JP6938584B2 - 細胞外小胞による疾患の診断方法 - Google Patents

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Description

本出願は、２０１８年８月３０日に提出された米国仮出願第６２／７２４，６４５号の優先権を主張し、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、疾患の予測及び治療の分野に関する。より具体的には、本開示は、被験体の細胞外小胞（ＥＶ）における１つ以上の標的分子の発現レベルを決定することにより、治療を必要とする被験体を特定し、特定された結果に基づいて、疾患を予測し、被験体に適切な治療を施す方法に関する。
細胞外小胞（ＥＶ）は、細胞由来の膜小胞であり、組織液の様々な由来源（血液、尿、脳脊髄液、胸水、腹水、母乳、羊水、産道、胃腸管、気管支肺胞洗浄液及び唾液を含む）に存在する。ＥＶは、ドナー細胞（例えば、内皮細胞、上皮細胞、リンパ球、又はがん細胞）又は遠隔組織（例えば、脳、心臓、膵臓、骨髄、肺、腎臓、又は胎盤）から放出され、エンドサイトーシス、膜融合又は特異的なリガンド受容体の内在化を介して受容細胞に取り込まれることによって、ＥＶの内容物（例えば、核酸、リポ多糖、タンパク質及び／又は脂質）をドナー細胞から受容細胞に送達する。ＥＶは、臓器の発達、細胞間コミュニケーション、腫瘍の転移、免疫関連疾患（例えば、自己免疫疾患、変性疾患又は炎症性疾患）の発症と進行など、様々な生理学的及び病理学的反応を媒介することが知られている。
ＥＶの内容物は、ドナー細胞の状態に反映しているため、診断、予後、及び疫学の応用において候補分子として使用することができる。しかし、生理学的及び病理学的反応の複雑さと予測不能性に基づいて、疾患（例えば、がん、変性疾患、又は感染症）及び／又は症状（例えば、老化）に関連する特異的ＥＶバイオマーカーを特定する必要性がある。当業者は、これらのＥＶバイオマーカーを分析することにより、疾患又は症状の発生を正確に予測又は診断し、被験体に適切な治療を迅速に施すことができる。
以下は、読者に基本的な理解を提供するために、本開示の簡略化された概要を示す。この概要は、本開示の広範な概略ではなく、本発明の肝心／重要な要素を特定したり、本発明の範囲を限定したりするものではない。その唯一の目的は、後で提示するより詳細な説明の前置きとして、本明細書で開示するいくつかの概念を簡略化した形で提示することである。
本明細書で具体化され、広く説明されるように、本開示の一態様は、被験体の生体サンプルからがん、変性疾患、感染症又は老化を診断又は予後する方法に関する。当該方法は、
生体サンプルから複数の細胞外小胞（ＥＶ）を分離するステップ（ａ）と、
上記複数のＥＶの標的分子の発現レベルを決定するステップ（ｂ）と、
ステップ（ｂ）で決定された標的分子の発現レベルに基づいて、がん、変性疾患、感染症又は老化を診断又は予後し、上記複数のＥＶの標的分子の発現レベルが健康な被験者から得られた参照サンプルの発現レベルと異なる場合、上記被験体は、がん、変性疾患若しくは感染症を患っているか、又は発症するリスクがあるか、或いは老化状態にあることを示すステップ（ｃ）と、を含む。
本開示において、１つ以上の標的分子の発現パターンは、１つ以上の標的分子に対する結合親和性を示すユニークな抗体及び／又は新規アプタマーを有する二重特異性及び多重特異性モジュールによって真に設計及び検出され、シグナル強度の増幅に使用される。
本開示の実施形態によれば、がんの診断又は予後において、ＥＶにおける標的分子は、Ｅ−カドヘリン、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、ダームシジン、ＥＦハンドドメイン１を有する細胞成長制御因子（ＣＧＲＥＦ１）、コクリン、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、ロイシンリッチα２糖タンパク質（ＬＲＧ）、グアニンデアミナーゼ、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）、ムチン５ＡＣ（Ｍｕｃ５ＡＣ）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４１０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６−５ｐ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。
変性疾患の診断又は予後において、ＥＶにおける標的分子は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、フラクタルカイン、α−シヌクレイン、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、ＩＦＮ−γ、成長調節タンパク質（ＧＲＯ）、インターロイキン（ＩＬ）−１０、単球走化性タンパク質３（ＭＣＰ−３）、エキソソームＤＮＡ（ｅｘｏＤＮＡ）、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される
感染症の診断又は予後において、ＥＶにおける標的分子は、核酸、リポ多糖、脂質及び／又はタンパク質、例えば、非構造タンパク質１（ＮＳ−１）である。
老化の診断又は予後において、ＥＶにおける標的分子は、α−シヌクレイン、Ｌ１ＣＡＭ、Ｓ１００Ａ８、ＥＧＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＧＲＯ、インターロイキン−１受容体拮抗薬（ＩＬ−１ＲＡ）、ＩＬ−１α、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、インターフェロンガンマ誘発タンパク質１０（ＩＰ−１０）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、フラクタルカイン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、ｅｘｏＤＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。
本開示の実施形態によれば、上記複数のＥＶのそれぞれは、その内及び／又はその上で発現される少なくとも１つのマーカーを有し、上記マーカーがＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）、ＨＳＰ９０及びＨＳＰ１０５からなる群より選択されること、及び３０から４５０ｎｍの粒子サイズを有することを特徴とする。
本発明の方法により診断又は予測されるのに適したがんの例は、胃がん、肺がん、膀胱がん、乳がん、膵臓がん、腎がん、大腸がん、子宮頸がん、卵巣がん、脳腫瘍、前立腺がん、肝細胞がん、黒色腫、食道がん、多発性骨髄腫、及び頭頸部がんを含むが、これらに限定されない。
本発明の方法により診断又は予測されるのに適した変性疾患の非限定的な例は、パーキンソン病、アルツハイマー病、認知症、ストローク、慢性腎臓病、慢性肺疾患、良性前立腺肥大及び難聴を含む。
本発明の方法により診断又は予測されるのに適した感染症は、細菌、ウイルス又は真菌によって引き起こされ得る。
本開示の特定の実施形態によれば、上記生体サンプルは、血液、尿、脳脊髄液、胸水、腹水、母乳、羊水、産道、消化管、気管支肺胞洗浄液又は唾液である。
本開示のいくつかの例によれば、がんの診断又は予後を目的とする場合、上記生体サンプルは、被験体から採取した尿サンプルであり、ＥＶにおける標的分子は、Ｅ−カドヘリン、Ｓ１００Ａ８、Ｍｕｃ５ＡＣ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。標的分子の発現レベルが参照サンプルよりも高い場合、被験体は、がんに罹患しているか、又はがんを発症するリスクがあることを示す。
本開示のいくつかの例によれば、ＥＶにおける標的分子は、がんの診断又は予後に使用される。Ｅ−カドヘリン、ＩＣＯＳ−Ｌ、Ｍｕｃ５ＡＣ、ダームシジン、ＣＧＲＥＦ１、コクリン、ＡＲＥＧ、ＬＲＧ、グアニンデアミナーゼ、Ｓ１００Ａ８、ＮＧＡＬ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ若しくはｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−５ｐの発現レベルが参照サンプルよりも高い場合、及び／又はｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４１０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６−５ｐの発現レベルが参照サンプルよりも低い場合、被験体は、がんに罹患しているか、又はがんを発症するリスクがあることを示す。
本開示の特定の例によれば、変性疾患を診断又は予後するための生体サンプルは、被験体から採取した血液サンプル、唾液サンプル又は尿サンプルであり、ＥＶにおける標的分子は、ＥＧＦ、フラクタルカイン、Ｌ１ＣＡＭ、α−シヌクレイン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＲＯ、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−３、ｅｘｏＤＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。ＥＧＦ、フラクタルカイン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＲＯ、ＩＬ−１０若しくはＭＣＰ−３の発現レベルが参照サンプルよりも低い場合、及び／又はＬ１ＣＡＭ、α−シヌクレイン若しくはｅｘｏＤＮＡの発現レベルが参照サンプルよりも高い場合、被験者は、変性疾患に罹患しているか、又は変性疾患を発症するリスクがあることを示す。
本開示の特定の例によれば、感染症を診断又は予後するための生体サンプルは、被験者から採取した血液又は尿サンプルである。ＥＶの標的分子は、核酸、リポ多糖又は微生物タンパク質、例えばＮＳ−１である。上記標的分子の発現レベルが参照サンプルよりも高い場合、被験体は、感染症に罹患しているか、又は感染症を発症するリスクがあることを示す。
本開示のいくつかの実施形態によれば、上記方法は、被験体の老化の診断又は予後（即ち、被験体の老化の状態の診断又は予測）に用いられる。一実施例において、生体サンプルは、試験体から分離した血液サンプルであり、ＥＶにおける標的分子は、Ｌ１ＣＡＭ、Ｓ１００Ａ８、α−シヌクレイン、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）、ＣＤ９０、エフリン受容体Ａ２（ＥｐｈＡ２）、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ｂ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＲＯ、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＴＮＦ−α及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。ＥＧＦの発現レベルが参照サンプルよりも低い場合、及び／又はＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＲＯ、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＴＮＦ−αの発現レベルが参照サンプルよりも高い場合、被験体は老化状態にあることを示す。或いは、生体サンプルは、被験体の尿サンプルであってもよく、ＥＶにおける標的分子は、Ｓ１００Ａ８、ＤＰＰ４、ＣＤ９０、ＥｐｈＡ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＢＤＮＦ、Ｂ２Ｍ、ＣＴＧＦ、ＮＦＬ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、フラクタルカイン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＭＤＣ、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１α、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＲＯ、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、Ｌ１ＣＡＭ、α−シヌクレイン、ｅｘｏＤＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、フラクタルカイン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＭＤＣ、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１α若しくはＩＬ−４の発現レベルが参照サンプルよりも低い場合、及び／又はＳ１００Ａ８、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＲＯ、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、Ｌ１ＣＡＭ、α−シヌクレイン若しくはｅｘｏＤＮＡの発現レベルが参照サンプルよりも高い場合、被験体は老化状態にあることを示す。
診断又は予後の結果に基づいて、当業者は、がん、変性疾患若しくは感染症に罹患しているか、又はがん、変性疾患若しくは感染症を発症するリスクがある被験体、或いは老化状態にある被験体に、有効量の治療薬、例えば、抗がん剤、抗変性剤、抗感染症剤（例えば、抗菌剤、抗ウイルス剤又は抗真菌剤）又は抗老化剤を投与することにより、疾患／病状の発生及び／又は進行を防止又は阻害することができる。従って、本開示の別の態様によれば、被験体のがん、変性疾患、感染症又は老化を治療する方法が提供される。上記方法は、
試験体から生体サンプルを取得するステップ（ａ）と、
上記生体サンプルから複数のＥＶを分離するステップ（ｂ）と、
上記複数のＥＶの標的分子の発現レベルを決定するステップ（ｃ）と、
ステップ（ｃ）で決定された標的分子の発現レベルに基づいて、がん、変性疾患、感染症又は老化を治療するステップ（ｄ）であって、上記複数のＥＶの標的分子の発現レベルが健康な被験体から得られた参照サンプルと異なる場合、健康な被験体ではない上記被験体に有効量の治療薬を投与するステップ（ｄ）と、を含む。
治療方法の特徴は、上記の診断／予後方法の特徴と非常に類似しているため、簡潔のために本明細書ではその詳細な説明は省略される。
本発明の方法の被験体は、好ましくは哺乳動物である。本開示のいくつかの実施例によれば、被験体はヒトである。
本開示の付随する特徴及び利点の多くは、添付の図面に関連して考慮される以下の詳細な説明を参照してよりよく理解されるようになる。
本明細書は、添付図面に照らして読まれる以下の詳細な説明からよりよく理解されるであろう。
本開示の実施例１に係るＥＶ又は素通り画分における特異的マーカーの発現を示すウェスタンブロットアッセイの結果である。同図には、ＰＥＶは、血漿サンプルから分離されたＥＶを示し、ＵＥＶは、尿サンプルから分離されたＥＶを示し、ＭＥＶは、臍帯の間葉系幹細胞から分離されたＥＶを示し、ＳＥＶは、唾液サンプルから分離されたＥＶを示し、Ｓｏｌｎは、血漿サンプル、尿サンプル、臍帯の間葉系幹細胞又は唾液サンプルの素通り画分を示す。 本開示の実施例２．１に係るイムノブロットアッセイの結果を示す。ここで、臍帯の間葉系幹細胞（即ち、ＭＥＶ）から分離されたＥＶと比較して、ＤＬＤ−１がん細胞（即ち、ＤＥＶ）から分離されたＥＶは、Ｅ−カドヘリン及びＳ１００Ａ８発現のレベルがより高かった。 それぞれ本開示の実施例２．１に係るＭＥＶ及びＤＥＶのｍｉＲＮＡプロファイルを示すヒストグラムである。 本開示の実施例２．２に係るイムノクロマトグラフィーの結果を示す。ここで、健康な被験体から採取された血液のＥＶにおけるＥ−カドヘリン及びムチン５ＡＣの発現レベル（図３の左側には「対照」として表記）は、がん患者の血液から分離されたＥＶ（図３の右側には「がん」として表記）よりも低かった。検出は、ＥＶの二重特異性捕捉によって実行され、ここで、１：２，０００希釈の抗ＣＤ６３抗体（０．２ｍｇ／ｍｌ）をＥＶとともにサンプルローディング領域でインキュベートし、Ｅ−カドヘリン及びムチン５ＡＣのアプタマーをそれぞれイムノクロマトグラフィーストリップの上部ポールに標識した。二重特異性結合は、化学発光イメージング用のストレプトアビジン−ＨＲＰ（１：２，０００）と結合した二次抗体によって行われた。 本開示の実施例４に係るイムノクロマトグラフィーの写真である。ここで、抗ＮＳ１抗体を結合した金ナノ粒子によって捕捉されたＮＳ−１発現は、デング熱患者の血漿又は尿から分離されたＥＶにおいて検出可能であるが、非ＥＶ画分（ｐＳｏｌｎ又はｕＳｏｌｎ）において検出できない（図４Ａ）。デング熱の疑いがある患者の尿サンプルに由来する６つのＥＶのうちの５つは、ＮＳ１発現の陽性を明らかにした（図４Ｂ）。血漿は、デングウイルス（ＤＥＶ）に感染した患者から取得した血漿サンプルを示す。ＰＥＶは、ＤＥＶ感染患者の血漿サンプルから分離されたＥＶを示す。ｐＳｏｌｎは、ＤＥＶ感染患者から取得した血漿サンプルの素通り画分を示す。ＵＥＶは、ＤＥＶ感染患者の尿サンプルから分離されたＥＶを示す。ｕＳｏｌｎは、ＤＥＶ感染患者から取得した尿サンプルの素通り画分を示す。尿は、ＤＥＶ感染患者から取得した尿サンプルを示す。ＮＳ−１シグナルは矢印で示される。ＵＥＶ１−６は、それぞれデング熱疑いの患者番号１−６の尿サンプルから分離されたＵＥＶを示す。 それぞれ本開示の実施例５に係るイムノブロッティング及びイムノクロマトグラフィーの結果を示す。ここで、高齢被験体（５０歳以上）のＥＶにおけるＳ１００Ａ８（図５Ａ）及びα−シヌクレイン（図５Ｂ）の発現レベルは、若齢被験体（５０歳以下）のＥＶよりも高かった。代表的な結果は、３組の実験で再現性があった。 本開示の実施例５に係る若齢被験体とパーキンソン病を有するか又は有しない高齢被験体との発現の違いを示すウェスタンブロットアッセイの写真である。Ｙｏｕｎｇ ＵＥＶは、５０歳未満の被験体から分離されたＥＶＵを示す。Ｏｌｄ ＵＥＶは、５０歳以上の被験体から分離されたＵＥＶを示す。ＰＤ ＵＥＶは、５０歳以上でパーキンソン病の被験体から分離されたＵＥＶである。Ｙｏｕｎｇ ｕＳｏｌｎは、５０歳未満の被験体から取得した尿サンプルの素通り画分を示す。Ｏｌｄ ｕＳｏｌｎは、５０歳以上の被験体から取得した尿サンプルの素通り画分を示す。ＰＤ ｕＳｏｌｎは、５０歳以上でパーキンソン病の被験体から取得した尿サンプルの素通り画分を示す。代表的な結果は、５組の実験で再現性があった。
添付の図面に関連して以下に提供される詳細な説明は、本発明の実施例の説明として意図されており、本発明の実施例を構築又は利用できる唯一の形態を表すことを意図していない。この説明では、実施例の機能と、実施例の構築及び操作のための一連の手順について説明する。ただし、同じ又は同等の機能とシーケンスは、異なる実施例で実現することができる。
Ｉ．定義
便宜上、本明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語をここに集める。 本明細書中で他に定義されない限り、本開示において使用される科学技術用語は、当業者によって一般に理解され使用される意味を有するものとする。文脈によって他に必要とされない限り、単数形の用語は複数の形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。具体的には、本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、文脈が明らかに他に示されない限り、単数形「ａ」及び「ａｎ」は複数の言及を含む。また、本明細書及び特許請求の範囲で使用する「少なくとも１つの」及び「１つ以上の」という用語は、同じ意味を有し、１、２、３又はそれ以上を含む。
本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示された数値は可能な限り正確に報告される。しかし、いずれの数値も本質的に、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含む。また、本明細書で使用する「約」という用語は、一般に、所与の値又は範囲の１０％、５％、１％又は０．５％以内を意味する。或いは、用語「約」は、当業者によって考慮される場合、平均の許容可能な標準誤差内にあることを意味する。操作例／実施例以外で、又は特に明記しない限り、本明細書中に開示される材料の量、時間、温度、操作条件、量の比などについての、数値範囲、量、値及びパーセンテージの全てが、すべての場合において、用語「約」により修飾されているものと理解されるべきである。したがって、反対に示されない限り、本開示及び添付の請求項に記載される数値パラメータは、所望に応じて変化することのできる近似値である。少なくとも、各数値パラメータは、報告された有効数字の数に照らして、及び通常の丸め技法を適用することによって、少なくとも解釈されるべきである。
本明細書で使用される「診断」という用語は、当業者が、患者が所定の疾患又は病状に罹患しているかどうかの確率（「可能性」）を推定及び／又は決定できる方法を指す。本発明の場合には、「診断」は、本発明の特定の標的分子の発現レベルを、場合により他の臨床的特徴とともに使用し、試験体からサンプルを採取して分析することにより、この試験体のがん、変性疾患、感染症又は老化に対する診断結果（即ち、発生又は非発生）を得ることを含む。そのような診断が「決定」されるということは、診断結果が１００％正しいと示していることを意味しない。多くのバイオマーカーは、複数の状態を示す。熟練臨床医は、情報が欠如している状態（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｖａｃｕｕｍ）では、バイオマーカーの結果を使用せずに、むしろ、試験結果を他の臨床的徴候と併せて使って、診断を行う。従って、所定の診断閾値の一方の側にある測定バイオマーカーレベルは、所定の診断閾値のもう一方の側にあるレベルに比べて、被験者における疾患の発生のより大きな可能性を示す。
本明細書における「リスク」という用語は、結果が望ましくない結果、例えば、がん又は変性疾患、感染症、老化などの疾患又は病状の発生、進行又は再発をもたらす可能性を指す。
「投与される」、「投与する」又は「投与」という用語は、本明細書で互換的に使用され、本発明の薬剤（例えば、抗がん剤、抗変性剤、抗ウイルス剤、又は抗老化剤）の静脈内、関節内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、動脈内、頭蓋内、又は皮下投与を含むがこれらに限定されない送達態様を指す。
本明細書で用いられる「治療」は、哺乳動物（特にヒト）の疾患又は症状の予防（例えば、防止）、治癒又は一時的に軽くする治療を含み、そして、（１）疾患又は症状の傾向にあるが、まだ診断されていない個人で生じる疾患又は症状（例えば、がん、変性疾患、感染症、又は老化）の予防（例えば、防止）、治癒又は一時的に軽くする治療、（２）（例えば、疾患又は症状の発症を抑制することによって）疾患を阻害すること、又は（３）疾患又は症状を緩和する（例えば、疾患又は症状と関連した症状を低減する）こと、を含む。
本明細書で言及される「有効量」という用語は、所望の応答をもたらすのに十分な成分の量を指す。治療目的のために、有効量は、成分の毒性又は有害な効果よりも治療的に有益な効果を上回る量でもある。薬剤の有効量は、疾患又は症状を治癒する必要はないが、疾患若しくは症状の発症を遅延、妨害又は予防し、又は疾患若しくは症状を緩和し、疾患若しくは症状を治療することができる。有効量は、適切な投薬形態で１回、２回又はそれ以上の用量に分割されることで、所定の期間内で１回、２回又はそれ以上で投与されることができる。具体的な有効量又は十分量は、処置される特定の病状、患者の身体的条件（例えば、患者の体重、年齢、又は性別）、治療を受けている哺乳類又は動物のタイプ、治療期間、併用療法の性質（存在する場合）、採用される特定の処方、化合物の構造又はその誘導体などの要因によって変化する。有効量は、例えば、細胞数、グラム、ミリグラム若しくはマイクログラムで、又は体重１キログラムあたりのミリグラム（ｍｇ／Ｋｇ）として表されてもよい。あるいは、有効量は、活性成分（例えば、本開示の抗癌剤、抗変性剤、抗ウイルス剤、又は抗老化剤）の濃度（例えば、細胞濃度、モル濃度、質量濃度、体積濃度、質量モル濃度、モル分率、質量分率及び混合比）で表すことができる。当業者は、動物モデルから決定された用量に基づいて、医薬品（本発明の抗癌剤、抗変性剤、抗ウイルス剤、又は抗老化剤など）のヒト等価用量（ＨＥＤ）を計算することができる。例えば、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が発行した「成人の健康なボランティアの治療薬の初期臨床試験における最大安全開始用量の推定」と題された業界のガイダンスに従って、ヒト被験体での使用の最大安全用量を推定することができる。
「被験体」及び「患者」という用語は、本開示において互換的に使用され、本発明の方法により予測、診断、及び／又は治療されるのに適したヒト種を含む哺乳動物を指す。「被験体」又は「患者」という用語は、１つの性別が特に示されていない限り、雄性と雌生の両方の性別を指すことを意図しています。
「健康な被験体」という用語は、疾患又は病状を有しない被験体、例えば、がん、変性疾患若しくは感染症を有しない被験体、又は老化状態ではない被験体（即ち、５０歳未満の被験体）を指す。一般的に、「健康な被験体」という用語は、疾患又は病状を有すると診断されておらず、疾患又は病状に関連する２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ又は５つ）の症状を呈していない被験体を指す。
本明細書で使用される場合、「老化状態にある」という用語は、５０歳以上であり、老化の一般的な兆候及び症状（例えば、髪の色の変化、脱毛、しわ、感染症への感受性の増加、熱射病又は低体温のより大きなリスク、及び前屈姿勢）の１つ以上を示す被験体を指す。
ＩＩ．発明の説明
（ｉ）疾患又は病状を予測又は診断する方法
本開示は、少なくとも部分的に、対照被験体（即ち、がん、変性疾患若しくは感染症を有しない被験体、又は老化状態ではない被験体）から取得したＥＶと比較して、がん、変性疾若しくは感染症を有する被験体、又は老化状態（即ち、５０歳以上）にある被験体から取得したＥＶ内又は上において、いくつかのバイオマーカーの発現レベルがアップレギュレート又はダウンレギュレートされる発見に基づく。従って、本開示は、１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを決定することにより、がん、変性疾患、感染症又は老化を診断又は予後する方法を提供する。これによって、当業者又は臨床医師は、治療を必要とする被験体に適切な治療を適時に施すことができる。
被験体のがん、変性疾患、感染症又は老化を診断又は予後する方法は、
上記被験体から生体サンプルを取得するステップ（ａ）と、
上記生体サンプルから複数のＥＶを分離するステップ（ｂ）と、
上記複数のＥＶの標的分子の発現レベルを決定するステップ（ｃ）と、
ステップ（ｃ）で決定された標的分子の発現レベルに基づいて、がん、変性疾患、感染症又は老化を診断又は予後し、上記複数のＥＶの標的分子の発現レベルが健康な被験体から取得した参照サンプルと異なる（即ち、より高いか、又は低い）場合、健康な被験体ではない上記被験体は、がん、変性疾患若しくは感染症を有するか又は発症するリスクがあるか、或いは老化状態にあることを示すステップ（ｄ）と、を含む。
ステップ（ａ）において、生体サンプルは、最初に被験体から取得される。使用目的によっては、上記生体サンプルは、血液、尿、脳脊髄液、胸水、腹水、母乳、羊水、産道、消化管、気管支肺胞洗浄液、唾液又はＥＶを含む他の生体液であり得る。本発明の方法の上記被験体は、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、サル、及びウマである。好ましい実施形態によれば、上記被験体はヒトである。
次いで、ステップ（ｂ）に記載のように生体サンプルから複数のＥＶを分離する。上記ＥＶは、当分野で公知の任意の方法、例えば、示差遠心分離、ショ糖勾配遠心分離、精密濾過、イムノクロマトグラフィー、抗体被覆磁気ビーズ及び市販キット（例えば、ＥＸＯＱＵＩＣＫ（商標））により分離することができる。本開示の実施形態によれば、各分離されたＥＶは、（１）その内及び／又はその上で発現される特異的マーカー（即ち、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ９０及び／又はＨＳＰ１０５）を有すること、並びに（２）３０から４５０ｎｍの粒子サイズを有する（即ち、各ＥＶは３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０又は４５０ｎｍの粒子サイズを有し得る）ことを特徴とする。このような分離されたＥＶは、エキソソーム（粒子サイズが３０から１５０ｎｍ）及び微小小胞体（粒子サイズが１５０から４５０ｎｍ）を含む。
分離されたＥＶをアッセイにかけられることにより、ＥＶ内及び／又は上で発現される１つ以上の標的分子のレベルを決定し（ステップ（ｃ））、次いで、当業者又は臨床医師は、被験体が疾患又は病状（即ち、がん、変性疾患、感染症又は老化）に罹患しているか、又は発症するリスクがあるか否かを診断又は予後することができる（ステップ（ｄ））。本開示において、１つ以上の標的分子の発現パターンは、上記１つ以上の標的分子に対する結合親和性を示すユニークな抗体及び／又は新規アプタマーを有する二重特異性及び多重特異性モジュールによって真に設計及び検出され、シグナル強度の増幅に使用される。本開示の実施形態によれば、ＥＶにおける標的分子は、タンパク質又は核酸である。タンパク質の発現レベルを決定するためのアッセイの例は、ウェスタンブロットアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、マイクロビーズアッセイ、イムノクロマトグラフィー、免疫化学発光、及びバイオチップを含むが、これらに限定されない。核酸の発現レベルを決定するための例示的なアッセイは、分光分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列決定、及びリボ核酸（ＲＮＡ）配列決定を含むが、これらに限定されない。
理解できるように、ステップ（ｃ）で決定された標的分子は、生体サンプルのタイプ及び本発明の方法により予測又は診断される疾患／病状によって異なる。本開示のいくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、がんの診断又は予後に使用される。これらの実施形態において、ＥＶにおける標的分子は、Ｅ−カドヘリン、ＩＣＯＳ−Ｌ、Ｍｕｃ５ＡＣ、ダームシジン、ＣＧＲＥＦ１、コクリン、ＡＲＥＧ、ＬＲＧ、グアニンデアミナーゼ、Ｓ１００Ａ８、ＮＧＡＬ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００２５３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−５ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００２５９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００２５４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−３ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００００７７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００２５６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００００７６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３−３ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００４３５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−３ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００４４６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００２７８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００２７９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００４１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００４１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００００８２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００００９８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００７５７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００００９２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−３ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００４４９４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００４２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００２５７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００００８９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００００８７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００００６７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００２３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−３ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００４５０２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００２４３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４０９−３ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００１６３９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００００６９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００６８９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１−３ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００７３６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００００８１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４１０−３ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００２１７１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００００８６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００４５６３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００４４３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６−５ｐ（アクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００４５６）及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施例において、生体サンプルは、被験体から採取された尿サンプルであり、標的分子は、Ｅ−カドヘリン、Ｓ１００Ａ８、Ｍｕｃ５ＡＣ、α−シヌクレイン、Ｌ１ＣＡＭ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。ここで、標的分子の発現レベルが参照サンプルよりも高い場合、被験体は、がんを有するか、又はがんを発症するリスクがあることを示す。特定の例において、Ｅ−カドヘリン、ＩＣＯＳ−Ｌ、Ｍｕｃ５ＡＣ、ダームシジン、ＣＧＲＥＦ１、コクリン、ＡＲＥＧ、ＬＲＧ、グアニンデアミナーゼ、Ｓ１００Ａ８、ＮＧＡＬ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ ｏｒ ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−５ｐの発現レベルが参照サンプルよりも高い場合、被験体は、がんを有するか、又はがんを発症するリスクがあることを示す。いくつかの例において、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４１０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６−５ｐの発現レベルが参照サンプルよりも低い場合、被験体は、がんを有するか、又はがんを発症するリスクがあることを示す。
本開示の特定の実施形態によれば、本発明の方法は、変性疾患の診断又は予後に使用される。これらの実施例において、ＥＶにおける標的分子は、ＩＣＯＳ−Ｌ、Ｍｕｃ５ＡＣ，ダームシジン、ＣＧＲＥＦ１、コクリン、ＡＲＥＧ、ＬＲＧ、グアニンデアミナーゼ、Ｓ１００Ａ８、ＤＰＰ４、ＣＤ９０、ＥｐｈＡ２、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＢＤＮＦ、Ｂ２Ｍ、ＣＴＧＦ、ＮＦＬ、ＮＧＡＬ、α−シヌクレイン、Ｌ１ＣＡＭ、ＥＧＦ、フラクタルカイン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＲＯ、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ｅｘｏＤＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの例において、生体サンプルは、被験体から採取された血液サンプル又は尿サンプルであり、ＥＧＦ、フラクタルカイン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＲＯ、ＩＬ−１０又はＭＣＰ−３の発現レベルが参照サンプルよりも低い場合、被験体が変性疾患を有するか、変性疾患を発症するリスクがあることを示す。特定の例において、生体サンプルは、被験体から採取された血液サンプル、唾液サンプル又は尿サンプルであり、ｅｘｏＤＮＡの発現レベルが参照サンプルよりも高い場合、被験体が変性疾患を有するか、又は変性疾患を発症するリスクがあることを示す。
本開示の特定の実施形態によれば、本発明の方法は、感染症の診断又は予後に有用である。いくつかの実施例において、生体サンプルは、被験体から採取された尿サンプルであり、ＥＶの標的分子は、微生物核酸、リポ多糖及び／又はタンパク質（例えば、ＮＳ−１タンパク質）であり、標的分子の発現レベルが参照サンプルよりも高い場合、被験体が感染症を有するか、又は感染症を発症するリスクがあることを示す。
本開示の代替的な実施形態によれば、本発明の方法は、被験体の老化状態の診断又は予後に有用である。いくつかの実施例において、生体サンプルは、被験体から採取された血液サンプルであり、ＥＶにおけるＦＥＧの発現レベルが参照サンプルよりも低い場合、被験体が老化状態にあることを示す。特定の実施例において、生体サンプルは、被験体から採取された血液サンプルであり、ＥＶにおけるＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＲＯ、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１β又はＴＮＦ−αの発現レベルが参照サンプルよりも高い場合、被験体が老化状態にあることを示す。いくつかの実施例において、生体サンプルは、被験体から採取された尿サンプルであり、ＥＶにおけるＥＧＦ、ｂＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、フラクタルカイン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＭＤＣ、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１α又はＩＬ−４の発現レベルが参照サンプルよりも低い場合、被験体が老化状態にあることを示す。いくつかの実施例において、生体サンプルは、被験体から採取された尿サンプルであり、ＥＶにおけるＳ１００Ａ８、ＤＰＰ４、ＣＤ９０、ＥｐｈＡ２、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＢＤＮＦ、Ｂ２Ｍ、ＣＴＧＦ、ＮＦＬ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＲＯ、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、Ｌ１ＣＡＭ、α−シヌクレイン又はｅｘｏＤＮＡの発現レベルが参照サンプルよりも高い場合、被験体が老化状態にあることを示す。いくつかの例において、ＥＶにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４１０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６−５ｐの発現レベルが参照サンプルよりも低い場合、被験体が変性疾患の有無にかかわらず、老化状態にあるか、又は老化を発症するリスクがあることを示す。
本発明の方法により予測又は診断されるのに適したがんの例は、胃がん、肺がん、膀胱がん、乳がん、膵臓がん、腎がん、大腸がん、子宮頸がん、卵巣がん、脳腫瘍、前立腺がん、肝細胞がん、黒色腫、食道がん、多発性骨髄腫又は頭頸部がんを含むが、これらに限定されない。
本発明の方法により予測又は診断されるのに適した変性疾患の非限定的な例は、パーキンソン病、アルツハイマー病、認知症、ストローク、慢性腎臓病、慢性肺疾患、良性前立腺肥大及び難聴を含む。
本発明の方法により予測又は診断されるのに適した感染症は、細菌、ウイルス又は真菌により引き起こされ得る。
（ｉｉ）疾患又は病状の治療方法
本明細には、本開示のセクション（ｉ）の方法予後又は診断結果に基づいて被験体のがん、変性疾患、感染症又は老化を治療する方法がさらに開示される。特に、被験体のがん、変性疾患、感染症又は老化を治療する方法は、
被験体から生体サンプルを取得するステップ（ａ）と、
上記生体サンプルから複数の細胞外ＥＶを分離するステップ（ｂ）と、
上記複数のＥＶの標的分子の発現レベルを決定するステップ（ｃ）と、
ステップ（ｃ）で決定された標的分子の発現レベルに基づいて、がん、変性疾患、感染症又は老化を治療するステップ（ｄ）であって、上記複数のＥＶの標的分子の発現レベルが健康な被験体から取得した参照サンプルと異なる（即ち、より高いか、又は低い）場合、健康な被験体ではない上記被験体に有効量の治療薬を投与するステップ（ｄ）と、を含む。
上記治療方法のステップ（ａ）〜（ｃ）は、本開示のセクション（ｉ）に記載の方法のステップと類似しているため、簡潔にするために、本明細書ではその詳細を省略する。
ステップ（ｄ）において、当業者又は臨床医師は、ステップ（ｃ）で決定された発現レベルに基づいて、治療を必要とする被験体に、有効量の治療薬（例えば、抗がん剤、抗変性剤、抗ウイルス薬又は抗老化剤）を投与することができる。具体的には、本開示のセクション（ｉ）に記載のように、被験体の１つ以上の標的分子の発現レベルが参照サンプルと異なる場合、試験体は、がん、変性疾患若しくは感染症を有するか又は発症するリスクがあるか、或いは老化状態にあることを示す。これによって、当業者又は臨床医師は、このような被験体に適切な治療を施すことにより、がん、変性疾患、感染症若しくは老化に関連する症状の発生を防止、改善及び／又は軽減することができる。
本開示において、治療薬は、健康な被験体と比較してＥＶにおける１つ以上の標的分子の発現パターンが歪んだ被験体に投与される。上記治療薬は、アゴニスト（例えば、アゴマー）又はアンタゴニスト（アンタゴミール、抗体又はアプタマー）であり得る。これにより、被験体のＥＶにおける１つ以上の標的分子の歪んだ発現パターンが修正される。
例示的な抗がん剤は、クルクミン、インターフェロン、サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子、インターフェロンα、インターフェロンγ）、抗体（例えば、ハーセプチン（トラスツズマブ）、Ｔ−ＤＭ１、ＡＶＡＳＴＩＮ（ベバシズマブ）、ＥＲＢＩＴＵＸ（セツキシマブ）、ベクチビックス（パニツムマブ）、リツキサン（リツキシマブ）、及びベクサール（トシツモマブ））、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、及びメゲストロール）、ＬＨＲＨアゴニスト（例えば、ゴスクリン及びロイプロリド）、抗アンドロゲン（例えば、フルタミド及びビカルタミド）、光線力学療法（例えば、ベルテポルフィン（ＢＰＤ−ＭＡ）、フタロシアニン、光増感剤Ｐｃ４、及びデメトキシヒポクレリンＡ（２ＢＡ−２−ＤＭＨＡ））、窒素マスタード（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、トロホスファミド、クロラムブシル、エストラムスチン、メルファラン）、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ））、アルキルスルホン酸塩（例えば、ブスルファン及びトレスルファン）、トリアゼン（例えば、ダカルバジン、テモゾロミド）、白金含有化合物（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、及びビノレルビン）、タキソイド（例えば、パクリタキセル又はパクリタキセル同等物、例えば、ナノ粒子アルブミン結合パクリタキセル（アブラキサン）、ドコサヘキサエン酸結合パクリタキセル（ＤＨＡ−パクリタキセル、タキソプレキシン）、ポリグルタミン酸結合パクリタキセル（ＰＧ−パクリタキセル、パクリタキセルポリグルメックス、ＣＴ−２１０３、ＸＹＯＴＡＸ）、腫瘍活性化プロドラッグ（ＴＡＰ）ＡＮＧ１００５（３分子のパクリタキセルに結合したアンジオペップ−２）、パクリタキセル−ＥＣ−１（ｅｒｂＢ２認識ペプチドＥＣ−１に結合したパクリタキセル）、及びグルコース結合パクリタキセル、例えば、２'−パクリタキセルメチル２−グルコピラノシルスクシネート；ドセタキセル、タキソール）、エピポドフィリン（例えば、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、トポテカン、９−アミノカンプトテシン、カンプトイリノテカン、イリノテカン、クリスナトール、マイトマイシンＣ）、代謝拮抗剤、ＤＨＦＲ阻害剤（例えば、メトトレキサート、ジクロロメトトレキサート、トリメトレキサート、エダトレキサート）、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ阻害剤（例えば、ミコフェノール酸、チアゾフリン、リバビリン、及びＥＩＣＡＲ）、リボヌクレオチド還元酵素阻害剤（例えば、ヒドロキシ尿素及びデフェロキサミン）、ウラシルアナログ（例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン、ドキシフルリジン、ラチトレキセド、テガフールウラシル、カペシタビン）、シトシンアナログ（例えば、シタラビン（ａｒａ Ｃ）、シトシンアラビノシド及びフルダラビン）、プリンアナログ（例えば、メルカプトプリン及びチオグアニン）、ビタミンＡアナログ、ビタミンＤ３アナログ（例えば、ＥＢ １０８９、ＣＢ １０９３、及びＫＨ １０６０）、ビタミンＫ、イソプレニル化阻害剤（例えば、ロバスタチン）、ドーパミン作動性神経毒（例えば、１−メチル−４−フェニルピリジニウムイオン）、細胞周期阻害剤（例えば、スタウロスポリン）、アクチノマイシン（例えば、アクチノマイシンＤ、ダクチノマイシン）、ブレオマイシン（例えば、ブレオマイシンＡ２、ブレオマイシンＢ２、ペプロマイシン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、ミトキサントロン）、ＭＤＲ阻害剤（例えば、ベラパミル）、Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅ阻害剤（例えば、タプシガルギン）、イマチニブ、サリドマイド、レナリドマイド、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、アキシチニブ（ＡＧ０１３７３６）、ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）、セジラニブ（ＲＥＣＥＮＴＩＮ（商標）、ＡＺＤ２１７１）、ダサチニブ（ＳＰＲＹＣＥＬ（登録商標）、ＢＭＳ−３５４８２５）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、ＣＧＰ５７１４８Ｂ、ＳＴＩ−５７１）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＴＹＶＥＲＢ（登録商標））、レスタウルチニブ（ＣＥＰ−７０１）、ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）、ニロチニブ（ＴＡＳＩＧＮＡ（登録商標））、セマキサニブ（セマキサニブ、ＳＵ５４１６）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、ＳＵ１１２４８）、トセラニブ（ＰＡＬＬＡＤＩＡ（登録商標））、バンデタニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標）、ＺＤ６４７４）、ヴァタラニブ（ＰＴＫ７８７、ＰＴＫ／ＺＫ）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、ニロチニブ（ＴＡＳＩＧＮＡ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、エベロリムス（ＡＦＩＮＩＴＯＲ（登録商標））、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標））、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標））、ＥＮＭＤ−２０７６、ＰＣＩ−３２７６５、ＡＣ２２０、乳酸ドビチニブ（ＴＫＩ２５８、ＣＨＩＲ−２５８）、ＢＩＢＷ ２９９２（ＴＯＶＯＫ（商標））、ＳＧＸ５２３、ＰＦ−０４２１７９０３、ＰＦ−０２３４１０６６、ＰＦ−２９９８０４、ＢＭＳ−７７７６０７、ＡＢＴ−８６９、ＭＰ４７０、ＢＩＢＦ １１２０（ＶＡＲＧＡＴＥＦ（登録商標））、ＡＰ２４５３４、ＪＮＪ−２６４８３３２７、ＭＧＣＤ２６５、ＤＣＣ−２０３６、ＢＭＳ−６９０１５４、ＣＥＰ−１１９８１、チボザニブ（ＡＶ−９５１）、ＯＳＩ−９３０、ＭＭ−１２１、ＸＬ−１８４、ＸＬ−６４７及び／又はＸＬ２２８）、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ））、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、エベロリムス（ＲＡＤ−００１）、リダフォロリムス、ＡＰ２３５７３（Ａｒｉａｄ）、ＡＺＤ８０５５（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＢＥＺ２３５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＢＧＴ２２６（Ｎｏｒｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ７６５（Ｓａｎｏｆｉ Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＰＦ−４６９１５０２（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＧＤＣ０９８０（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）、ＳＦ１１２６（Ｓｅｍａｆｏｅ）及びＯＳＩ−０２７（ＯＳＩ））、オブリマーセン、ゲムシタビン、カルミノマイシン、ロイコボリン、ペメトレキセド、シクロホスファミド、ダカルバジン、プロカルビジン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、カンパテシン、プリカマイシン、アスパラギナーゼ、アミノプテリン、メトプテリン、ポルフィロマイシン、メルファラン、ロイロシジン、ロイロシン、クロラムブシル、トラベクテジン、プロカルバジン、ジスコデルモリド、カルミノマイシン、アミノプテリン、及びヘキサメチルメラミンを含むが、これらに限定されない。
抗変性剤の例は、クルクミン、分岐鎖アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリンを含むＢＣＡＡ）、コリンエステラーゼ阻害剤（例えば、ドネペジル（Ａｒｉｃｅｐｔ）、ガランタミン（Ｒａｚａｄｙｎｅ）及びリバスチグミン（Ｅｘｅｌｏｎ））、メマンチン（Ｎａｍｅｎｄａ）、オメガ−３脂肪酸、イチョウ、ビタミン（ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、及びビタミンＥを含む）、レボドパ、カルビドパ、ドーパミンアゴニスト（例えば、プラミペキソール（Ｍｉｒａｐｅｘ）、ロピニロール（Ｒｅｑｕｉｐ）、ロチゴチン（Ｎｅｕｐｒｏ）、及びアポモルフィン（Ａｐｏｋｙｎ））、モノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯ阻害剤、例えば、セレギリン（Ｅｌｄｅｐｒｙｌ，Ｚｅｌａｐａｒ）、セレギリン（Ａｚｉｌｅｃｔ）、及びサフィンアミド（Ｘａｄａｇｏ））、カテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤（ＣＯＭＴ阻害剤、例えば、エンタカポン（Ｃｏｍｔａｎ）及びトルカポン（Ｔａｓｍａｒ））、抗コリン剤（例えば、ベンズトロピン（Ｃｏｇｅｎｔｉｎ）、及びトリヘキシフェニジル）、及びアマンタジンを含むが、これらに限定されない。
抗感染症剤の実施例は、ＬＬ３７、インターフェロン−α、親水性及び疎水性抗生物質、及びアプタマーを含むが、これらに限定されない。
抗老化剤の例は、クルクミン、コエンザイムＱ１０、キサントフィル（例えば、アスタキサンチン、フコキサンチン、ゼアキサンチン）、Ｌ−グルタチオン、レチノイド、α−ヒドロキシル酸、β−ヒドロキシル酸及びルテインを含むが、これらに限定されない。或いは、抗老化剤は、プロテオグリカン、及び糖タンパク質又は糖脂質であってもよく、必要に応じて組織の局在化を改善するために足場に搭載される。
上記治療薬は、適切な経路、例えば、局所、粘膜（例えば、結膜内、鼻腔内、気管内）、経口、脊髄内（例えば、髄腔内）、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、関節内、脳室内、脳室内、腹腔内、腫瘍内、及び中耳内により被験体に投与され得る。
理解できるように、本発明の方法は、単独で、又はがん、変性疾患、感染症若しくは老化の治療にいくつかの有益な効果をもたらす他の療法（例えば、抗酸化剤又は免疫療法）と組み合わせて被験体に適用することができる。目的に応じて、本発明の方法は、他の療法の使用前、使用中、又は使用後に対象に適用することができる。
標的分子の使用
本開示によれば、キットの製造のためのバイオマーカーとして機能する標的分子の使用に関する。本開示の使用において、
上記バイオマーカーは、ＥＶの内及び／又は上で発現される標的分子であり、
上記キットは、被験体ががん、変性疾患、感染症若しくは老化を有するか、又は発症するリスクがあるかを診断又は予後するのに有用であり、
がんの予後又は診断において、上記標的分子は、Ｅ−カドヘリン、ＩＣＯＳ−Ｌ、Ｍｕｃ５ＡＣ、ダームシジン、ＣＧＲＥＦ１、コクリン、ＡＲＥＧ、ＬＲＧ、グアニンデアミナーゼ、Ｓ１００Ａ８、ＮＧＡＬ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４１０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６−５ｐ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択され、
変性疾患の予後又は診断において、上記標的分子は、ＤＰＰ４、ＣＤ９０、ＥｐｈＡ２、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＢＤＮＦ、Ｂ２Ｍ、ＣＴＧＦ、ＮＦＬ、Ｌ１ＣＡＭ、α−シヌクレイン、ＥＧＦ、フラクタルカイン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＲＯ、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−３、核酸（例えば、ｅｘｏＤＮＡ）、及びそれらの組み合わせからなる群より選択され、
感染症の診断又は予後において、上記標的分子はＮＳ−１であり、
老化の診断又は予後において、上記標的分子は、Ｓ１００Ａ８、ＤＰＰ４、ＣＤ９０、ＥｐｈＡ２、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＢＤＮＦ、Ｂ２Ｍ、ＣＴＧＦ、ＮＦＬ、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＲＯ、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１α、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＴＮＦ−α、ｂＦＧＦ、フラクタルカイン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＭＤＣ、Ｌ１ＣＡＭ、α−シヌクレイン、核酸（例えば、ｅｘｏＤＮＡ）、及びそれらの組み合わせからなる群より選択され、
上記複数のＥＶの標的分子の発現レベルが健康な被験体から取得された参照サンプルと異なる（即ち、より高い又は低い）場合、被験体は、がん、変性疾患若しくは感染症を有するか又は発症するリスクがあるか、或いは老化状態にあることを示す。
標的分子の発現レベルを決定し、そして決定されたレベルに基づいて疾患／病状を診断又は予測する方法は、本開示のセクション（Ｉ）に記載の方法と非常に類似しているため、簡潔のために、その詳細な説明はここでは省略する。
以下の実施例は、本発明の特定の態様を説明し、当業者が本発明を実施するのを助けるために提供される。これらの実施例は、決して本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。さらに詳述することなく、当業者は、本明細書の説明に基づいて、本発明を最大限に利用できると考えられる。本明細書で引用されるすべての刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
材料及び方法
異なるセルからのＥＶの分離
臍帯（即ち、ｕｃＭＳＣ）から分離された間葉系幹細胞及びＤＬＤ−１がん細胞（濃度：１×１０５細胞／ｍｌ）をそれぞれ１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む培地で２４時間培養した後、無血清培地に交換した。４８時間後、無血清培地（上清）を０．４５μｍの孔径の精密濾過により濾過して細胞破片と潜在的な細菌汚染を除去し、次に、０．０３ｕｍフィルターにかけ、０．０３ｕｍフィルターに保持された（２００倍の）ＥＶを収集して濃縮した。このように収集されたＥＶは、３０から４５０ｎｍの粒子サイズを有する。本発明の実験において、ｕｃＭＳＣから取得されたＥＶはＭＥＶとして定義され、ＤＬＤ−１細胞から取得されたＥＶはＤＥＶとして定義された。ナノ粒子追跡分析の結果によると、ＭＥＶ及びＤＥＶは、いずれも１０８５．１μｇ／ｍｌ（約５．０×１０１０から１０×１０１０小胞／ｍｌ）の平均タンパク質濃度を有していた。
組織液からのＥＶの分離
本発明の調査には、（１）頭頸部がんと診断されたがん患者、（２）パーキンソン病の患者、（３）デング熱ウイルスに感染し、デング熱にかかった患者、及び（４）５０歳を超えた被験体の４群の被験体が含まれた。血液サンプル又は尿サンプルは、これらの被験体から採取された。
ＥＶは、一連の遠心分離（１００ｘ濃度）及び０．４５ｕｍ、０．２２ｕｍ及び０．０２ｕｍフィルター膜による濾過によって尿サンプル（３０ｍｌ）から分離された。ドロップスルー画分は、精製効率を分析するために収集された。
血液のＥＶは、ＥＸＯＱＵＩＣＫ（商標）沈殿により血漿から調製された。簡単に言えば、０．５ｍｌの血漿を０．１２６ｍｌ ＥＸＯＱＵＩＣＫ（商標）沈殿により４°Ｃで３０分間処理した後、１，５００ｘｇで３０分間の遠心分離した。血漿ＥＶのペレットを０．５ｍｌに再懸濁し、５アリコートに等分し、精製効率を分析するために上清を回収した。
ＭＥＶ及びＤＥＶのプロテオミクスプロファイルの決定
ＭＥＶ及びＤＥＶのタンパク質濃度をタンパク質アッセイキットで測定し、３バッチのサンプルの混合物からの等化タンパク質（ｅｑｕａｌｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）をＩＴＲＡＱＴＭ法（相対及び絶対定量（ｉＴＲＡＱ）のための等価タグ）により処理した。ＩＴＲＡＱ(TM)法は、等価断片を生成する化合物で標識されたペプチドに基づくタンパク質定量法である。４セットとして提供されたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＩＴＲＡＱＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）（同重体（同質量）試薬：ＩＴＲＡＱＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔ １１４、ＩＴＲＡＱＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔ １１５、ＩＴＲＡＱ(TM)Ｒｅａｇｅｎｔ １１６及びＩＴＲＡＱＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔ １１７）を使用してＥＶのタンパク質を標識し、ＬＣ／ＭＳ−ＭＳ実験で４プレックスサンプル分析を可能にする４つの試薬を作成した。このＩＴＲＡＱＴＭにより、合計１０３４個のタンパク質が同定された結果、１０３４個のタンパク質のうち１１個は、ＭＥＶと比較してＤＥＶでより高い発現レベル（＞５倍）を示した。ＤＥＶでより高い発現を示す１１個のタンパク質は、Ｅ−カドヘリン、ＩＳＣＯリガンド、Ｍｕｃ５ＡＣ、ダームシジン、ＣＧＲＥＦ１、コクリン、ＡＲＥＧ、ＬＲＧ、グアニンデアミナーゼ、Ｓ１００Ａ８及びＮＧＡＬであった。
ＭＥＶ及びＤＥＶのｍｉＲＮＡプロファイルの決定
ＭＥＶ又はＤＥＶからのＲＮＡサンプルを溶解試薬で採取した。具体的には、７００ｕｌの溶解緩衝液をＭＥＶ又はＤＥＶペレットに加え、室温で５分間ホモジナイズした後、１５秒間激しく振とうしながら１４０ｕｌのクロロホルムを加えた。４°Ｃで１５分間をかけて１２，０００ｇの総ＲＮＡサンプルを採取した。次に、採取されたＲＮＡサンプルをＴＲＵＳＥＱ（登録商標）Ｓｍａｌｌ ＲＮＡＬｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔで処理することで、生成されたＲＮＡ断片の両端に５'及び３'アダプターが結合され、ｃＤＮＡ生成物（約１４０ｂｐ）を得た。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によりＭＥＶ及びＤＥＶのｍｉＲＮＡプロファイルを分析した。ディファレンシャルディスプレイ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ）により、ＭＥＶ及びＤＥＶからのＥＶにおける３６個のｍｉＲＮＡを確定し、そのうち、ＭＥＶと比較して、ＤＥＶにおいて２個のｍｉＲＮＡ（即ち、ｍｉＲ−１０ａ及びｍｉＲ−１８２ａ）はより高い発現を示し、３４個のｍｉＲＮＡはより低い発現を示した。ＲＴ−ＰＣＲ定量により１０個のｍｉＲＮＡを検証した。
ウェスタンブロットアッセイ
血液、唾液又は尿に由来するＥＶサンプルの総タンパク質２０ｍｇを、変性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理した。電気泳動後、タンパク質ゲルを半乾燥転写装置によりニトロセルロース膜に転写した。膜を脱脂粉乳と共にインキュベートしてトリス緩衝液（５０ｍＭ）での非特異的結合をブロックした後、抗体（１：２，０００希釈）又はアプタマー（１００ｎＭ；例えば、それぞれＥ−カドヘリン及びムチン５Ａｃに特異的な配列番号１又は２のアプタマー）と共にインキュベートした。トリス緩衝液で洗浄して未結合の抗体又はアプタマーを除去した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）化学発光反応により特定のタンパク質の発現レベルを検出した。
免疫化学発光による組織液中の特定のＥＶの捕捉
１から１０ｍｌの組織液を磁気セルのシリンダーに注入した。ＥＶは高親和性ビーズによって捕捉され、未結合の溶液はドロップスルーされた。特定のタンパク質（抗体又はアプタマーによって捕捉又は検出される）又は核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ）（ＲＴ−ＰＣＲ又はアプタマーによって捕捉又は検出される）の発現を検出するために、リガンドでコーティングされた磁気ビーズによって捕捉されたＥＶを、イムノブロット若しくはアフィニティ結合蛍光フォトニック、化学発光、又は磁気電子変換によりシグナル増幅した。
イムノクロマトグラフィーによる組織液中の特定のＥＶの捕捉
ＥＶを抗ＣＤ６３、抗ＣＤ９又は抗ＣＤ８１抗体（１：１０００希釈）と５分間混合した後、イムノクロマトグラフィーで１５分間展開させた。ストリップの上部ポールはガラス繊維で作製され、特定のＥＶバイオマーカーとの親和性が高いアプタマーでスポットされた。或いは、ＥＶを標識するためのアプタマーを有する最初の混合物は、ＥＶのバイオマーカーに特異的な抗体のスポットによって置き換えることができる。実験では、１０ｕｌのＥＶ（１００又は１０００を超える小胞（粒子））と２０ｕｌの抗体（０．２ｍｇ／ｍｌ）又はアプタマー（１００ｎＭ）（金ナノ粒子（４０ｎｍ、２０ＯＤ）を１：１の比率で事前に組み込むかどうかにかかわらず）とを混合し、６０ｕｌのトリス緩衝液（５０ｍＭ）でイムノクロマトグラフィーストリップの底部領域にスポットした。高分子は、クロマトグラフィーのストリップの上部ポールに移動した。この上部ポールにおいて、１００ｎＭのアプタマーがＥＶを特異的に保持するためのガラス繊維領域にスポットされている。金が取り込まれている場合は、２次抗体による発色は不要である一方、金が取り込まれていない場合は、化学発光又は蛍光を伴う２次抗体を用いて特定のＥＶバイオマーカーの発現レベルを検出した。
組織液のＥＶにおけるｍｉＲＮＡの検出
被験体の血液又は尿サンプルから分離されたＥＶをＥＸＯＱＵＩＣＫ（商標）により４：１の比率で沈殿させた。次に、ＥＶペレットを洗浄して溶解することで、ＥＶに含まれるｍｉＲＮＡを放出した。ｍｉＲＮＡを逆転写反応に供してｃＤＮＡを生成し、定量的ＰＣＲ反応を介して特異的プライマーにより定量化した。例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−５ｐは、配列番号３の配列を有し、配列番号４及び５のプライマーにより検証され得る。ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−３ｐは、配列番号６の配列を有し、配列番号７及び８のプライマーにより検証され得る。ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３−５ｐは、配列番号９の配列を有し、配列番号１０及び１１のプライマーにより検証され得る。ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３−３ｐは、配列番号１２の配列を有し、配列番号１３及び１４のプライマーにより検証され得る。ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐは、配列番号１５の配列を有し、配列番号１６及び１７のプライマーにより検証され得る。ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐは、配列番号１８の配列を有し、配列番号１９及び２０のプライマーにより検証され得る。ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐは、配列番号２１の配列を有し、配列番号２２及び２３のプライマーにより検証され得る。ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐは、配列番号２４の配列を有し、配列番号２５及び２６のプライマーにより検証され得る。ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−５ｐは、配列番号２７の配列を有し、配列番号２８及び２９のプライマーにより検証され得る。ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａは、配列番号３０の配列を有し、配列番号３１及び３２のプライマーにより検証され得る。
組織液のＥＶにおけるｅｘｏＤＮＡの検出
オレンジＧスペクトロメトリーにより被験体の尿から分離されたＥＶについてエキソソームＤＮＡ（ｅｘｏＤＮＡ）を検出した。簡単に言えば、濃縮されたＥＶサンプルをエッペンドルフチューブの１：４のトリス緩衝液に入れ、３０分間をかけてヒートポットで溶解した。２０ｕｌのＥＶ溶液を０．０１５％オレンジＧ溶液と混合して二本鎖ＤＮＡを染色し、その後、２００ｕｌに希釈し、４７６／５９０ｎｍの励起／発光で分光測光を行った。ｅｘｏＤＮＡの濃度は、一連の既知のＤＮＡ濃度で作成された標準曲線に基づいて計算され、ＢＣＡタンパク質アッセイで測定された１ｍｇの総ＥＶｓタンパク質に基づいて正規化された。
実施例１：分離されたＥＶの特性評価
「材料及び方法」で説明されている手順で分離されたＥＶについてナノ粒子追跡アナライザーとウェスタンブロット分析を行い、そのテトラスパニン（ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１を含む）と小胞タンパク質（ＨＳＰ６０、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ１０５を含む）の数及び発現を決定した。ナノ粒子追跡アナライザーの分析結果によると、尿ＥＶの小胞数（以下「ＵＥＶ」）は、尿濃度に応じて０．５×１０１１から５．１×１０１１であり、血漿ＥＶの小胞数（以下「ＰＥＶ）は、約５．４×１０１１から７．８×１０１１であった。ＥＶ画分（即ち、フィルター膜に保持された画分又はＥＸＯＱＵＩＣＫ（商標）で沈殿した画分）における小胞数は、ドロップスルー画分よりも顕著に高かった（データは示していない）。ＵＥＶ及びＰＥＶのサイズは、８０から１６０ｎｍであった。
ウェスタンブロットアッセイのデータは、血漿、尿又は唾液から分離されたＥＶ（即ち、ＰＥＶ、ＵＥＶ、ＳＥＶ）内／上においては、テトラスパニン（即ち、ＣＤ９、ＣＤ６３及び／又はＣＤ８１）（図１）及び小胞タンパク質（即ち、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ９０及び／又はＨＳＰ１０５）が発現されており、また、ＵＥＶにおけるＣＤ９の発現レベルがＰＥＶよりも高く、ＰＥＶにおけるＣＤ８１の発現レベルがＵＥＶよりも高いことを示した（図１）。ドロップスルー画分にはテトラスパニンが検出されなかった（図１）。発現の違いに基づいて、ＣＤ９及びＣＤ８１を以下のアッセイでＵＥＶ及びＰＥＶをそれぞれ捕捉するための標的として使用した。
実施例２：癌性及び非癌性の細胞／組織から分離されたＥＶ間の発現の違いの特性評価
２.１ ＭＥＶ及びＤＥＶにおける標的分子の発現レベル
まず、ＩＴＲＡＱＴＭによりＭＥＶ及びＤＥＶのプロテオミクスプロファイルを分析した。分析結果は、差が５倍以上又は１／５未満の変化として定義された場合、ＭＥＶとＤＥＶにおける発現レベルが異なる２１種類のタンパク質が存在し、そのうち、１１種類のタンパク質（Ｅ−カドヘリン、ＩＣＯＳ−Ｌ、Ｍｕｃ５ＡＣ、ダームシジン、ＣＧＲＥＦ１、コクリン、ＡＲＥＧ、ＬＲＧ、グアニンデアミナーゼ、Ｓ１００Ａ８，及びＮＧＡＬを含む（データは示されていない））がＤＥＶにおける発現レベルがＭＥＶよりも高いことを示す。ウェスタンブロットのデータにより、ＭＥＶと比較して、ＤＥＶにおいてＥ−カドヘリンとＳ１００Ａ８の発現レベルが顕著に高いことがさらに確認された（図２Ａ）。
本実施例において、プロテオミクスプロファイルに加えて、ＭＥＶ及びＤＥＶのｍｉＲＮＡプロファイルを分析し、その結果を表１に示した。ＭＥＶと比較して、ＤＥＶにおいてｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−５ｐのレベルがアップレギュレートされた一方、ＤＥＶにおいてｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４１０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１８６−５ｐのレベルがダウンレギュレートされた（表１）。
表１： ＭＥＶ及びＤＥＶのｍｉＲＮＡプロファイル

Figure 0006938584
ＵＤ：検出限界以下
図２Ｂ及び２Ｃの定量結果は、ＭＥＶにおけるｍｉＲ−１８１ａ及びｍｉＲ−１２７ａの発現レベルがＤＥＶよりも顕著に高いことをさらに確認した。
２．２ がんを有するか又は有しない被験者の標的分子の発現レベル
本実施例において、例２．１で特徴付けられた表現の違いがさらに確認されました。本実施例では、健康な被験体及び頭頸部がんを有するがん患者からそれぞれ尿サンプルを採取し、「材料及び方法」に記載の手順に従って尿サンプルからＥＶを分離した。図３のデータに示されるように、対照群（即ち、健康な被験体から採取されたＵＥＶ）と比較して、Ｅ−カドヘリン及びムチン５ＡＣの発現レベルは、がん患者のＵＥＶにおいて顕著に高かった。
これらの結果は、図２−３及び表１に記載の各標的分子ががん性及び非がん性の組織／細胞の区別に有用であり、したがって、がんの発生を予測又は診断するためのがんマーカーとして適用できることを示している。
実施例３：健康な被験体とパーキンソン患者のＥＶ間の発現の違いの特性評価
パーキンソン病を有するか又は有しない高齢者（５０歳以上）からそれぞれ尿サンプルを採取し、「材料及び方法」に記載のように、尿サンプルからＥＶを分離した。表２の結果に示されるように、健康な被験体から分離されたＵＥＶと比較して、パーキンソン病の患者のＵＥＶにおけるＥＧＦ、フラクタルカイン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＲＯ、ＩＬ−１０及びＭＣＰ−３の発現レベルは、顕著に低かった。
表２：パーキンソン病を有するか又は有しない被験体から採取されたＵＥＶにおける特定の標的分子の発現

Figure 0006938584
（１）＊Ｐ＜０．０５
（２）調査した高齢者と患者の数は、それぞれ１０人と２４人であった。
結果は、ＥＧＦ、フラクタルカイン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＲＯ、ＩＬ−１０及びＭＣＰ−３がパーキンソン病の発生を予測又は診断するためのバイオマーカーとして適用できることを実証した。
実施例４：健康な被験体及びデング熱患者のＥＶ間の発現の違いの特性評価
それぞれ健康な被験体及びデング熱を有する患者から血液及び尿サンプルを採取した。次いで、「材料及び方法」に記載の手順に従って、血液及び尿サンプルからＥＶを分離した。図４Ａのデータに示されるように、微生物抗原ＮＳ−１はデング熱患者のＰＥＶ及びＵＥＶに存在したが、非ＥＶ画分（Ｓｏｌｎ）にはＮＳ−１シグナルは検出されなかった。図４Ｂのデータは、デング熱が疑われる患者の尿サンプルに由来する６つのＥＶのうち５つがＮＳ１発現の陽性を示したことをさらに示した。金ナノ粒子共役免疫クロマトグラフィーによって検出されたＮＳ−１シグナルは、図４Ａ及び４Ｂの矢印で示された。デングＮＳ１タンパク質が血液及び尿のＥＶ、特に尿ＥＶで検出されるが、非ＥＶ画分（ｐＳｏｌｎ又はｕＳｏｌｎ）で検出されないことは、微生物感染（例えば、ＤＥＶ感染）を予測又は診断する斬新でユニークな発見である。
実施例５：若齢者と高齢者のＥＶ間の発現の違いの特性評価
５０歳以上又は以下の被験体からそれぞれ血液及び尿サンプルを採取し、「材料及び方法」に記載の手順に従って、血液及び尿サンプルからＥＶを分離した。分離されたＰＥＶ及びＵＥＶの発現の違いをそれぞれ表３−４及び図５Ａ−５Ｂに示した。
若齢被験体のＰＥＶと比較して、高齢被験体のＥＧＦの発現レベルは低下し、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＲＯ、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１β又はＴＮＦ−αの発現レベルは高齢者（高齢被験体）（即ち、老化状態にある被験体）のＰＥＶにおいて向上した（表３）。
表３：５０歳以上又は以下の被験体から分離されたＰＥＶにおける特定の標的分子の発現

Figure 0006938584
ＵＥＶは、ＰＥＶと異なる発現プロファイルを示した。表４のデータに示されるように、若齢被験体のＵＥＶと比較して、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、フラクタルカイン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＭＤＣ、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１α及びＩＬ−４の発現レベルは高齢被験体において低下した一方、ＧＲＯ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１０及びＭＣＰ−１の発現レベルは、高齢被験体（即ち、老化状態にある被験体）のＵＥＶにおいて向上した。
表４：５０歳以上又は以下の被験体から分離されたＵＥＶにおける特定の標的分子の発現

Figure 0006938584
図５Ａ及び５Ｂのデータに示されるように、老化状態（図５Ａ及び５Ｂにおいて「ａｇｉｎｇ」で示される）にある被験体のＵＥＶは、イムノブロット及びイムノクロマトグラフィーアッセイにおいてそれぞれより高いＳ１００Ａ８及びα−シヌクレインのレベルを有した。老化状態ではない被験体のＵＥＶと比較して（図５Ａ及び５Ｂにおいて「ｙｏｕｎｇ」で示される）。
これらの結果は、Ｓ１００Ａ８、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＲＯ、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１α、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＴＮＦ−α、ｂＦＧＦ、フラクタルカイン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＭＤＣ、Ｌ１ＣＡＭ及びα−シヌクレインのそれぞれは、被験体が老化状態にあるか否かを診断するためのバイオマーカーとして適用できることを示している。
本発明は、若齢被験体及びパーキンソン病を有するか又は有しない高齢被験体のＵＥＶにおけるＬ１ＣＡＭ及びｅｘｏＤＮＡの発現を調査した。図６及び表５のデータに示されるように、５０歳以上の被験体と比較して、５０歳未満の被験体は、Ｌ１ＣＡＭ及びｅｘｏＤＮＡの発現がより低いが、ＣＤ９の発現がより高かった。また、Ｌ１ＣＡＭ及びｅｘｏＤＮＡの発現レベルは、パーキンソン病を有する被験体ではさらに向上する可能性がある。若齢成人と高齢成人の間のＬ１ＣＡＭとＣＤ９の相互発現は、老化にとって良い予測因子となり得る。
表５：特定の被験体のＥｘｏＤＮＡ濃度
Figure 0006938584
１．ｅｘｏＤＮＡは、オレンジＧスペクトロメトリーによって測定される。
２．ＳＥは標準誤差を示す（ｎ＝１０）。
＊はＰ＜０．０５（群間）を示し、＃はＰ＜０．０１（群間）を示す。
結論として、本開示は、いくつかの標的分子が、がん、変性疾患、感染症、及び老化を含む特定の疾患又は病状を有するか又は有しない被験体において異なる発現レベルを示したことを実証した。本開示の結果に基づいて、当業者又は医師は、これらの疾患及び病状を予後又は早期診断することができ、これによって被験体における疾患又は病状の発生又は進行を効率的に阻害するように、それを必要とする被験体に適切な治療を適時に施すことができる。
実施形態の上記の説明は、例としてのみ与えられ、当業者によって様々な修正がなされ得ることが理解されるであろう。上記の態様、実施例、及びデータは、本発明の例示的な実施形態の構造及び使用の完全な説明を提供する。本発明の様々な実施形態が、ある程度の特殊性を伴って、又は１つ以上の個々の実施形態を参照して上記で説明されたが、当業者は、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、開示された実施形態に多数の変更を加えることができる。

Claims (5)

  1. 以下のステップ（ａ）から（ｃ）を含む被験体の生体サンプルから前記被験体ががんに罹患しているか否かを診断する方法であって、
    ステップ（ａ）において、前記生体サンプルから複数の細胞外小胞（ＥＶ）を分離し、
    ステップ（ｂ）において、複数の上記ＥＶのＥ−カドヘリン、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、ダームシジン、ＥＦハンドドメイン１を有する細胞成長制御因子（ＣＧＲＥＦ１）、コクリン、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、ロイシンリッチα２糖タンパク質（ＬＲＧ）、グアニンデアミナーゼ、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）、ムチン５ＡＣ（Ｍｕｃ５ＡＣ）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４１０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１８６−５ｐの発現レベルを特定し、
    ステップ（ｃ）において、ステップ（ｂ）で特定された前記発現レベルに基づいて前記被験体ががんに罹患しているか否かを診断し、Ｅ−カドヘリン、ＩＣＯＳ−Ｌ、Ｍｕｃ５ＡＣ、ダームシジン、ＣＧＲＥＦ１、コクリン、ＡＲＥＧ、ＬＲＧ、グアニンデアミナーゼ、Ｓ１００Ａ８、ＮＧＡＬ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２−５ｐのいずれかの発現レベルが健康な被験体から取得された参照サンプルよりも高い場合、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４１０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１８６−５ｐのいずれかの発現レベルが前記参照サンプルよりも低い場合、前記健康な被験体ではない前記被験体ががんに罹患していることを診断する、方法。
  2. 複数の前記ＥＶのそれぞれは、
    その内及び／又は上で発現される少なくとも１つのマーカーを有し、前記マーカーは、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）、ＨＳＰ９０及びＨＳＰ１０５からなる群より選択されること、及び
    ３０から４５０ｎｍの粒子サイズを有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 前記がんは、胃がん、肺がん、膀胱がん、乳がん、膵臓がん、腎がん、大腸がん、子宮頸がん、卵巣がん、脳腫瘍、前立腺がん、肝細胞がん、黒色腫、食道がん、多発性骨髄腫又は頭頸部がんである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記生体サンプルは、血液、尿、脳脊髄液、胸水、腹水、母乳、羊水、気管支肺胞洗浄液又は唾液である請求項１に記載の方法。
  5. 前記被験体はヒトである、請求項１に記載の方法。
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