TW201843306A - 腫瘤與配對的正常cfRNA - Google Patents
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Abstract
本發明公開了用於分離及使用cfRNA之組合物及方法。最佳地,該cfRNA包括一患者與腫瘤特異性突變,及/或編碼與免疫反應或免疫抑制相關的一基因。cfRNA的鑑定及/或量可進一步用於診斷腫瘤、監測腫瘤的預後、監測提供給該患者的治療的有效性、基於一治療方案成功的可能性評估該治療方案,以及甚至能夠作為對一患者進行重複及非侵入性採樣的發現工具。
Description
本發明之領域為分析核酸,特別是使用無細胞RNA (cell free RNA, cfRNA)來管理、監測,及/或修改被診斷患有一腫瘤之一患者的治療。
背景描述包括可用於理解本發明之資訊。這並非承認本文提供的任何資訊為現有技術或與現在請求保護的發明相關,或者明確或暗示地引用的任何出版物為現有技術。
本文中所有的出版物及專利申請透過引用的方式併入,其程度如,同每個單獨的出版物或專利申請被具體地並單獨地指示為透過引用方式併入。當併入的參考文獻中的術語之定義或使用與本文提供的術語之定義不一致或相反時,適用本文提供的術語之定義,且不適用在該參考文獻中的該術語之定義。
多年來,無細胞DNA (cell-free DNA, cfDNA)就是已知的,並且自生物體液中被描述特徵,而且cfDNA已被用於診斷癌症以及監測癌症對一治療的反應。最近,分子遺傳學的進展不僅能夠檢測到相對較低量的cfDNA,還能夠鑑定突變的cfDNA。由於獲得cfDNA的方式很便利,循環核酸的分析已成為一種在癌症診斷與治療中具有吸引力的工具。然而,cfDNA分析在一定程度上受到限制,因為獲得的資訊並不提供關於實際轉譯(即,相應蛋白質的存在)或一基因表現量的觀察。
為了規避至少一些與cfDNA相關的難題,近來已開發了用於檢測及分析無細胞RNA (cfRNA)的組合物及方法,並且在PCT專利公開號WO 2016/077709中發現某些方法。雖然從各種角度檢測cfRNA是令人期望的,但仍然存在許多難題。在其他因素中,由於cfRNA相對較少,因此cfRNA檢測需要對一患者的腫瘤具有顯著的敏感性與特異性。由於循環腫瘤RNA (circulating tumor RNA, ctRNA)的片段可能僅代表在血液或其他生物體液中總cfRNA的一小部分,這樣的事實進一步加劇了在疾病(特別是癌症)分析中的這種挑戰。
為了避免這些難題,被選上的cfRNA測試集中於檢測對某些腫瘤特異性的已知標記。例如,授與Kuslich的美國專利第9,469,876號以及授與Shelton的美國專利第8,597,892號討論了檢測與在血液中循環囊泡相關的循環微小RNA生物標記以診斷特定類型的癌症(例如,前列腺癌等)。於另一實施例中,授與Kopreski的美國專利第8,440,396號公開了檢測編碼腫瘤相關抗原的基因之循環mRNA片段,該腫瘤相關抗原已知為數種類型的癌症(例如,黑素瘤、白血病等)的標記物。然而,這種方法在確定癌症患者的預後方面經常受到限制,因為並非所有腫瘤都具有可透過cfRNA方便監測的通用標記(例如,HER2、PSA等),而且並非所有患有相同或相似類型癌症的患者甚至可以相同的方式表現相同類型的標記基因。
因此,儘管本領域已知有許多實施、監測以及改變癌症治療的方法,但幾乎所有方法都具有各種缺點。因此,仍需要改進的系統及方法以實現cfRNA的週期性、非侵入性,以及高度特異性分析。
本發明主題涉及用於分析cfRNA的各種組合物及方法,特別是涉及腫瘤治療的實施、監測及/或改變。設想的cfRNA較佳包括具有患者與腫瘤特異性突變的cfRNA,但也包括miRNA以及其他調節性RNA分子,包括較佳對一腫瘤特異的siRNA、shRNA以及內含子RNA。
於本發明主題之一方面,發明人設想了在一患者中監測癌症之方法,其包括鑑定該患者的腫瘤基因中的一患者與腫瘤特異性突變的步驟。於另一步驟中,自該患者體內獲得一體液,並且在更進一步的步驟中,在該患者的體液中定量一包含該患者與腫瘤特異性突變的cfRNA。
最典型地,在一基因中的該患者與腫瘤特異性突變可透過比較來自同一患者的腫瘤組織與正常組織的一個或多個體學(omics)數據來鑑定。較佳地,體學數據包括全基因體序列數據、外顯體序列數據、轉錄體序列數據,及/或蛋白質體序列數據中的至少一個。較佳地,以增量同步的方式比較該體學數據。於一些具體實施例中,這樣鑑定的患者與腫瘤特異性突變可與路徑模型(例如,PARADIGM)一起用於推斷該腫瘤的生理參數(例如,該腫瘤對一藥物的敏感性),以及以經驗數據向該路徑模型提供回饋。
關於該患者與腫瘤特異性突變,設想此類突變可能編碼一新抗原決定位,其可能衍生自一癌症驅動基因。此外,該患者與腫瘤特異性突變也可能與該腫瘤內的癌細胞的選殖株群體相關聯,而能夠監測在同一患者中不同的癌細胞亞群。當然,還應該認識到,可以在治療期間或治療之前/之後重複設想之方法的一個或多個步驟(例如,獲得該體液的步驟以及定量該cfRNA的步驟)。在這種情況下,鑑定該患者與腫瘤特異性突變的步驟因此可鑑定一第二基因中的一第二患者與腫瘤特異性突變,然後其可用於定量一包含該第二患者與腫瘤特異性突變的cfRNA。
另外,通常較佳的體液為血清或血漿。在這樣的具體實施例中,定量步驟還較佳地包括在一定條件下並且使用大量避免細胞溶解的RNA穩定劑自該體液中移除細胞之步驟。然後可以使用由該cfRNA製備的cDNA的即時定量PCR來進行定量。如,果需要,可以將從該體液分離的至少一些體液或cfRNA或從該cfRNA製備的cDNA存檔。例如,cfRNA可以在-80°C冷凍,而cDNA可以在-4°C冷凍或在+2-8°C冷藏。設想的方法還可能包括利用與該cfRNA的量有關的一腫瘤預後的指示來產生或更新一患者記錄,及/或將一治療選項及/或該治療選項的成功可能性與一數量的定量cfRNA關聯化之步驟。
因此,並且從不同的角度來看,本案發明人還設想了一種監測在一患者中的一癌症之方法,該方法包括在複數個相應時間點自該患者獲得複數個體液樣本之步驟,以及進一步定量在該患者體液的每個樣品中的一第一cfRNA之步驟,其中該第一cfRNA包含該患者的一腫瘤的一基因中的一第一患者與腫瘤特異性突變。
於本發明主題的一些方面,所設想的方法可以進一步包括鑑定在該患者的該腫瘤的一第二基因中的一第二患者與腫瘤特異性突變之步驟,以及量化在該患者的該體液中的一包含該第二患者與腫瘤特異性突變的一第二cfRNA之另一步驟。最典型地,透過比較來自同一患者的腫瘤組織以及正常組織的體學數據(例如,全基因體序列數據、外顯體序列數據、轉錄體序列數據,及/或蛋白質體序列數據),以鑑定該第一以及第二患者與腫瘤特異性突變中的至少一個。在希望的或實際的情況下,該體學數據較佳透過增量同步比對進行比較。此外,可以使用一路徑模型(例如,PARADIGM)以及該患者與腫瘤特異性突變來推斷該腫瘤的一生理參數(例如,腫瘤對一藥物的敏感性)。
如,前所述,該第一以及第二患者與腫瘤特異性突變中的至少一個可編碼一新抗原決定位,及/或位於一癌症驅動基因中,及/或可與在該腫瘤內的癌細胞的一選殖株群體相關聯。亦如,前所述,通常在對該患者提供一治療方案的期間及/或之前/之後,可以重複該獲得體液之步驟以及該定量該第一及/或第二cfRNA之步驟。
在本發明主題的其他方面,這樣的方法還可以包括鑑定該患者的該腫瘤的一第二基因之步驟,以及進一步對來自在該患者的該體液中的該第二基因的一第二cfRNA進行定量之步驟。較佳地,該第二基因可為一癌症驅動基因、一癌症相關基因,或一癌症特異性基因。或者,該第二基因也可為被確定為相對於該同一患者的一正常組織,在該患者的該腫瘤中過高表現或過低表現的一基因。在更進一步設想之方面,該第二基因可為一檢查點抑制相關基因、一細胞因子相關基因,以及一趨化因子相關基因中的至少一個。
於本發明主題之更進一步的方面中,本案發明人還設想了一種確定在一患者中的突變標記之方法。該方法包括定量在該患者的一體液中的第一以及第二基因的cfRNA之步驟,其中該第一以及第二基因中的至少一個包含一患者與腫瘤特異性突變。較佳地,在該第一或第二基因中的患者與腫瘤特異性突變中的至少一種可編碼一新抗原決定位。
於一些具體實施例中,該第一以及第二基因可為相同類型的基因。於其他具體實施例中,該第一以及第二基因可為不同類型的基因。例如,該第一基因為一癌症驅動基因,而該第二基因可為一免疫狀態相關基因(例如,檢查點抑制相關基因、一編碼一細胞因子的基因,或一編碼一趨化因子的基因)。在需要的情況下,該定量該cfRNA的步驟可在治療之前或期間(例如,使用一檢查點抑制劑、一免疫治療藥物、一化學治療藥物,及/或放射治療)進行。
於本發明主題之另一方面,本案發明人設想了一種cfRNA收集套組。該套組包含一第一容器(較佳用於收集血液),其包含一RNA酶抑制劑、一防腐劑、一代謝抑制劑,以及一螯合劑,其中該第一容器適用於在16,000的相對離心力下離心;以及一第二容器(較佳用於cfRNA的分離/純化),其包含一選擇性結合或降解cfDNA之材料。
在一較佳具體實施例中,該RNA酶抑制劑可包含金三羧酸,該防腐劑可包含二唑烷基脲,該代謝抑制劑可包含甘油醛以及氟化鈉中的至少一種,及/或該螯合劑可包含EDTA。此外,通常較佳為該第一容器進一步包含一血清分離凝膠,而該第二容器包含一不含RNase的DNA酶。於進一步特別較佳之方面,該第一以及第二容器被構造成允許由機器人處理。
此外,本案發明人還設想了一種分離cfRNA之方法。該方法包括以一第一相對離心力(relative centrifugal force, RCF)離心全血以獲得一血漿分段之步驟,在一第二RCF下離心該血漿分段以獲得一澄清的血漿分段之步驟,以及使得至少一部分的該澄清的血漿分段進行一DNA降解步驟以降解ctDNA與基因體DNA (genomic DNA, gDNA)之另一步驟。
最典型地,該離心全血之步驟在如,上所述的一RNA酶抑制劑、一防腐劑、一代謝抑制劑,以及一螯合劑的存在下進行。此外,通常較佳為在保持細胞組成分完整性的情況下進行該離心全血之步驟。例如,該第一RCF可為介於700與2,500之間(例如,1,600),及/或該第二RCF可為介於7,000與25,000之間(例如,16,000)。設想在該第一RCF下的離心進行15-25分鐘(例如,20分鐘),而且在該第二RCF下的離心進行5-15分鐘(例如,10分鐘)。如,果想要或需要,cfRNA可儲存於-80°C,及/或由cfRNA製備的cDNA可儲存於-4°C或冷藏於+2-8°C。
根據以下對較佳具體實施例的詳細描述,本發明主題的各種目的、特徵、方面以及優點將變得更加明顯。
本案發明人設想到腫瘤細胞及/或與該腫瘤細胞相互作用或圍繞該腫瘤細胞的一些免疫細胞釋放無細胞DNA及/或RNA,更具體地釋放無細胞腫瘤DNA (cell free tumor DNA, ctDNA)及/或RNA (ctRNA),到該患者的體液,因此相較於一健康的個體,可以增加在該患者的體液中的該特定ctRNA的量。有鑑於此,本案發明人現已發現ctDNA及/或ctRNA,特別是具有患者與腫瘤特異性突變的ctRNA,可作為一靈敏的、具有選擇性的,以及定量的標記,以用於診斷腫瘤、監測該腫瘤預後、監測提供給該患者的治療之有效性、基於一治療方案成功的可能性評估該治療方案,以及甚至作為能夠對一患者進行重複且非侵入性採樣的發現工具。在這種情況下,應當注意的是,該總cfRNA將包括ctRNA,其中該ctRNA可具有一患者與腫瘤特異性突變,且因此可與健康細胞的相應cfRNA區分,或者其中該ctRNA可以在腫瘤中選擇性地表現,而不在相應的健康細胞中表現。
從不同的角度來看,本案發明人因此發現各種核酸,更具體而言為cfDNA及/或cfRNA,可被選擇用於檢測及/或監測一特定疾病(例如,腫瘤、癌症等)、疾病階段、該疾病的進展、在一特定患者中的一治療方案的治療反應/有效性,以及甚至在治療開始之前設想一治療方案在一特定患者中的治療反應/有效性。
據此,在本發明主題的一個特別較佳之方面,本案發明人設想了使用cfDNAs及/或cfRNAs,特別是ctDNAs及/或ctRNAs,以監測在一患者中的一癌症之方法。在該方法中,自該患者的一腫瘤中鑑定出在一基因中的一患者與腫瘤特異性突變。然後,可以分析及/或定量從該患者的體液獲得的ctDNA/RNA以確定該癌症的預後。最佳地,該ctDNA/ctRNA包括該患者與腫瘤特異性突變,及/或該ctRNA僅在一腫瘤細胞中表現。
如,本文所用,術語“腫瘤”係指,且為可與一個或多個癌症細胞、癌症組織、惡性腫瘤細胞,或惡性腫瘤組織交替使用之術語,其可被放置或在一人體內的一個或多個解剖位置內被發現。應該注意的是,如,本文所用之術語“患者”包括被診斷患有病症(例如,癌症)的個體以及為了檢測或鑑定一病症而進行檢查及/或測試的個體。因此,一患有一腫瘤的患者係指被診斷患有一癌症的個體以及懷疑患有一癌症的個體。如,本文所用,術語“提供(動詞)”或“提供(動名詞)”係指並包括製造、產生、放置、能夠使用、轉移,或準備使用的任何行為。
最典型地,在該腫瘤中的該患者與腫瘤特異性突變可以透過對一全基因體或一全外顯體的高通量基因體定序來鑑定,其允許快速且特異地鑑定患者與腫瘤特異性突變基因。較佳地,進行這樣的高通量基因體定序以比較該全基因體或外顯體之腫瘤與匹配的正常組織(即,來自同一患者的非患病組織),以確定在一基因中的腫瘤特異性突變,較佳使用如,美國專利第9721062號中所述之增量同步比對,及/或使用RNA定序。此外,可以進行蛋白質體學分析,最佳使用定量質譜法。於一些具體實施例中,進一步進行高通量基因體定序以比較腫瘤以及匹配的健康個體組織(例如,肺癌患者的鱗狀細胞以及一健康個體的鱗狀細胞等)以確定一患者特異性突變。儘管不限於本發明之主題,但是包含該腫瘤與匹配的正常組織的序列資訊的數據格式為以SAM、BAM、GAR的形式,或者僅在VCF格式中列出差異的情況下。
本案發明人設想到該患者與腫瘤特異性突變可以存在於可能直接或間接與一腫瘤細胞的功能相關的任何基因中。因此,該患者與腫瘤特異性突變可能為一已知的突變,其與一已知的癌症之發展及/或預後相關。然而,也設想到的是,該患者與腫瘤特異性突變在具有相同類型腫瘤的患者之間可能並非常見的或已知的突變。因此,該患者與腫瘤特異性突變可能存在於一已知的腫瘤相關基因中,特別是在一癌症驅動基因中,或者可能存在於並非普遍知道與特定類型的腫瘤或任何類型的腫瘤相關的基因中。當然,應該理解的是,該突變可包括錯義或無義突變、插入、缺失、融合,及/或易位中的一種或多種,所有這些在轉錄時都可能導致或不導致全長mRNA的形成。如,本文所用,一癌症驅動基因係指其突變可觸發、引起或促進一細胞轉化為一腫瘤細胞,或在特定微環境條件下觸發、引起,或促進淨細胞生長的基因。
例如,該患者與腫瘤特異性突變可存在於腫瘤相關基因中,特別是癌症驅動基因中,包括但不限於:ABL1、ABL2、ACTB、ACVR1B、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、AMER11、APC、AR、ARAF、ARFRP1、ARID1A、ARID1B、ASXL1、ATF1、ATM、ATR、ATRX、AURKA、AURKB、AXIN1、AXL、BAP1、BARD1、BCL2、BCL2L1、BCL2L2、BCL6、BCOR、BCORL1、BLM、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BTG1、BTK、EMSY、CARD11、CBFB、CBL、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD274、CD79A、CD79B、CDC73、CDH1、CDK12、CDK4、CDK6、CDK8、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CEA、CEBPA、CHD2、CHD4、CHEK1、CHEK2、CIC、CREBBP、CRKL、CRLF2、CSF1R、CTCF、CTLA4、CTNNA1、CTNNB1、CUL3、CYLD、DAXX、DDR2、DEPTOR、DICER1、DNMT3A、DOT1L、EGFR、EP300、EPCAM、EPHA3、EPHA5、EPHA7、EPHB1、ERBB2、ERBB3、ERBB4、EREG、ERG、ERRFI1、ESR1、EWSR1、EZH2、FAM46C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCL、FAS、FAT1、FBXW7、FGF10、FGF14、FGF19、FGF23、FGF3、FGF4、FGF6、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FLCN、FLI1、FLT1、FLT3、FLT4、FOLH1、FOXL2、FOXP1、FRS2、FUBP1、GABRA6、GATA1、GATA2、GATA3、GATA4、GATA6、GID4、GLI1、GNA11、GNA13、GNAQ、GNAS、GPR124、GRIN2A、GRM3、GSK3B、H3F3A、HAVCR2、HGF、HMGB1、HMGB2、HMGB3、HNF1A、HRAS、HSD3B1、HSP90AA1、IDH1、IDH2、IDO、IGF1R、IGF2、IKBKE、IKZF1、IL7R、INHBA、INPP4B、IRF2、IRF4、IRS2、JAK1、JAK2、JAK3、JUN、MYST3、KDM5A、KDM5C、KDM6A、KDR、KEAP、KEL、KIT、KLHL6、KLK3、MLL、MLL2、MLL3、KRAS、LAG3、LMO1、LRP1B、LYN、LZTR1、MAGI2、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MCL1、MDM2、MDM4、MED12、MEF2B、MEN1、MET、MITF、MLH1、MPL、MRE11A、MSH2、MSH6、MTOR、MUC1、MUTYH、MYC、MYCL、MYCN、MYD88、MYH、NF1、NF2、NFE2L2、NFKB1A、NKX2-1、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NPM1、NRAS、NSD1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUP93、PAK3、PALB2、PARK2、PAX3、PAX、PBRM1、PDGFRA、PDCD1、PDCD1LG2、PDGFRB、PDK1、PGR、PIK3C2B、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PLCG2、PMS2、POLD1、POLE、PPP2R1A、PREX2、PRKAR1A、PRKC1、PRKDC、PRSS8、PTCH1、PTEN、PTPN11、QK1、RAC1、RAD50、RAD51、RAF1、RANBP1、RARA、RB1、RBM10、RET、RICTOR、RIT1、RNF43、ROS1、RPTOR、RUNX1、RUNX1T1、SDHA、SDHB、SDHC、SDHD、SETD2、SF3B1、SLIT2、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMO、SNCAIP、SOCS1、SOX10、SOX2、SOX9、SPEN、SPOP、SPTA1、SRC、STAG2、STAT3、STAT4、STK11、SUFU、SYK、T (BRACHYURY)、TAF1、TBX3、TERC、TERT、TET2、TGFRB2、TNFAIP3、TNFRSF14、TOP1、TOP2A、TP53、TSC1、TSC2、TSHR、U2AF1、VEGFA、VHL、WISP3、WT1、XPO1、ZBTB2、ZNF217、ZNF703、CD26、CD49F、CD44、CD49F、CD13、CD15、CD29、CD151、CD138、CD166、CD133、CD45、CD90、CD24、CD44、CD38、CD47、CD96、CD 45、CD90、ABCB5、ABCG2、ALCAM、ALPHA-FETOPROTEIN、DLL1、DLL3、DLL4、ENDOGLIN、GJA1、OVASTACIN、AMACR、NESTIN、STRO-1 、MICL、ALDH、BMI-1、GLI-2、CXCR1、CXCR2、CX3CR1、CX3CL1、CXCR4、PON1、TROP1、LGR5、MSI-1、C-MAF、TNFRSF7、TNFRSF16、SOX2、PODOPLANIN、L1CAM、HIF-2 ALPHA、TFRC、ERCC1、TUBB3、TOP1、TOP2A、TOP2B、ENOX2、TYMP、TYMS、FOLR1、GPNMB、PAPPA、GART、EBNA1、EBNA2、LMP1、BAGE、BAGE2、BCMA、C10ORF54、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD30、CD33、CD80、CD86、CD123、CD276、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL17、CXCR3、CXCR5、CXCR6、CTAG1B、CTAG2、CTAG1、CTAG4、CTAG5、CTAG6、CTAG9、CAGE1、GAGE1、GAGE2A、GAGE2B、GAGE2C、GAGE2D、GAGE2E、GAGE4、GAGE10、GAGE12D、GAGE12F、GAGE12J、GAGE13、HHLA2、ICOSLG、LAG1、MAGEA10、MAGEA12、MAGEA1、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA4、MAGEA5、MAGEA6、MAGEA7、MAGEA8、MAGEA9、MAGEB1、MAGEB2、MAGEB3、MAGEB4、MAGEB6、MAGEB10、MAGEB16、MAGEB18、MAGEC1、MAGEC2、MAGEC3、MAGED1、MAGED2、MAGED4、MAGED4B、MAGEE1、MAGEE2、MAGEF1、MAGEH1、MAGEL2、NCR3LG1、SLAMF7、SPAG1、SPAG4、SPAG5、SPAG6、SPAG7、SPAG8、SPAG9、SPAG11A、SPAG11B、SPAG16、SPAG17、VTCN1、XAGE1D、XAGE2、XAGE3、XAGE5、XCL1、XCL2,以及XCR1。
又如,某些患者與腫瘤特異性突變可存在於編碼一種或多種炎症相關蛋白的基因中,該蛋白包括,但不限於:HMGB1、HMGB2、HMGB3、MUC1、VWF、MMP、CRP、PBEF1、TNF-α、TGF-β、PDGFA、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、伊紅麴素(Eotaxin)、FGF、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IP-10、MCP-1、PDGF,以及hTERT,以及另一例子為,ctRNA編碼HMGB1的全長或片段。
又如,一些患者與腫瘤特異性突變可存在於基因DNA修復相關蛋白或RNA修復相關蛋白中。表 1
提供了本文設想的主要RNA修復基因及其相關修復途徑的示例性集合,但應認識到,本文還明確涵蓋與DNA修復以及修復途徑相關的許多其他基因,表 2
與表 3
顯示了進一步用於分析的示例性基因及其在DNA修復中的相關功能。 表 1 表 2 表 3
於又一個實施例中,一些患者與腫瘤特異性突變可以存在於與疾病不相關的基因(例如,持家基因)中,這些基因包括與轉錄因子(例如,ATF1、ATF2、ATF4、 ATF6、ATF7、ATFIP、BTF3、E2F4、ERH、HMGB1、ILF2、IER2、JUND、TCEB2等)、抑制因子(例如,PUF60)、RNA剪接(例如,BAT1、HNRPD、HNRPK、PABPN1、SRSF3等)、轉譯因子(EIF1、EIF1AD、EIF1B、EIF2A、EIF2AK1、EIF2AK3、EIF2AK4、EIF2B2、EIF2B3、EIF2B4、EIF2S2、EIF3A等)、tRNA合成酶(例如,AARS、CARS、DARS、FARS、GARS、HARS、 IARS、KARS、MARS等)、RNA結合蛋白(例如,ELAVL1等)、核醣體蛋白(例如,RPL5、RPL8、RPL9、RPL10、RPL11、RPL14、RPL25等)、粒線體核醣體蛋白、MRPL9、MRPL1、MRPL10、MRPL11、MRPL12、MRPL13、MRPL14等)、RNA聚合酶(例如,POLR1C、POLR1D、POLR1E、POLR2A、POLR2B、POLR2C、POLR2D、POLR3C等)、蛋白質加工、PPI3、PPIF、CANX、CAPN1、NACA、PFDN2、SNX2、SS4 1、SUMO1等)、熱休克蛋白(例如,HSPA4、HSPA5、HSBP1等)、組蛋白(例如,HIST1HSBC、H1FX等)、細胞週期(例如,ARHGAP35、RAB10、RAB11A、CCNY、CCNL (例如,ALDOA、GSK3A、PGK1、PGAM5等)、脂質代謝(例如,HADHA)、檸檬酸循環(例如,SDHA、SDHB等)、胺基酸代謝(例如,COMT等)、NADH脫氫酶(例如,NDUFA2等)、細胞色素c氧化酶(例如,COX5B、COX8、COX11等)、ATP酶(例如, ATP2C1、ATP5F1等)、溶酶體(如,CTSD、CSTB、LAMP1等)、蛋白酶體(如,PSMA1、UBA1等)、細胞骨架蛋白(如,ANXA6、ARPC2等)以及細胞器合成(例如,BLOC1S1、AP2A1等)。
關於突變的類型,通常較佳為該患者與腫瘤特異性突變存在於一基因的編碼區中(例如,外顯體),使得該突變可以影響由該基因編碼的蛋白質的胺基酸序列。因此,在一些具體具體實施例中,該患者與腫瘤特異性突變可導致產生腫瘤與患者特異性的新抗原決定位。最典型為,該患者特異性抗原決定位對於該患者是獨特的,且因此可以產生一患病細胞或細胞群(例如,腫瘤的次選殖株分段)的獨特且患者特異性的標記。因此,應該特別理解的是,攜帶這種患者與腫瘤特異性突變的ctRNA可作為替代標記物,不僅針對腫瘤的存在,而且針對特定腫瘤次選殖株的細胞(例如,治療抗性腫瘤)。而且,在突變編碼一患者與腫瘤特異性的新抗原決定位以作為免疫治療中的一目標的情況下,攜帶這種突變的ctRNA將能夠作為該免疫治療的治療功效的一高度特異性標記。
或者,還設想到的是,該患者與腫瘤特異性突變存在於一基因的非編碼區中(例如,內含子、啟動子等),使得該突變可影響表現量或轉錄模式(例如,選擇性剪接等)而不影響該基因編碼的蛋白質的胺基酸序列。在一些具體實施例中,該患者與腫瘤特異性突變可存在於產生非編碼RNA(例如,微小RNA、小干擾RNA、長非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA))的基因中,使得非編碼RNA的活性或功能可能會受到突變的影響。
本案發明人設想到在該腫瘤細胞的一基因中的該患者與腫瘤特異性突變可以在從該患者體液中獲得的一種或多種ctDNA及/或ctRNA中檢測到。此外,還設想到的是,一些患者與腫瘤特異性突變可能影響具有患者與腫瘤特異性突變的基因的表現量,或可能影響另一基因的表現量,該另一基因位於傳信級聯反應的下游或與該具有患者與腫瘤特異性突變的基因交互作用。在一些具體實施例中,表現量受影響的基因可能位於相同的細胞(例如,腫瘤細胞)中。例如,當另一患者與腫瘤特異性突變位於編碼一蛋白激酶的腫瘤細胞中的基因A中時,可能影響基因A的表現量以降低或增加基因A的mRNA轉錄物的量。在另一個實施例中,當該患者與腫瘤特異性突變位於編碼一蛋白激酶的腫瘤細胞的基因A中時,基因B的表現量可能在相同細胞中受到影響,因為基因B的表現依賴於蛋白激酶的磷酸化活性。再例如,當該患者與腫瘤特異性突變位於編碼一蛋白激酶的腫瘤細胞的基因A中時,透過具有突變的基因B與一編碼的蛋白質相互作用,基因C的表現可能在不同類型的細胞(例如,NKT細胞等)中受到影響。因此,在該腫瘤細胞的一基因中的該患者與腫瘤特異性突變可以直接或間接影響具有突變的基因的ctRNA的量、另一基因的ctRNA的量,或源自該腫瘤細胞以外的一細胞的任何其他基因的其他無細胞RNA的量。
最典型為,合適的組織來源包括全血,其較佳以血漿或血清的形式提供。因此,於一較佳的具體實施例中,ctDNA及/或ctRNA從在保持ctRNA的細胞完整性以及穩定性的條件下處理的全血樣品中分離。或者,應該注意的是,只要ctDNA及/或ctRNA存在於這些液體中,各種其他體液也被認為是合適的。適當的液體包括唾液、腹水、脊髓液、尿液或任何其他類型的體液,其可為新鮮的、化學保存的、冷藏的或冷凍的。
取決於體學分析之目的,可以在任何期望的時間點獲得該患者的體液。例如,可以在確認該患者患有腫瘤之前及/或之後及/或之後定期(例如,每週、每月等)獲得患者的體液,以便將ctDNA及/或ctRNA數據與癌症預後進行關聯。於一些具體實施例中,該患者的體液可以在癌症治療(例如,化學療法、放射療法、藥物治療、癌症免疫療法等)之前以及之後從患者獲得。儘管其可根據治療類型及/或癌症類型而變化,但癌症治療後至少24小時、至少3天、至少7天可獲得該患者的體液。為了更準確地比較,癌症治療之前的患者體液可以在癌症治療開始前少於1小時、少於6小時、少於24小時、少於一周內獲得。另外,可以在癌症治療之前及/或之後的期間(例如,24小時後每天一次,持續7天等)獲得患者體液的多個樣本。
另外或可選擇地,可以獲得健康個體的體液以比較ctDNA及/或ctRNA序列的序列/修飾,及/或ctRNA的量/亞型表現。如本文所用,一健康個體係指沒有腫瘤的個體。較佳地,該健康個體可選自與患者共享特徵的人群(例如,年齡、性別、種族、飲食、生活環境、家族史等)。
任何合適用於分離無細胞DNA/RNA的方法是可被設想的。例如,在DNA分離的一個示例性方法中,接受的樣本為吸入一試管中的10 ml全血。無細胞DNA可以使用磁珠從其他單核小體與雙核小體複合物中分離出來,該磁珠可分離出100-300 bps之間大小的無細胞DNA。又例如,在RNA分離的一種示例性方法中,接受的樣本為分別被抽入無細胞RNA的BCT®試管或含有RNA穩定劑的無細胞DNA的BCT®試管的10 ml全血。有利的是,在全血中的無細胞RNA在該無細胞RNA的BCT試管中可穩定存在7天,而在全血中的無細胞RNA在該無細胞DNA的BCT試管中可穩定存在14天,允許有足夠的時間可將患者樣品運送至世界各地而不會產生無細胞RNA的降解。
通常較佳為使用RNA穩定劑來分離cfRNA。雖然可以設想任何合適的RNA穩定劑,但較佳的RNA穩定劑包括:核酸酶抑制劑、防腐劑、代謝抑制劑,及/或螯合劑中的一種或多種。例如,設想的核酸酶抑制劑可以包括例如,焦碳酸二乙酯、乙醇、金三羧酸(aurintricarboxylic acid, ATA)、甲醯胺、氧釩基-核糖核苷複合物、生物鹼、肝素、膨潤土、硫酸銨、二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)、β-巰基乙醇、二硫赤蘚糖醇、三(2-羧乙基)膦乙烯鹽酸鹽,最通常含量為0.5至2.5重量百分比(wt%)。防腐劑可以包括:二唑烷基脲(diazolidinyl urea, DU)、咪唑烷基脲、二甲基醇-5,5-二甲基乙內醯脲、二羥甲基脲、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、噁唑烷、羥甲基甘氨酸鈉、羥甲氧基甲基-1- -3,7-二氧雜雙環[3.3.0]辛烷、5-羥甲基-1-1氮雜-3,7-二氧雜二環[3.3.0]辛烷、5-羥基聚[亞甲氧基]甲基-1-1-氮雜-3,7-二氧雜雙環[3.3.0]辛烷、季金剛烷或其任何組合。在大多數例子中,防腐劑將以約5-30 wt%的量存在。此外,通常設想防腐劑不含離液劑及/或清潔劑以減少或避免與防腐劑接觸的細胞裂解。
合適的代謝抑制劑可以包括:甘油醛、磷酸二羥丙酮、甘油醛3-磷酸、1,3-雙磷酸甘油酸、3-磷酸甘油酸、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸與甘油二羥基乙酸,以及氟化鈉,其濃度通常在0.1-10 wt%。較佳的螯合劑可以包括:二價陽離子的螯合劑,例如,乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)及/或乙二醇-雙(β-氨乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid, EGTA),其濃度通常在1-15 wt%的範圍內。
另外,RNA穩定劑還可以包括蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑及/或多胺。因此,用於收集與穩定全血中ctRNA的示例性組合物可以包括金三羧酸、二唑烷基脲、甘油醛/氟化鈉及/或EDTA。美國專利第8,304,187號與第8,586,306號中描述了用於ctRNA分離的其他組合物及方法,其透過引用的方式併入本文。
最佳地,用於ctRNA穩定的這種設想的RNA穩定劑置於適於血液收集、儲存、運輸及/或離心的試管內。因此,在大多數典型的方面,收集管配置為抽真空的血液收集管,其還包括一種或多種血清分離物質以幫助將全血分離為含有且基本上無細胞相的細胞(存在不超過1%的所有細胞)。通常,RNA穩定劑較佳為不會或基本上不會(例如,等於或小於1%,或等於或小於0.1%,或等於或小於0.01%,或等於或小於0.001%等)溶解血液細胞。從不同的角度來看,在試劑與血液結合後,RNA穩定試劑不會導致血清或血漿中的RNA量實質性增加(例如,總RNA的增加不超過10%,或不超過5%,或不超過2%,或不超過1%)。同樣地,這些試劑也將保持血液中細胞的物理完整性,以減少甚至消除血液細胞中發現的細胞RNA的釋放。這種保存可能為採集血液的形式,可能或可能未分離。於一些方面,設想的試劑將使存在於收集的除血液以外的組織中的ctRNA穩定至少2天,更佳為至少5天,並且最佳為至少7天。當然,應該認識到,除採集管之外的許多其他採集方式(例如,測試板、晶片、收集紙、卡匣等)也被認為是合適的,而且ctDNA及/或ctRNA可以至少部分地純化或吸附到固相上以在進一步處理之前增加穩定性。
如將容易理解的,血漿的分段分離以及cfDNA及/或cfRNA的取可以以許多方式完成。於一示例性的較佳方面,將在10 mL試管中的全血離心,以1600 rcf分離血漿20分鐘。然後如此獲得的澄清血漿分段被分離,並以16,000 rcf離心10分鐘以除去細胞碎片。當然,各種替代的離心方案也被認為是合適的,只要離心不會導致大量的細胞裂解(例如,裂解不超過所有細胞的1%,或不超過0.1%,或不超過0.01%,或不超過0.001%)。使用市售的Qiagen試劑從2 mL血漿中萃取ctDNA以及ctRNA。例如,在分離了cfRNA的情況下,本案發明人使用了包含保留在過濾材料中的DNA酶的一第二容器。值得注意的是,該cfRNA還包括miRNA (以及其他調控RNA,例如,shRNA、siRNA,以及內含子RNA)。因此,應該理解的是,所設想的組合物及方法也適用於分析來自全血的miRNA與其他RNA。
此外,還應該認識到的是,萃取方案被設計為去除潛在的污染血液細胞,其他雜質,並且在萃取期間維持核酸的穩定性。將所有核酸保存在條碼基質儲存管中,其中ctDNA儲存於-4°C且ctRNA儲存於-80°C或反轉錄為cDNA (例如,使用市售反轉錄酶,例如,Maxima或Superscript VILO)然後儲存於-4°C或冷藏於+2-8°C。值得注意的是,如此分離的ctRNA可在進一步加工之前冷凍。
設想cfDNA以及cfRNA可以包括任何類型的起源於或衍生自腫瘤細胞的DNA/RNA,所述腫瘤細胞在人類的體液中循環而不被封閉在細胞體或細胞核中。雖然不希望受到特定理論的束縛,但設想當腫瘤細胞與免疫細胞相互作用或腫瘤細胞經歷細胞死亡(例如,壞死、細胞凋亡、自噬等)時,可以增加cfDNA/cfRNA的釋放。因此,於一些具體實施例中,可以將cfDNA/cfRNA封閉在泡狀結構中(例如,透過細胞質物質的胞外體釋放),從而可以保護其免於某種類型的體液中的核酸酶(例如,RNA酶)的活性。然而,也設想了在其他方面,cfDNA/cfRNA是不被任何膜結構包封的裸DNA/RNA,但其本身可為穩定形式或透過與一個或多個非核苷酸分子(例如,任何RNA結合蛋白等)交互作用。
因此,cfDNA可包括任何完整或片段化的基因體DNA或粒線體DNA,且cfRNA可包括mRNA、tRNA、微小RNA、小干擾RNA、長非編碼RNA (lncRNA)。最典型為,無細胞DNA為通常具有至少50個鹼基對(bp)、100 bp、200 bp、500 bp,或1 kbp長度的片段化DNA。此外,可以設想cfRNA為mRNA的全長或片段(例如,全長的至少70%,全長的至少50%,全長的至少30%等)。
較佳地,ctDNA/ctRNA可以衍生自包括該患者與腫瘤特異性突變的一基因。因此,於一些具體實施例中,ctDNA/ctRNA可為包括該患者與腫瘤特異性突變的至少一部分的基因片段。然而,也設想到,雖然ctDNA/ctRNA源自於包括該患者與腫瘤特異性突變的基因,但ctDNA/ctRNA片段可能不包括該患者與腫瘤特異性突變的全部或部分。於一些具體實施例中,ctDNA以及ctRNA為可對應於該基因的相同或基本上相似部分的片段(例如,ctRNA序列的至少50%,至少70%,至少90%與ctDNA序列互補等)。於其他具體實施例中,ctDNA以及ctRNA片段可對應於該基因的不同部分(例如,小於50%,小於30%,小於20%的ctRNA序列與ctDNA序列互補等)。
雖較不佳,但也設想到的是,ctDNA以及無細胞RNA可以來自腫瘤細胞的不同基因。於一些具體實施例中,還設想到ctDNA以及cfRNA可以來自不同類型細胞的不同基因(例如,來自腫瘤細胞的ctDNA以及來自NK細胞的cfRNA等)。在這種情況下,較佳為ctDNA可包括該患者與腫瘤特異性突變的全部或一部分。
儘管ctDNA/ctRNA或cfRNA可包括任何類型的編碼任何細胞、胞外蛋白質或非蛋白質元件的DNA/RNA,但較佳為至少一些ctDNA/ctRNA (或來自非腫瘤細胞的cfRNA)編碼一種或多種癌症相關蛋白、炎症相關蛋白、DNA修復相關蛋白,或RNA修復相關蛋白,其突變、表現及/或作用可直接或間接與腫瘤發生、轉移、免疫抑制腫瘤的形成相關微環境,免疫逃避,或在腫瘤細胞上呈現患者、腫瘤特異性的新抗原決定位。還設想到的是,ctDNA/ctRNA (或來自非腫瘤細胞的cfRNA)可以源自一種或多種編碼細胞機械或結構蛋白的基因,包括,但不限於,持家基因、轉錄因子、抑制因子、RNA剪接機器或元件、轉譯因子、tRNA合成酶、RNA結合蛋白、核醣體蛋白、粒線體核醣體蛋白、RNA聚合酶、與蛋白質加工有關的蛋白、熱休克蛋白、細胞週期相關蛋白、與碳水化合物代謝有關的元件、脂質、檸檬酸循環、胺基酸代謝、NADH脫氫酶、細胞色素c氧化酶、ATP酶、溶酶體、蛋白酶體、細胞骨架蛋白以及胞器合成。
於一特別較佳的具體實施例中,設想的ctRNA包括編碼腫瘤相關抗原、腫瘤特異性抗原、過表現RNA (其中該RNA的表現量比在非腫瘤細胞中的更高),包括一患者與腫瘤特異性突變的RNA,特別是當突變編碼一新抗原決定位時(亦即,突變為導致改變的胺基酸的密碼子的一部分)。於特別設想的方面,應該理解的是,患者與腫瘤特異性突變,尤其是新抗原決定位突變,在治療及監測治療中是有利的,其中該治療是以一新抗原決定位為基礎的治療組合物(例如,DNA質體疫苗、酵母或病毒表現系統)來治療該病患的。此外,合適的ctRNA還包括已知或可疑的原致癌基因及/或致癌基因(腫瘤啟動子或腫瘤抑制基因)的所有序列。因此,設想的致癌基因包括編碼一種或多種生長因子,編碼形成信號傳遞網絡的一部分的蛋白質(例如,酪胺酸激酶、絲胺酸或蘇胺酸激酶、GTP酶等),及/或編碼作為轉錄因子或參與細胞週期調控或DNA修復的蛋白。
例如,在一癌症與ras
中的一個或多個突變相關的情況下,設想合適的ctRNA測定可以檢測及/或定量突變的ras序列,且特別設想的ras突變包括在h-ras、n-ras,以及k-ras的胺基酸位置12、13,以及61上(例如,G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P以及Q61R)。在ras中進一步設想到的突變包括所有已知的致癌突變,且示例性突變公開於PCT專利公開號WO2015/123532以及Nature Reviews Drug Discovery
第13卷,第828–851頁(2014年)中,其透過引用方式併入本文。其他ctRNA包括編碼EGFR、ALK融合,以及ROS1的序列。合適的ctRNA的選擇可基於一患者的體學數據的分子譜分析,及/或基於在特定癌症中常見的已知突變序列的存在。
於另一較佳的具體實施例中,合適的ctRNA也可包括涉及免疫刺激及/或免疫抑制的ctRNA。例如,已知NKD2D配體(特別是可溶性NKG2D配體如,MICA)降低NK細胞以及CTL的細胞毒性活性,因此特別設想編碼NKG2D配體(特別是可溶性NKG2D配體)的ctRNA的檢測及/或定量。類似地,並且如下文更詳細討論的,編碼各種免疫調節因子,包括PD-1L,的其他ctRNA也被認為是合適的。合適的ctRNA分子也可編碼間接下調抗腫瘤免疫反應的蛋白質,因此設想的ctRNA包括編碼MUC1的那些。於進一步的實施例中,設想了編碼各種癌症標記物基因的ctRNA。例如,在標記為EMT (上皮-間質轉變,epithelial-mesenchymal transition)的情況下,設想的ctRNA可以編碼brachyury蛋白。在這些以及其他情況下(特別是當存在分泌的抑制因子時),設想在檢測到ctRNA時可以採取適當的治療作用(例如,這些可溶性因子的血球分離移除等)。
還設想到的是,ctDNA/ctRNA或cfRNA可以修飾形式或不同的同功型(isoforms)存在。例如,ctDNA可能以甲基化或羥基甲基化形式存在,且某些基因(例如,GSTP1、p16、APC等)的甲基化程度可能是特定類型癌症的標記(例如,結腸癌等)。ctRNA可以與不同細胞類型及/或位置相關的多種同功型(例如,剪接變體等)存在。較佳地,ctRNA的不同的同功型可為特定組織(例如,腦、腸、脂肪組織、肌肉等)的標記,或者可為癌症的標記(例如,與相應的正常細胞相比,癌細胞中存在不同的同功型,或者與相應的正常細胞相比,癌細胞中不同的同功型的比例是不同的等)。例如,編碼HMGB1的mRNA以18種不同的可變剪接變體以及2種未剪接形式存在。設想那些同功型在患者體內的不同組織/位置表現(例如,同功型A對前列腺具有特異性,同功型B對腦具有特異性,同功型C對脾臟具有特異性等)。因此,在這些具體實施例中,鑑定患者體液中ctRNA的同功型可以提供關於ctRNA的來源(例如,細胞類型、組織類型等)的資訊。
可選擇地或另外地,本案發明人設想了ctRNA可包括調節性非編碼RNA (例如,微小RNA、小干擾RNA、長非編碼RNA (lncRNA)),其量及/或同功型(或亞型)可透過一腫瘤的存在或針對該腫瘤的免疫反應而改變並波動。不希望受任何具體理論的束縛,一癌症患者的體液中調節性非編碼RNA的不同表現可由於該癌細胞的遺傳修飾(例如,染色體部分的缺失、易位等)及/或免疫系統在癌組織發生炎症(例如,透過激活干擾素信號傳遞及/或病毒感染來調節miR-29家族等)。因此,於一些具體實施例中,該ctRNA可為一調節非編碼RNA,該RNA調節編碼一癌症相關蛋白或一炎症相關蛋白(例如,HMGB1、HMGB2、HMGB3、MUC1、VWF、MMP、CRP、PBEF1、TNF-α、TGF-β、PDGFA、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、伊紅麴素、FGF、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IP-10、MCP-1、PDGF、hTERT等)的mRNA的表現(例如,下調、沉默等)。
還設想到的是,一些無細胞調節性非編碼RNA可存在於可能與不同細胞類型及/或位置相關的多種同功型或成員(例如,miR-29家族的成員等)中。較佳地,調節性非編碼RNA的不同的同功型或成員可為特定組織(例如,腦、腸、脂肪組織、肌肉等)的標記,或者可為癌症的標記(例如,相較於相應的正常細胞,癌症細胞中存在不同的同功型,或者與相應的正常細胞相比,癌細胞中不同的同功型的比例不同)。例如,體液中miR-155的高表現量可能與乳腺腫瘤的存在相關,且miR-155的表現量降低可能與乳腺腫瘤的大小減小相關。因此,在這些具體實施例中,鑑定患者體液中無細胞調節性非編碼RNA的同功型可提供關於無細胞調節性非編碼RNA的來源(例如,細胞類型、組織類型等)的資訊。
一旦分離出ctDNA/ctRNA或cfRNA,可使用任何合適的方法獲得各種類型的體學數據。DNA序列數據不僅包括存在或不存在與癌症或炎症相關的基因,而且還考慮到基因突變的突變數據、複製數(例如,以鑑別重複、等位基因缺失或雜合性缺失)以及表觀遺傳狀態(例如,甲基化、組蛋白磷酸化、核小體定位等)。關於RNA序列數據,應該注意的是,所設想的RNA序列數據包括mRNA序列數據、剪接變體數據、聚腺苷酸化資訊等。此外,通常較佳為RNA序列數據還包括轉錄強度的度量(例如,每百萬總轉錄物中一損傷修復基因的轉錄物數量,所有損傷修復基因的轉錄物總數中一損傷修復基因的轉錄物數量,每個肌動蛋白或其他持家基因RNA的轉錄物數目中一損傷修復基因的轉錄物數量等)以及該轉錄物穩定性(例如,poly A尾巴的長度等)。 關於轉錄強度(表現量),可以透過定量ctRNA或cfRNA來檢查ctRNA或cfRNA的轉錄強度。V的量化可以多種方式進行,然而,分析物的表現較佳透過使用對每種基因特異的引子對ctRNA或cfRNA進行定量即時RT-PCR來測量。例如,可以使用含有2 μL ctRNA或cfRNA、引子以及探針的10 μL反應混合物分析以進行擴增。α-肌動蛋白或β-肌動蛋白的mRNA可作為ctRNA或cfRNA輸入量的內部對照。每個PCR反應盤包含已知濃度的每種分析物的標準曲線或單個反應以及每個基因的陽性以及陰性對照。透過在含有核酸的基質管上掃描2D條碼以鑑定測試樣品。將來自對每種分析物進行定量PCR (quantitative PCR, qPCR)擴增得到的Ct值,減去每個患者血液樣本的肌動蛋白Ct值,以得到ΔCt (dCT)。患者樣本的相對表達使用通用人類參考RNA的系列稀釋物的delta Cts標準曲線或已知表現目標基因設定為基因表現值10或合適整數的另一種對照來計算,所述範圍允許特定患者樣本結果的範圍約為1至1000 (當ΔCTs與每種分析物的對數濃度作圖時)。或者及/或額外地,每個基因測試的Delta Cts對log10
相對基因表現(標準曲線)可以在數百個PCR反應盤(歷史反應)上捕獲。可以對每個測定進行線性回歸分析,並用來從原始標準曲線前進的單個點計算基因表現。
可選擇地或額外地,在需要發現或掃描新突變或特定基因表現的變化的情況下,即時定量PCR可被RNA定序取代或添加以涵蓋至少部分患者的轉錄體。此外,應該理解的是,分析可以靜態地或隨時間進行,重複採樣以獲得動態畫面而不需要對腫瘤或轉移進行活體組織檢查。
除了RNA定量之外,可以進行cfRNA的RNA測序(直接或透過反轉錄)以驗證同一性及/或鑑定轉錄後修飾、剪接變異,及/或RNA編輯。 為此目的,可以將序列資訊與同一患者(另一患者的,或參考RNA)的先前RNA序列進行比較,較佳為使用同步位置引導分析(例如,使用如美國專利申請公開第2012/0059670號及/或第2012/0066001號中所述的BAMBAM)。這樣的分析是特別有利的,因為這種鑑定的突變可以針對患者特有的新抗原決定位被過濾,存在於患者的MHC I及/或II複合物中,並且因此作為治療靶標。此外,還可以使用路徑模型以及患者與腫瘤特異性突變來推斷腫瘤的生理參數以進一步表徵合適的突變。例如,特別合適的路徑模型包括PARADIGM (參見例如,WO2011/139345、WO2013/062505)以及類似模型(參見例如,WO2017/033154)。而且,合適的突變對於癌細胞的亞群也可為獨特的。因此,可基於患者以及特定腫瘤(甚至轉移)、作為治療目標的適合性、基因類型(例如,癌症驅動基因等)以及受其影響的基因產物的受影響功能來選擇突變基因與突變。
此外,本案發明人設想可以從患者的相同體液樣品中分離、檢測及/或定量多種類型的cfDNA及/或cfRNA,使得突變、數量及/或多個cfDNA及/或cfRNA的亞型可以被確定以用於進一步分析。因此,於一具體實施例中,可以從單個體液樣品或從基本上相似時間點獲得的來自患者的多個體液樣品中檢測以及定量多種cfRNA種類。在該具體實施例中,特別較佳的是,至少一些cfRNA測量結果對於癌相關核酸是具有特異性的。
因此,這樣獲得的ctDNA/ctRNA或cfRNA的體學數據資訊以及一個或多個基因中的腫瘤特異性、患者特異性突變的資訊可用於診斷腫瘤、監測腫瘤的預後、監測提供給患者的治療之有效性、基於治療方案成功的可能性評估治療方案,甚至作為允許對患者進行重複以及非侵入性採樣的發現工具。
例如,可以透過測量患者體液的樣品中ctDNA及/或ctRNA的總量來實現癌症的早期檢測,而不管腫瘤的特定解剖或分子類型(例如,在國際專利申請PCT/US18/22747中描述的,透過引用方式併入本文)。設想當總體cfDNA及/或cfRNA量達到特定或預定閾值時,可假定或推斷患者中存在癌症。cfDNA及/或cfRNA量的預定閾值可以透過測量來自具有類似身體狀況(例如,種族、性別、年齡、其他易感遺傳或疾病狀態等)的多個健康個體的總cfDNA及/或cfRNA量來決定。
例如,cfDNA及/或cfRNA數量的預定閾值比健康個體的cfDNA及/或cfRNA數量的平均值或中數值高出至少20%、至少30%、至少40%、至少50%。應該理解的是,這種早期檢測腫瘤的方法可以在沒有關於解剖或分子特徵或腫瘤的先驗知識或者甚至腫瘤的存在的情況下進行。為了進一步獲得癌症特異性資訊及/或關於免疫系統狀態的資訊,可檢測及/或量化額外的cfRNA標記物。最典型的是,這種額外的cfRNA標記將包括編碼如上所述的一種或多種致癌基因的cfRNA及/或編碼與免疫抑制或其他免疫逃避機制相關的蛋白的一種或多種cfRNA。在此類使用中的其他標記物中,特別設想的cfRNA包括編碼MUC1、MICA、brachyury蛋白,及/或PD-L1的那些。
本案發明人進一步設想,一旦鑑定或檢測到腫瘤,就可以透過在各種時間點監測cfDNA及/或cfRNA的類型及/或數量來監測腫瘤的預後。如所描述的,患者腫瘤基因中鑑定出一患者與腫瘤特異性突變。一旦鑑定到,從患者體液(通常是全血、血漿、血清)中分離出cfDNA及/或cfRNA,其中至少一種包含該患者與腫瘤特異性突變,然後將突變、數量,及/或cfDNA及/或cfRNA的亞型檢測及/或定量。發明人設想從患者體液中檢測到的cfDNA及/或cfRNA的突變、數量及/或亞型可為腫瘤的狀態、大小以及位置的強烈指示。例如,具有一患者與腫瘤特異性突變的cfDNA及/或cfRNA的量的增加,可為在針對該腫瘤細胞的免疫反應時增加的腫瘤細胞溶解的指標,及/或具有突變的腫瘤細胞數量增加的指標。於另一實施例中,具有該患者與腫瘤特異性突變的cfRNA對cfDNA的比例增加(其中cfRNA與cfDNA來自具有該突變的相同基因)可能表示這種患者與腫瘤特異性突變可能導致突變的基因的轉錄增加,以潛在地觸發腫瘤發生或影響該腫瘤細胞功能(例如,與轉移有關的免疫抗性等)。於又一實施例中,具有一患者與腫瘤特異性突變的ctRNA的量的增加以及另一種ctRNA (或非腫瘤相關的cfRNA)的量的增加,可能表示該另一種ctRNA可能與該具有一患者與腫瘤特異性突變的ctRNA具有相同途徑,使得兩種ctRNA (或一ctRNA與一cfRNA)的表現或活性可以相關(例如,共同調節、一種影響另一種、一種在另一種的途徑的上游等)。
因此,應該認識到的是,來自cfRNA定量的結果不僅可以作為產生所測量的cfRNA的特定細胞或細胞群的存在或不存在的指標,而且還可以作為這種細胞或細胞群的狀態(例如,遺傳、代謝、與細胞分裂、壞死及/或細胞凋亡有關)的額外指示,特別是在路徑分析中及/或機器學習模型中使用cfRNA定量結果作為輸入數據的情況下。例如,合適的模型包括那些預測單個或多個路徑中的路徑活性(或路徑組成分的活性)的模型。因此,除了或作為來自轉錄體分析(例如,透過RNA定序或cDNA或RNA陣列獲得)的RNA數據的替代之外,量化的cfRNA也可作為模型以及模擬系統的輸入數據。
於特別較佳之方面,ctDNA/ctRNA或cfRNA可包括編碼一新抗原決定位的核酸序列,其也是免疫療法的合適目標。不希望被任何具體理論所束縛,本案發明人設想到,如果源自該基因的ctRNA的量增加(例如,至少20%,至少40%,至少50%等),那麼具有一患者與腫瘤特異性突變的基因可能產生一新抗原決定位。基於該具有該患者與腫瘤特異性突變的基因序列,可以產生潛在的一新抗原決定位序列,其可以進一步過濾以匹配患者的HLA類型,從而增加該新抗原決定位的抗原呈現之可能性。最佳地,這種匹配可以使用計算機模擬完成。最典型的為,該患者特異性抗原決定位對該患者是獨特的,但也可以在至少一些情況下包括腫瘤類型特異性新抗原決定位(例如,Her-2、PSA、brachyury蛋白等)或癌症相關的新抗原決定位(例如,CEA、MUC-1、CYPB1等)。設想了針對該新抗原決定位的任何合適的免疫療法,而且示例性的免疫療法可以包括針對該新抗原決定位的一基於抗體之免疫療法,使用結合於該新抗原決定位的一結合分子(例如,抗體、抗體片段、scFv等),以及一基於細胞的免疫療法(例如,具有對該新抗原決定位特異性受體的免疫感受態細胞等)。例如,該基於細胞的免疫療法可以包括一T細胞、NK細胞,及/或NKT細胞,這些細胞表現對衍生自具有該患者與腫瘤特異性突變的基因的該新抗原決定位具有特異性的嵌合抗原受體。
另外,還設想到的是,可隨時間(在不同時間點)檢測、量化及/或分析ctDNA及/或ctRNA以確定該腫瘤的進展/預後及/或確定對該患者的一治療的有效性。通常,可以從相同的患者及相同的體液隨時間獲得多次測量,並且可以在單個時間點或隨時間對至少一第一ctRNA進行定量。最佳地,這種第一ctRNA來自一腫瘤相關基因、一腫瘤特異性基因,或涵蓋一患者與腫瘤特異性突變。在至少一個其他時間點上,然後可以量化一第二cfRNA,並且可以將該第一以及第二量進行相關聯,以用於診斷及/或監測治療。或者,該第二cfRNA也可以衍生自與該患者的免疫狀態有關的基因。例如,合適的cfRNA可以衍生自一檢查點抑制相關的基因、一細胞因子相關的基因,及/或一趨化因子相關的基因,或者該第二cfRNA為一miRNA。因此,設想的系統以及方法將不僅能監測特定的基因,而且還能監測免疫系統的狀態。例如,在該第二cfRNA衍生自一檢查點受體配體或IL-8基因的情況下,該免疫系統可能受到抑制。另一方面,當該第二cfRNA衍生自一IL-12或IL-15基因時,該免疫系統可能被激活。因此,測量該第二cfRNA可能進一步提供治療的資訊。同樣地,該第二cfRNA也可衍生自一第二轉移或一次選殖株,並且可以作為治療功效的替代指標。就此而言,還應該注意的是,可以使用設想的系統以及方法間接監測免疫療法的功效。例如,在患者接種了表現一新抗原決定位或多抗原決定位的DNA質體、重組酵母或腺病毒的情況下,可以檢測這些重組載體的cfRNA,並由此驗證來自這些重組載體的轉錄。
特別是在cfRNA隨時間而定量的情況下,通常較佳進行相同(以及在某些情況下新鑑定的)突變的多於一次的測量。例如,隨著時間的推移,多次測量可能有助於監測目標特定突變或新抗原決定位的治療效果。因此,這種測量可以在治療之前/期間及/或之後進行。在檢測到新突變的情況下,這樣的新突變通常位於不同的基因中,並且因此監測多種不同的cfRNA。
不管突變的類型以及數量如何,通常較佳為以一指示產生或更新一患者記錄,該指示與cfRNA的量相關聯,及/或為與一特定測量量相關聯的量化的cfRNA有關的治療選項,及/或為一針對該腫瘤的治療(例如,免疫療法、放射療法、化學療法等)的有效性。此外,還可以針對特定疾病(例如,特定癌症或該癌症的亞型)、特定疾病參數(例如,對特定藥物具有抗性的治療,對一藥物敏感),或疾病相關狀態(例如,對免疫刺激劑,如,細胞因子或檢查點抑制劑,的反應)來建立患者記錄。從不同的角度來看,因此也應該認識到,cfRNA結果可為患者特異性的,或對某一特定疾病、疾病參數,或疾病相關狀態具有特異性,並且因此也被認為是隊列特異性參數。
因此,應該理解的是,可以任何適當的方式來識別、量化或以其他方式描述患者的cfRNA之特徵。例如,設想與基於血液的RNA表現檢測(cfRNA)有關的系統以及方法識別、量化表現,並允許非侵入性監測疾病驅動因子(例如,PD-L1以及納武單抗(nivolumab)或派姆單抗(pembrolizumab))可單獨使用或與分析活組織檢查結合使用。這樣的以cfRNA為中心的系統以及方法允許監測疾病驅動因素的變化及/或鑑定可能與新出現的對化學療法的抗性相關的藥物靶標的變化。例如,可以使用cfRNA存在及/或一種或多種特定基因(例如,來自腫瘤組織及/或T-淋巴細胞的突變或野生型)的存在及/或量作為診斷工具,以評估患者是否可為對一種或多種檢查點抑制劑敏感,例如,可以透過分析針對ICOS信號傳遞的cfRNA來提供。
此外,並且從另一個角度來看,本案發明人還設想了所設想的系統以及方法可以用於產生在一患者中一腫瘤的一突變標記。在此類方法中,定量一種或多種cfRNA,其中導致那些cfRNA的至少一種基因包含一患者與腫瘤特異性突變。與實體腫瘤的突變特徵相比,這種特徵可能特別有用,特別是在兩個特徵相對於同一患者的健康組織進行標準化的情況下。特徵差異可能代表治療選擇及/或治療選擇成功的可能性。此外,還可以隨著時間的推移監測這樣的標記以鑑定對治療看起來具有抗性或較不敏感的細胞亞群。這種突變特徵也可用於鑑定一種或多種蛋白質的腫瘤特異性表達,特別是膜結合或分泌蛋白,其可作為在AND/NAND閘控治療組合物中的信號傳遞及/或回饋信號。這種組合物在本案申請人同時申請中的美國專利申請第15/897816號中被描述,其係以引用的方式併入本文。
在各種其他優點中,應當認識到的是,由於目標序列已經被預先識別,而且可以使用簡單的血液檢驗而容易地調查目標cfRNA,而不需要活體組織檢驗,因此可以使用設想的系統以及方法簡化治療監測,以及甚至一患者的長期追蹤。在存在微轉移或腫瘤或轉移瘤位於排除活體檢驗的位置的情況下,這是特別有利的。此外,還應該理解的是,設想的組合物以及方法獨立於關於導致癌症或與癌症相關的已知突變的先驗知識。更進一步地,所設想的方法還允許監測選殖株腫瘤細胞群以及使用免疫調節療法(例如,檢查點抑制劑或細胞因子)預測治療成功,尤其是使用基於新抗原決定位的治療(例如,使用DNA質體疫苗及/或表現新抗原決定位或多抗原決定位的病毒或酵母表現系統)。
關於預防性及/或預防性應用,設想可以使用已知的cfDNA及/或cfRNA的鑑定及/或定量來評估癌症發病的存在或風險(或其他疾病或病原體的存在)。取決於檢測到的特定cfRNA,還設想到cfDNA及/或cfRNA可以針對特定的藥物或方案(例如,手術、化學療法、放射療法、免疫治療療法、飲食療法、行為矯正等)可能的治療結果提供指導。類似地,可以使用定量cfRNA結果來測量腫瘤健康,以修改患者中癌症的免疫治療性治療(例如,定量序列並相應地改變治療目標)或評估治療功效。還可以將患者置於治療後診斷測試時間表上以監測患者復發或疾病及/或免疫狀態的改變。
因此,本案發明人進一步設想到,基於檢測、分析及/或定量的cfDNA及/或cfRNA,可以產生並推薦新的治療計劃或者可以更新先前使用的治療計劃。例如,可以基於ctDNA及/或ctRNA(來源於基因A)的檢測,以及在基因A中具有患者與腫瘤特異性突變的ctRNA的表現量的增加,其係從患者的第一血液樣本獲得的,以提供使用免疫療法來針對由基因A編碼的一新抗原決定位的治療建議。以針對由基因A編碼的該新抗原決定位的抗體處理1個月後,抽取第二血液樣品,並測定ctRNA含量。在該第二血液樣本中,基因A的ctRNA表現量降低,而基因B的ctRNA表現量升高。基於這樣的更新結果,可以更新治療建議以針對由基因B編碼的新抗原決定位。而且,可以更新患者記錄,其中針對由基因A編碼的新抗原決定位的治療能有效減少表現由基因A編碼的新抗原決定位的腫瘤細胞的數目。 實施例
基於透過以放射學測試以外的手段評估腫瘤反應的需要未被滿足,本案發明人設想了在患者的血漿中的基因表現、突變的等位基因-部分、PDL-1表現及/或無細胞DNA [ctDNA] 及/或RNA [ctRNA]以監測疾病狀態並預測抗腫瘤治療的結果。
從全血中分離 ctDNA/ctRNA
:透過靜脈穿刺獲得全血,並將10 ml全血收集到分別含有RNA或DNA穩定劑的無細胞RNA的BCT®試管或無細胞DNA的BCT®試管(Streck公司,7002 S. 109th
St., La Vista NE 68128)。然後將樣品管以1600 rcf離心20分鐘,取出血漿並進一步以16,000 rcf離心10分鐘以除去細胞碎片。使用商業上可獲得的RNA分離套組按照製造商的方案對血漿進行分離並進行輕微修改。具體而言,在管柱上DNA酶消化中從樣品內除去DNA。在另一種方法中,還使用QiaSymphonyTM
儀器(Qiagen公司,19300 Germantown Road; Germantown,MD 20874)上的機器人萃取方法以自動方式獲得cfRNA,稍微修改以適應所需的DNA去除。在cfRNA樣品中,機器人萃取保留了大約12%的DNA污染(為了品質目的,我們的截止值小於25%)。本案發明人發現25%的DNA污染不會影響我們的PCR結果,因為PCR中的固有誤差是雙重的。我們測量了切除修復交叉互補酶(Excision Repair Cross-Complementing enzyme, ERCC1)的相對表達相對於相同的21個NSCLC樣品的β肌動蛋白作用,以確定兩種萃取程序之間是否存在顯著差異。新方法以及先前使用PCR技術的過程產生的相對表達沒有統計學上的差異。p= 0.4111 (配對t檢驗)。註:對於該測試,統計學上的差異為p<0.05。
於一實施例中,本案發明人測量了在經歷第一線治療的非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)以及乳腺癌的轉移患者中的血漿ctDNA/ctRNA的連續含量,並將它們與由電腦斷層(CT)掃描看到的反應(完全反應(complete response, CR)/部分反應(partial response, PR)/穩定疾病(stable disease, SD)/進行性疾病(progressive disease, PD))進行相關聯。本案發明人還監測了使用免疫療法治療的NSCLC患者中的PD-L1表現。從血漿中萃取ctDNA以及ctRNA,以隨機引子將ctRNA反轉錄為cDNA。然後透過RT-qPCR確定ctDNA以及ctRNA的含量。
更具體而言,在該實驗中,招募了52名患者(28名乳腺癌/24名NSCLC)並分為二個單獨的患者群組:乳腺癌組中的28名患者以及非小細胞肺癌組(NSCLC組)中的24名患者。乳腺癌組中,高加索人(白人,NHW)佔39% (11/28),拉丁裔(H)佔36% (10/28),52例患者中有20例完成治療。PR患者2例,其ctDNA/ctRNA含量無變化(NC)或減少(DEC)。11名患者達到SD,9名患者具有ctDNA/ctRNA的NC含量。在患有PD的患者中,5位患者中的5位在ctDNA/ctRNA含量中經歷顯著增加(INC)。總體而言,在乳腺癌患者中,反應與ctDNA/ctRNA含量之間存在84% (16/19)的一致性。這些為相互關聯的(r =0.7002,p<0.0001)。在NSCLC組中,71% (16/24)為NHW,而25% (6/24)為H。其中87% (21/24)患者為非鱗狀細胞癌(non-squamous cell carcinoma SQCC)。在CT掃描的20例患者中,1例患者為PR,其ctDNA/ctRNA的含量為DEC,10例患者達到了SD,其ctDNA/ctRNA含量均表現出DEC或NC。8例患者為PD,其中6例在PD前7週其ctDNA/ctRNA含量為INC。在這些NSCLC患者中,90% (17/19)的反應與ctDNA/ctRNA含量一致。這些為相互關聯的(r=0.6231,p<0.0001)。在5例患者中,當CT掃描顯示為SD或PR時,PD-L1表現保持穩定。
如表4所示,NSCLC患者(90%)以及乳腺癌患者(84%)的臨床反應與ctDNA/ctRNA血漿含量變化之間有很強的相關性。其中一些可以在成像完成前數週記錄下來。因此,ctRNA可以作為與ctDNA一樣有效的預測工具。
為了進一步證實ctRNA以及ctDNA結果的有效性,本案發明人進行了一致性測定,其中在二種癌症類型的雙盲測試中比較了組織活體檢驗值以及液體活體檢驗結果。值得注意的是,如下表所示,數據相關性很好,並確立了ctRNA以及ctDNA作為預後以及診斷標記的效用。 表 4
於又一實施例中,FOLFOXIRI加上貝伐單抗(Bevacizumab)已被作為轉移性結腸癌(metastatic colorectal cancer, mCRC)的標準初始治療,並且應該是具有RAS突變的腫瘤中的較佳方案之一。然而,在接受FOLFOXIRI加上貝伐單抗的日本患者中報導了頻繁的發熱性嗜中性白血球減少症(febrile neutropenia, FN)。本案發明人進行了第二期臨床試驗以評估mCRC中第一線m-FOLFOXIRI加上貝伐單抗對RAS突變的安全性以及活性,其伴隨著液體活體檢驗(liquid biopsy LB)研究(UMIN000015152)。
具體而言,對具有RAS突變腫瘤的不可切除/可測量腫瘤的患者給予貝伐單抗以及m-FOLFOXIRI (伊立替康150 mg/m2
,奧沙利鉑85 mg/m2
,左葉酸鹽[levofolinate, LV] 200 mg/m2
)以及氟尿嘧啶2400 mg/m2
,每兩週重複一次)。在最多12個週期的誘導治療後,使用氟尿嘧啶/亞葉酸加貝伐單抗進行維持治療。主要結束點為客觀緩解率(objective response rate, ORR)。次級結束點為無進展生存期(Progression-free survival, PFS)、總生存期、早期腫瘤縮小率(early tumor shrinkage, ETS)、反應深度(depth of response, DpR)以及安全性。在治療期間在3個點(治療前、治療8週,以及進展)收集血漿樣品。使用對KRAS、NRAS、BRAF以及PIK3CA變體特異的競爭性等位基因特異性TaqMan®PCR測定,在qPCR上測試目標ctDNA突變。
64位參與者中的62位可評估FOLFOXIRI加上貝伐單抗的功效。參與者組的中位數年齡為63歲(36-75歲)。55%的參與者為男性,45%為女性。92%的參與者處於有利的PS0階段,27%的參與者患有右側腫瘤。中位隨訪時間為7.9個月。客觀緩解率(ORR)以及疾病控制率分別為74.2%以及96.8%。參與者中,74%的參與者表現出ETS,中位DpR為48%。未達到中位PFS。常見的3或4級不良事件為嗜中性白血球減少症(49%)、高血壓(22%)、腹瀉(13%),以及FN(4.8%)。沒有發生與治療有關的死亡事件。液體活體檢驗研究顯示,72% (38/53)患者在治療前觀察到任何突變。無論在治療前的突變狀態如何,8週時突變的存在與ORR相關[無突變; 80% (32/40),任何突變;45% (5/11),P=0.05]。此外,治療前PIK3CA突變的患者反應較差(43%,3/7)。
觀察到m-FOLFOXIRI加上貝伐單抗具有活性而不影響對RAS突變mCRC的功效,並且對於日本患者可能更可行。KRAS、NRAS、PIK3CA突變的狀況可能潛在地預測對三聯體加貝伐單抗的最佳反應。
除癌症外,設想的系統以及方法對依賴於特定標記的存在及/或數量的各種其他測試系統也是有用的。因此,本文提出的方法可以用於背景/藥物濫用測試、移民、旅行或大流行控制的篩查,以及篩查保險風險的識別。在本案申請人同時申請中的PCT專利申請第PCT/US18/22747號以及WO 2016/077709中提供了進一步的設想以及具體實施例,其係以引用的方式併入本文。
對於本領域技術人員來說顯而易見的是,在不脫離本文的發明概念的情況下,除了已經描述的那些之外的更多修改是可能的。因此,本發明的主題不限於所附申請專利範圍要求的範圍。而且,在解釋說明書以及申請專利範圍時,所有術語應該以與上下文一致的最寬泛可能的方式來解釋。具體而言,術語“包括”以及“包含”應該被解釋為以非排他性方式引用元件、組件或步驟,指示所提及的元件、組件或步驟可以存在、或被利用、或與未明確引用的其他元素、組件或步驟組合。在說明書申請專利範圍要求涉及選自由A、B、C ... 以及N所組成之群組中的至少一項的情況下,該內容應該被解釋為只需要來自該群組的一個元素,而非A+N或B+N等等。
Claims (20)
- 一種產生或更新一患有一腫瘤之患者的患者記錄之方法,包括: 鑑定在該患者的該腫瘤的一基因中的一患者與腫瘤特異性突變; 獲得該患者的一體液; 定量包括在該患者的該體液中的該患者與腫瘤特異性突變的一第一cfRNA;以及 利用與該腫瘤的一狀態、該腫瘤的一治療建議,以及對該腫瘤的一治療的有效性中的至少一個相關聯的該第一cfRNA的一量產生或更新一患者記錄。
- 如請求項第1項所述之方法,其中該鑑定步驟包括比較來自同一患者的腫瘤組織以及正常組織的體學數據,而且該體學數據包括全基因體序列數據、外顯體序列數據、轉錄體序列數據,及/或蛋白質體序列數據。
- 如請求項第2項所述之方法,其中該體學以增量同步方式進行比較。
- 如請求項第1項所述之方法,進一步包括一使用一路徑模型以及該患者與腫瘤特異性突變以推斷該腫瘤的一生理參數之步驟。
- 如請求項第4項所述之方法,其中該路徑模型為PARADIGM,且可選擇地其中該生理參數為該腫瘤對一藥物的敏感性。
- 如請求項第1項所述之方法,其中該患者與腫瘤特異性突變編碼一新抗原決定位。
- 如請求項第1項所述之方法,其中該患者與腫瘤特異性突變位於一癌症驅動基因中。
- 如請求項第1項所述之方法,進一步包括一將該患者與腫瘤特異性突變與在該腫瘤內的癌細胞的一選殖株群體進行相關聯之步驟。
- 如,前述申請專利範圍任一項所述之方法,其中該獲得該體液之步驟以及該定量該cfRNA之步驟 在治療該患者的期間或之後被重複進行。
- 如請求項第1項所述之方法,其中該鑑定該患者與腫瘤特異性突變之步驟在治療該患者的期間或之後被重複進行,並且鑑定在一第二基因中的一第二患者與腫瘤特異性突變。
- 如請求項第10項所述之方法,進一步包括一定量衍生自該第二基因的一第二cfRNA之步驟。
- 如請求項第11項所述之方法,其中該第二cfRNA包含該第二患者與腫瘤特異性突變。
- 如請求項第1項所述之方法,其中該cfRNA包含一miRNA。
- 如請求項第1項所述之方法,進一步包括一定量源自在一腫瘤微環境中的一非腫瘤細胞的一無細胞RNA之步驟。
- 如請求項第1項所述之方法,其中該定量步驟包括一在一定條件下並且使用大量避免細胞溶解的RNA穩定劑自該體液中分離該第一cfRNA之步驟。
- 如請求項第1項所述之方法,其中該定量步驟包括由該cfRNA製備的一cDNA之即時定量PCR。
- 如請求項第1項所述之方法,進一步包括一歸檔該體液或自該體液分離的該第一cfRNA或由該cfRNA製備的cDNA之步驟,而且可選擇地,其中該歸檔該cfRNA之步驟包括在-80°C冷凍,或其中該歸檔該cDNA之步驟包括在-4°C冷凍或在+2-8°C冷藏。
- 如請求項第11項所述之方法,進一步利用與該第一及第二cfRNA的量有關的一指示來產生或更新該患者記錄,該第一及第二cfRNA的量與該腫瘤的該狀態、該腫瘤的該治療建議,以及對該腫瘤的該治療的有效性中的至少一個相關聯。
- 如請求項第1項所述之方法,進一步包括: 分離一具有該患者與腫瘤特異性突變的ctDNA; 確定該ctDNA的一量或一形式中的至少一種;以及 利用與該ctDNA的該量或該形式中的至少一種相關聯的該第一cfRNA的該量產生或更新該患者記錄。
- 如請求項第1項所述之方法,進一步包括一基於該所產生或更新之記錄以施用一檢查點抑制劑以及一免疫治療處理中的至少一種之步驟。
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