CN106701920A

CN106701920A - 一种预测结直肠癌肝转移的试剂盒和使用方法

Info

Publication number: CN106701920A
Application number: CN201611055440.2A
Authority: CN
Inventors: 刘杜娟; 徐健; 唐元华
Original assignee: First Biotechnology (suzhou) Co Ltd; Suzhou For First Time Gene Technology LLC
Current assignee: First Biotechnology (suzhou) Co Ltd; Suzhou For First Time Gene Technology LLC
Priority date: 2016-11-25
Filing date: 2016-11-25
Publication date: 2017-05-24

Abstract

本发明涉及一种预测结直肠癌肝转移的试剂盒和使用方法，试剂盒包括DNA建库试剂盒，所述DNA建库试剂盒包括多个基因的探针，所述多个基因包括：高危基因：KRAS、NRAS、BRAF、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、UGT1A1、AKT1、PIK3CA、PTEN、SMAD4、TP53、NM23、TIAM1、MTS1；低危基因：PRKDC、RAD50、STAG2、XRCC5、XRCC6、FANCA、ATR、MUTYH、EMSY、ERCC4、RAD51、PARP1、XRCC1。通过对外周血中结直肠癌肝转移相关基因进行相关突变检测，结合特有打分机制快速便捷判定、预测结直肠癌肝转移。

Description

一种预测结直肠癌肝转移的试剂盒和使用方法

技术领域

本发明涉及一种预测结直肠癌肝转移的试剂盒和使用方法。

背景技术

结直肠癌也叫大肠癌，指的是来源于结肠和直肠黏膜的恶性肿瘤，病理学上指穿透黏膜层肌层，浸润到黏膜下层的结直肠上皮性肿瘤，是最常见的消化道肿瘤之一，严重威胁着人类的健康。结直肠癌全球发病率第3位、死亡率第4位的恶性肿瘤，每年新发病例数100-200万并导致60万人死亡。我国结直肠癌的发病率和死亡率均保持上升趋势，《2014年中国肿瘤登记年报》显示，结直肠癌发病率(16.14/10万)和死亡率(7.55/10万)均位居所有恶性肿瘤第五位，且多数患者确诊时已为中晚期。结直肠癌可以通过局部浸润、淋巴系统、血液系统转移到其它部位，大约40％到70％的结直肠癌最终会出现转移。肝脏是结直肠癌血行转移最主要的靶器官，结直肠癌肝转移(Colorectal Cancer Liver Metastases)是结直肠癌治疗的重点和难点之一。约有15-25％结直肠癌患者在确诊时即合并有肝转移，而另15-25％的患者将在结直肠癌原发灶根治术后发生肝转移，其中绝大多数(80-90％)的肝转移灶无法获得根治性切除。结直肠癌肝肝转移也是结直肠癌患者最主要的死亡原因，未经治疗的肝转移患者的中位生存期仅6-9个月，无法切除患者的5年生存率接近0％，而肝转移灶能完全切除患者的中位生存期为29个月，5年生存率可达30-50％。研究表明，有一部分最初肝转移灶无法切除的患者经治疗后可以转化为可切除。资料显示，常规内镜检查易对患者身体造成不适，而约有30％的患者在手术前已有B超或CT无法检测的阴匿性肝转移。因此，发现能够实时、精确、无创的判定结直肠癌肝转移与否的检测方法对于结直肠癌的早期诊断具有重要意义。目前结直肠癌肝肝转移的诊断方法包括：(1)肝脏超声和/或增强CT检查。确定病变性质，了解有无肝肝转移的发生；(2)对于怀疑肝肝转移的患者可加行血清AFP(甲胎蛋白)和肝脏核磁共振成像(MRI)检查，MRI检测小于1cm的病灶具有显著优势，增强MRI检查肝肝转移灶敏感度为80-90％；(3)PET-CT检查不作为常规推荐，可在病情需要时酌情应用，PET-CT检查在敏感度和特异度上优势明显，并且有助于发现肝外肝转移，是用于进展期结直肠癌分期最为准确的方法；(4)活检，肝肝转移灶的经皮针刺活检仅限于病情需要时应用；(5)电子结肠镜的检查，可以完整、直观、仔细地将整个结肠，甚至回肠末端观察清楚，并能对可疑部位进行照像、录像及取活组织作病理检查，能及时、准确地对疾病作出诊断，对疾病的早期合理治疗起重要作用；(6)结直肠癌及其肝肝转移的相关基因检测：(a)RAS检测(KRAS第2、3、4外显子以及NRAS第2、3、4外显子)，RAS基因是否突变不仅有一定的预后意义，更是抗EGFR治疗有效性的重要生物学标记物，(b)BRAF检测，建议在KRAS基因第2外显子野生型的结直肠癌肝肝转移患者中进行检测，作为预后的评估指标，(c)UGT1A1检测，非野生型的UGT1A1患者接受伊立替康化疗，可能会增加III度以上骨髓抑制以及腹泻的风险，(d)错配修复基因(MMR)检测包括MLH1、MSH2、MSH6、PMS2，如果存在表达缺失(其中MLH1表达缺失患者应检测BRAF基因状态并确认其未发生突变)应通过基因测序来确认突变。影像学指标不够客观，对于一些微小的肿瘤灶识别人为因素大，要求临床经验丰富的医生进行识别；通过影像学识别到的肿瘤肝转移灶需要生长到一定程度，确诊时多已经处于肝转移晚期，错过最佳治疗时期，耽误宝贵治疗时间；部分检测价格昂贵，不易反复操作长期跟踪；已有基因检测主要针对辅助治疗及预后判断，对肝转移的预测缺乏系统性标准。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种预测结直肠癌肝转移的试剂盒和使用方法，通过对外周血中结直肠癌肝转移相关基因进行相关突变检测，结合特有打分机制快速便捷判定、预测结直肠癌肝转移。

本发明的一种预测结直肠癌肝转移的试剂盒，包括DNA建库试剂盒，所述DNA建库试剂盒包括多个基因的探针，所述多个基因包括：

高危基因：KRAS、NRAS、BRAF、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、UGT1A1、AKT1、PIK3CA、PTEN、SMAD4、TP53、NM23、TIAM1、MTS1；和

低危基因：PRKDC、RAD50、STAG2、XRCC5、XRCC6、FANCA、ATR、MUTYH、EMSY、ERCC4、RAD51、PARP1、XRCC1。

进一步的，所述DNA建库试剂盒还包括能够从商业途径购买的常规试剂：EndRepair&A-Tailing Buffer、End Repair&A-Tailing Enzyme、Ligation Buffer和DNALigase等，DNA建库试剂盒由多个小试剂盒组成，如品牌为KAPA、货号为KK8504的KAPAHyper Prep Kit试剂盒；品牌为Roche、货号分别为7141530001、7141548001、6777287001、6777317001、7145594001、6977952001、5634253001的SeqCap Adapter Kit A,96Rxn试剂盒、SeqCap Adapter Kit B,96Rxn试剂盒、SeqCap EZ HE-Oligo Kit A 96Rxn试剂盒、SeqCap EZ HE-Oligo Kit B 96Rxn试剂盒、SeqCap EZ Accessory Kit V2,24Rxn试剂盒、SeqCap EZ Pure Capture Beads Kit 24Rxn试剂盒、SeqCap EZ Hyb and Wash Kit v296Rxn试剂盒。

进一步的，所述试剂盒内还包括真空采血管。

进一步的，所述试剂盒内还包括DNA抽提试剂盒。

进一步的，所述DNA抽提试剂盒包括能够从商业途径购买的常规试剂：BufferACL、Buffer ACB、Buffer ACW1、Buffer ACW2、Buffer AVEl和QIAGEN Proteinase K，如品牌为QIAGEN、货号为55114的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit试剂盒。

本发明的一种预测结直肠癌肝转移的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)采用血液DNA提取试剂盒抽提血液样本中游离DNA(cfDNA)，抽提的游离DNA中含有结直肠癌肿瘤细胞释放的DNA，携带有肿瘤细胞特异性的基因突变。

(2)采用DNA建库试剂盒对步骤(1)中抽提的游离DNA进行建库；所述DNA建库试剂盒包括多个基因的探针，所述多个基因包括：

高危基因：KRAS，NRAS，BRAF，MLH1，MSH2，MSH6，PMS2，UGT1A1，AKT1，PIK3CA，PTEN，SMAD4，TP53，NM23，TIAM1，MTS1；和

低危基因：PRKDC，RAD50，STAG2，XRCC5，XRCC6，FANCA，ATR，MUTYH，EMSY，ERCC4，RAD51，PARP1，XRCC1。

(3)对步骤(2)中建库的DNA进行测序，获得DNA全长序列。

(4)通过生物信息方法对步骤(3)中得到的DNA全长序列进行基因突变分析(包括SNV，Indel，SV)。

进一步的，在步骤(1)之前，还包括使用真空采血管采集血液样本的步骤，并在样本采集72小时内进行游离DNA抽提。

进一步的，步骤(4)中，所述基因突变包括导致肺癌转移的概率依次降低的失活突变、致病性突变、非致病性非同义突变和同义突变，根据所述概率对突变设定分值，将这些基因的突变按如表1中的规则进行评分：

进一步的，根据DNA中基因突变的种类和数量得到分数，将该分数与总分数对比来判断结直肠癌肝转移的概率。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明的试剂盒通过血液基因检测来预测结直肠癌肝转移的概率，通过对外周血中结直肠癌肝转移相关29个基因进行相关变异检测，结合特有打分机制快速便捷判定、预测结直肠癌肝转移，在结直肠癌发病初期，可预测其肝转移的概率，达到提前预防及辅助治疗的目的，对提高结直肠癌患者生活质量、争取宝贵治疗时间、延长肝转移患者生存时间至关重要，具有巨大的临床价值。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

使用本发明的试剂盒进行预测结直肠癌肝转移的方法，包括以下步骤：

(1)样本采集，采集患者的血液5ml，保存于真空采血管中，72小时内进行cfDNA抽提；

(2)DNA抽提，采用血液DNA提取试剂盒抽提血液中cfDNA(其中含有少量的结直肠癌肿瘤细胞释放的DNA，携带有肿瘤细胞特异性的基因突变)；

(3)建库，采用DNA建库试剂盒，对血液游离DNA进行建库；

(4)上机测序，采用Illumina二代测序平台，对DNA进行测序，获得29个基因的全长序列；

(5)突变检测，通过生物信息方法分析每个样本中的基因变异情况(包括SNV，Indel，SV)；

(6)系统评分，通过前期的研究及数据积累，将29个与结直肠癌肝转移密切相关的基因分为高危基因和低危基因，16个高危基因：KRAS、NRAS、BRAF、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、UGT1A1、AKT1、PIK3CA、PTEN、SMAD4、TP53、NM23、TIAM1、MTS1；13个低危基因：PRKDC、RAD50、STAG2、XRCC5、XRCC6、FANCA、ATR、MUTYH、EMSY、ERCC4、RAD51、PARP1、XRCC1，并按以下规则进行评分(表1)：

各种突变的定义及打分规则如下：

失活突变为以下4种类型的突变：提前终止(Stopgain)、终止子缺失(Stoploss)、移码突变(Frameshift)和第一位甲硫氨酸突变(M1)；某个基因如检测到失活突变，则直接评分，不再参与后续的打分，例如KRAS发生移码突变，则直接打20分，其它致病性突变，非同义突变和同义突变都不再评分；致病性突变为Clinvar在线数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)中记载为pathogenic的变异(致病性变异)；某个基因如未检测到失活突变，检测到致病性突变则直接评分，不再参与后续的打分，例如KRAS未发生失活突变，发生一个致病性突变，则直接打18分，其它非同义突变和同义突变都不再评分；非致病性非同义突变为改变氨基酸的变异，但是在Clinvar在线数据库中记载为良性变异或未记载；同义突变为未改变氨基酸的变异。对于任意一个患者，其测序结果都可以按以上评分表进行打分，最高分为450分，230分作为临界判定点。

结直肠癌肝转移概率的打分系统可以归一化为百分比，以50％作为界限，大于50％的，预测结直肠癌肝转移的概率很高，需要预防及提前进行治疗；小于50％的，预测短时间内(1-2年)不会发生结直肠癌肝转移。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种预测结直肠癌肝转移的试剂盒，其特征在于：包括DNA建库试剂盒，所述DNA建库试剂盒包括多个基因的探针，所述多个基因包括：

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内还包括真空采血管。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内还包括DNA抽提试剂盒。

4.一种如权利要求1-3中任一所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)抽提血液样本中游离DNA，抽提的游离DNA中含有结直肠癌肿瘤细胞释放的DNA；

(2)采用DNA建库试剂盒对步骤(1)中抽提的游离DNA进行建库；

(3)对步骤(2)中建库的DNA进行测序，获得DNA全长序列；(4)对步骤(3)中得到的DNA全长序列进行基因突变分析。

5.根据权利要求4所述的使用方法，其特征在于：在步骤(1)之前，还包括血液样本采集的步骤，并在样本采集72小时内进行游离DNA抽提。

6.根据权利要求4所述的使用方法，其特征在于：步骤(4)中，所述基因突变包括导致肺癌转移的概率依次降低的失活突变、致病性突变、非致病性非同义突变和同义突变，根据所述概率对突变设定分值。

7.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于：根据DNA中基因突变的种类和数量得到分数，将该分数与总分数对比来判断结直肠癌肝转移的概率。