以是獨特的。因此，可基於患者和特定腫瘤（甚至病灶轉移），以及基於如治療靶標的適合性、基因的類型（例如癌症驅動基因），以及基於由該突變基因編碼的基因產物的受影響功能來選擇突變。

此外，本發明人考慮可以從患者的相同體液樣品中分離、檢測和/或定量多種類型的cfDNA和/或cfRNA，使得多個cfDNA和/或cfRNA的突變、數量和/或亞型之間的關係或關聯可以被確定用於進一步分析。因此，在一個實施例中，可以在一個基本相似的相間點從一個患者的單個體液樣品或多個體液樣品中檢測和定量多種cfRNA種類。在該實施例中，特別優選的是，至少一些cfRNA測量結果對於癌症相關核酸是特異性的。

因此，這樣獲得的一種或多種基因的cfDNA/cfRNA的組學資料資訊可以用於腫瘤的診斷，腫瘤預後的監測，監測提供給患者的治療的有效性，評估基於治療方案的成功的可能性的治療方案，甚至作為對患者進行重複和非侵入性取樣的發現工具。

例如，可以通過測量患者體液樣品中ctDNA和/或ctRNAs的總量來實現癌症的早期檢測，而不需要考慮特定的解剖學或腫瘤分子類型（例如，如國際專利申請PCT/US18/22747中所描述的，在此通過參考引入本文）。可預期的是，當總體cfDNA和/或cfRNA量達到特定或預定閾值時，可假定或推斷患者中癌症的存在。cfDNA和/或cfRNA量的預定閾值可以通過測量來自多個類似身體狀況（例如種族、性別、年齡、其他先天遺傳或疾病狀況等）的健康個體的總cfDNA和/或cfRNA量來確定。

例如，cfDNA和/或cfRNA量的預定閾值比健康個體的cfDNA和/或cfRNA量的平均值或中值數量多至少20％、至少30％、至少40％、至少50％。應該理解的是，這種早期檢測腫瘤的方法可以在沒有關於解剖或分子特徵或腫瘤的先驗知識或者甚至在腫瘤的存在的情況下進行。為了進一步獲得癌症特異性資訊和/或關於免疫系統狀態的資訊，可檢測和/或量化額外的cfRNA標誌物。最典型的是，這種額外的cfRNA標記將包括編碼如上所述的一種或多種致癌基因的cfRNA和/或編碼與免疫抑制或其他免疫逃避機制相關的蛋白的一種或多種cfRNA。在此類用途的其他標誌物中，特別期望的cfRNA包括編碼MUC1、MICA、brachyury和/或PD-L1的那些。

本發明人進一步設想，一旦腫瘤被鑒定或檢測，腫瘤的預後可通過在各種時間點監測cfDNA和/或cfRNA的類型和/或數量來監測。如所描述的，患者腫瘤基因中鑒定出患者-和腫瘤-特異性突變。一旦鑒定出來，從患者體液（通常是全血、血漿、血清）中分離出cfDNA和/或cfRNA，其中至少一種包含患者-和腫瘤-特異性突變，然後檢測和/或定量多個cfDNA和/或多個cfRNA的突變、數量和/或亞型。本發明人考慮從患者體液中檢測到的cfDNA和/或cfRNA的突變，數量和/或亞型可以是腫瘤的狀態、大小和位置的有力指標。例如，具有患者-和腫瘤-特異性突變的多個cfDNA和/或多個cfRNA的量的增加可以是在針對腫瘤細胞的免疫應答時增加的腫瘤細胞裂解的指標和/或是增加的具有突變的腫瘤細胞數量的指標。在另一個實施例中，增加的cfRNA與具有患者-和腫瘤-特異性突變的cfDNA（其中cfRNA和cfDNA源自具有該突變的相同基因）的比率可能說明，這樣的患者-和腫瘤-特異性突變會潛在地導致突變基因轉錄的增加觸發腫瘤發生或影響腫瘤細胞功能（例如與病灶轉移相關的免疫抗性等）。在另一個實施例中，具有患者-和腫瘤-特異性突變的ctRNA的增量以及另一種ctRNA（或非腫瘤相關cfRNA）的增量可能說明，另一種ctRNA可能與具有患者-和腫瘤-特異性突變的ctRNA具有相同的途徑，使得兩種ctRNA（或ctRNA和cfRNA）的表達或活性可以相互關聯（例如共同調節、一種影響另一種、另一種在通路中的另一種上游等）。

關於ctDNA，應該指出的是，自從它被用作癌症的診斷工具以來，診斷測試中ctDNA的準確性一直備受質疑。當依賴ctDNA監測疾病進展時，尤其是當考慮使用ctDNA預測疾病存在時，必須解決異常高的假陽性率的問題。如圖1所示，健康個體產生與癌症患者ctDNA總量相似的量，然而，健康個體的總cfRNA水準（例如通過使用β肌動蛋白定量測定）顯著較低。此外，當cfRNA分離方案在不導致大量細胞裂解的條件下進行時，癌症患者與健康個體之間的總cfRNA表現顯著不同。事實上，因為健康個體群之間沒有重疊，因此能夠通過癌症患者的cfRNA表現來區分癌症患者。相反，在癌症患者和健康個體中ctDNA表現之間存在重疊。因此ctDNA無法區分這兩個群體。在進一步考慮的方法中，應該理解的是，在cfRNA被全部分離的情況下，可以使用合適的DNA酶（例如使用DNA的柱上消化）來去除和/或降解cfDNA。同樣，在ctDNA被分離的情況下，可以使用適當的RNA酶將cfRNA去除和/或降解。此外，當在不導致大量細胞裂解的條件下進行分離方案時，cfRNA的線性檢測範圍（此處為PD-L1）是顯著的。

此外，cfDNA和/或cfRNA的類型和/或數量可能說明，可通過監測在不同的時間點的cfDNA和/或cfRNA的類型和/或數量來監測腫瘤的預後，病灶轉移的存在或進展，病灶轉移的可能性，癌症幹細胞的存在，免疫抑制性腫瘤微環境的存在，免疫細胞對抗腫瘤細胞的活性或毒性的增加或減少，或導致cfDNA/cfRNA身份或表達改變的腫瘤中的或腫瘤周圍的任何細胞、分子、結構或生物化學變化。

例如，考慮的分析將包括指示癌症或癌細胞的幹性指標的分析物和/或指示上皮至間充質轉變（EMT）指標的分析物的測試。在其他合適的分析物中，可以檢測編碼全部或部分DCC、UNC5A和/或Netrin的cfRNA和/或cfDNA以鑒定一種或多種癌細胞中的癌症幹細胞特徵。同樣，可以檢測編碼全部或部分IL-8、CXCR1和/或CXCR2的cfRNA和/或cfDNA以鑒定對EMT的傾向性。應該理解的是，這些示例性分析物在發育過程中在生理學上是鼠短尾突變體表型（brachyury）的「下游」，並且可能對EMT有顯著貢獻，這個作用很好地歸屬於brachyury。因此，brachyury也被認為特別適用於本文，特別是與以上示例性分析物結合使用。有利的是，靶向netrin連接蛋白的藥物與靶向brachyury（例如使用靶向brachyury的癌症病毒或酵母疫苗）的藥物組合可以具有顯著的治療（協同）作用。從另一個角度來看，針對上述示例性分析物的診斷方法將鑒定EMT的潛力，並因此鑒定對常規療法的轉移和抗性（因為已經經歷EMT的細胞通常對化療有抗性）。此外，並且進一步關注IL-8/CXCR1/CXCR2，應該理解的是，這樣的分析物也表明癌細胞採用的免疫抑制機制。例如，CXCR2配體（例如CXCL1、CXCL2、CXCL5和IL-8）吸引免疫抑制性的骨髓衍生抑制細胞（MDSC）。CXCR2在大多數循環的MDSC上表達並且是MDSC被募集至腫瘤微環境的先決條件。

在一些實施例中，可以檢測並分析至少兩種不同基因的cfRNA和/或cfDNA以確定腫瘤的狀態。這兩個不同的基因可能與共同的靶分子（例如由兩個不同基因編碼的蛋白質啟動的訊號分子等）有關，可能處於相同的信號傳導途徑中，可能受到共同的上游分子的影響（例如通過相同類型的激酶磷酸化啟動等），或受相同生理環境的影響（例如免疫抑制環境等）。因此，至少兩種不同基因的cfRNA和/或cfDNA可以來自相同細胞或相同類型的細胞（例如相同類型的腫瘤細胞等），或來自不同細胞類型（例如，一種cfRNA和/或cfDNA源自腫瘤細胞，另一種cfRNA和/或cfDNA源自腫瘤微環境中的免疫活性細胞或抑制性免疫細胞（例如MDSC細胞等）等）。

可預期的是，可以確定至少兩種不同基因的cfRNA和/或cfDNA之間的各種關係可以與癌症狀態相關聯。例如，CXCR1和CXCR2的cfRNAs的絕對量或絕對量之和（用看家基因的cfRNA標準化等）可以與免疫抑制性腫瘤微環境的存在和/或發展相關聯。在這樣的例子中，如果確定CXCR1和CXCR2 cfRNA量的總和高於預定量閾值（如與健康個體相比的絕對量增量或百分比增量），可以確定存在免疫抑制性腫瘤微環境或免疫抑制性腫瘤微環境的快速發展。在另一個例子中，兩種不同基因的cfRNA比例可能與免疫抑制性腫瘤微環境的存在和/或發展有關。例如FoxP3的cfRNA（調節性T細胞標誌物）和Ag1（Sca-1，其在啟動NK細胞後上調）的cfRNA比例，如果FoxP3的cfRNA和Ag1的cfRNA之間的比率是至少0.5，至少1，至少2，至少3，至少5或至少10的話，可以確定免疫抑制性腫瘤微環境的存在和/或發展。在另一個實例中，兩種不同基因的cfRNA的總和或比例可以與EMT的存在和/或發展或癌細胞幹細胞相關聯。例如當TGF-β1的cfRNA和FOXC2的cfRNA的總和高於預定閾值（如與健康個體相比絕對量增量或百分比增量等）時，TGF-β1的cfRNA和FOXC2的cfRNA的總和可以反映EMT的存在和/或發展或癌細胞幹細胞的存在和/或發展。這樣的例子還可以包括TGF-β1的cfRNA和E-鈣粘著蛋白的cfRNA的比例，當TGF-β1的cfRNA和E-鈣粘著蛋白的cfRNA的比例高於預定閾值（例如至少0.5，至少1，至少2，至少3，至少5，或至少10等）時，可以反映出EMT或癌細胞幹細胞的存在和/或發展。

另外地和/或可選地，本發明人考慮可以進一步鑒定和分析來自至少一個基因的cfDNA以確定癌症狀態。例如，cfDNA可以來自編碼鋅指E盒結合同源框轉錄因數1（Zeb1）的基因，其可以包括基因中的一個或多個突變以改變其對EGFR抑制劑的敏感性。在這樣的例子中，除了ZEB1的cfRNA的表達水準之外，還可以使用來源於ZEB1的cfDNA的核酸序列分析來確定癌症狀態。例如，源自ZEB1的cfDNA中的突變（無論該突變是否為已知的EMT突變）和ZEB1的cfRNA表達的增加可能與EMT的存在和/或發展或癌症幹細胞性強烈相關。在一些實施例中，突變的數量和/或位置以及表現增加的量可以被認為是獨立因素和/或具有確定EMT或癌症幹細胞的存在和/或發展的相同的權重的因素。在其他實施例中，突變的數量、類型和/或位置以及表達增加的水準可以被賦予不同的權重（例如cfRNA水準增加30％，至少比ZEB1外顯子中存在單點突變高兩倍，ZEB1外顯子中的錯義突變比ZEB1 cfRNA水準增加10％至少高50％，等等）。

此外，在一些實施例中，cfDNA/cfRNA分析的結果可以對體液樣品中胜肽或蛋白質的鑒定和/或定量進行補充。優選地，胜肽或蛋白質可以是來自腫瘤細胞、免疫細胞或腫瘤微環境中的任何其他細胞的任何分泌胜肽，其包括但不限於任何類型的細胞因數（例如IL-1、IL-2，IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-13、IL-17、IL-22、IL-25、IL-30、IL-33、IFN-等等），趨化因子（例如CCL2、CXCL14、CD40L、CCL2、CCL1、CCL22、CCL17、CXCR3、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL14、CXCR4等），受體配體（例如如MICA的NKG2D配體等）。例如，已知NKD2D配體（特別是可溶性NKG2D配體如MICA、MICB、MBLL和ULBP1-6）降低NK細胞和CTL的細胞毒性活性，並檢測和/或定量編碼NKG2D配體（特別是可溶性NKG2D配體）的ctRNA，且可溶性NKG2D的量可以反映腫瘤微環境的免疫抑制狀態，這可以支援FoxP3的cfRNA表達水準的增加和/或Ag1的表達水準的降低。例如，可溶性和/或外來體膜在蛋白質水準上結合NKG2D配體。可以以多種方法檢測，並且特別期望的方法包括ELISA測定和基於質譜的測定，其可以提供關於由於NK細胞上的NKG2D和T細胞上的NKG2D的下調所引起的潛在免疫抑制的額外資訊。

類似地，並且如下文更詳細討論的，編碼各種免疫調節因數（包括PD-1L）的其他ctRNA也被認為是合適的。合適的ctRNA分子也可編碼間接下調抗腫瘤免疫應答的蛋白質，因此預期的ctRNA包括編碼MUC1的那些。在進一步的實例中，考慮了編碼各種癌症標誌物基因的ctRNA。例如，在標誌物是EMT（上皮-間質轉換）的情況下，考慮的ctRNA可以編碼brachyury。在這些和其他情況下（特別是當存在分泌的抑制因子時），考慮在檢測到ctRNA時可以採取適當的治療行為（例如，這些可溶性因子的血漿去除等）。與本文提供的教導結合使用的進一步的方面和考慮在17年6月1日提交的WO 2016/077709，US 62/513706，在17年5月10日提交的US62/504149和在17年5月2日提交的US62/500497中描述，所有這些申請的全部內容通過參考併入本文。

應該理解的是，來自cfRNA定量的結果不僅可以用作產生所測量的cfRNA的特定細胞或細胞群的存在或不存在的指標，而且還可以用作這種細胞或細胞群狀態（例如與細胞分裂、壞死和/或細胞凋亡有關的遺傳、代謝）的附加指標，和/或腫瘤微環境狀態的指標。因此，本發明人進一步考慮了來自cfRNA定量的結果可以作為途徑分析和/或機器學習模型中的輸入資料被採用。例如，合適的模型包括那些在單個或多個途徑中預測途徑活性（或途徑組分的活性）的模型。因此，除轉錄組分析（例如通過RNAseq或cDNA或RNA陣列獲得）的RNA資料或作為RNA資料的替代外，量化的cfRNA也可用作模型和類比系統的輸入資料。

在一些實施例中，可以隨時間的推移確定cfRNA定量和/或cfDNA/cfRNA突變的鑒定。特別是隨著時間對cfRNA進行定量的情況下，通常優選對相同（以及在某些情況下新鑒定的）突變進行多於一次的測量。例如，隨著時間的推移多次測量可能有助於監測針對特定突變或新表位的治療效果。因此，這種測量可以在治療之前/期間和/或之後進行。在檢測到新突變的情況下，這樣的新突變通常位於不同的基因中，並且因此監測多種不同的cfRNA。

有利地，考慮的方法獨立於導致癌症或與癌症相關的先驗已知突變。更進一步，所設想的方法還允許監測克隆腫瘤細胞群以及用於預測採用免疫調節療法（例如檢查點抑制劑或細胞因子）的治療成功，並且尤其用於預測基於新表位的治療（例如使用DNA質粒疫苗和/或表達新表位或多表位元元的病毒或酵母表達系統）的成功。就此而言，還應該注意的是，可以使用考慮的系統和方法間接監測免疫療法的功效。例如，在患者接種了表達新表位或多表位的DNA質粒、重組酵母或腺病毒的情況下，可以檢測這些重組載體的ctRNA，並且從而驗證來自這些重組載體的轉錄。

此外，本發明人進一步考慮到在cfDNA/cfRNA中或來源於cfDNA/cfRNA的基因中cfRNA的表達增加以及突變（例如錯義突變、插入、缺失、各種融合或易位等）可能表明cfDNA/cfRNA可能來自編碼腫瘤抗原和/或患者-和腫瘤-特異性新表位的基因。最典型的是，患者-特性異表位對於患者是獨特的，並且因此可以產生患病細胞或細胞群（例如腫瘤的亞克隆部分）的獨特和患者-特異性標誌物。因此，應該特別理解的是，攜帶這種患者和腫瘤特異性突變的cfRNA不僅針對腫瘤的存在，而且針對特定腫瘤亞克隆的細胞（例如抗腫瘤治療）可作為替代標誌物。而且，當突變編碼患者和用作免疫療法靶標的腫瘤特異性新表位時，攜帶這種突變的cfRNA將能夠充當免疫療法治療功效的高度特異性標記。

因此，本發明人進一步考慮可基於癌症狀態和/或cfDNA和/或cfRNA的變化/類型來設計和/或確定治療方案。考慮可以基於癌症狀態和cfDNA和/或cfRNA的類型/數量確定治療方案成功的可能性。例如，在來自在細胞中表達的基因（例如腫瘤細胞，免疫細胞等）的cfRNA的量表明免疫抑制性腫瘤微環境，癌症幹細胞發育，病灶轉移發生或其他癌症狀態的一些實施例中，由衍生cfRNA的基因編碼的蛋白質或胜肽可被拮抗劑或任何其他類型的結合分子靶向以抑制胜肽的功能。因此，來自與免疫抑制性腫瘤微環境相關的基因的cfRNA的表達增加（例如高於預定閾值）意味著免疫抑制性腫瘤微環境的存在，並且還暗示與由與免疫抑制性腫瘤微環境有關的基因編碼的肽的拮抗劑具有通過抑制免疫抑制性腫瘤微環境並進一步促進針對這種微環境中的腫瘤細胞的免疫細胞活性來成功抑制癌症進展的高度可能性。任何適用於目標分子的拮抗劑都是可行的。例如，特定的激酶可以被激酶抑制劑作為靶向目標，或者特定的訊號受體可以被合成配體作為靶向目標，或特定檢查點受體可被合成拮抗劑或抗體作為靶向目標等。在來源於非編碼RNA的cfRNA的量增加的一些實施例中，治療方案可以包括任何針對非編碼RNA的抑制劑（例如諸如與miRNA具有互補序列的另一種miRNA的miRNA抑制劑等）。

此外，在cfDNA和/或cfRNA分析表明存在腫瘤細胞表達的新表位元的情況下，治療方案可以包括基於新表位的免疫治療。考慮了將新表位元作為靶向目標的任何合適的免疫療法，並且示例性免疫療法可以包括通過將分子（例如抗體、抗體片段、scFv等）結合到新表位上來靶向新表位的基於抗體的免疫療法以及基於細胞的免疫療法（例如，具有新表位特異性受體的免疫活性細胞等）。例如，基於細胞的免疫療法可以包括T細胞、NK細胞和/或NKT細胞，上述細胞表達了對來自具有患者-和腫瘤-特異性突變基因的新表位具有特異性的嵌合抗原受體。

本發明人進一步考慮，治療方案可以包括兩種或多種藥物組合物，所述兩種或多種藥物組合物將與兩種或多種cfRNA/cfDNA相關的兩種單獨的和/或不同的分子作為靶向目標，其中兩種或多種cfRNA/cfDNA顯示患者樣品中的變化。例如，患者樣品可能具有來自檢查點抑制相關基因（例如，PD-L1）的一種cfRNA的表達增加和分別來自CXCL1和CXCL2基因的另一種cfRNA的表達增加，這可能表明由MDSC細胞的補充和沉積引起的免疫抑制性腫瘤微環境。在這樣的實例中，治療方案可以包括檢查點抑制劑和針對CXCL1和/或CXCL2的抗體（或結合分子），其可以同時或基本同時（例如同一天等）給予患者，或者其可以分開地和/或有順序地施用（例如在不同的日子，在另一種治療的一系列施用完成後施用一次治療等）。

此外，還考慮到cfDNA和/或cfRNA可隨時間的推移（在不同時間點）被檢測、量化和/或分析以確定治療對患者的效果和/或患者的反應或患者腫瘤對治療的反應（例如發展抵抗力、感藥性等）。通常，從同一患者和同一體液隨時間的推移可獲得多次測量，並且至少第一個cfRNA在單個時間點或隨時間的推移可以被量化。在至少一另一個時間點，第二個cfRNA可以是量化，然後第一和第二量化數量可以與監測治療相關。在一些實施例中，第一和第二cfRNA是相同類型和/或來自相同基因的RNA以監測處理後相同類型cfRNA（例如PD-L1）的變化。在其他實施例中，第一和第二cfRNA可以是不同類型的RNA（例如，一種源自mRNA及另一種源自miRNA）和/或源自不同基因的RNA。例如，第一ctRNA源自腫瘤相關基因、腫瘤特異性基因、或涵蓋患者-和腫瘤特異性突變。在至少一個其他時間點上，可以量化第二cfRNA，並且第一和第二量化的數量可以與診斷和/或監測治療相關聯。在這樣的例子中，第二cfRNA也可以源自與患者免疫狀態相關的基因，例如檢查點抑制相關基因，細胞因子相關基因和/或趨化因數相關基因，或第二個cfRNA是一種miRNA。因此，考慮的系統和方法將不僅能夠監測特定的基因，還能夠監測免疫系統的狀態。例如，在第二種cfRNA源自檢查點受體配體或IL-8基因的情況下，免疫系統可能受到抑制。另一方面，當第二種cfRNA來源於IL-12或IL-15基因時，免疫系統可能被啟動。因此，測量第二種cfRNA可能會進一步反映治療。同樣，第二種cfRNA也可以源自第二次病灶轉移或亞克隆，並且可以用作治療功效的替代標誌物。就此而言，應該注意到的是，可以使用所述的系統和方法間接監測免疫療法的功效。例如，在患者接種了表達新表位或多表位的DNA質粒、重組酵母或腺病毒的情況下，可以檢測這些重組載體的cfRNA，並由此驗證來自這些重組載體的轉錄。

例如，如圖2所示，cfRNA（或ctRNA）總量的變化可能是對各種療法產生耐藥性的表明。患者＃16用截瘤達®/賀癌平®/賀疾妥®聯合治療。患者＃18用紫杉醇/卡鉑聯合治療。患者＃32用來曲唑/愛乳適聯合治療。患者＃4用氟維司群治療。患者＃5用復乳納/癌伏妥®聯合治療。通過RT-PCR測量用不同療法治療的5名患者的血漿中總ctRNA的表現量，所述表現量通過RT-PCR測量，通過β-肌動蛋白的表現量進行標準化。抽血大約在6週後進行。雖然治療後6週患者血清中ctDNA表現沒有顯著變化，但患者＃16、＃18、＃32和＃5中的總ctRNA表現顯著增加，表明給予這些患者的治療有效地攻擊了癌細胞或增加了針對癌細胞的免疫應答。同時，顯示在患者＃4中，治療後ctDNA表現和ctRNA表現均未顯著改變，表明對患者＃4施用氟維司群無效或患者＃4的癌細胞對氟維司群治療產生耐藥性。

在另一個實例中，如圖3所示，兩名選定患者（患者＃1和患者＃2）的PD-L1狀態（即PD-L1陽性或PD-L1陰性）的差異也與用IHC分析和對尼莫單抗的治療反應非常相關。在這裡，兩名鱗狀細胞肺癌患者用抗PD-1抗體尼莫單抗治療。使用cfRNA測量，患者1沒有在組織或血液中表達PD-L1，表明患者1對尼莫單抗沒有反應。CT掃描證實了瘤生長，患者迅速逝世。相比之下，使用cfRNA測量，患者2在組織和在基線處的血液中具有高表現的PD-L1。患者2對尼莫單抗的持久反應持續了數個藥物週期。通過CT掃描證實了該反應顯著縮小了腫瘤。有趣的是，患者血液中高表現的基因表達（通過cfRNA測量）在患者持續應答三週半後消失。如圖4所示，這種腫瘤縮小與從患者＃2獲得的RNA-seq和QPCR結果一致。如在q11和q21.32處或附近與該基因進行序列比對所示，在尼莫單抗響應中，患者＃2在治療前的PD-L1 ctRNA表達呈陽性。在來自同一患者（患者＃2）的第二次抽血（治療後3週）中，PD-L1 ctRNA表現量幾乎檢測不到（陰性），與由CT掃描補充證實的顯著的腫瘤縮小一致。

基於上述觀察到的相關性，發明人著手研究PD-L1 cfRNA的表現量是否可以提供適合於應答預測的閾值水準，所述應答為對用尼莫單抗或其他干擾PD1/PD-L1訊號的治療劑進行治療的應答。為此，使用cfRNA在NSCLC患者血漿中測量PD-L1表達，並與IHC狀態進行比較。圖5顯示了用抗PD-L1治療劑的治療反應狀態和通過IHC確定的PD-L1狀態之間的關係，以及通過cfRNA高於回應閾值的PD-L1表達。確定為治療回應者的患者也通過IHC確定為PD-L1陽性，而所有確定為非治療回應者的患者通過IHC確定為PD-L1陰性。值得注意的是，當應答閾值應用於資料時，使用PD-L1 cfRNA水準可以實現回應者和非回應者之間的相同分離。在這個例子中，相對表達閾值是10個準確分離的響應者和非回應者。

此外，發明人測量了PD-L1 cfRNA的表現量以確定癌症的進展或狀態。如圖6所示，在患者＃1中約350天監測用尼莫單抗治療的PD-L1 cfRNA的表現量，在患者＃2中約120天監測用尼單抗治療的PD-L1 cfRNA的表現量。相對穩定的PD-L1表現量對應於穩定的疾病狀態（SD）。隨後的PD-L1表現量升高可預測對尼莫單的耐藥性，其至少1.5個月後可通過CT掃描檢測到。

基於上述發現可準確定量cfRNA，本發明人試圖確定量化的cfRNA水準是否也與通過諸如FISH、質譜等常規方法測量的已知分析物水準相同。更具體地說，使用液體基因組學Dx測試來自320名連續NSCLC患者的血漿的cfRNAPD-L1表達的頻率和強度，及在主要試驗的派姆珠單抗（吉舒達®）的登記試驗中與使用組織IHC測試的陽性患者的頻率進行比較。值得注意的是，如圖7所示，主要試驗中66％的NSCLC患者（1,475/2,222）在IHC中（＞1％的細胞陽性）有PD-L1表達，64％的NSCLC患者（204/320）的PD-L1的基於血液的cfRNA檢測結果是陽性的。明顯地，兩種分析方法之間的PD-L1狀態沒有顯著差異，但cfRNA檢測提供了定量資料。

本發明人進一步研究了上述結果是否可以在各種其他癌症類型和所選基因（例如，PD-L1）中被證實，並且分析了來自被診斷患有乳腺癌，結腸癌，胃癌，肺癌和前列腺癌的選定患者的血液樣品。在這一系列測試中，定量了PD-L1cfRNA的相對表達，結果如圖8A所示。有趣的是，如圖2A所示，並非所有癌症都表達PD-L1，並且各種癌症中陽性的頻率與在實體組織中使用IHC公佈的PD-L1表達一致。如圖8B所示，在健康患者中未檢測到PD-L1 cfRNA。

在進一步研究乳腺癌樣品中，如圖9B所示，發明人還發現腫瘤中的HER2 cfRNA似乎與PD-L1共表達或共調控。另外，如圖9A所示，發明人還發現，至少在一些胃腫瘤中的HER2 cfRNA也似乎與PD-L1共表達或共調控。這種發現特別值得注意，因為已知大約15％的胃癌確實表達HER2。因此，發明人設想了檢測或定量胃癌患者中的HER2 cfRNA的方法。此外，本發明人還考慮到由cfRNA測量的一種或多種免疫檢查點基因（例如PD-L1、TIM3、LAG3）可用作其他癌症特異性標誌物或腫瘤相關標誌物（例如CEA、PSA、 MUC1、brachyury等）的可替代標誌物。

基於觀察到的共表達或共調控，發明人研究了免疫檢查點相關基因的其他cfRNA水準是否與PD-L1 cfRNA水準相關，並且在圖12中描繪了示例性結果。在此，從前列腺癌患者的血液樣品中測量PD-L1、TIM3和LAG3的cfRNA水準。值得注意的是，除一個樣本外，所有樣本的多於一個檢測點的相關基因均強烈表達。有趣而重要的是，TIM3和LAG3的水準中的TIM3水準已被證明可作為PD-1或抑制PD-L1的逃避機制或阻力因數，通常反映PD-L1表達，強調需要解決除了PD-1和PD-L1之外的所有檢查點的蛋白質。因此，應該認識到，免疫檢查點相關基因的cfRNA水準可以針對癌症患者進行分析以獲得免疫特徵或然後可以建議患者使用多於一個檢查點抑制藥物的適當治療。如將認識到的，根據針對上述PD-L1和HER2所述的方法可以建立適合的基因閾值。

此外，PCA3在測試中被限定為前列腺癌的標誌物，其中在來自前列腺癌患者的血漿中能夠檢測到並定量PCA3 cfRNA水準，而非前列腺癌患者樣品具有相對低至不可檢測水準。非前列腺癌患者是NSCLC和CRC患者。從圖13中可以看出，PCA3 cfRNNA在兩組之間表達差異（前列腺癌和非前列腺癌患者之間的非重疊中值），其表明非侵入性基於血液的cfRNA檢測可用於檢測前列腺癌。再次，基於測試人群的先驗知識，如圖13中示例性描繪的，可以建立表達閾值（此處為：與β-肌動蛋白相關的PCA3的△△CT＞10）。

可選地和/或另外地，也考慮了每個第一和第二cfRNA都是cfRNA組，其可以分別包含來自多個基因的多個cfRNA，其中它們中的一些可能是常見的。例如，第一cfRNA可以包括分別來自基因A、B和C的cfRNA，第二cfRNA可以包括分別來自基因A、D和E的cfRNA。在另一個示例中，第一cfRNA可以包括分別來自基因A、B和C的cfRNA，第二cfRNA可以包括分別來自基因D、E和F的cfRNA。因此，第一組cfRNA可能與免疫抑制性腫瘤微環境有關，第二組cfRNA可能與病灶轉移/EMT有關。

因此，應該理解，患者的cfRNA可以以任何適當的方式被鑒定、量化或以其他方式表徵。例如，考慮與基於血液的RNA表達檢測（cfRNA）有關的系統和方法可以識別、量化表達並能夠非侵入性監測疾病驅動因數（例如PD-L1和尼莫單抗或派姆單抗）的變化，其可單獨使用或與活檢組織的分析結合使用。這樣的以cfRNA為中心的系統和方法能夠監測疾病驅動因素的變化和/或鑒定可能與新出現的對化學療法的抗性相關的藥物靶標的變化。例如，一種或多種特定基因（例如來自腫瘤組織和/或T-淋巴細胞的突變或野生型）的cfRNA的存在和/或定量可以作為診斷工具來評估患者是否可以是對一種或多種檢查點抑制劑敏感，例如可以通過cfRNA對ICOS信號的分析來進行。

此外，可檢測各種可替代的cfRNA種類以量化區分健康個體與受癌症折磨的個體和/或預測治療反應。如圖10所示，雄激素受體基因可被轉錄成多個剪接變體，其中一個被翻譯成雄激素受體（AR-V7）蛋白的剪接變體7。檢測激素受體（AR-V7）的剪接變體7對於用激素療法治療前列腺癌來說是重要的。因此，本發明人通過檢測和定量AR-V7 cfRNA，研究了激素療法抗性是否與前列腺癌腫瘤生長和 AR-V7的檢測相關。圖11描繪了使用來自前列腺癌患者的血漿通過cfRNA方法進行的AR和AR-V7基因表達的示例性結果。還使用來自循環腫瘤細胞（來自相同患者的CTC）的IHC技術來測量AR-V7。值得注意的是，AR-V7的CTCs和cfRNA的結果是一致的。

此外，從另一個角度來看，本發明人還考慮了所述的系統和方法可以用於生成患者中腫瘤的突變標記。在該方法中，定量一種或多種cfRNA，其中導致那些cfRNA的至少一種基因包含患者-和腫瘤-特異性突變。與實體腫瘤的突變識別標記相比，這種識別標記可能特別有用，特別是在兩個特徵相對於同一患者的健康組織正常化的情況下。識別標記的差異可反映治療選擇和/或治療選擇成功的可能性。此外，還可以隨著時間的推移監測該識別標記以鑒定對治療看起來具有抗性或較不敏感的細胞亞群。這種突變識別標記也可用於鑒定可作為AND/NAND門控治療組合物中的訊號傳導和/或回饋訊號的一種或多種蛋白質，特別是膜結合蛋白或分泌蛋白的腫瘤特異性表達。這種組合物在共同未決的美國專利序號15/897816的申請中描述，在此通過引入併入本文。

在各種其他優點中，應當認識到，由於目標序列已經被預先識別，並且目標cfRNA可以使用簡單的血液測試容易地進行測量而不需要進行活檢，因此使用所述的系統和方法簡化了治療監測甚至患者的長期隨訪需要。在存在微轉移灶或腫瘤或轉移瘤位於防礙活檢的位置的情況下，這是特別有利的。此外，還應該理解的是，所述的組合物和方法獨立於關於導致癌症或與癌症相關的已知突變的先驗知識。更進一步，所設想的方法還允許監測克隆腫瘤細胞群以及預測免疫調節療法（例如檢查點抑制劑或細胞因數）治療的成功性，並且尤其是基於新表位的治療（例如使用DNA質粒疫苗和/或表達新表位或多表位元元的病毒或酵母表達系統）的成功性。

就預防和/或預防用途而言，考慮可以使用已知的cfDNA和/或cfRNA的鑒定和/或定量來評估癌症（或其他疾病或病原體的存在）的存在或風險。取決於檢測到的特定cfRNA，還考慮到cfDNA和/或cfRNA可以針對特定藥物或方案（例如手術、化學療法、放射療法、免疫治療療法、飲食療法、行為矯正）可能的治療結果提供指導等。類似地，可以使用定量cfRNA結果來測量腫瘤健康，修改患者中癌症的免疫治療性治療（例如定量序列並相應地改變治療目標）或評估治療功效。還可以將患者置於治療後診斷測試時間表上以監測患者復發或疾病和/或免疫狀態的改變。

因此，本發明人進一步設想，基於檢測、分析和/或定量的cfDNA和/或cfRNA，可以生成和推薦新的治療計畫或者可以更新先前使用的治療計畫。例如，可以基於ctDNA和/或ctRNA（來源於基因A）的檢測和在基因A中具有患者-和腫瘤-特異性突變的ctRNA的表達水準的增加來提供使用免疫療法來靶向由基因A編碼的新表位元的治療建議，所述基因A從患者的第一次血液樣本中獲得。在用抗體靶向由基因A編碼的新表位元來治療的1個月後，抽取第二血液樣品，並確定ctRNA水準。在第二次血液樣本中，基因A的ctRNA表達水準降低，而基因B的ctRNA表達水準升高。基於這樣的更新結果，可以更新治療建議以靶向由基因B編碼的新表位元。而且，可以更新患者記錄，使得靶向由基因A編碼的新表位元的治療有效減少腫瘤細胞表達由基因A編碼的新表位元的數量。

對於本領域技術人員來說顯而易見的是，在不脫離本文的發明構思的情況下，除了已經描述的那些以外，還可以有更多的修改。因此，本發明的主題在所附權利要求的範圍內是不受限制的。而且，在解釋說明書和權利要求書時，所有術語都應該以與上下文一致的最寬泛可能的方式來理解。具體而言，術語「包括」和「包含」應該被解釋為以非排他性方式指代元件、元件或步驟，指示所提及的元件、元件或步驟可以存在、或被利用、或與未明確引用的其他元素、元件或步驟組合。在說明的權利要求涉及選自A、B、C、...N中的至少一項的情況下，文本應該被解釋為只需要來自該組的一個元素，而不是A+N或B+N等。

無

圖1示出了健康的受試者和診斷有癌症的受試者的cfDNA和cfRNA的血漿濃度圖。 圖2示出了在各種治療中進展的患者血漿中ctRNA的表現量圖。 圖3示出了對尼莫單抗（Nivolumab）的無應答及應答的PD-L1 cfRNA水準的圖以及肺腫瘤樣品的相應IHC染色在治療期間隨著PD-L1 cfRNA水準變化的圖。 圖4示出在患者中尼莫單抗治療時PD-L1 ctRNA的存在示意圖。 圖5示出了通過PD-L1 IHC確定的PD-L1 cfRNA水準與PD-L1狀態相關聯的圖。 圖6示出了在兩個接受尼莫單抗治療的患者之間PD-L1 cfRNA表達的比較圖。 圖7示出了在臨床治療中用於肺癌患者的相關PD-L1 cfRNA表達的圖以及一張總結資料的圖表。 圖8A示出了分別與各種不同癌症類型或分別與健康個體比較的PD-L1 cfRNA的血漿濃度圖。 圖8B示出了健康受體的PD-L1 cfRNA血漿濃度圖。 圖9A示出了通過cfRNA水準測量的在胃癌中的相關PD-L1和HER2的聯合表達。 圖9B示出了通過cfRNA水準測量的PD-L1和HER2的相關聯合表達。 圖10示出了雄激素受體剪接變體7（AR-V7）的示意圖。 圖11示出了在前列腺癌患者中AR-V7 cfRNA水準和AR cfRNA水準的示例性結果，表明AR-V7 cfRNA是合適的標記物。 圖12示出了通過cfRNA水準測量的在多個前列腺癌患者中的LAC-3、PD-L1、TIM-3的相關聯合表達。 圖13示出了在前列腺癌患者中與非前列腺癌患者相比的PCA3 cfRNA表達圖。

Claims (22)

1. 一種生成或更新患有癌症或懷疑患有癌症的個體的病歷的方法，係包括： 獲得個體的體液樣品； 確定樣品中cfRNA及ctRNA中的至少一種的量，其中cfRNA和ctRNA中的至少一種來自一癌症相關的基因； 將cfRNA和ctRNA中的至少一種的量與癌症狀態相關聯，其中癌症狀態選自由下列組成的組：存在病灶轉移、存在癌症幹細胞、存在免疫抑制性腫瘤微環境以及增加或減少的免疫活性細胞對抗癌症的活性；以及 基於癌症狀態生成或更新患者病歷。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該癌症相關的基因是癌症關聯基因、癌症特異性基因、癌症驅動基因、或編碼患者和腫瘤特異性新生表位的基因。
3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該癌症相關的基因選自由下列組成的組：ABL1、ABL2、ACTB、ACVR1B、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、AMER11、APC、AR、ARAF、ARFRP1、ARID1A、ARID1B、ASXL1、ATF1、ATM、ATR、ATRX、AURKA、AURKB、AXIN1、AXL、BAP1、BARD1、BCL2、BCL2L1、BCL2L2、BCL6、BCOR、BCORL1、BLM、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BTG1、BTK、EMSY、CARD11、CBFB、CBL、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD274、CD79A、CD79B、CDC73、CDH1、CDK12、CDK4、CDK6、CDK8、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CEA、CEBPA、CHD2、CHD4、CHEK1、CHEK2、CIC、CREBBP、CRKL、CRLF2、CSF1R、CTCF、CTLA4、CTNNA1、CTNNB1、CUL3、CYLD、DAXX、DDR2、DEPTOR、DICER1、DNMT3A、DOT1L、EGFR、EP300、EPCAM、EPHA3、EPHA5、EPHA7、EPHB1、ERBB2、ERBB3、ERBB4、EREG、ERG、ERRFI1、ESR1、EWSR1、EZH2、FAM46C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCL、FAS、FAT1、FBXW7、FGF10、FGF14、FGF19、FGF23、FGF3、FGF4、FGF6、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FLCN、FLI1、FLT1、FLT3、FLT4、FOLH1、FOXL2、FOXP1、FRS2、FUBP1、GABRA6、GATA1、GATA2、GATA3、GATA4、GATA6、GID4、GLI1、GNA11、GNA13、GNAQ、GNAS、GPR124、GRIN2A、GRM3、GSK3B、H3F3A、HAVCR2、HGF、HNF1A、HRAS、HSD3B1、HSP90AA1、IDH1、IDH2、IDO、IGF1R、IGF2、IKBKE、IKZF1、IL7R、INHBA、INPP4B、IRF2、IRF4、IRS2、JAK1、JAK2、JAK3、JUN、MYST3、KDM5A、KDM5C、KDM6A、KDR、KEAP、KEL、KIT、KLHL6、KLK3、MLL、MLL2、MLL3、KRAS、LAG3、LMO1、LRP1B、LYN、LZTR1、MAGI2、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MCL1、MDM2、MDM4、MED12、MEF2B、MEN1、MET、MITF、MLH1、MPL、MRE11A、MSH2、MSH6、MTOR、MUC1、MUTYH、MYC、MYCL、MYCN、MYD88、MYH、NF1、NF2、NFE2L2、NFKB1A、NKX2-1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NPM1、NRAS、NSD1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUP93、PAK3、PALB2、PARK2、PAX3、PAX、PBRM1、PDGFRA、PDCD1、PDCD1LG2、PDGFRB、PDK1、PGR、PIK3C2B、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PLCG2、PMS2、POLD1、POLE、PPP2R1A、PREX2、PRKAR1A、PRKC1、PRKDC、PRSS8、PTCH1、PTEN、PTPN11、QK1、RAC1、RAD50、RAD51、RAF1、RANBP1、RARA、RB1、RBM10、RET、RICTOR、RIT1、RNF43、ROS1、RPTOR、RUNX1、RUNX1T1、SDHA、SDHB、SDHC、SDHD、SETD2、SF3B1、SLIT2、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMO、SNCAIP、SOCS1、SOX10、SOX2、SOX9、SPEN、SPOP、SPTA1、SRC、STAG2、STAT3、STAT4、STK11、SUFU、SYK、T (BRACHYURY)、TAF1、TBX3、TERC、TERT、TET2、TGFRB2、TNFAIP3、TNFRSF14、TOP1、TOP2A、TP53、TSC1、TSC2、TSHR、U2AF1、VEGFA、VHL、WISP3、WT1、XPO1、ZBTB2、ZNF217、ZNF703、CD26、CD49F、CD44、CD49F、CD13、CD15、CD29、CD151、CD138、CD166、CD133、CD45、CD90、CD24、CD44、CD38、CD47、CD96、CD 45、CD90、ABCB5、ABCG2、ALCAM、ALPHA-FETOPROTEIN、DLL1、DLL3、DLL4、ENDOGLIN、GJA1、OVASTACIN、AMACR、NESTIN、STRO-1 、MICL、ALDH、BMI-1、GLI-2、CXCR1、CXCR2、CX3CR1、CX3CL1、CXCR4、PON1、TROP1、LGR5、MSI-1、C-MAF、TNFRSF7、TNFRSF16、SOX2、PODOPLANIN、L1CAM、HIF-2 ALPHA、TFRC、ERCC1、TUBB3、TOP1、TOP2A、TOP2B、ENOX2、TYMP、TYMS、FOLR1、GPNMB、PAPPA、GART、EBNA1、EBNA2、LMP1、MICA、MICB、MBLL、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、BAGE、BAGE2、BCMA、C10ORF54、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD30、CD33、CD80、CD86、CD123、CD276、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL17、CXCR3、CXCR5、CXCR6、CTAG1B、CTAG2、CTAG1、CTAG4、CTAG5、CTAG6、CTAG9、CAGE1、GAGE1、GAGE2A、GAGE2B、GAGE2C、GAGE2D、GAGE2E、GAGE4、GAGE10、GAGE12D、GAGE12F、GAGE12J、GAGE13、HHLA2、ICOSLG、LAG1、MAGEA10、MAGEA12、MAGEA1、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA4、MAGEA5、MAGEA6、MAGEA7、MAGEA8、MAGEA9、MAGEB1、MAGEB2、MAGEB3、MAGEB4、MAGEB6、MAGEB10、MAGEB16、MAGEB18、MAGEC1、MAGEC2、MAGEC3、MAGED1、MAGED2、MAGED4、MAGED4B、MAGEE1、MAGEE2、MAGEF1、MAGEH1、MAGEL2、NCR3LG1、SLAMF7、SPAG1、SPAG4、SPAG5、SPAG6、SPAG7、SPAG8、SPAG9、SPAG11A、SPAG11B、SPAG16、SPAG17、VTCN1、XAGE1D、XAGE2、XAGE3、XAGE5、XCL1、XCL2、XCR1、DCC、UNC5A、Netrin和IL8。
4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該癌症相關的基因具有一患者-特異性突變和一患者-和腫瘤-特異性突變。
5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該ctRNA和cfRNA中的至少一種是編碼患者-特異性和癌症-特異性新表位的癌症相關的基因的一部分。
6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中確定量化的步驟包括在一定條件下分離該cfRNA和ctRNA中的至少一種，並且使用RNA穩定劑以基本上避免細胞裂解。
7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該cfRNA和ctRNA中的至少一種的量是通過cDNA的即時定量PCR確定的，該cDNA由該cfRNA和ctRNA中的至少一種製備。
8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，還包括確定該樣品中的所有cfRNA和ctRNA的總量，以及選擇性地將確定的總量與癌症的存在或缺失關聯。
9. 如申請專利範圍第1項所述之方法，還包括確定樣品中的腫瘤相關胜肽的存在和腫瘤相關胜肽的量中的至少一個。
10. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該腫瘤相關胜肽是可溶性NKG2D。
11. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該癌症相關的基因編碼檢查點抑制相關基因、上皮-間質轉換相關基因、免疫抑制相關基因中的至少一個。
12. 如申請專利範圍第1項所述之方法，還包括確定樣品中cfRNA及ctRNA中的至少兩種的量，其中cfRNA和ctRNA中的至少兩種來自兩種不同的癌症相關的基因。
13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，還包括 確定cfRNA和ctRNA中的至少兩種的量之間的比率；以及 將該比率與癌症狀態相關聯。
14. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該cfRNA和ctRNA中的至少兩種包括該樣品中的至少一種cfRNA和至少一種ctRNA，其中至少一種cfRNA源自免疫細胞。
15. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該免疫細胞是抑制免疫細胞。
16. 如申請專利範圍第1項所述之方法，還包括確定ctRNA和ctRNA中的至少一種的核酸序列。
17. 如申請專利範圍第16項所述之方法，還包括檢測cfDNA和ctDNA中的至少一種，其中該cfDNA和ctDNA中的至少一種源自相同的基因，該cfRNA和ctRNA中的至少一種源自該相同的基因。
18. 如申請專利範圍第17項所述之方法，還包括： 確定cfDNA和ctDNA中的至少一種的核酸序列中的突變； 將該突變和cfRNA和 ctRNA中的至少一種的量，與癌症相關聯。
19. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中cfRNA和ctRNA中的至少一種是非編碼調控RNA。
20. 如申請專利範圍第1項所述之方法，還包括：根據癌症狀態選擇治療方案。
21. 如申請專利範圍第20項所述之方法，其中該治療方案包括：當源自該癌症相關的基因的cfRNA和ctRNA中的至少一種增長時，一種靶向由該癌症相關的基因編碼的胜肽的一部分的治療。
22. 如申請專利範圍第20項所述之方法，其中該cfRNA和ctRNA中的至少一種是miRNA，以及該治療方案是該miRNA的抑制劑。