CN109716135A - 外排体引导的癌症治疗 - Google Patents

Abstract

使用由外排体获得的信息监测患者治疗的系统和方法，其中在肿瘤外的生物流体中的外排体中跟踪从肿瘤中识别的治疗靶标。

Description

外排体引导的癌症治疗

本申请要求2016年6月21日提交的序列号为62/352753的美国临时专利申请的优先权。

技术领域

本发明的领域是通过外排体监测癌症的治疗，尤其是通过外排体的蛋白质分析，其中蛋白质与已知为促使生长、转移和/或增殖的突变相关。

发明背景

背景描述包括可用于理解本发明的信息。本文提供的任何信息均不承认为是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者明确或暗含地引用的任何出版物不承认为是现有技术。

本文中的所有出版物均通过引用并入，如同每个单独的出版物或专利申请被特别地和单独地指出通过引用并入。如果并入的参考文献中术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或相反，则适用本文提供的该术语定义而不适用该术语在该参考文献中的定义。

组学分析逐渐成为在治疗各种疾病、尤其是癌症时确定临床相关目标的工具。虽然组学分析能够提供对患病组织和潜在治疗选择的关键理解，但监测治疗进展或成功通常是不可行的，因为这种监测需要频繁地对患病组织重新取样。或者，在一些情况下，外排体可用作活组织切片的替代物，因为已知癌细胞大量排出外排体。例如，US 8021847和US8476017教导了使用外排体作为诊断工具来识别已知与疾病相关的RNA序列。然而，这种方法不能提供治疗的直接功能信息，并且在RNA序列也存在于非患病组织中时不太有用。

最近，还报道了外排体影响肿瘤微环境(参见例如,Molecular Cancer 2016；15:42,或Semin Cell Dev Biol 2015；40:72-81)以及免疫应答(参见例如,Nat RevImmunol2014；14(3):195–208)的生物学。此外，据报道外排体含有反转录转座子元件和扩增的致癌基因序列(参见例如,Nat Commun 2011；2:180)。

因此，外排体也已被提出作为治疗剂，如在例如US2011/0053157中所公开的。然而，虽然肿瘤来源的外排体已被证明是在动物模型中有效的促使抗原特异性T细胞和B细胞应答的抗癌疫苗，但最近有关肿瘤来源的外排体的文献强烈表明囊泡具有显著的免疫抑制作用(参见例如,Vaccines 2015,3,1019-1051)。‘157参考文献还教导了与外排体相关的RNA在识别可用于监测治疗的潜在治疗靶标中的用途。类似地，报道了各种与外排体相关的miRNA可作为潜在标志物(参见例如,Molecular Cancer(2016)15:42)。

因此，尽管外排体领域已经受益于大量的研究工作，但在功能，尤其是疾病相关功能方面具有强烈的关联性的可靠蛋白质标志物仍然是遥不可及的。因此，仍然需要允许使用外排体进行监测和验证治疗的系统和方法。

发明内容

本发明的主题涉及使用一种或多于一种与患者和疾病相关的蛋白监测患者治疗的各种系统和方法，所述与患者和疾病相关的蛋白用作疾病治疗中的靶标。有利地，这种监测对疾病和患者是高度特异性的，并提供关于治疗效果的直接信息，特别是在治疗是靶向新表位的免疫疗法的情况下。

在本发明主题的一个方面，发明人设想了一种监测患者治疗的方法，该方法包括使用多个组学数据来识别患者特异性疾病相关蛋白的步骤。在另一个步骤中，在第一外排体中确定患者特异性疾病相关蛋白的存在和/或量，其中第一外排体在治疗之前由患者的生物流体获得，并且其中治疗靶向患者特异性疾病相关蛋白。在又一个步骤中，在第二外排体中确定患者特异性疾病相关蛋白的存在和/或量，其中第二外排体在治疗期间或治疗后由患者的生物流体获得。然后基于第二外排体中患者特异性疾病相关蛋白的存在和量中至少一个的确定来更新患者记录。

最典型地，多个组学数据选自全基因组测序数据、外显子组测序数据、转录组测序数据和蛋白质组测序数据，和/或多个组学数据包括来自患病组织的组学数据和相匹配的正常组织的组学数据。

在一些实施方案中，使用途径分析算法(例如，使用PARADIGM识别下调途径或拯救途径)识别患者特异性疾病相关蛋白，其将有利地使得能够识别非突变、沉默、低表达或过表达的基因。在其他实施方案中，患者特异性疾病相关蛋白是突变或下调的基因，其可以识别癌症驱动基因或参与癌转移的基因。因此，预期的患者特异性疾病相关蛋白包括激酶、受体、生长因子、转录因子或信号转导相关蛋白(例如，其中治疗包括化学疗法)。在其他实施方案中，患者特异性疾病相关蛋白是患者和肿瘤特异性新表位(例如，其中治疗包括免疫疗法)。另外，预期可以使用质谱反应监测(例如，选择反应监测、连续反应监测、多反应监测或平行反应监测)来确定患者特异性疾病相关蛋白的存在和/或量。此外，如果需要，预期的方法还可包括分析第一外排体和/或第二外排体中存在的核酸，或循环肿瘤核酸(例如ctRNA)的步骤。

可以使用非特异性包埋和/或抗体介导的捕获来分离外排体，并且生物流体通常包括全血、血清、血浆和尿液。此外，预期确定第二外排体中患者特异性疾病相关蛋白的存在和/或量的步骤可以重复至少一次，并且更新患者记录的步骤将包括修改治疗的建议。

因此，发明人还考虑了选择用于监测治疗的外排体标志物的方法。这种方法优选包括使用多个组学数据识别患者特异性疾病相关蛋白的步骤，以及识别靶向患者特异性疾病相关蛋白的治疗组合物的另一个步骤。在外排体中确定患者特异性疾病相关蛋白的存在和量的至少一个，其中外排体在治疗前由患者的生物流体获得。然后，在确定疾病相关蛋白以足以定量的量存在(例如，至少是阿托摩尔级)时，选择患者特异性疾病相关蛋白用于监测治疗。

最典型地，组学数据选自全基因组测序数据、外显子组测序数据、转录组测序数据和蛋白质组测序数据，和/或使用途径分析算法(例如使用PARADIGM)识别患者特异性疾病相关蛋白。虽然不限制本发明的主题，但通常优选的组学数据包括来自患病组织的组学数据和来自相匹配的正常组织的组学数据，并且所患疾病是癌症。

关于患者特异性疾病相关蛋白，预期蛋白质可以是可以用化学疗法靶向的过表达的蛋白或突变的蛋白(例如，激酶、受体、生长因子、转录因子或信号转导相关蛋白)，和/或患者特异性疾病相关蛋白可以是可以用免疫疗法靶向的患者和肿瘤特异性新表位。还进一步考虑使用质谱反应监测来确定患者特异性疾病相关蛋白的存在和/或量。

鉴于上述情况，发明人还预期一种监测患者的免疫疗法治疗的方法。优选的方法包括在第一外排体中确定患者和肿瘤特异性新表位的存在和/或量的步骤，其中第一外排体在治疗之前由患者的生物流体获得，其中免疫疗法治疗靶向患者和肿瘤特异性新表位。在另一个步骤中，在第二外排体中确定患者和肿瘤特异性新表位的存在和/或量，其中第二外排体在治疗期间或治疗后由患者的生物流体获得。最优选地，使用质谱反应监测(例如，选择反应监测、连续反应监测、多反应监测和平行反应监测)来进行确定步骤。

例如，合适的免疫疗法治疗可包括施用包含编码患者和肿瘤特异性新表位的核酸的重组实体(例如，任选具有复制缺陷的腺病毒、经辐照的细菌、或经辐照的酵母)。另外，预期的方法可包括分析存在于第一外排体和第二外排体中的至少一个中的核酸的步骤，和/或分析生物流体中的循环肿瘤RNA的步骤。需要时，免疫疗法治疗可进一步包括施用检查点抑制剂和/或免疫刺激细胞因子。

从以下优选实施方案的详细描述中，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显。

具体实施方式

发明人已经发现，可以通过检测和/或定量一种或多于一种患者特异性且与患者疾病相关的外排体蛋白质来监测患者的各种治疗，尤其是癌症治疗。在特别优选的方法中，蛋白质是定性或定量确定的，并且可以在从患者体液分离的外排体上和/或外排体中。此外，蛋白质优选是治疗的靶标，并因此将提供对治疗功效的直接和特异性的理解。还应该认识到，所预期的方法可以实时或接近实时地跟踪患者的治疗效果。

如本文所使用的，术语“患者”可与术语“对象”和“个体”互换，并且是指表明或预期具有外排体的所有动物。例如，患者可以是哺乳动物、人或非人灵长类动物、狗、猫、马、牛、其他农场动物或啮齿动物。

在本发明主题的一个示例性方面，可以对诊断患有癌症的患者进行肿瘤活组织检查，其中一部分肿瘤用于组学分析，通常使用全基因组测序、转录组测序和/或蛋白质组学分析。优选地，全基因组测序数据与来自相匹配的正常组织(即来自相同患者的健康组织，例如血液或受肿瘤影响的器官的健康组织部分)的全基因组测序数据结合使用，从而识别与癌症相关的变化，这也是患者特异性的。尽管用于这种比较分析的许多算法在本领域中是公知的，但是特别优选使用基于位置参考信息(例如，BAM格式、GAR格式等)而组织的数据文件的同步增量比对来完成的这种分析。例如，合适的算法包括US2012/0059670和US2012/0066001中描述的算法。此外，通常优选的是组学数据(连同转录组学数据和蛋白质组学数据)也用于途径分析算法中以识别潜在成药靶标或靶标途径，或识别可恢复肿瘤对药物敏感性的一种或多于一种治疗。在其他合适的途径分析工具中，特别考虑在WO2011/139345、WO2013/062505和WO2014/193982中教导的途径分析算法。

如应容易理解的，一旦基于途径分析和/或突变分析识别了合适的靶标，可以用靶向成药靶标或靶向药物敏感途径的一种或多于一种化学治疗剂治疗患者。从不同的角度来看，应该认识到，如此识别的成药靶标和/或途径提供患者特异性的和疾病相关的蛋白，然后将其用于癌症治疗。类似地，可以基于表达水平和/或突变状态(例如，导致活性过高或活性丧失)使用途径算法识别患者特异性和疾病相关蛋白。或者或另外地，组学分析还可揭示适合用癌症疫苗治疗的一种或多于一种新表位的存在(例如，通过重组细菌、酵母或病毒，其携带编码可表达和MHC可呈递形式的新表位的重组核酸)。因此，患者特异性和疾病相关蛋白还包括一种或多于一种患者和肿瘤特异性新表位。

应该特别理解的是，患者特异性和疾病相关蛋白在治疗(或者在先前治疗无效的新一轮治疗)开始之前建立，并且疾病相关蛋白的识别直接指导有效治疗类型。此外，在治疗(或先前治疗无效的新一轮治疗)开始之前获得来自患者的生物流体，并且在患者生物流体中的外排体中确定患者特异性疾病相关蛋白的存在和/或量。通过确定化学疗法和/或免疫疗法的治疗并通过确定化学疗法和/或免疫疗法的靶标的存在，选择预期具有更高的成功可能性而且还可在化学疗法和/或免疫疗法期间和之后直接检测和定量的治疗方式。因此，在治疗期间或之后的较晚时间，可以从患者中分离外排体，并且确定疾病相关蛋白的存在和/或量以实时或接近实时地跟踪疾病相关蛋白的动态变化。

在这种情况下，应该理解肿瘤细胞释放大量的外排体，并且肿瘤细胞的变化由在外排体中的相应变化直接反映。值得注意的是，这些变化可能在外排体(该情况下它们通常是蛋白质)表面上和/或外排体(该情况下它们可能是siRNA、miRNA、mRNA、DNA、双微染色体、蛋白质、代谢物等)腔中检测到。此外，特别是当靶蛋白仅以相对较小的量存在时，外排体靶标识别和/或定量可以通过相对快速的方式集中扩增信号(通过集中外排体和/或外排体蛋白)。

关于多个组学数据，通常预期组学数据是全基因组测序数据、外显子组测序数据、转录组测序数据和/或蛋白质组测序数据，并且疾病相关蛋白优选是新表位或使用途径分析算法(例如，PARADIGM)识别的，其中疾病相关蛋白是信号传导或信号转导途径的一部分。最典型地，多个组学数据将包括来自患病组织(肿瘤活组织切片)的组学数据和来自相匹配的正常组织(例如，血液)的组学数据。虽然通常优选疾病是癌症，但应该理解还预期许多其他疾病，并且特别包括遗传性疾病。

例如，关于从患者获得组学信息以识别一种或多于一种新表位，通常考虑按照标准组织处理方案和测序方案从一个或多于一个患者活组织切片样品中获得组学数据。虽然不限制本发明的主题，但通常优选数据是患者匹配的肿瘤数据(例如，肿瘤数据与同一患者的正常数据)，并且数据格式是SAM、BAM、GAR或VCF格式。然而，非匹配的或与其它参考数据(例如，先前同一患者正常数据或先前同一患者肿瘤数据或同源统计数据)匹配的数据也被认为适合用于本文。因此，组学数据可以是“新鲜的”组学数据或从先前程序(或甚至不同患者)获得的组学数据。例如，可以在第一步中通过肿瘤活组织切片(或淋巴活组织切片或转移部位的活组织切片)和匹配的正常组织(即，来自同一患者的非患病组织例如周边血液)的全基因组和/或外显子组分析，通过位置引导同步比较由此获得的组学信息来从患者肿瘤中识别新表位。

在其他选择中，预期可以通过任何数量的分析方法进行基因组分析，然而，特别优选的分析方法包括使用下一代测序，例如大规模并行测序方法、离子激流测序、焦磷酸测序等的肿瘤和匹配的正常样品的WGS(全基因组测序)和外显子组测序。同样，应当理解，序列数据的计算分析可以以多种方式进行。然而，在最优选的方法中，通过肿瘤和正常样品的位置引导的同步比对在计算机中进行分析，例如，在US2012/0059670A1和US2012/0066001A1中公开的使用BAM文件和BAM服务器来进行。当然，本文还明确预期用于序列分析的替代文件格式(例如，SAM、GAR、FASTA等)。

应当注意，针对计算机的任何语言应被解读为包括计算机设备的任意适当组合，计算机设备包括服务器、接口、系统、数据库、代理、对等设备、引擎、控制器、或单独或共同操作的其他类型的计算机设备。应当理解，计算机设备包括处理器，该处理器被配置为执行存储在有形、非暂时性计算机可读存储介质(例如，硬盘驱动器、固态驱动器、RAM、闪存、ROM等)上的软件指令。软件指令优选地配置计算设备以提供如下面讨论的关于所公开的装置的作用、职责或其他功能。此外，所公开的技术可以体现为计算机程序产品，其包括存储软件指令的非暂时性计算机可读介质，该软件指令使处理器执行与基于计算机的算法、过程、方法或其他指令的实现相关联的所公开的步骤。在特别优选的实施方案中，各种服务器、系统、数据库或接口使用标准化协议或算法交换数据，其可能基于HTTP、HTTPS、AES、公钥-私钥交换、web服务API、已知金融交易协议、或其他电子信息交换方法。设备之间的数据交换可以通过分组交换网络、因特网、LAN、WAN、VPN或其他类型的分组交换网络；电路交换网络；小区交换网络；或其他类型的网络进行。

当然，应当理解，可以对由此识别的序列差异进行下游分析，以识别基于癌症和患者特异性突变产生的新肽序列的那些序列差异。因此，可以通过考虑突变的类型(例如，删除、插入、颠换、转换、易位)和突变的影响(例如，无义、错义、移码等)来识别新表位，并且可以由此用作内容过滤器，通过该内容过滤器消除沉默和其他非相关(例如，非表达)突变。此外，对合适的新表位的过滤还可以包括过滤步骤以消除转录和/或翻译低于阈值(通常低于匹配的正常转录和/或翻译值)的基因。

在另一个实例中，还可以使用途径分析算法分析组学数据，以识别突变、过表达或低表达(相对于匹配的正常表达)的基因，和对疾病贡献或甚至是引起疾病的基因。虽然各种途径分析算法在本领域中是已知的并且被认为适用于本文，但是特别优选的途径分析算法是PARADIGM，其描述于WO2011139345、WO2013062505和WO/2014/059036中，以及WO 2017/033154中描述的系统和方法。

此外，途径分析和途径模型修改也可以经由计算机模拟用于识别药物治疗选项和/或模拟药物治疗，其靶向途径元件，途径元件是病症，特别是为肿瘤疾病治疗相关参数的决定因素或与治疗相关参数(例如，对特定治疗的抗药性和/或敏感性)有关。更具体地，可以使用途径分析系统和方法经由计算机调节或修改识别的途径元件，以测试是否可以实现期望的效果。例如，当抗药性的途径模型将某种元件的过表达识别为对病症发展至关重要(例如，针对特定药物的抗药性)时，可以经由计算机模拟减少该元件的表达水平，从而测试在相同的途径分析系统和方法中，经由计算机模拟的该元件的减少是否可潜在地逆转细胞对药物的敏感性。在代表多种可能的肿瘤变体的多种细胞系已经可用的情况下，这种方法特别有价值。在这种情况下，可以对每种细胞系进行途径分析，以获得细胞系特异性途径模型的集合。这种集合对于与由患者样品获得的数据进行比较特别有用，因为可以在与集合相同的数据空间内分析患者样品的数据，这最终可以识别患者的治疗靶标。除了其他优点之外，预期的系统和方法因此可以分析来自肿瘤样品的患者数据，以在患者实际经历药物治疗之前识别多药物治疗。

因此，并且从不同的角度来看，还预期来自患病细胞和/或患者组织的各种组学数据可以用于计算方法中以确定细胞和/或组织的敏感性模式，其中所述模式基于的是对各种类似患病细胞(例如，乳腺癌细胞)中的途径和/或途径元件的先验识别。最优选地，先验识别的途径和/或途径元件与对特定药物干预和/或治疗方案的抗性和/或敏感性相关。一旦建立了敏感性模式，就可以由先验识别的途径和/或途径元件直接预测治疗，或者可以使用已知途径建模系统和方法经由计算机模拟调节识别的途径和/或途径元件，这样有助于预测药物干预和/或治疗方案的可能结果。用于这种方法的合适系统和方法描述于WO2014/193982中。

应该认识到，途径模型可以由一组组学数据生成，或者可以从先前的确定中获得。因此，预期的系统和方法还可以包括与组学处理模块相连的存储模块，其中存储模块存储一个或多于一个先前确定的途径模型。还应该认识到，存储的途径模型可以对应于“正常”组织或患病组织。在途径模型来自患病组织的情况下，还应当理解，患病组织可以是特征在于亚特性(sub-trait)的特定亚型(例如，对特定药物具有治疗抗性的亚型、来自转移组织的亚型等)。还预期可以通过接口以多种方式提供组学数据。例如，数据可以以单个文件提供，或者以不同文件的集合提供，其可以由服务提供者从先前存储的库或者从测序装置或序列分析系统提供。因此，学习引擎可以进一步包括或可以连接到基因组数据库、BAM服务器或测序设备。

根据具体的途径，应该注意的是，途径元件的性质将随着调节参数的性质的变化而发生很大变化。然而，一般而言，应该注意，调节参数将确定通过从途径元件到下游元件的途径的信号流。例如，当途径元件是或包含DNA序列时，预期的调节参数将是影响DNA序列的转录(或其他作用)的那些细胞实体。因此，预期的DNA序列的调节参数包括一种或多于一种转录因子、转录激活因子、RNA聚合酶亚基、顺式调节元件、反式调节元件、(去)乙酰化组蛋白、(去)甲基化组蛋白和/或抑制因子。同样，在途径元件是或包含RNA序列时，预期合适的调节参数包括影响RNA的翻译(或其他活性)的因子。因此，此类调节参数包括起始因子、翻译因子、RNA结合蛋白、核糖体RNA和/或蛋白质、siRNA、和/或多聚A结合蛋白。以相同的方式，此处途径元件是或包含蛋白质，影响该蛋白质活性的所有因素被认为是合适的调节参数，因此可包括其他蛋白质(例如，与蛋白质相互作用以形成活化复合物或具有差异活性的复合物)、化学修饰(例如，磷酸化、酰化、蛋白水解切割等)。

因此，并且使用组学分析的结果来识别新表位和/或其他疾病相关蛋白(例如，受体、激酶、磷酸酶、转录因子等)，发明人还预期选择外排体标志物的方法。在这种方法中，来自患者的多个组学数据用于识别一种或多于一种疾病相关蛋白，并且药物被识别为靶向疾病相关蛋白(例如，激酶抑制剂、细胞信号传导抑制剂等)，其中所述治疗是化学疗法。同样地，在治疗是免疫疗法的情况下，来自患者的多个组学数据被用于识别一种或多于一种新表位、癌症相关抗原和/或癌症特异性抗原。在又一步骤中，证实疾病相关蛋白(例如，以特定量)存在于外排体中或外排体上。最典型地，并且如上所述，外排体在治疗之前从患者的生物流体中获得。如将容易理解的，一旦确定或确认疾病相关蛋白确实以足以定量的量存在，则可以选择一种或多于一种疾病相关蛋白。

从不同的角度来看，因此预期所有生物化学和组学分析方法都是合适的，并且合适的疾病相关蛋白包括一种或多于一种代谢物、一种或多于一种膜脂质组分、膜相关蛋白、跨膜蛋白和细胞内蛋白，以及各种核酸。因此，预期的识别方法将变化很大并且包括肿瘤组织的生物化学分析(例如，检测或定量酶活性)、全基因组和/或外显子组测序(例如，检测新表位、遗传重排等)、转录组分析(例如，过表达或低表达)和蛋白质组分析(例如，检测翻译后修饰、表达的蛋白质的量等)。

例如，就疾病相关蛋白而言，蛋白质可以是过表达或突变的蛋白质(例如，激酶、受体、生长因子、转录因子、或信号转导相关蛋白)。需要时，预期的方法还可包括分析可能存在于第一外排体和/或第二外排体中的核酸的步骤。例如，合适的核酸包括如下文进一步描述的双微染色体和RNA。

最典型地，可以使用BAMBAM和/或PARADIGM由组织和匹配的正常样品进行组学(基因组学、转录组学和/或蛋白质组学)分析，这将容易地识别疾病相关蛋白，尤其包括新表位、成药途径的改变(例如，信号传导活性过高，或对药物的敏感性丧失)、驱动基因/突变和与转移相关的基因。然后用适当的药物或免疫疗法治疗将导致表达新表位的细胞减少，并且通过延伸，减少携带新表位的外排体。同样地，用药物治疗可以减少癌细胞上受体的表达，并且通过延伸，减少外排体上表达的受体的量。

更具体地，在其他合适的靶标中，可以使用组学分析(并且在较不优选的方面基因组或其他遗传分析)来识别癌症中是否存在驱动突变，和/或在癌症中与转移相关的基因是否被激活或被抑制。例如，预期的驱动基因突变和驱动突变包括TP53、PIK3CA、KRAS、BRAF、PTEN、MLL3、APC、MLL2、ARID1A、NF1、FAT1、ANK3、MACF1、AHNAK、LAMA2、CDKN2A、EGFR、VHL、PBRM1、FAT2IDH1、NRAS、ATRX、ATM、RB1、NOTCH1、ARID2等。用于识别合适的癌症驱动因子的其他方法和系统可以在Nature Methods 2013,第10卷第11号,1081-4中找到，并且预期的驱动基因和驱动突变的其他实例由Integrative Onco Genomics(Intogen.org)公布。

类似地，存在许多与转移相关的已知基因，并且预期认为所有这些基因适合用于本文。例如，预期的基因包括AKAP12(PKA调节)、BRMS1(转录调节)、Caspase 8(细胞凋亡)、CDH1(细胞黏附)、CDH11(细胞黏附)、CD44(透明质酸受体)、CRSP3(转录调节)、DCC(细胞黏附)、DLC1(Rho-GTP酶活化)、DRG1(血管生成)、GAS1(细胞凋亡)、凝溶胶蛋白(肌动蛋白解聚)、KAI1(细胞凋亡)、KISS1/KISS1R(肿瘤休眠维持)、KLF17(转录调节)、LSD1(染色质重塑)、MAP2K4(MAPKK信号传导)、MKK4(MAPK信号传导)、MAK7(MAPK信号传导)、微RNA-335,126(抑制SOX4、MERTK、PTPRN2、TNC)、Nm23(MAPK信号传导)、PEBP1(Raf激酶抑制)、RhoGDI2(Rho信号传导)、RRM1(PTEN上调)、TXNIP(氧化还原调节)。

此外，组学分析还可以识别被扩增的基因或序列。例如，具有肝转移的结肠直肠癌患者的原发性肿瘤样品显示染色体7p、8q、13q和20q的增加以及染色体1p、8p、9p、14q、17p和22q的缺失。位于染色体缺失区域的基因包括MAP2K4、LLGL1、FBLN1、ELAC2、ALDH3A2、ALDH3A1、SHMT1、ARSA、WNT7B、TNFRSF13B、UPK3A、TYMP、RASD1、PEMT和TOP3A，它们都可能充当转移抑制因子。

一旦确立了与疾病相关的蛋白质和治疗，就在治疗之前获取患者的生物流体(例如，血浆、血清或尿液)，然后使用本领域众所周知的方法(例如，通过非特异性包埋和随后的亲和纯化)从生物学流体中分离或富集外排体。例如，外排体通常从患者的体液中分离。如本文所使用的，术语“体液”是指从对象体内的任何地方分离的流体样品，优选周边位置，包括血液、血浆、血清、尿液、痰、脊髓液、胸膜液、淋巴液、呼吸道流体、肠道流体、泪液、唾液、母乳、腹水和肿瘤囊肿液。

如前所述，外排体的分离可以多种方式进行，包括非特异性方法，例如超速离心和包埋到聚合物网络中(例如，使用ExoQuick^TM，可从System Biosciences,2438EmbarcaderoWay,Palo Alto,CA 94303商购获得)，通过外排体膜联蛋白A5与GlcNAc-碳水化合物共沉淀，以及使用包括CD9、CD63、CD81的外排体特异性表面标志物进行免疫沉淀或磁性分离。当然，应当理解，可以组合所有分离方法以进一步增加外排体的纯度(例如，在采用后续蛋白质分析的情况下)。然而，特别在分析是基于核酸分析的情况下，仅通过包埋的外排体富集可能是合适的。一旦富集或分离完成，外排体然后可经历各种分析过程以确定疾病相关蛋白的存在和/或量。

从生物流体中分离外排体的其他方法包括使用差速离心、超速离心、阴离子交换和/或凝胶渗透色谱、纳米膜超滤、微流体等的那些方法(参见例如US6899863、US 6812023、US 7198923)。在特别优选的方法中，可以使用聚合组合物(例如，(可从System Biosciences,2438Embarcadero Way,Palo Alto,CA 94303商购获得的专利聚合物))、沉淀溶液(例如，Exosome Precipitation Solution^TM，可从Macherey-Nagel Inc.,2850Emrick Blvd.,Bethlehem,PA 18020商购获得的专利溶液)非特异性地分离外排体。同样，合适的离心方案是众所周知的(参见例如Methods Mol Biol.2015；1295:179-209；Scientific Reports 5,Article number:17319(2015))。

此外，还可以进一步富集源自特定细胞类型的那些外排体，特定细胞类型例如肺、胰腺、胃、肠、膀胱、肾、卵巢、睾丸、皮肤、结肠直肠、乳腺、前列腺、脑、食管、肝脏、胎盘等。由于外排体通常携带来自其供体细胞的表面分子/抗原，表面分子/抗原可用于识别、分离和/或富集来自特定供体细胞类型的外排体。这样，可以分析源自不同细胞群的外排体的蛋白质和/或核酸含量。例如，肿瘤(恶性和非恶性)外排体将携带肿瘤相关或肿瘤特异性表面抗原，并且可以通过这些抗原检测、分离和/或富集。例如，合适的抗原包括上皮细胞黏附分子(EpCAM)，其特异于来自肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、头颈癌和肝来源的癌的外排体，但不特异于血液细胞来源的癌的外排体。在另一个实例中，表面抗原是CD24，其是对尿液外排体有特异性的糖蛋白。在又一个实例中，表面抗原可以是CD70、癌胚抗原(CEA)、EGFR、EGFRvIII、Fas配体、TRAIL、转铁蛋白受体、HSP72等。

另外，还可以基于对特定肿瘤和患者有特异性的新表位分离肿瘤特异性外排体，其中通过如上所述的组学分析进行新表位的识别。可以使用抗体(最典型的是合成抗体)和例如通过噬菌体展示、mRNA展示等识别的那些其他高亲和力结合物分离这样的外排体。在WO 2016/172722中公开了产生针对新表位的高亲和力结合物的示例性方法。

此外，还可以使用对所需表面抗原具有特异性的抗体、适配子、适配子类似物或分子印迹聚合物来实现从特定细胞类型中分离外排体。在一个实施方案中，表面抗原对癌症类型具有特异性。在另一个实施方案中，表面抗原对于不一定是癌性的细胞类型是特异性的。US 7198923中提供了基于细胞表面抗原的外排体分离方法的一个实例。如例如US5840867、US 5582981和WO/2003/050290中所述，适配子及其类似物特异性结合表面分子，并且可用作回收细胞类型特异性外排体的分离工具。分子印迹聚合物还特异性识别表面分子，如US 6525154、US 7332553和US 7384589中所述，并且适用于分离细胞类型特异性外排体。

一旦从患者的生物流体中分离外排体，就可以进行蛋白质和/或核酸分析。在这种情况下，应当理解，蛋白质可以位于外排体的腔内、与膜结合、或在外排体的表面上(例如，作为跨膜蛋白的胞外域，或作为膜相关蛋白)。因此，应该注意，可以使用各种化学试剂裂解或以其他方式处理外排体，并且特别考虑的试剂包括一种或多于一种洗涤剂、离液剂。同样地，外排体也可以用蛋白酶处理以释放膜结合蛋白。或者或另外地，外排体也可以经历物理过程(例如，超声处理、电穿孔等)以使疾病相关蛋白质可释放或可及。另一方面，外排体也可用于蛋白质分析而无需进一步处理(例如，其中疾病相关蛋白存在于外排体表面并用可检测的标签检测或定量)。

最典型地，使用质谱反应监测确定疾病相关蛋白的存在和量，尤其是使用选择反应监测(SRM)、连续反应监测(CRM)、多反应监测(MRM)或平行反应监测(PRM)。或者，外排体上的蛋白质分析可以以各种其他方式进行，包括蛋白质印迹法，ELISA测试，结合磁珠用于FACS或其他光学分析，以及各种质谱技术，并且可用外排体和特定疾病相关蛋白质的量将至少部分地决定所使用的分析类型。

如前所述，通常优选在治疗(例如，化学疗法和/或免疫疗法)之前确定和定量疾病相关蛋白。关于开始治疗后进行疾病相关蛋白的确定，预期这种确定可以通过在适合于跟踪疾病相关蛋白的任何方案下进行。例如，可以以常规方式(例如，每周或每月一次或两次)或遵循其他参数(例如，在施用靶向疾病相关蛋白的药物后12小时或24小时，和/或作为超声、放射学或其他断层扫描程序后的补充测试)进行确定。同样地，疾病相关蛋白质不需要在治疗过程中固定，但可以根据观察到的治疗效果、活组织检查结果、随后的组学分析等而变化。

在进一步预期的方面，从外排体中提取核酸(DNA、RNA、siRNA、shRNA、miRNA等)可能是有益的或者是期望的。可以使用任何数量的方法从外排体中分离核酸分子，所有这些方法都是本领域众所周知的，并且具体的分离方法将取决于特定的生物样品和核酸的类型。例如，在核酸是RNA的情况下，RNA可以在进一步扩增之前逆转录成互补DNA。这种逆转录可以单独进行或与扩增步骤组合进行。结合逆转录和扩增步骤的方法的一个实例是逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，其可以进一步修改为定量的，如US 5639606中所述。其他实例包括杂交(RNA印记/DNA印迹)以捕获寡核苷酸，尤其是在核酸序列是已知或疑似的情况下。此外，外排体中核酸的分析可以是定量的或定性的。对于定量分析，可以用本领域已知的方法测量外排体内感兴趣的特定核酸的相对或绝对的量(表达水平)。对于定性分析，外排体内感兴趣的特定核酸的种类，无论是野生型还是变体，也可以用本领域已知的方法来识别。

此外，预期还可以分析体液中的一种或多于一种以下循环核酸：循环游离RNA(cfRNA)、循环肿瘤RNA(ctRNA)、循环游离DNA(cfDNA)和循环肿瘤DNA(ctDNA)。这种分析可以有益地为外排体蛋白质分析提供另外的信息，并且可以用相同的生物流体进行。

例如，ctRNA可以用作敏感的、选择性的和定量的标志物，用于结合外排体蛋白质分析来诊断和监测治疗，并且有利地允许重复和非侵入性地从患者的相同生物学流体中取样。在大多数典型方面，ctRNA从全血中分离，所述全血在保持细胞完整性的条件下加工(以避免被裂解的RNA污染或以其他方式损害细胞)并稳定ctRNA和/或ctDNA。一旦与非核酸组分分离，优选使用实时定量PCR定量循环核酸(当然，如上所述的其他循环核酸也被认为适合用于本文)。

最典型地，生物流体与从其中分离外排体的生物流体相同。然而，本文还考虑了独立采样。因此，适当的流体包括唾液、腹水、脊髓液、尿液等，其可以是新鲜的或保存/冷冻的。例如，对于合适的分析，可以接受标本为吸入分别含有RNA或DNA稳定剂的无细胞RNA管或无细胞DNA管中的10ml全血。有利地，ctRNA在无细胞RNA BCT管中的全血中稳定7天，而ctDNA在无细胞DNA BCT管中的全血中稳定14天，从而使得在从世界各地运送患者样品的时间内没有ctRNA或ctDNA的降解。此外，通常优选使用RNA稳定剂分离ctRNA，所述RNA稳定剂不会或基本上不会(例如，等于或小于1％，或等于或小于0.1％，或等于或小于0.01％，或等于或小于0.001％)裂解血细胞。从不同的角度来看，RNA稳定剂不会导致试剂与血液结合后，血清或血浆中的RNA量显著增加(例如，总RNA增加不超过10％，或不超过5％，或不超过2％，或不超过1％)。当然，应该认识到许多其他收集方式也被认为是合适的，并且ctRNA和/或ctDNA可以至少部分纯化或吸附到固相上，从而在进一步加工之前增加稳定性。

容易理解的是，血浆的分离以及ctDNA和ctRNA的提取可以以多种方式进行。在一个示例性优选方面，将10mL管中的全血在1600rcf下离心20分钟以分离血浆。然后分离由此获得的血浆并以16000rcf离心10分钟以除去细胞碎片。当然，只要离心不会导致大量的细胞裂解(例如，对于所有细胞裂解不超过1％，或不超过0.1％，或不超过0.01％，或者不超过0.001％)，各种替代的离心方案也被认为是合适的。使用Qiagen试剂从2mL血浆中提取ctDNA和ctRNA。提取方案优选设计用以除去潜在的污染性血细胞、其他杂质，并在提取过程中保持核酸的稳定性。将所有核酸保存在有条形码的基质储存管中，DNA保存在-4℃下，RNA保存在-80℃下或逆转录成cDNA，然后储存在-4℃下。值得注意的是，可以在进一步加工之前冷冻由此分离的ctRNA。

分离的ctRNA的定量可以以多种方式进行，然而，分析物的表达优选通过使用对每种基因特异的引物进行ct-cDNA的定量实时PCR来测量。例如，可以使用含有2μLcDNA、引物和探针的10μL反应混合物的试验进行扩增。β-肌动蛋白可用作ct-cDNA输入水平的内部对照。每个PCR板中可以包括具有已知浓度的每种分析物的样品的标准曲线以及每种基因的阳性和阴性对照。由每个分析物的定量PCR(qPCR)扩增得到的Ct值减去每个患者的血液样品的β-肌动蛋白的Ct值来计算ΔCt(dCT)。使用基因表达值为10的通用人参考RNA的系列稀释度的ΔCt的标准曲线计算患者样本的相对表达(当将ΔCT相对于每种分析物浓度的对数作图时)。

关于合适的靶标核酸，应当理解，合适的靶标包括与疾病和/或疾病治疗相关的所有基因。例如，疾病靶标包括一种或多于一种癌症相关基因、癌症特异性基因，具有患者和肿瘤特异性突变的基因(新表位)、癌症驱动基因和已知在癌症中过表达的基因。更进一步考虑的靶标核酸包括编码疾病相关蛋白的核酸。因此，合适的靶标包括编码“功能性”蛋白质(例如，酶、受体、转录因子等)和编码“非功能性”蛋白质(例如结构蛋白质、微管蛋白等)的那些靶标，以及编码新表位的靶标。从不同的角度来看，合适的靶标还包括特异于患病细胞或器官的靶标(例如，PCA3、PSA等)，或癌症患者中常见的靶标，包括KRAS中的各种突变(例如，G12V、G12D、G12C等)或BRAF(例如V600E)、新表位、检查点抑制剂配体(例如PD-L1)等。

用于检测和定量ctRNA以及检测和/或定量来自外排体的疾病相关蛋白的更其他合适的靶标包括编码以下一种或多于一种的RNA：ABL1、ABL2、ACTB、ACVR1B、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、AMER11，APC，AR，ARAF，ARFRP1，ARID1A，ARID1B，ASXL1，ATF1，ATM，ATR，ATRX，AURKA，AURKB，AXIN1，AXL，BAP1，BARD1，BCL2，BCL2L1，BCL2L2，BCL6，BCOR，BCORL1，BLM，BMPR1A，BRAF，BRCA1，BRCA2，BRD4，BRIP1，BTG1，BTK，EMSY，CARD11，CBFB，CBL，CCND1，CCND2，CCND3，CCNE1，CD274，CD79A，CD79B，CDC73，CDH1，CDK12，CDK4，CDK6，CDK8，CDKN1A，CDKN1B，CDKN2A，CDKN2B，CDKN2C，CEA，CEBPA，CHD2，CHD4，CHEK1，CHEK2，CIC，CREBBP，CRKL，CRLF2，CSF1R，CTCF，CTLA4，CTNNA1，CTNNB1，CUL3，CYLD，DAXX，DDR2，DEPTOR，DICER1，DNMT3A，DOT1L，EGFR，EP300，EPCAM，EPHA3，EPHA5，EPHA7，EPHB1，ERBB2，ERBB3，ERBB4，EREG，ERG，ERRFI1，ESR1，EWSR1，EZH2，FAM46C，FANCA，FANCC，FANCD2，FANCE，FANCF，FANCG，FANCL，FAS，FAT1，FBXW7，FGF10，FGF14，FGF19，FGF23，FGF3，FGF4，FGF6，FGFR1，FGFR2，FGFR3，FGFR4，FH，FLCN，FLI1，FLT1，FLT3，FLT4，FOLH1，FOXL2，FOXP1，FRS2，FUBP1，GABRA6，GATA1，GATA2，GATA3，GATA4，GATA6，GID4，GLI1，GNA11，GNA13，GNAQ，GNAS，GPR124，GRIN2A，GRM3，GSK3B，H3F3A，HAVCR2，HGF，HNF1A，HRAS，HSD3B1，HSP90AA1，IDH1，IDH2，IDO，IGF1R，IGF2，IKBKE，IKZF1，IL7R，INHBA，INPP4B，IRF2，IRF4，IRS2，JAK1，JAK2，JAK3，JUN，MYST3，KDM5A，KDM5C，KDM6A，KDR，KEAP，KEL，KIT，KLHL6，KLK3，MLL，MLL2，MLL3，KRAS，LAG3，LMO1，LRP1B，LYN，LZTR1，MAGI2，MAP2K1，MAP2K2，MAP2K4，MAP3K1，MCL1，MDM2，MDM4，MED12，MEF2B，MEN1，MET，MITF，MLH1，MPL，MRE11A，MSH2，MSH6，MTOR，MUC1，MUTYH，MYC，MYCL，MYCN，MYD88，MYH，NF1，NF2，NFE2L2，NFKB1A，NKX2-1，NOTCH1，NOTCH2，NOTCH3，NPM1，NRAS，NSD1，NTRK1，NTRK2，NTRK3，NUP93，PAK3，PALB2，PARK2，PAX3，PAX，PBRM1，PDGFRA，PDCD1，PDCD1LG2，PDGFRB，PDK1，PGR，PIK3C2B，PIK3CA，PIK3CB，PIK3CG，PIK3R1，PIK3R2，PLCG2，PMS2，POLD1，POLE，PPP2R1A，PREX2，PRKAR1A，PRKC1，PRKDC，PRSS8，PTCH1，PTEN，PTPN11，QK1，RAC1，RAD50，RAD51，RAF1，RANBP1，RARA，RB1，RBM10，RET，RICTOR，RIT1，RNF43，ROS1，RPTOR，RUNX1，RUNX1T1，SDHA，SDHB，SDHC，SDHD，SETD2，SF3B1，SLIT2，SMAD2，SMAD3，SMAD4，SMARCA4，SMARCB1，SMO，SNCAIP，SOCS1，SOX10，SOX2，SOX9，SPEN，SPOP，SPTA1，SRC，STAG2，STAT3，STAT4，STK11，SUFU，SYK，T(BRACHYURY)，TAF1，TBX3，TERC，TERT，TET2，TGFRB2，TNFAIP3，TNFRSF14，TOP1，TOP2A，TP53，TSC1，TSC2，TSHR，U2AF1，VEGFA，VHL，WISP3，WT1，XPO1，ZBTB2，ZNF217，ZNF703，CD26，CD49F，CD44，CD49F，CD13，CD15，CD29，CD151，CD138，CD166，CD133，CD45，CD90，CD24，CD44，CD38，CD47，CD96，CD 45，CD90，ABCB5，ABCG2，ALCAM，ALPHA-FETOPROTEIN，DLL1，DLL3，DLL4，ENDOGLIN，GJA1，OVASTACIN，AMACR，NESTIN，STRO-1，MICL，ALDH，BMI-1，GLI-2，CXCR1，CXCR2，CX3CR1，CX3CL1，CXCR4，PON1，TROP1，LGR5，MSI-1，C-MAF，TNFRSF7，TNFRSF16，SOX2，PODOPLANIN，L1CAM，HIF-2ALPHA，TFRC，ERCC1，TUBB3，TOP1，TOP2A，TOP2B，ENOX2，TYMP，TYMS，FOLR1，GPNMB，PAPPA，GART，EBNA1，EBNA2，LMP1，BAGE，BAGE2，BCMA，C10ORF54，CD4，CD8，CD19，CD20，CD25，CD30，CD33，CD80，CD86，CD123，CD276，CCL1，CCL2，CCL3，CCL4，CCL5，CCL7，CCL8，CCL11，CCL13，CCL14，CCL15，CCL16，CCL17，CCL18，CCL19，CCL20，CCL21，CCL22，CCL23，CCL24，CCL25，CCL26，CCL27，CCL28，CCR1，CCR2，CCR3，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR8，CCR9，CCR10，CXCL1，CXCL2，CXCL3，CXCL5，CXCL6，CXCL9，CXCL10，CXCL11，CXCL12，CXCL13，CXCL14，CXCL16，CXCL17，CXCR3，CXCR5，CXCR6，CTAG1B，CTAG2，CTAG1，CTAG4，CTAG5，CTAG6，CTAG9，CAGE1，GAGE1，GAGE2A，GAGE2B，GAGE2C，GAGE2D，GAGE2E，GAGE4，GAGE10，GAGE12D，GAGE12F，GAGE12J，GAGE13，HHLA2，ICOSLG，LAG1，MAGEA10，MAGEA12，MAGEA1，MAGEA2，MAGEA3，MAGEA4，MAGEA4，MAGEA5，MAGEA6，MAGEA7，MAGEA8，MAGEA9，MAGEB1，MAGEB2，MAGEB3，MAGEB4，MAGEB6，MAGEB10，MAGEB16，MAGEB18，MAGEC1，MAGEC2，MAGEC3，MAGED1，MAGED2，MAGED4，MAGED4B，MAGEE1，MAGEE2，MAGEF1，MAGEH1，MAGEL2，NCR3LG1，SLAMF7，SPAG1，SPAG4，SPAG5，SPAG6，SPAG7，SPAG8，SPAG9，SPAG11A，SPAG11B，SPAG16，SPAG17，VTCN1，XAGE1D，XAGE2，XAGE3、XAGE5、XCL1、XCL2、和XCR1。当然，应该理解的是，上述基因可以是野生型或突变型，包括错义或无义突变、插入、缺失、融合和/或易位，所有这些都可能会或可能不会导致由这种RNA表达的蛋白质形成新表位。这些识别的ctRNA还可以作为选择靶向上述基因产物的药物治疗的基础。此外，将疾病相关蛋白的定量或定性分析与ctRNA的定量或定性分析相结合，不仅可以提供对可用治疗的理解，还可以从相同或互补的有利方面监测疾病状态和/或治疗效果。例如，虽然来自生物流体(例如，血液)的组学分析可以识别随后进行外排体蛋白质分析的成药靶标，但是相同的生物流体也可以提供免疫状态的信息，例如通过检测PD-L1ctRNA，或其他肿瘤特异性标志物的信息。

应当理解，通过使用从外排体获得的疾病相关蛋白，实现了各种优点。除此之外，当疾病相关蛋白不是突变蛋白和/或存在于非患病细胞中时，这样的蛋白仍然可以被定量，因为癌细胞比健康细胞产生/释放到循环中的外排体的量显著更高。此外，如本文所要求保护的外排体的使用允许实时(即，在抽血或生物流体分离后数小时或数天内)检测治疗效果，而无需获得进一步的肿瘤活组织切片。此外，可以检测和定量肿瘤细胞或其他患病细胞的细胞内蛋白质(经由外排体代理)，而不需要肿瘤活组织检查。当从残留的和/或循环的肿瘤细胞中检测到疾病相关蛋白质时，这是特别有益的，否则这些肿瘤细胞将是不可见的或不可获得的。

特别是在疾病相关蛋白是新表位的情况下，应该注意检测/定量的新表位将与免疫疗法的效果直接相关。此外，外排体疾病相关蛋白也可用于识别克隆的群、抗性和/或对检查点抑制的易感性。在其他所述的优点中，即使在没有肿瘤生长的情况下，也可以监测外排体疾病相关蛋白。因此，外排体的疾病相关蛋白特别适用于肿瘤具有治疗抗性和/或已经历其他变化的情况。

因此，应当理解，发明人在本发明主题的一个方面预期一种监测被诊断患有癌症的患者的持续治疗的方法，其中使用多个组学数据来首先识别一种或多于一种疾病相关蛋白。然后在靶向疾病相关蛋白的治疗之前从患者的生物流体获得的第一外排体中确定疾病相关蛋白的存在和/或量(例如，靶向激酶、受体、或受体的配体的化学疗法，或靶向肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原或新表位等的免疫疗法等)。之后，在治疗期间或治疗之后从患者的生物流体获得的第二外排体中确定疾病相关蛋白的存在和/或量。然后基于确定第二外排体中疾病相关蛋白的存在和/或量来更新患者记录(例如，包括修改治疗的建议)。

因此，从不同的角度来看，发明人还预期选择外排体标志物的方法。特别优选的选择方法包括使用多个组学数据识别一种或多于一种疾病相关蛋白，以及识别靶向疾病相关蛋白的药物(其他治疗)的步骤。在另一个步骤中，然后在外排体中确定疾病相关蛋白的存在和/或量，其中在治疗之前从患者的生物流体中获得外排体，并且在确定疾病相关蛋白以足以定量的量(例如，使用质谱确定时，为阿托摩尔级的疾病相关蛋白)存在时，选择疾病相关蛋白。

同样，发明人因此也预期一种监测患者治疗的方法。这种方法优选包括确定第一外排体中一种或多于一种疾病相关蛋白的存在和/或量的步骤，在治疗之前从患者的生物流体获得所述第一外排体(例如，靶向激酶、受体、或受体配体的化学疗法，或靶向肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原、或新表位的免疫疗法等)，其中治疗靶向疾病相关蛋白，以及确定第二外排体中的疾病相关蛋白的存在和/或量的另一步骤，其中在治疗期间或治疗之后从患者的生物流体中获得第二外排体。最典型地，使用质谱反应监测进行确定步骤。

鉴于上述情况，因此应当理解，可以通过在预处理确定中确定外排体中或外排体上的疾病相关蛋白的存在和/或量来监测患者的治疗，其中通常从患者的生物流体中获得外排体，其中所述治疗靶向疾病相关蛋白。在治疗期间或之后，再次确定在外排体中或在外排体上(其再次从患者的生物流体中分离)的疾病相关蛋白的存在和/或量。最优选地，使用质谱反应监测，特别是选择反应监测(SRM)进行疾病相关蛋白的测定。

除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。关于本文的一些实施方案提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明要求保护的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示对于本发明的实践必不可少的任何未声明的要素。

应当注意，针对计算机的任何语言应解读为包括任何合适的计算设备组合，包括服务器、接口、系统、数据库、代理、对等设备、引擎、控制器、或单独或共同操作的其他类型的计算设备。应当理解，计算设备包括处理器，该处理器被配置为执行存储在有形、非暂时性计算机可读存储介质(例如，硬盘驱动器、固态驱动器、RAM、闪存、ROM等)上的软件指令。软件指令优选地配置计算设备以关于所公开的设备提供所讨论的作用、职责或其他功能。在特别优选的实施方案中，各种服务器、系统、数据库或接口使用标准化协议或算法交换数据，可能基于HTTP、HTTPS、AES、公钥-私钥交换、web服务API、已知金融交易协议、或其他电子信息交换方法。优选地，数据交换通过分组交换网络、因特网、LAN、WAN、VPN或其他类型的分组交换网络进行。

本文公开的本发明的替代要素或实施方案的分组不应解释为限制。每个组成员可以单独地或与该组中的其他成员或本文中其他要素任意组合地提及和要求保护。出于方便和/或可专利性的原因，可以将一个或多于一个组成员包括在组中或从组中删除。当进行任何这样的包含或删除时，本说明书在此被认为包含经修改的组，从而实现所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。如在本文的说明书和权利要求中不使用数量词可以表示“一个”，但是其也符合多个参照物的意思，除非上下文另有明确说明。此外，如在本文的描述中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则“在……中”的含义包括“在...中”和“在……上”。而且，如本文所使用的，并且除非上下文另有说明，否则术语“连接”旨在包括直接连接(其中两个彼此连接的元件彼此接触)和间接连接(其中两个元件之间存在至少一个其他元件)。因此，术语“连接”和“与……连接”同义使用。

对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的可行的修改外可以进行更多的修改。因此，除了所附权利要求的范围之外，不限制本发明的主题。此外，在解释说明书和权利要求时，所有术语应以与上下文一致的最广泛的方式解释。特别地，术语“包括”和“包含”应该被解释为以非排他的方式指代元素、组分或步骤，指示所引用的元素、组分或步骤可以存在，或者被利用或与未明确引用的其它元素、组分或步骤组合。当说明书权利要求涉及选自A、B、C...和N中的至少一种时，文本应解释为只需要其中的一种元件，而不是A加N、或B加N等。

Claims (60)

1.一种监测患者治疗的方法，其包括：

使用多个组学数据识别患者特异性疾病相关蛋白；

确定第一外排体中所述患者特异性疾病相关蛋白的存在和量的至少一个，其中所述第一外排体是在治疗前从患者的生物流体中获得的；

其中所述治疗靶向患者特异性疾病相关蛋白；

确定第二外排体中所述患者特异性疾病相关蛋白的存在和量的至少一个，其中所述第二外排体是在治疗期间或治疗之后从患者的生物流体中获得的；

基于第二外排体中患者特异性疾病相关蛋白的存在和量中的至少一个的确定来更新患者记录。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个组学数据选自全基因组测序数据、外显子组测序数据、转录组测序数据和蛋白组测序数据。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个组学数据包括患病组织的组学数据和匹配的正常组织的组学数据。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用途径分析算法来识别所述患者特异性疾病相关蛋白。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述途径分析算法是PARADIGM。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者特异性疾病相关蛋白是过表达的蛋白或突变的蛋白。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者特异性疾病相关蛋白是激酶、受体、生长因子、转录因子或信号转导相关蛋白，其中所述治疗包括靶向激酶、受体、生长因子、转录因子或信号转导相关蛋白的化学疗法。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者特异性疾病相关蛋白是患者和肿瘤特异性新表位，其中所述治疗包括靶向患者和肿瘤特异性新表位的免疫疗法。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括分析在所述第一外排体和第二外排体的至少一个中存在的核酸的步骤，任选地其中所述核酸是双微染色体。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用质谱反应监测来确定所述患者特异性疾病相关蛋白的存在和量。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述质谱反应监测选自选择反应监测、连续反应监测、多反应监测和平行反应监测。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用非特异性包埋和抗体介导的捕获中的至少一种来分离外排体。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物流体是全血、血清、血浆或尿液。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中重复确定所述第二外排体中所述患者特异性疾病相关蛋白的存在和量中的至少一个的步骤至少一次。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中更新患者记录的步骤包括修改治疗的建议。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个组学数据包括患病组织的组学数据和匹配的正常组织的组学数据。

17.根据权利要求1所述的方法，其中使用途径分析算法来识别所述患者特异性疾病相关蛋白。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述途径分析算法是PARADIGM。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者特异性疾病相关蛋白是过表达的蛋白或突变的蛋白。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者特异性疾病相关蛋白是激酶、受体、生长因子、转录因子或信号转导相关蛋白，其中所述治疗包括靶向激酶、受体、生长因子、转录因子或信号转导相关蛋白的化学疗法。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者特异性疾病相关蛋白是患者和肿瘤特异性新表位，其中所述治疗包括靶向患者和肿瘤特异性新表位的免疫疗法。

22.根据权利要求1所述的方法，其还包括分析在所述第一外排体和第二外排体的至少一个中存在的核酸的步骤，任选地其中所述核酸是双微染色体。

23.根据权利要求1所述的方法，其中使用质谱反应监测来确定所述患者特异性疾病相关蛋白的存在和量。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述质谱反应监测选自选择反应监测、连续反应监测、多反应监测和平行反应监测。

25.根据权利要求1所述的方法，其中使用非特异性包埋和抗体介导的捕获中的至少一种来分离外排体。

26.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物流体是全血、血清、血浆或尿液。

27.根据权利要求1所述的方法，其中重复确定所述第二外排体中所述患者特异性疾病相关蛋白的存在和量中的至少一个的步骤至少一次。

28.根据权利要求1所述的方法，其中更新患者记录的步骤包括修改治疗的建议。

29.一种选择用于监测治疗的外排体标志物的方法，其包括：

使用多个组学数据识别患者特异性疾病相关蛋白，以及识别靶向所述患者特异性疾病相关蛋白的治疗组合物；

确定外排体中所述患者特异性疾病相关蛋白的存在和量的至少一个，其中所述外排体是在治疗前从患者的生物流体中获得的；

在确定患者特异性疾病相关蛋白以足以定量的量存在时，选择该疾病相关蛋白用于监测治疗。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述多个组学数据选自全基因组测序数据、外显子组测序数据、转录组测序数据和蛋白组测序数据。

31.根据权利要求29或30所述的方法，其中使用途径分析算法来识别所述患者特异性疾病相关蛋白。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述途径分析算法是PARADIGM。

33.根据权利要求29至32中任一项所述的方法，其中所述多个组学数据包括患病组织的组学数据和匹配的正常组织的组学数据。

34.根据权利要求29至33中任一项所述的方法，其中所述疾病是癌症。

35.根据权利要求29至34中任一项所述的方法，其中所述患者特异性疾病相关蛋白是过表达的蛋白或突变的蛋白。

36.根据权利要求29至35中任一项所述的方法，其中所述患者特异性疾病相关蛋白是激酶、受体、生长因子、转录因子或信号转导相关蛋白，其中所述治疗包括靶向激酶、受体、生长因子、转录因子或信号转导相关蛋白的化学疗法。

37.根据权利要求29至35中任一项所述的方法，其中所述患者特异性疾病相关蛋白是患者和肿瘤特异性新表位，其中所述治疗包括靶向患者和肿瘤特异性新表位的免疫疗法。

38.根据权利要求29至37中任一项所述的方法，其中使用质谱反应监测来确定所述患者特异性疾病相关蛋白的存在和量。

39.根据权利要求29至38中任一项所述的方法，其中足以定量的量是至少阿托摩尔级的疾病相关蛋白。

40.根据权利要求29所述的方法，其中所述多个组学数据是差异组学数据。

41.根据权利要求29所述的方法，其中使用途径分析算法来识别所述患者特异性疾病相关蛋白。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述途径分析算法是PARADIGM。

43.根据权利要求29所述的方法，其中所述多个组学数据包括患病组织的组学数据和匹配的正常组织的组学数据。

44.根据权利要求29所述的方法，其中所述疾病是癌症。

45.根据权利要求29所述的方法，其中所述患者特异性疾病相关蛋白是过表达的蛋白或突变的蛋白。

46.根据权利要求29所述的方法，其中所述患者特异性疾病相关蛋白是激酶、受体、生长因子、转录因子或信号转导相关蛋白，其中所述治疗包括靶向激酶、受体、生长因子、转录因子或信号转导相关蛋白的化学疗法。

47.根据权利要求29所述的方法，其中所述患者特异性疾病相关蛋白是患者和肿瘤特异性新表位，其中所述治疗包括靶向患者和肿瘤特异性新表位的免疫疗法。

48.根据权利要求29所述的方法，其中使用质谱反应监测来确定所述患者特异性疾病相关蛋白的存在和量。

49.根据权利要求29所述的方法，其中足以定量的量是至少阿托摩尔级的疾病相关蛋白。

50.一种监测患者的免疫疗法治疗的方法，其包括：

确定第一外排体中患者和肿瘤特异性新表位的存在和量的至少一个，其中所述第一外排体是在治疗前从患者的生物流体中获得的，其中所述治疗靶向患者和肿瘤特异性新表位；

确定第二外排体中患者和肿瘤特异性新表位的存在和量的至少一个，其中所述第二外排体是在治疗期间或治疗之后从患者的生物流体中获得的；并且

其中使用质谱反应监测进行确定步骤。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述免疫疗法治疗包括施用含有编码患者和肿瘤特异性新表位的核酸的重组实体。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述重组实体是腺病毒，其任选地为复制缺陷型。

53.根据权利要求51所述的方法，其中所述重组实体是经辐照的细菌或经辐照的酵母。

54.根据权利要求50至53中任一项所述的方法，其还包括分析在所述第一外排体和第二外排体的至少一个中存在的核酸的步骤。

55.根据权利要求50至54中任一项所述的方法，其还包括分析在所述生物流体中的循环肿瘤RNA的步骤。

56.根据权利要求50至55中任一项所述的方法，其中所述质谱反应监测选自选择反应监测、连续反应监测、多反应监测和平行反应监测。

57.根据权利要求50所述的方法，其还包括分析在所述第一外排体和第二外排体的至少一个中存在的核酸的步骤。

58.根据权利要求50所述的方法，其还包括分析在所述生物流体中的循环肿瘤RNA的步骤。

59.根据权利要求50所述的方法，其中所述质谱反应监测选自选择反应监测、连续反应监测、多反应监测和平行反应监测。

60.根据权利要求50所述的方法，其中所述免疫疗法治疗包括施用检查点抑制剂和免疫刺激细胞因子中的至少一种。