CN104294371B - 构建测序文库的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

公开了构建测序文库的方法及其应用，该方法包括：(a)在双链DNA片段的两端分别连接接头，以便获得连接产物；(b)将所述连接产物裂解为单链DNA片段；(c)利用探针对所述单链DNA片段进行筛选；(d)利用第一引物对所述单链DNA片段进行链延伸反应，以便获得链延伸产物；(e)对所述链延伸产物进行扩增，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述测序文库。还公开了测序方法、确定核酸序列的方法、构建测序文库的装置、测序设备以及确定核酸序列的系统。

Description

构建测序文库的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域。具体而言，本发明涉及构建测序文库的方法、测序方法、确定核酸序列的方法、构建测序文库的装置、测序设备以及确定核酸序列的系统。
背景技术
高通量测序日益被关注，但是目前高通量测序用于低频率突变的检测仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，根据本发明的实施例，本发明提出了用于构建测序文库的方法以及检测低频率突变的手段。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种构建测序文库的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(a)在双链DNA片段的两端分别连接接头，以便获得连接产物，其中，所述接头包括第一链和第二链，所述第一链和第二链部分匹配并且所述第一链包含第一标签序列，以便所述接头上限定出双链区和两个单链尾部，所述两个单链尾部之一的序列中包含第一标签；(b)将所述连接产物裂解为单链DNA片段；(c)利用探针对所述单链DNA片段进行筛选，其中，所述探针特异性识别预定区域，其中，所述预定区域包括下列之一：(1)表1所示基因的至少之一；(2)(1)的CDS区域；以及(3)(2)的上下游至少10bp的区域；(d)利用第一引物对所述单链DNA片段进行链延伸反应，以便获得链延伸产物，其中，所述第一引物包括第二标签序列，并且所述第一引物适于与所述接头的第一链形成双链结构，只是所述第一标签序列与所述第二标签序列之间存在错配；(e)对所述链延伸产物进行扩增，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述测序文库，其中，所述扩增采用适于同时扩增所述第一标签序列和所述第二标签序列的引物。。
由此，利用根据本发明实施例的构建测序文库的方法，能够有效地构建测序文库，同时，所构建的测序文库中，针对相同的双链DNA片段(在本文中也被称为“源序列”)的每条链，分别获得了具有第一标签序列和第二标签序列的扩增产物，由此，在后续测序结果的分析中，可以依据两种标签的测序结果进行互相校正，提高分析结果的可靠性。
根据本发明的实施例，所述双链DNA片段是通过下列步骤获得的：将核酸样本进行末端修复，以便获得经过修复的核酸样本；以及在所述核酸样本的5’末端添加碱基A，以便获得两端分别具有粘性末端碱基A的核酸样本，所述两端分别具有粘性末端碱基A的核酸样本构成所述双链DNA片段。由此，可以在后续操作中，方便地在所述双链DNA片段的两端添加接头。从而，提高了构建测序文库的效率。
根据本发明的实施例，所述核酸样本为人基因组DNA的至少一部分或游离核酸。根据本发明的实施例，所述人游离核酸是从患者的外周血提取的。根据本发明的实施例，所述患者患有癌症，所述癌症为选自下列的至少之一：膀胱癌、前列腺癌、肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、宫颈癌、食管癌以及肝癌。由此，利用本发明实施例的方法，能够有效地对人类疾病患者的基因突变进行有效的分析，进而能够有效用于常见肿瘤的早诊、个体化用药、以及术后监控等。
根据本发明的实施例，所述人基因组DNA的至少一部分是通过对人基因组DNA进行随机打断而获得的。由此，可以在后续操作中，方便地在所述双链DNA片段的两端添加接头。从而，提高了构建测序文库的效率。
根据本发明的实施例，所述接头具有3’碱基T粘性末端。由此，可以在后续操作中，方便地在所述双链DNA片段的两端添加接头。从而，提高了构建测序文库的效率。
根据本发明的实施例，所述单链DNA片段是通过将所述连接产物进行变性处理获得的。由此，可以快速有效的获得单链DNA片段。根据本发明的一些实施例，所述变性处理可以为热变性处理或碱变性处理。
根据本发明的实施例，所述探针是以芯片的形式提供的。由此，可以提高探针筛选的效率。
根据本发明的实施例，在存在UDG酶/FPG酶时，进行所述链延伸反应。由此，可以有效地对存在损伤的DNA在链延伸过程中进行修复，减少假阳性的产生，提高构建测序文库的质量。
根据本发明的实施例，所述第一标签序列和所述第二标签序列分别独立地长度为4～10nt。根据本发明的实施例，所述第一标签序列和所述第二标签序列的长度均为8nt。根据本发明的实施例，所述第一标签序列和所述第二标签序列之间存在至少2nt的错配。发明人惊奇地发现，采用如此设置，能够有效地提高在后续分析中，利用第一标签序列和第二标签序列进行校正的效率。
根据本发明的实施例，所述接头的第一链具有SEQ ID NO：1所示的序列，所述接头的第二链具有SEQ ID NO：2所示的序列，所述第一标签具有SEQ ID NO：3-6中任一项所示的序列，所述第二标签具有SEQ ID NO：7-10中至少之一所示的序列，所述第一引物具有SEQID NO：11所示的序列，所述适于同时扩增所述第一标签序列和所述第二标签序列的引物具有SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的序列。
其中，接头的第一链的序列中“XXXXXXXX”表示第一标签序列，第一引物中序列中的“XXXXXXXX”表示第二标签序列。
根据本发明的实施例，标签包括但不限于上述所述的4对，可以根据需要涉及多对标签以用于多样品的同时检测。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种测序方法，该方法包括：根据前面所述的方法构建测序文库；对所述测序文库进行测序。
根据本发明的实施例，在Hiseq2000或Hiseq2500上进行所述测序。由此，可以有效地提高测序的效率。另外，前面关于构建测序文库的方法所描述的特征和优点，同样适用该测序方法，在此不再赘述。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种确定核酸序列的方法，该方法包括：针对核酸样本，根据权利要求前面所述的方法进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果；基于所述测序结果，构建至少一个测序数据子集，其中，每个测序数据子集中的所有测序数据均对应核酸样本上相同的源序列；针对每一个测序数据子集，分别确定与所述第一标签序列对应的测序数据为正链测序数据，与所述第二标签序列对应的测序数据为负链测序数据；针对每一个测序数据子集，分别基于所述正链测序数据和所述负链测序数据，对测序数据进行校正，以便确定经过校正的测序数据；以及基于所述经过校正的测序数据，确定所述核酸样本的序列。由此，可以有效地基于正链测序数据和负链测序数据进行校正，提高分析结果的可靠性。
根据本发明的实施例，所述测序为双末端测序，所述测序结果由多对成对的测序数据构成。
根据本发明的实施例，基于所述测序结果，构建至少一个测序数据子集是通过下列步骤进行的：针对所述多对成对的测序数据的每一对，确定成对测序数据索引，所述成对测序数据索引由成对的测序数据的每一个的最初N个碱基构成，其中，N为10～20之间的整数；基于所述成对测序数据索引，构建至少一个初步测序数据子集，其中，所述初步测序数据子集中的每一个测序数据均具有相同的成对测序数据索引；以及基于所述初步测序数据子集中测序数据之间的汉明距离，对所述至少一个初步测序数据子集进行细分，以便获得多个所述测序数据子集。
根据本发明的实施例，N为12。
根据本发明的实施例，在所述多个测序数据子集的每一个中，任意两对成对测序数据的汉明距离不超过20。
根据本发明的实施例，在所述多个测序数据子集的每一个中，正链测序数据和负链测序数据分别为至少两个。
根据本发明的实施例，基于所述正链测序数据和所述负链测序数据，确定经过校正的测序数据是基于下列原则进行的：经过校正的测序数据中的每一个碱基同时获得至少50％正链测序数据和至少50％负链测序数据的支持。
根据本发明的实施例，经过校正的测序数据中的每一个碱基同时获得至少80％正链测序数据和至少80％负链测序数据的支持。
根据本发明的实施例，进一步包括：将所述经过校正的测序数据比对至参考序列上，并删除比对质量小于30的测序数据。
根据本发明的实施例，进一步包括：基于所述核酸样本的序列，进行SNV分析或Indel分析。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种构建测序文库的装置。根据本发明的实施例，该装置包括：连接单元，用于在双链DNA片段的两端分别连接接头，以便获得连接产物，其中，所述接头包括第一链和第二链，所述第一链和第二链部分匹配并且所述第一链包含第一标签序列，以便所述接头上限定出双链区和两个单链尾部，所述两个单链尾部之一的序列中包含第一标签；裂解单元，用于将所述连接产物裂解为单链DNA片段；筛选单元，用于在进行所述链延伸之前，利用探针对所述单链DNA片段进行筛选，其中，所述探针特异性识别预定区域，其中，所述预定区域包括下列之一：(1)表1所示基因的至少之一；(2)(1)的CDS区域；以及(3)(2)的上下游至少10bp的区域；链延伸单元，用于利用第一引物对所述单链DNA片段进行链延伸反应，以便获得链延伸产物，其中，所述第一引物包括第二标签序列，并且所述第一引物适于与所述接头的第一链形成双链结构，只是所述第一标签序列与所述第二标签序列之间存在错配；扩增单元，用于对所述链延伸产物进行扩增，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述测序文库，其中，所述扩增采用适于同时扩增所述第一标签序列和所述第二标签序列的引物。
根据本发明的实施例，上述装置能够有效地实施前面所描述的构建测序文库的方法，能够有效地构建测序文库，同时，所构建的测序文库中，针对相同的双链DNA片段(在本文中也被称为“源序列”)的每条链，分别获得了具有第一标签序列和第二标签序列的扩增产物，由此，在后续测序结果的分析中，可以依据两种标签的测序结果进行互相校正，提高分析结果的可靠性。
根据本发明的实施例，进一步包括：末端修复单元，用于将核酸样本进行末端修复，以便获得经过修复的核酸样本；以及末端修饰单元，用于在所述核酸样本的5’末端添加碱基A，以便获得两端分别具有粘性末端碱基A的核酸样本，所述两端分别具有粘性末端碱基A的核酸样本构成所述双链DNA片段。
根据本发明的实施例，所述探针是以芯片的形式提供的。
根据本发明的实施例，在存在UDG酶/FPG酶时，进行所述链延伸反应。由此，可以有效地对存在损伤的DNA在链延伸过程中进行修复，减少假阳性的产生，提高构建测序文库的质量。
根据本发明的实施例，所述第一标签序列和所述第二标签序列分别独立地长度为4～10nt。
根据本发明的实施例，所述第一标签序列和所述第二标签序列的长度均为8nt。
根据本发明的实施例，所述第一标签序列和所述第二标签序列之间存在至少2nt的错配。
根据本发明的实施例，所述接头的第一链具有SEQ ID NO：1所示的序列，所述接头的第二链具有SEQ ID NO：2所示的序列，所述第一标签具有SEQ ID NO：3-6中任一项所示的序列，所述第二标签具有SEQ ID NO：7-10中至少之一所示的序列，所述第一引物具有SEQID NO：11所示的序列，所述适于同时扩增所述第一标签序列和所述第二标签序列的引物具有SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的序列。
根据本发明的实施例，标签包括但不限于上述所述的4对，可以根据需要涉及多对标签以用于多样品的同时检测。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对构建测序文库的方法所描述的特征和优点，同样适用于该构建测序文库的装置，在此不再赘述。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种测序设备。根据本发明的实施例，该测序设备包括：根据前面所述的构建测序文库的装置；测序装置，用于对所述测序文库进行测序。
由此，可以有效地提高测序的效率。另外，前面关于构建测序文库的方法和装置所描述的特征和优点，同样适用该测序设备，在此不再赘述。
根据本发明的实施例，所述测序装置为Hiseq2000或Hiseq2500。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种确定核酸序列的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：前面所述的测序设备，用于针对核酸样本进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果；测序数据子集构建设备，用于基于所述测序结果，构建至少一个测序数据子集，其中，每个测序数据子集中的所有测序数据均对应核酸样本上相同的源序列；测序数据分类设备，用于针对每一个测序数据子集，分别确定与所述第一标签序列对应的测序数据为正链测序数据，与所述第二标签序列对应的测序数据为负链测序数据；测序数据校正设备，用于针对每一个测序数据子集，分别基于所述正链测序数据和所述负链测序数据，对测序数据进行校正，以便确定经过校正的测序数据；以及序列确定设备，用于基于所述经过校正的测序数据，确定所述核酸样本的序列。由此，利用根据本发明实施例的确定核酸序列的系统，能够有效地实施前面确定核酸序列的方法。从而可以有效地基于正链测序数据和负链测序数据进行校正，提高分析结果的可靠性。
根据本发明的实施例，所述测序为双末端测序，所述测序结果由多对成对的测序数据构成。
根据本发明的实施例，测序数据子集构建设备包括：测序数据索引确定设备，用于针对所述多对成对的测序数据的每一对，确定成对测序数据索引，所述成对测序数据索引由成对的测序数据的每一个的最初N个碱基构成，其中，N为10～20之间的整数；初步筛选装置，用于基于所述成对测序数据索引，构建至少一个初步测序数据子集，其中，所述初步测序数据子集中的每一个测序数据均具有相同的成对测序数据索引；以及二次筛选装置，用于基于所述初步测序数据子集中测序数据之间的汉明距离，对所述至少一个初步测序数据子集进行细分，以便获得多个所述测序数据子集。
根据本发明的实施例，N为12。
根据本发明的实施例，在所述多个测序数据子集的每一个中，任意两对成对测序数据的汉明距离不超过20。
根据本发明的实施例，在所述多个测序数据子集的每一个中，正链测序数据和负链测序数据分别为至少两个。
根据本发明的实施例，基于所述正链测序数据和所述负链测序数据，确定经过校正的测序数据是基于下列原则进行的：经过校正的测序数据中的每一个碱基同时获得至少50％正链测序数据和至少50％负链测序数据的支持。
根据本发明的实施例，经过校正的测序数据中的每一个碱基同时获得至少80％正链测序数据和至少80％负链测序数据的支持。
根据本发明的实施例，进一步包括：将所述经过校正的测序数据比对至参考序列上，并删除比对质量小于30的测序数据。
根据本发明的实施例，进一步包括序列分析装置，所述序列分析装置用于基于所述核酸样本的序列，进行SNV分析或Indel分析。
本领域技术人员可以理解的是，前面关于确定核酸序列的方法所描述的优点和特征同样适用该确定核酸序列的系统，在此不再赘述。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明的实施例的构建测序文库的方法的流程图；
图2显示了根据本发明的一个实施例，相同索引reads簇的分析结果；以及
图3显示了根据本发明的一个实施例，突变谱分析结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施例，对本发明进行说明，需要说明的是这些实施例仅仅是为了说明目的，而不能以任何方式解释成对本发明的限制。
一般方法
除非特别说明，在下面的实施例中，按照下面的一般方法进行：
一、设计探针
根据人类基因组HG19，调取相关基因的外显子序列，考虑到捕获区域的大小及成本，最终的芯片只涉及了上述基因的CDS区域，并对CDS区域前后延伸了20bp。芯片上覆盖有丰富的捕获探针，探针覆盖区域达98％，可以从复杂的基因组中富集目标DNA片段，在同一张芯片上以高特异性和高覆盖率捕获基因组区域。
二、构建测序文库和测序
参照图1，构建文库和测序的步骤如下：
1.抽取患者5ml外周血，离心分离血浆和白细胞，分别对血浆样本和白细胞样本提取DNA，白细胞提取的DNA之后将作为对照用于体细胞突变的检出。
2.血浆中提取出的游离循环DNA平均在170BP，之后直接按照常规建库方法进行3步酶促反应：末端修复，加“A”和连接特殊处理的测序接头(该接头上带有8BP的标签，被命名为index1，其不仅具有区别不同样品的功能，也将被用于之后正链的标记)。
3.获得的连接产物，进行CANPer-YY芯片杂交捕获，其洗脱的单链模板产物之后经过1轮1个循环的带有index2标记的引物扩增，使得反链被标记。同时在PCR过程中加入UDG/FPG酶进行孵育，以消除模板链中带有的DNA损伤，减少假阳性的产生。
4.正反链双index标记完成的产物，经过纯化后，进行第二轮PCR富集，完成文库的制备。
5.测序方法采用Hiseq 2000或Hiseq2500，根据测序量的不同和样本数，可以灵活选择合适的测序平台。
具体步骤包括：
1.cfDNA的提取
取5ml外周血分离出的血浆约2-3ml，按照QIAamp Circulating Nucleic AcidKit提取试剂说明书，进行血浆cfDNA的提取。Qubit(Invitrogen，the Quant-iT TM dsDNAHS Assay Kit)定量所提取的DNA，总量约为5～50ng。
2.样品文库的制备：
血浆中提取的cfDNA，之后按照KAPA LTP Library Preparation Kit建库说明书，进行3步酶促反应。
1)末端修复
之后，加入Agencourt AMPure XP reagent 120μL，进行磁珠纯化，最后回溶42μLddH2O，带磁珠进行下一步反应。
2)加A
之后加入PEG/NaCl SPRI溶液90μL，充分混合，进行磁珠纯化，最后回溶(35-接头)μL ddH2O，带磁珠进行下一步反应。
3)接头连接
之后分别加入PEG/NaCl SPRI溶液50μL2次，进行2次磁珠纯化，最后回溶25μLddH2O。
3芯片杂交捕获
本发明中采用发明人设计的针对12种常见癌症的个体化用药指导芯片CANPer-YY，参照芯片制造商提供的说明书进行杂交捕获。最后洗脱回溶21μL ddH2O带杂交洗脱磁珠。
4.双index正反链标记和富集：
总共进行2轮PCR，PCR 1进行反链标记和模板DNA损伤修复，PCR2进行扩增富集，完成文库制备。
1)PCR1
PCR1程序：
先除去杂交洗脱磁珠，然后加入Agencourt AMPure XP reagent40μL，进行磁珠纯化，最后回溶20μL ddH2O，带磁珠进行下一步反应。
2)PCR2
PCR2程序：
先除去上一步磁珠，然后重新加入Agencourt AMPure XP reagent50μL，进行磁珠纯化，最后回溶25μL ddH2O，进行QC及上机。
三、测序结果分析
1，将paired reads (成对测序数据)的reads1的前12bp碱基和reads2的前12bp碱基(即断点序列)连接成24bp的一条短序列，并且以这24bp作为paired reads的索引，并根据其index标记正链和反链。
2，对索引进行外部排序，以达到将同一个DNA模板的拷贝聚集到一起的目的。
3，对聚集起来的拥有相同索引的reads进行中心聚类，根据其序列之间的汉明距离，将每个有相同索引的大簇聚集成若干个小簇，每个小簇中任意两对paired reads的汉明距离不超过10，以达到区分开拥有相同索引却来自不同DNA模板的reads的目的。
4，对步骤3中获得的同一个DNA模板的拷贝簇进行筛选，若正链和反链的reads数都达到2对以上，则进行后续分析。
5，对满足4中条件的簇进行纠错，并产生一对无错的新reads，对于DNA模板的每一个测序碱基，若某种碱基型在正链的reads中的一致率达到80％，且在反链reads中的一致率也达到80％，则记新reads的这个碱基为此碱基型，否则记为N，这样便得到了代表原始DNA模板序列的新reads。
6，将新reads用bwa mem算法重新比对到基因组上，筛除比对质量小于30的reads。
7，SNV分析:
1)根据6中得到的reads进行统计，得到捕获区域内每个位点的碱基型分布，与主流碱基型(比例大于15％的碱基型)不一致的碱基型既为突变碱基型。统计目标区域覆盖大小、平均测序深度，正反链互配率，低频突变率等。
2)利用CCDS、人类基因组数据库(NCBI36.3)、dbSNP(v130)信息对SNP进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、SNP功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测SNP影响蛋白功能预测等；
3)根据患者样品与对照样品信息的比对，Call Somatic Mutation。同时在候选的SNV中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的SNP，以作为最后疾病相关的候选SNV。
8，INDEL分析：
1)根据6中得到的reads中含有indel的reads进行统计，得到所有的indel并选择有2条及以上reads支持的indel作为可靠的突变indel，
2)利用CCDS、人类基因组数据库(NCBI36.3)、dbSNP(v130)信息对Indel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸插入/氨基酸缺失/移码突变)；
3)根据患者样品与对照样品信息的比对，Call Somatic Mutation。同时在候选的Indel中去除掉在dbSNP以及其他外显子测序项目中出现的Indel，以作为最后疾病相关的候选Indel。
实施例1十二种常见肿瘤个体化用药
一、芯片设计
1)肿瘤个体化基因芯片的设计：
基于TCGA，ICGC，COSMIC等数据库和相关文献参考，采用迭代算法设计出针对12种常见癌症的肿瘤个体化用药指导基因芯片CANPer-YY。CANPer-YY芯片包括了：癌基因，抑癌基因，12种常见癌症高频基因，癌症12条信号通路中重要基因，靶药及化疗药物基因等，共计524个基因，750KB。
芯片主要设计过程分为4步：
1、统计cosmic数据库中有关12种癌症相关的driver gene(驱动基因)的每个外显子区变异样本数、变异样本、最热点变异所在的样本数、PI值(以评估患者回复频率在每个外显子上的水平，PI＝每外显子上携带突变的累计患者数目/外显子长度)，并根据PI值降序排列。之后采用迭代算法：以第一个外显子区变异的样本作为样本数据库，统计其他所有区间和样本数据库不同样本的个数，将不同样本个数最多的样本区间列为第二个筛选到芯片区间，此时以筛选到的两个区间的变异样本作为样本数据库，以同样的方法筛选第三个区间，直到样本数据库包括了所有的样本，以统计外显子区集，而对于没有筛选到任何区间的基因所有区间，则都加到芯片区间上。
2.基于TCGA，ICGC等数据库，以去除driver gene区间并且包括大于等于5个样本的热点变异的区间(SNV>＝5)为候选区间，重复上一步的迭代计算。
3.基于TCGA，ICGC等数据库，在去除已被筛选的区间中分别以：PI>＝30，SNV>＝3和：PI>＝20，SNV>＝3为候选区间，筛选使得单样本数据库样本数减少最多的区间作为第一个芯片区间，重复以上过程进行迭代计算。
4.加入融合基因以及化疗检测位点基因等区间。
基因列表详情见表1。
表1
ABL1 C1R DIS3 FGF19 HSPA4 MIR142 PAX5 RB1 SRSF2
ABL2 C1S DNMT1 FGF23 IDH1 MITF PBRM1 REL SSTR2
ACVR1B CARD11 DNMT3A FGF3 IDH2 MLH1 PCBP1 RET STAG2
ACVR2A CASP8 DOT1L FGF4 IFNAR1 MLH3 PCM1 RHEB STAT4
AJUBA CBFB DUSP6 FGF6 IFNAR2 MLL PDGFRA RICTOR STAT5B
AKT1 CBL EDNRA FGF7 IGF1 MLL2 PDGFRB RNASEL STK11
AKT2 CBLB EGFR FGFR1 IGF1R MLL3 PDK1 RNF43 SUFU
AKT3 CBR1 EGR3 FGFR2 IGF2 MLL4 PHF6 ROBO1 SUZ12
ALK CCND1 EIF4A2 FGFR3 IKBKB MPL PIGF ROBO2 SYK
ALOX12B CCND2 ELAC2 FGFR4 IKBKE MRE11A PIK3C2A ROS1 TAF1
ANGPT1 CCND3 ELF3 FH IKZF1 MS4A1 PIK3C2B RPA1 TBL1XR1
ANGPT2 CCNE1 EML4 FLCN IL7R MSH2 PIK3C2G RPL22 TBX3
APC CD79A EP300 FLT1 INHBA MSH3 PIK3C3 RPL5 TEK
APCDD1 CD79B EPCAM FLT3 IRF4 MSH4 PIK3CA RPS14 TERT
AR CDC25C EPHA2 FLT4 IRS2 MSH5 PIK3CB RPS6KB1 TET2
ARAF CDC42 EPHA3 FNTA ITGB2 MSH6 PIK3CG RPTOR TFG
ARFRP1 CDC73 EPHA5 FOXA1 JAK1 MSR1 PIK3R1 RUNX1 TGFBR2
ARHGAP35 CDH1 EPHB1 FOXA2 JAK2 MTOR PIK3R2 RUNX1T1 TIPARP
ARID1A CDK12 EPHB2 FOXL2 JAK3 MUC1 PLK1 RXRA TLR4
ARID1B CDK2 EPHB6 FPGS JUN MUTYH PML RXRB TMEM127
ARID2 CDK4 EPPK1 FUBP1 KAT6A MYC PMS1 RXRG TNFAIP3
ARID5B CDK6 ERBB2 FYN KDM5A MYCL1 PMS2 SDHAF2 TNFRSF14
ASXL1 CDK8 ERBB3 GAB2 KDM5C MYCN PNRC1 SDHB TNFRSF8
ATM CDKN1A ERBB4 GATA1 KDM6A MYD88 POLQ SDHC TNFSF11
ATR CDKN1B ERCC2 GATA2 KDR NAV3 PPP2R1A SDHD TNFSF13B
ATRX CDKN2A ERCC3 GATA3 KEAP1 NBN PRDM1 SEMA3A top1
AURKA CDKN2B ERG GID4 KIF1B NCOA1 PRKAA1 SEMA3E top2A
AURKB CDKN2C ESR1 GNA11 KIF5B NCOA2 PRKAR1A SETBP1 top2B
AXIN1 CDX2 ETV1 GNA13 KIT NCOR1 PRKCA SETD2 TP53
AXIN2 CEBPA ETV6 GNAQ KLF4 NEK11 PRKCB SF1 TRAF7
AXL CFLAR EWSR1 GNAS KLHL6 NF1 PRKCG SF3B1 TSC1
B2M CHD1 EXT1 GNRHR KRAS NF2 PRKDC SH2B3 TSC2
B4GALT3 CHD2 EXT2 GPR124 LCK NFE2L2 PRSS8 SIN3A TSHR
BACH1 CHD4 EZH2 GRIN2A LIMK1 NFE2L3 PSMB1 SLAMF7 TSHZ2
BAK1 CHEK1 FAM123B GRM3 LRRK2 NFKBIA PSMB2 SLC4A1 TSHZ3
BAP1 CHEK2 FAM46C GSK3B LYN NKX2-1 PSMB5 SLIT2 TUBA1A
BARD1 CHUK FANCA H3F3A MALAT1 NKX3-1 PTCH1 SMAD2 TUBB
BCL2 CIC FANCC H3F3C MAP2K1 NOTCH1 PTCH2 SMAD3 TUBD1
BCL2A1 CRBN FANCD2 HCK MAP2K2 NOTCH2 PTEN SMAD4 TUBE1
BCL2L1 CREBBP FANCE HDAC1 MAP2K4 NOTCH3 PTP4A3 SMARCA1 TUBG1
BCL2L11 CRIPAK FANCF HDAC2 MAP3K1 NOTCH4 PTPN11 SMARCA4 TYR
BCL2L2 CRKL FANCG HDAC3 MAP3K13 NPM1 PTPRD SMARCB1 U2AF1
BCL6 CRLF2 FANCI HDAC4 MAPK1 NR3C1 RAC1 SMARCD1 USP9X
BCOR CROT FANCL HDAC6 MAPK3 NRAS RAC2 SMC1A VEGFA
BCORL1 CSF1R FANCM HDAC8 MAPK8 NSD1 RAD21 SMC3 VEGFB
BCR CTCF FAT3 HGF MAPK8IP1 NTRK1 RAD50 SMO VEZF1
BLM CTLA4 FBXW7 HIF1A MAX NTRK2 RAD51 SOCS1 VHL
BMPR1A CTNNA1 FCGR1A HIST1H1C MC1R NTRK3 RAD51B SOX10 WHSC1L1
BRAF CTNNB1 FCGR2A HIST1H2BD MCL1 NUP93 RAD51C SOX17 WISP3
BRCA1 CUL4A FCGR2B HIST1H3B MDM2 PAK3 RAD51D SOX2 WWP1
BRCA2 CUL4B FCGR2C HNF1A MDM4 PAK7 RAD52 SOX9 XIAP
BRIP1 CYLD FCGR3A HRAS MECOM PALB2 RAD54L SPEN XPA
BTG1 CYP17A1 FCGR3B HRH2 MED12 PARP1 RAF1 SPOP XPC
BTK DAXX FGF10 HSD17B3 MEF2B PARP2 RARA SPRY4 XPO1
C11orf30 DDR1 FGF12 HSD3B2 MEN1 PARP3 RARB SRC XRCC3
C1QA DDR2 FGF14 HSP90AA1 MET PARP4 RARG SRD5A2 YES1
ZNF217 ZNF703 ZRSR2 WT1 XRCC1 GSTP1 ERCC1 MTHFR SOD2
CBR3 ATIC MTRR DPYD UMPS TPMT UGT1A1 MDR1 CDA
CYP19A1 CYP2D6
2)基因预测药物疗效数据库构建：
化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效应与特定的一种(一组)基因的表达和/或多态性显著相关，通过相关基因的检测，预测化疗药物的疗效，选择合适的药物进行个体化化疗，已经成为提高疗效、减少无效治疗的合理选择。基于化疗药物以上特点，参考PharmGKB数据库，整合目前临床上所有的化疗药物以及与疗效相关的基因及疗效预测评判，形成化疗个体化用药解读数据库。并将化疗数据整合入肿瘤个体化信息流程，完成化疗药物的自动化解读。
靶向药物在肿瘤治疗中具有药效显著、副作用少的特点，但它对靶点(包括蛋白、DNA等)有依赖性，必须先对患者做靶点分析，才能确定患者能否用药。整合目前FDA批准的靶向药物，以及处于临床Ⅲ、Ⅳ的药物。依据NCCN临床指南，临床药物基因研究整理药物靶点基因与靶药疗效关系，形成肿瘤个体化靶药解读数据库。
对生物信息分析后的变异数据进行个体化解读，参考构建的肿瘤数据库及相关文献，对患者检出的变异进行分析，判断变异所产生的致病原因、各种化疗药物的预期疗效及毒副作用、最适合的获益靶向药物及耐药性靶向药物，让临床医生对于中肿瘤患者的用药治疗更有针对性，免去无效用药所耽误的宝贵时间以及毒副作用给患者带去的治疗痛苦。
二、测序分析
采用本发明，对1例胃癌晚期患者(12种常见肿瘤中的一种)按照以上方法的步骤进行肿瘤个体化用药指导检测，结果如下：
测序数据统计结果如下表所示：
注释：正反链互配率：基于3条reads以上正反链均有的簇/3条reads以上总的簇的比值，以评估可用数据中正反链互配情况；有效数据利用率：基于至少满足2+/2-簇的reads纠错后的个数与总测序reads数的比值；平均测序深度：基于有效数据纠错后，对目标区域碱基的平均覆盖情况。
簇的分析：
相同索引reads簇的分析结果见图2，其中，横坐标代表簇的duplication(dup)个数，纵坐标代表满足某一dup个数的簇的总的reads个数。图2的结果显示：dup簇绝大部分在5左右，大部分簇内能满足2正+2反的条件，最终数据有效利用率为3.5％，平均测序深度为：667X
突变谱分析：
突变谱分析结果见图3，其中，互补的突变类型对于来源于双链的分子(DNA)，理论突变频率基本相同，横坐标代表碱基突变的类型；纵坐标代表突变的个数。图3的结果显示：突变碱基类型分布基本平衡，其突变频率(Mutations per nucleotide)为：4.2×10-6。
变异检测列表详情(基于exon区和非同义突变统计)见下表：
基因 碱基突变 氨基酸突变 突变类型 突变频率
TP53 c.241C>T p.R81X 终止密码子获得突变 10.83％
PIK3CA c.2816A>G p.D939G 错义突变 6.34％
KRAS c.35G>A p.G12D 错义突变 4.36％
ZNF678 c.1628G>C p.R543P 错义突变 3.40％
ALMS1 c.3971T>G p.V1324G 错义突变 3.20％
MLH1 c.1427A>T p.E476V 错义突变 2.80％
ZNF721 c.2061C>G p.H687Q 错义突变 2.76％
MUC17 c.392G>C p.S131T 错义突变 2.73％
GNAQ c.286A>T p.T96S 错义突变 2.46％
CASC1 c.97C>A p.R33S 错义突变 2.20％
ZNF20 c.1016G>A p.R339K 错义突变 2.00％
CYP4F2 c.1448C>G p.A483G 错义突变 2.00％
化疗位点如下表所示：
药物预测：
依据靶药化疗解读数据库，结合上述检测结果，以下结论仅供临床医生制定治疗方案时参考：
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。另外，需要说明的是，本领域技术人员能够理解，在本发明所提出的方案中所包含的步骤顺序，本领域技术人员可以进行调整，这也将包括在本发明的范围内。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (46)

1.一种构建测序文库的方法，其特征在于，包括：
(a)在双链DNA片段的两端分别连接接头，以便获得连接产物，其中，所述接头包括第一链和第二链，所述第一链和第二链部分匹配并且所述第一链包含第一标签序列，以便所述接头上限定出双链区和两个单链尾部，所述两个单链尾部之一的序列中包含第一标签；
(b)将所述连接产物裂解为单链DNA片段；
(c)利用探针对所述单链DNA片段进行筛选，其中，所述探针特异性识别预定区域，其中，所述预定区域包括下列之一：
(1)MLH1、PDK1、PIGF、ROBO2、IL7R、MSH2、EP300、FYN、ASXL1、CDKN2A、KEAP1、ESR1、AXIN1、BAP1、CHUK、PTCH1、MAP2K1、CTNNA1、CYLD、SRC、XRCC1、GSTP1、ERCC1、MTHFR、SOD2、CBR3、ATIC、MTRR、DPYD、UMPS、TPMT、UGT1A1、MDR1、CDA、CYP19A1及CYP2D6基因的至少之一；
(2)(1)的CDS区域；以及
(3)(2)的上下游至少10bp的区域；
(d)利用第一引物对所述单链DNA片段进行链延伸反应，以便获得链延伸产物，其中，所述第一引物包括第二标签序列，并且所述第一引物适于与所述接头的第一链形成双链结构，只是所述第一标签序列与所述第二标签序列之间存在错配；
(e)对所述链延伸产物进行扩增，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述测序文库，其中，所述扩增采用适于同时扩增所述第一标签序列和所述第二标签序列的引物，所述引物为第二引物和第三引物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双链DNA片段是通过下列步骤获得的：
将核酸样本进行末端修复，以便获得经过修复的核酸样本；以及
在所述核酸样本的5’末端添加碱基A，以便获得两端分别具有粘性末端碱基A的核酸样本，所述两端分别具有粘性末端碱基A的核酸样本构成所述双链DNA片段。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述核酸样本为人基因组DNA的至少一部分或游离核酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述游离核酸是从患者的外周血提取的。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述患者患有癌症，所述癌症为选自下列的至少之一：
膀胱癌、前列腺癌、肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、宫颈癌、食管癌以及肝癌。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述人基因组DNA的至少一部分是通过对人基因组DNA进行随机打断而获得的。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接头具有3’碱基T粘性末端。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单链DNA片段是通过将所述连接产物进行变性处理获得的。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针是以芯片的形式提供的。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在存在UDG酶/FPG酶时，进行所述链延伸反应。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一标签序列和所述第二标签序列分别独立地长度为4～10nt。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一标签序列和所述第二标签序列的长度均为8nt。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一标签序列和所述第二标签序列之间存在至少2nt的错配。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接头的第一链的核苷酸序列为SEQID NO：1所示的序列，所述接头的第二链的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列，所述第一标签的核苷酸序列为SEQ ID NO：3-6中至少之一所示的序列，所述第二标签的核苷酸序列为SEQ ID NO：7-10中至少之一所示的序列，所述第一引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：11所示的序列，所述第二引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：12所示的序列，所述第三引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：13所示的序列。
15.一种测序方法，所述方法用于非诊断目的，其特征在于，包括：
根据权利要求1～14任一项所述的方法构建测序文库；
对所述测序文库进行测序。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，在Hiseq2000或Hiseq2500上进行所述测序。
17.一种确定核酸序列的方法，所述方法用于非诊断目的，其特征在于，包括：
针对核酸样本，根据权利要求15或16所述的方法进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果；
基于所述测序结果，构建至少一个测序数据子集，其中，每个测序数据子集中的所有测序数据均对应核酸样本上相同的源序列；
针对每一个测序数据子集，分别确定与所述第一标签序列对应的测序数据为正链测序数据，与所述第二标签序列对应的测序数据为负链测序数据；
针对每一个测序数据子集，分别基于所述正链测序数据和所述负链测序数据，对测序数据进行校正，以便确定经过校正的测序数据；以及
基于所述经过校正的测序数据，确定所述核酸样本的序列。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述测序为双末端测序，所述测序结果由多对成对的测序数据构成。
19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，基于所述测序结果，构建至少一个测序数据子集是通过下列步骤进行的：
针对所述多对成对的测序数据的每一对，确定成对测序数据索引，所述成对测序数据索引由成对的测序数据的每一个的最初N个碱基构成，其中，N为10～20之间的整数；
基于所述成对测序数据索引，构建至少一个初步测序数据子集，其中，所述初步测序数据子集中的每一个测序数据均具有相同的成对测序数据索引；以及
基于所述初步测序数据子集中测序数据之间的汉明距离，对所述至少一个初步测序数据子集进行细分，以便获得多个所述测序数据子集。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，N为12。
21.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，在所述多个测序数据子集的每一个中，任意两对成对测序数据的汉明距离不超过20。
22.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，在所述多个测序数据子集的每一个中，正链测序数据和负链测序数据分别为至少两个。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，基于所述正链测序数据和所述负链测序数据，确定经过校正的测序数据是基于下列原则进行的：
经过校正的测序数据中的每一个碱基同时获得至少50％正链测序数据和至少50％负链测序数据的支持。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，经过校正的测序数据中的每一个碱基同时获得至少80％正链测序数据和至少80％负链测序数据的支持。
25.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，进一步包括：
将所述经过校正的测序数据比对至参考序列上，并删除比对质量小于30的测序数据。
26.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，基于所述核酸样本的序列，进行SNV分析或Indel分析。
27.一种构建测序文库的装置，其特征在于，包括：
连接单元，用于在双链DNA片段的两端分别连接接头，以便获得连接产物，其中，所述接头包括第一链和第二链，所述第一链和第二链部分匹配并且所述第一链包含第一标签序列，以便所述接头上限定出双链区和两个单链尾部，所述两个单链尾部之一的序列中包含第一标签；
裂解单元，用于将所述连接产物裂解为单链DNA片段；
筛选单元，用于在进行链延伸之前，利用探针对所述单链DNA片段进行筛选，其中，所述探针特异性识别预定区域，其中，所述预定区域包括下列之一：
(1)MLH1、PDK1、PIGF、ROBO2、IL7R、MSH2、EP300、FYN、ASXL1、CDKN2A、KEAP1、ESR1、AXIN1、BAP1、CHUK、PTCH1、MAP2K1、CTNNA1、CYLD、SRC、XRCC1、GSTP1、ERCC1、MTHFR、SOD2、CBR3、ATIC、MTRR、DPYD、UMPS、TPMT、UGT1A1、MDR1、CDA、CYP19A1及CYP2D6基因的至少之一；
(2)(1)的CDS区域；以及
(3)(2)的上下游至少10bp的区域；
链延伸单元，用于利用第一引物对所述单链DNA片段进行链延伸反应，以便获得链延伸产物，其中，所述第一引物包括第二标签序列，并且所述第一引物适于与所述接头的第一链形成双链结构，只是所述第一标签序列与所述第二标签序列之间存在错配；
扩增单元，用于对所述链延伸产物进行扩增，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述测序文库，其中，所述扩增采用第二引物以及第三引物，所述第二引物识别所述接头的第二链，所述第三引物被设置为适于同时扩增所述第一标签序列和所述第二标签序列。
28.根据权利要求27所述的装置，其特征在于，进一步包括：
末端修复单元，用于将核酸样本进行末端修复，以便获得经过修复的核酸样本；以及
末端修饰单元，用于在所述核酸样本的5’末端添加碱基A，以便获得两端分别具有粘性末端碱基A的核酸样本，所述两端分别具有粘性末端碱基A的核酸样本构成所述双链DNA片段。
29.根据权利要求27所述的装置，其特征在于，所述探针是以芯片的形式提供的。
30.根据权利要求27所述的装置，其特征在于，在存在UDG酶/FPG酶时，进行所述链延伸反应。
31.根据权利要求27所述的装置，其特征在于，所述第一标签序列和所述第二标签序列分别独立地长度为4～10nt。
32.根据权利要求31所述的装置，其特征在于，所述第一标签序列和所述第二标签序列的长度均为8nt。
33.根据权利要求27所述的装置，其特征在于，所述第一标签序列和所述第二标签序列之间存在至少2nt的错配。
34.根据权利要求27所述的装置，其特征在于，所述接头的第一链的核苷酸序列为SEQID NO：1所示的序列，所述接头的第二链的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列，所述第一标签的核苷酸序列为SEQ ID NO：3-6中至少之一所示的序列，所述第二标签的核苷酸序列为SEQ ID NO：7-10中至少之一所示的序列，所述第一引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：11所示的序列，所述第二引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：12所示的序列，所述第三引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：13所示的序列。
35.一种测序设备，其特征在于，包括：
根据权利要求27～34任一项所述的构建测序文库的装置；
测序装置，用于对所述测序文库进行测序。
36.根据权利要求35所述的测序设备，其特征在于，所述测序装置为Hiseq2000或Hiseq2500。
37.一种确定核酸序列的系统，其特征在于，包括：
权利要求35或36所述的测序设备，用于针对核酸样本进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果；
测序数据子集构建设备，用于基于所述测序结果，构建至少一个测序数据子集，其中，每个测序数据子集中的所有测序数据均对应核酸样本上相同的源序列；
测序数据分类设备，用于针对每一个测序数据子集，分别确定与所述第一标签序列对应的测序数据为正链测序数据，与所述第二标签序列对应的测序数据为负链测序数据；
测序数据校正设备，用于针对每一个测序数据子集，分别基于所述正链测序数据和所述负链测序数据，对测序数据进行校正，以便确定经过校正的测序数据；以及
序列确定设备，用于基于所述经过校正的测序数据，确定所述核酸样本的序列。
38.根据权利要求37所述的系统，其特征在于，所述测序为双末端测序，所述测序结果由多对成对的测序数据构成。
39.根据权利要求37所述的系统，其特征在于，测序数据子集构建设备包括：
测序数据索引确定设备，用于针对所述多对成对的测序数据的每一对，确定成对测序数据索引，所述成对测序数据索引由成对的测序数据的每一个的最初N个碱基构成，其中，N为10～20之间的整数；
初步筛选装置，用于基于所述成对测序数据索引，构建至少一个初步测序数据子集，其中，所述初步测序数据子集中的每一个测序数据均具有相同的成对测序数据索引；以及
二次筛选装置，用于基于所述初步测序数据子集中测序数据之间的汉明距离，对所述至少一个初步测序数据子集进行细分，以便获得多个所述测序数据子集。
40.根据权利要求39所述的系统，其特征在于，N为12。
41.根据权利要求39所述的系统，其特征在于，在所述多个测序数据子集的每一个中，任意两对成对测序数据的汉明距离不超过20。
42.根据权利要求39所述的系统，其特征在于，在所述多个测序数据子集的每一个中，正链测序数据和负链测序数据分别为至少两个。
43.根据权利要求42所述的系统，其特征在于，基于所述正链测序数据和所述负链测序数据，确定经过校正的测序数据是基于下列原则进行的：
经过校正的测序数据中的每一个碱基同时获得至少50％正链测序数据和至少50％负链测序数据的支持。
44.根据权利要求43所述的系统，其特征在于，经过校正的测序数据中的每一个碱基同时获得至少80％正链测序数据和至少80％负链测序数据的支持。
45.根据权利要求43所述的系统，其特征在于，进一步包括：
将所述经过校正的测序数据比对至参考序列上，并删除比对质量小于30的测序数据。
46.根据权利要求37所述的系统，其特征在于，进一步包括序列分析装置，所述序列分析装置用于基于所述核酸样本的序列，进行SNV分析或Indel分析。
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