CN111088358A - 结直肠癌分子标志物组合、其用途及引物组和检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种结直肠癌分子标志物组合，包括由序列表中的SEQ ID NO:1或其反向互补序列所示的AKT1基因，SEQ ID NO:2或其反向互补序列所示的AXIN2基因和SEQ ID NO:3或其反向互补序列所示的GNA12基因中的至少两种，该AKT1基因、该AXIN2基因和该GNA12基因启动子区域在结直肠癌人群中处于低甲基化状态。本发明还提供了结直肠癌分子标志物组合在制备用于检测结直肠癌的试剂中的用途，以及用于检测结直肠癌引物组和试剂盒。本发明的结直肠癌分子标志物组合对结直肠癌的检测灵敏度达到90％以上，甚至可达100％。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及疾病诊断分子标志物，具体涉及一种结直肠癌分子标志物组合，该分子标志物组合在制备用于检测结直肠癌的试剂中的用途，以及相应的引物组及检测试剂盒。
背景技术
结直肠癌是世界上第三大高发癌症，2012年共确诊140万病例，造成70万人死亡。结直肠癌在我国同样为最常见的恶性肿瘤之一。早期结直肠癌患者的5年生存率超过90％，而晚期时生存率仅为10％左右。然而，由于结直肠癌早期往往无特殊症状，容易延误治疗时机，确诊时约60％的患者是中晚期。
目前，结直肠癌的早期诊断主要有两种方式，第一种是粪便潜血试验(gFOBT)或免疫法粪便潜血试验(FIT)，第二种是进行结肠镜检查。粪便潜血试验是最常用的结直肠癌诊断方法，适用于大规模人群普查的初筛手段，但其灵敏度低，只有15％-30％。结肠镜检查是结直肠癌筛查和确诊的金标准，但其检测繁琐，具有侵入性和创伤性，易被受检者排斥。
DNA甲基化是哺乳动物基因组重要的表观遗传学调控机制，可以决定一类基因的表达或者抑制，具有重要的细胞生物学意义。DNA甲基化状态的改变是多种疾病尤其是肿瘤的危险因素。肿瘤组织中存在着基因组普遍低甲基化和局部区域过甲基化的现象。抑癌基因启动子区域CpG岛过甲基化是许多肿瘤发生的早期重要事件，可致使相关基因表达下调，从而影响细胞内及细胞间正常生长凋亡。原癌基因的低甲基化，可以引起原癌基因的转录激活。近年来的研究表明，DNA甲基化状态可作为生物标记应用于癌症治疗全程，如早期诊断、病理分型、监测疾病进展，预测治疗效果和预后等，尤其在早期诊断方面具有显著的优势。组合液体活检技术，检测外周血血浆ctDNA中甲基化分子标记物具有广阔的应用前景。Septin9基因检测就是针对外周血血浆中Septin9基因甲基化的状态的检测，具有非侵入性，但其检测的敏感度较低，仅68％-79.3％。
因此，寻找新的结直肠癌标志物，尤其是早期诊断标志物对于提高早期结直肠癌诊断率，实现早期干预治疗，降低结直肠癌死亡率具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结直肠癌分子标志物组合，该分子标志物组合对结直肠癌的检测灵敏度达到90％以上，甚至可达100％。
因此，在第一方面，本发明公开了一种结直肠癌分子标志物组合，该结直肠癌分子标志物组合包括由序列表中的SEQ ID NO:1或其反向互补序列所示的AKT1基因，SEQ IDNO:2或其反向互补序列所示的AXIN2基因和SEQ ID NO:3或其反向互补序列所示的GNA12基因中的至少两种，该AKT1基因、该AXIN2基因和该GNA12基因启动子区域在结直肠癌人群中处于低甲基化状态。
进一步地，该结直肠癌分子标志物组合包括该AKT1基因中的包含至少1个甲基化CpG位点的序列片段、该AXIN2基因中的包含至少1个甲基化CpG位点的序列片段、该GNA12基因中的包含至少1个甲基化CpG位点的序列片段。
进一步地，该结直肠癌分子标志物组合包括该AKT1基因、该AXIN2基因和该GNA12基因经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的，由SEQ ID NO:4或其反向互补序列所示的经处理的AKT1基因，由SEQ ID NO:4或其反向互补序列所示的经处理的AXIN2基因，和由SEQ ID NO:4或其反向互补序列所示的经处理的GNA12基因。
进一步地，该结直肠癌分子标志物组合包括该经处理的AKT1基因中的包含至少1个甲基化CpG位点的序列片段、该经处理的AXIN2基因中的包含至少1个甲基化CpG位点的序列片段、该经处理的GNA12基因中的包含至少1个甲基化CpG位点的序列片段。
在本发明的一个优选实施方案中，该结直肠癌分子标志物组合由该AKT1基因和该AXIN2基因组成。
在本发明的另一个优选实施方案中，该结直肠癌分子标志物组合由该AXIN2基因和该GNA12基因组成。
在本发明的又一个优选实施方案中，该结直肠癌分子标志物组合由该AKT1基因、该AXIN2基因和该GNA12基因组成。
在第二方面，本发明公开了本发明第一方面的结直肠癌分子标志物组合在制备用于检测结直肠癌的试剂中的用途。
在第三方面，本发明公开了一种用于检测SEQ ID NO:1或其反向互补序列所示的AKT1基因、SEQ ID NO:2或其反向互补序列所示的AXIN2基因和SEQ ID NO:3或其反向互补序列所示的GNA12基因启动子区域的甲基化状态的引物组，该引物组包括以下引物序列：
AKT1基因正向引物：GTTTGGTGTTATGGAGAGTAG(SEQ ID NO:7)；
AKT1基因反向引物：CAATTCCAACTCCCCTTCCT(SEQ ID NO:8)；
AXIN2基因正向引物：GTGGAAAGGAAAGGGAGGAG(SEQ ID NO:9)；
AXIN2基因反向引物：CCTTACCATCCACTCTACAC(SEQ ID NO:10)；
GNA12基因正向引物：GTTAAAGAGTTAGTGTAAGATAG(SEQ ID NO:11)；
GNA12基因反向引物：AAACATAAACACTTCCTAACAAC(SEQ ID NO:12)。
在第四方面，本发明公开了一种用于检测SEQ ID NO:1或其反向互补序列所示的AKT1基因、SEQ ID NO:2或其反向互补序列所示的AXIN2基因和SEQ ID NO:3或其反向互补序列所示的GNA12基因启动子区域的甲基化状态的检测试剂盒，该检测试剂盒包含根据本发明第三方面的引物组。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种基于甲基化修饰的结直肠癌早期诊断的分子标记物组合，使用患者外周血即可进行诊断，具有非侵入性的特点，患者依存性高，且可以在结直肠癌早期即确诊，提高直肠癌早诊率，从而提高结直肠癌患者生存率。通过两个或三个结直肠癌早期诊断分子标记物的组合，可以实现对结直肠癌的检测灵敏度达到90％以上，甚至可达100％。
附图说明
图1显示本发明实施例测得的17名受检者(包括11名结直肠癌早期患者和6名健康人)的AKT1基因溶解曲线；
图2显示本发明实施例测得的17名受检者(包括11名结直肠癌早期患者和6名健康人)的AXIN2基因溶解曲线；
图3显示本发明实施例测得的17名受检者(包括11名结直肠癌早期患者和6名健康人)的GNA12基因溶解曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式并组合附图对本发明作进一步详细说明。应指出的是，本文所用的词语“包含”或“包括”具有包括性或开放性的含义，不排除其它未描述的元素或方法步骤。然而，在本文每次提及“包含”中，也意指其包括作为替代的较窄实施方案的词语“基本由...组成”或“由...组成”，其中“由...组成”排除未规定的任何成分或步骤，“基本由...组成”允许包括不在实质上影响所考虑的组合物或方法的基本和新特征的额外的未列举成分或步骤。
DNA片段的甲基化状态可以通过重亚硫酸盐测序方法进行测定。该方法涉及用重亚硫酸盐处理DNA片段，未发生甲基化的胞嘧啶经历化学修饰，转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶由于甲基的保护作用，不会发生变化。通过qPCR仪扩增经处理的DNA片段并分析其溶解曲线，甲基化程度越高的DNA片段熔解温度越高。
为了寻找对于诊断结直肠癌有用的靶标，本发明人经过了广泛而深入的研究，使用全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)发现，结直肠癌早期患者血浆中AKT1基因、AXIN2基因和GNA12基因启动子区域的甲基化状态在肿瘤患者血浆和健康人血浆之间存在显著的差异，在健康人血浆中呈高甲基化状态，而在结直肠癌早期患者血浆中呈低甲基化状态。预期通过检测AKT1基因、AXIN2基因和GNA12基因启动子区域的甲基化状态，可以对结直肠癌早期患者与健康人进行区分，从而对结直肠癌早期患者进行诊断。因此，AKT1基因、AXIN2基因和GNA12基因可以作为诊断早期结直肠癌的分子标记物。
为了使用上述分子标记物进行早期结直肠癌诊断，对来自直肠癌早期患者和健康人血浆样本进行多重荧光PCR检测，获取样本的AKT1基因、AXIN2基因和GNA12基因的熔解温度，并根据患者AKT1基因、AXIN2基因和GNA12基因的熔解温度和健康人AKT1基因、AXIN2基因和GNA12基因的熔解温度的差异，设置AKT1基因、AXIN2基因和GNA12基因的溶解温度阈值范围和具体优选阈值，作为早期结直肠癌诊断的标准。
具体地，作为早期结直肠癌分子标记物的AKT1基因、AXIN2基因和GNA12基因的溶解温度阈值，以及适用于早期结直肠癌的分子标记物组合，可以按如下方法来设置：
(1)用cfDNA提取试剂盒提取代表性的确诊直肠癌早期患者群体和健康人群体的血浆样本中的cfDNA；
(2)用甲基化转化试剂盒对提取的cfDNA进行转化，使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；
(3)使用用于扩增AKT1基因、AXIN2基因和GNA12基因启动子区域的特异性引物，用多重荧光PCR仪对转化后的cfDNA进行这个三个基因的扩增，并分析这三个基因的熔解曲线；
用于扩增AKT1基因、AXIN2基因和GNA12基因启动子区域的三对引物如下所示：
(4)根据直肠癌早期患者群体的这三个基因的熔解温度与健康人群体的这三个基因的熔解温度的差异，设置这三个基因的溶解温度阈值范围和具体优选阈值；
(5)通过将所测出的每个确诊直肠癌早期患者的这三个基因的溶解温度与相应基因的溶解温度阈值进行比较，判断相应基因是否能检测出该患者就是直肠癌早期患者，以确定这三个基因检测直肠癌早期患者的灵敏度；
同样，通过将所测出的每个健康人的这三个基因的溶解温度与相应基因的溶解温度阈值进行比较，判断相应基因是否能检测出该健康人就是健康人，以确定这三个基因检测直肠癌早期患者的特异性；
(6)选择这三个基因中灵敏度高、特异性好的基因组合作为早期结直肠癌的分子标记物组合。
如实施例所描述，本发明优选选择AKT1基因与AXIN2基因两者组合、AXIN2基因与GNA12基因两者组合或者AKT1基因和AXIN2基因和GNA12基因三者组合作为早期结直肠癌的分子标记物组合，检测灵敏度达到100％，特异性达到83％，也可以选择AKT1基因与GNA12基因两者组合作为早期结直肠癌的分子标记物组合，检测灵敏度达到91.7％，特异性达到83％。
进一步地，本发明提供由序列表中的SEQ ID NO:1或其反向互补序列所示的AKT1基因，SEQ ID NO:2或其反向互补序列所示的AXIN2基因和SEQ ID NO:3或其反向互补序列所示的GNA12基因。在健康人中，AKT1基因、AXIN2基因和GNA12基因多处5’-CpG-3’的碱基C位置上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)，而在结直肠癌人群中，AKT1基因、AXIN2基因和GNA12基因中处于低甲基化状态。
进一步地，本发明也提供AKT1基因、AXIN2基因和GNA12的序列片段其中存在至少1个甲基化CpG位点，例如2-28个，更具体地例如3、5、10、15、20或25个甲基化CpG位点。
上述基因或者它们的序列片段在经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后，其中未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶保持不变。因此，上述的基因或者它们的序列片段可以作为分析基因组中甲基化状态的关键区域，通过各种本领域已知的技术来分析它们的甲基化状态。任何可用于分析基因组甲基化状态的技术均可应用于本发明中。在本发明的一个实施方案中，采用重亚硫酸盐转化和多重荧光PCR来分析甲基化状态。
本发明还提供上述基因经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的多核苷酸或其反向互补序列，包括SEQ ID NO:4或其反向互补序列、SEQ ID NO:5或其反向互补序列、SEQ ID NO:6或其反向互补序列所示核苷酸序列的多核苷酸。
本发明也提供上述基因的序列片段经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的多核苷酸或其反向互补序列的序列片段，其中存在至少1个甲基化CpG位点。
本发明也提供包含上述上述的基因、反向互补序列、多核苷酸或序列片段的基因Panel或基因群组。针对所述的基因Panel或基因群组，也可以通过DNA甲基化状态检测早期结直肠癌。
上述的基因、反向互补序列、多核苷酸或序列片段可以应用于设计早期结直肠癌的检测试剂或检测试剂盒。
以下通过非限制性实施例对本发明作举例说明。
实施例
本实施例选择17名受检者，其中11名为结直肠癌I-II期患者(CRC01-CRC11)及6名为健康人(H01-H06)。取所有人的外周血样本进行检测，具体检测步骤和结果如下：
(1)分离血浆样本
将外周血样本置于10mL离心管中，4℃条件下，1,600g离心10min。将上清液取出，置于新的10mL离心管中，4℃条件下，16,000g离心10min。将上清液取出，置于新的10mL离心管中。
(2)cfDNA的提取
使用Qiagen Circulating Nucleic Acid Kit，按生产商说明书提取血浆中循环核酸(cfDNA)。
(3)重亚硫酸盐转化
取20ng cfDNA，使用ZYMO EZ DNA Methylation Gold Kit，按生产商说明书对cfDNA进行重亚硫酸盐的转化，将cfDNA中的未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶保持不变。
(4)多重荧光PCR扩增和溶解曲线分析
使用天根高分辨率溶解(HRM)分析试剂盒，在ABI QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统上，对转化后的cfDNA进行多重荧光PCR扩增并进行溶解曲线分析。用于扩增AKT1基因、AXIN2基因和GNA12基因三个基因的三对引物分别为：
HRM PCR反应体系为：
采用两步法PCR反应程序进行反应，具体参数如下：
(5)结果分析
图1、图2和图3分别显示测得的17名受检者(包括11名结直肠癌早期患者和6名健康人)的AKT1基因溶解曲线、AXIN2基因溶解曲线和GNA12基因溶解曲线。11名结直肠癌早期患者(CRC01-CRC11)及6名健康人(H01-H06)的AKT1基因、AXIN2基因和GNA12基因的熔解温度如下表1所示。
表1：11名结直肠癌早期患者(CRC01-CRC11)及6名健康人(H01-H06)的AKT1基因、AXIN2基因和GNA12基因的熔解温度
| 受检者编号 | 健康状态 | AKT1 | AXIN2 | GNA12 |
| CRC01 | 结直肠癌 | 78.331 | 79.072 | 73.588 |
| CRC02 | 结直肠癌 | 78.578 | 78.627 | 74.082 |
| CRC03 | 结直肠癌 | 77.985 | 78.726 | 74.032 |
| CRC04 | 结直肠癌 | 77.936 | 76.898 | 73.094 |
| CRC05 | 结直肠癌 | 78.380 | 78.578 | 73.785 |
| CRC06 | 结直肠癌 | 77.639 | 78.726 | 74.082 |
| CRC07 | 结直肠癌 | 78.084 | 76.849 | 73.193 |
| CRC08 | 结直肠癌 | 78.677 | 76.602 | 73.934 |
| CRC09 | 结直肠癌 | 78.232 | 76.799 | 74.082 |
| CRC10 | 结直肠癌 | 77.936 | 78.726 | 73.934 |
| CRC11 | 结直肠癌 | 78.034 | 79.022 | 73.884 |
| H01 | 健康 | 78.281 | 78.726 | 74.082 |
| H02 | 健康 | 78.380 | 78.775 | 74.082 |
| H03 | 健康 | 78.430 | 79.418 | 74.131 |
| H04 | 健康 | 78.479 | 79.418 | 74.131 |
| H05 | 健康 | 78.430 | 78.874 | 74.131 |
| H06 | 健康 | 78.380 | 79.467 | 74.082 |
根据患者AKT1基因的熔解温度和健康人AKT1基因的熔解温度的差异，设置AKT1基因的溶解温度阈值范围为78.34℃-78.37℃，优选78.35℃。如果从受检者获得的AKT1基因的熔解温度超过此阈值，判断为阴性结果，该受检者为健康人，低于此阈值则判断为阳性结果，该受检者为结直肠癌患者。
根据患者AXIN2基因的熔解温度和健康人AXIN2基因的熔解温度的差异，设置AXIN2基因的溶解温度阈值范围为78.73℃-78.77℃，优选78.75℃。如果从受检者获得的AXIN2基因的熔解温度超过此阈值，判断为阴性结果，该受检者为健康人，低于此阈值则判断为阳性结果，该受检者为结直肠癌患者。
根据患者GNA12基因的熔解温度和健康人GNA12基因的熔解温度的差异，设置GNA12基因的溶解温度阈值范围为74.04℃-74.08℃，优选74.05℃。如果从受检者获得的GNA12基因的熔解温度超过此阈值，判断为阴性结果，该受检者为健康人，低于此阈值则判断为阳性结果，该受检者为结直肠癌患者。
根据AKT1基因、AXIN2基因和GNA12基因的上述溶解温度阈值，对表1的11名结直肠癌早期患者(CRC01-CRC11)及6名健康人(H01-H06)的直肠癌诊断灵敏度和特异性进行分析。灵敏度是指在11名已确诊的结直肠癌早期患者中，通过所测出的AKT1基因、AXIN2基因和GNA12基因标志物的熔解温度与这些基因的熔解温度阈值进行比较所得的患者占全部患者的百分比；特异性是指在6名健康人中，通过所测出的AKT1基因、AXIN2基因和GNA12基因标志物的熔解温度与这些基因的熔解温度阈值进行比较所得的健康人占全部健康人的百分比。结果在表2中总结。
表2：AKT1基因、AXIN2基因和GNA12基因作为结直肠癌诊断标志物的诊断灵敏度和特异性
| 标志物 | 阈值 | 灵敏度 | 特异性 |
| AKT1 | 78.35 | 72.7％(8名/11名) | 83.3％(5名/6名) |
| AXIN2 | 78.75 | 81.8％(9名/11名) | 83.3％(5名/6名) |
| GNA12 | 74.05 | 72.7％(8名/11名) | 100％(6名/6名) |
| AKT1+AXIN2 | 78.35+78.75 | 100％(12名/12名) | 83.3％(5名/6名) |
| AXIN2+GNA12 | 78.75+74.05 | 100％(12名/12名) | 83.3％(5名/6名) |
| AKT1+GNA12 | 78.35+74.05 | 91.7％(11名/12名) | 83.3％(5名/6名) |
| AKT1+AXIN2+GNA12 | 78.35+78.75+74.05 | 100％(12名/12名) | 83.3％(5名/6名) |
由表2可见，尽管GNA12基因的诊断特异性可以达到100％，AKT1基因和AXIN2基因的诊断特异性也可达到83.3％，但是AKT1基因、AXIN2基因和GNA12基因各种单独作为结直肠癌诊断标志物，诊断灵敏度仅为72.7％-81.8％，与现有技术中的Septin9基因检测的68％-79.3％的灵敏度相比提高并不明显。而AKT1基因与AXIN2基因组合，或者AXIN2基因与GNA12基因组合，或者AKT1基因与AXIN2基因和GNA12基因组合，作为结直肠癌诊断标志物，诊断灵敏度可以达到100％，即完全诊断出结直肠癌，而特异性为83.3％，不亚于AKT1基因、AXIN2基因和GNA12基因各种单独作为结直肠癌诊断标志物时的特异性。AKT1基因与GNA12基因组合，作为结直肠癌诊断标志物，诊断灵敏度可以达到91.7％，也比现有技术中的Septin9基因检测的68％-79.3％的灵敏度高，而特异性也为83.3％。
因此，本发明优选选取AKT1基因与AXIN2基因组合，或者AXIN2基因与GNA12基因组合，或者AKT1基因与AXIN2基因和GNA12基因组合，作为结直肠癌诊断标志物，可以保证诊断的灵敏度，并具有良好的特异性。也可以选择AKT1基因与GNA12基因组合，尽管不是最优选的。
以上应用了具体实例对本发明进行了阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。本发明所属技术领域的技术人员依据本发明的构思，还可以做出若干简单推演、变形或替换。这些推演、变形或替换方案也落入本发明的权利要求范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市海普洛斯生物科技有限公司
<120> 结直肠癌分子标志物组合、其用途及引物组和检测试剂盒
<130> 19I29486
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 499
<212> DNA
<213> AKT1基因
<400> 1
tcaccccaca gcaggcagct gcctgggcag gcatcacacc acccacccag cagggagcac 60
cgtctggtgc catggagagt agccgaggct ccgggaagga ccggccccac catgggcggc 120
ccacaggccg cgaagtccat cccccgcagc cccagcccct acctcgcccc cgttggcgta 180
ctccatgaca aagcagaggc ggtcgtgggt ctggaaagag tacttcaggg cctgcaagga 240
aggggagctg gaactgcggc cccacaggca ggacggcagc cccgcaccac gctgcccgac 300
accacgctgc ttgataccac gtcgcctgat accacaccgc ccgtagcccc acaccacact 360
gcccgacacc acgctgcctg ataccacacc gcccgatacc acactgcccc acaccacaca 420
ccccatcaca ctgccccaca ccatacaccc ccacatcaca ctgcccccat gccacgctgc 480
cccacaccac actgcccca 499
<210> 2
<211> 498
<212> DNA
<213> AXIN2基因
<400> 2
gaagaaggcc taggccgcat tacctctcgg atctgctgca ggcgctcctc caggctgtgg 60
cggctctcca actccagctt cagcttttcc agcctcgaga tcagctcagc tgcaaaggtg 120
gcgggttcca cgggggtcat ctccttgggc aggcggtggg ttctctacag gacgtggaaa 180
ggaaagggag gaggcacgtt cagcaggcta ggtgggcggt ggcttggccg gagcttcccg 240
caccaggcgc tgtgcaccgc aaacccatgt tcgggtgtag agtggatggc aaggcggcct 300
gggctgctcg ggacttttat gcgctagcgc catggcctca tggagagcca tggtccccac 360
cagcgtttgc cttgggcagg agcagttggt cgcactccga gaggccctgc ttgttctttc 420
tgtagtacaa ccagcccatc agtagttact ttgaagtaga aaatcttcaa agactgttgt 480
caaccatcaa aaaaaaaa 498
<210> 3
<211> 583
<212> DNA
<213> GNA12基因
<400> 3
ggacatcagg aatgggaagc ccgagagagg aggaaacttc cacttaccag ggagagggct 60
gagctgggcc agccggggct ccaacaggtg tgcctgaggc tggggatgcc gtgtccactg 120
tgacccggcg ggcagcccga gacacctggg caggtgagtg cagacgtggc caaagagcca 180
gtgcaagaca gcaaagcccc gctcacggct gttgccgtcc ctgtgtgctc tcccagacct 240
gcccctgcac ctcgtgatgc tgccaggaag tgcccatgcc ttccactgaa cagacgagca 300
agcagaggct ctaggcggcg aggtcacttg tccaggtcag agactcgcct ccctggccaa 360
gggtcgctcc agacggtgga gggaggtctc accttcgtgg ttgaccttgt agtgcagcgt 420
gacggggccg ctgcacctct ggatggtcca gtgggcttcc tctttggtgc atgtgtccaa 480
cgggacactc tgcctctcgc ctcggatgca gccttctagc tggagagcag agacagcgtt 540
tgtctcctgg ccccacaggc agcagagctg cgggagcgag acc 583
<210> 4
<211> 500
<212> DNA
<213> 经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理的AKT1基因
<400> 4
ttattttata gtaggtagtt gtttgggtag gtattatatt atttatttag tagggagtat 60
cgtttggtgt tatggagagt agtcgaggtt tcgggaagga tcggttttat tatgggcggt 120
ttataggtcg cgaagtttat ttttcgtagt tttagttttt atttcgtttt cgttggcgta 180
ttttatgata aagtagaggc ggtcgtgggt ttggaaagag tattttaggg tttgtaagga 240
aggggagttg gaattgcggt tttataggta ggacggtagt ttcgtattac gttgttcgca 300
tattacgttg tttgatatta cgtcgtttga tattatatcg ttcgtagttt tatattatat 360
tgttcgatat tacgttgttt gatattatat cgttcgatat tatattgttt tatattatat 420
attttattat attgttttat attatatatt tttatattat attgttttta tgttacgttg 480
ttttatatta tattgtttta 500
<210> 5
<211> 498
<212> DNA
<213> 经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理的AXIN2基因
<400> 5
gaagaaggtt taggtcgtat tatttttcgg atttgttgta ggcgtttttt taggttgtgg 60
cggtttttta attttagttt tagttttttt agtttcgaga ttagtttagt tgtaaaggtg 120
gcgggtttta cgggggttat ttttttgggt aggcggtggg ttttttatag gacgtggaaa 180
ggaaagggag gaggtacgtt tagtaggtta ggtgggcggt ggtttggtcg gagtttttcg 240
tattaggcgt tgtgtatcgt aaatttatgt tcgggtgtag agtggatggt aaggcggttt 300
gggttgttcg ggatttttat gcgttagcgt tatggtttta tggagagtta tggtttttat 360
tagcgtttgt tttgggtagg agtagttggt cgtatttcga gaggttttgt ttgttttttt 420
tgtagtataa ttagtttatt agtagttatt ttgaagtaga aaatttttaa agattgttgt 480
taattattaa aaaaaaaa 498
<210> 6
<211> 583
<212> DNA
<213> 经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理的GNA12基因
<400> 6
ggatattagg aatgggaagt tcgagagagg aggaaatttt tatttattag ggagagggtt 60
gagttgggtt agtcggggtt ttaataggtg tgtttgaggt tggggatgtc gtgtttattg 120
tgattcggcg ggtagttcga gatatttggg taggtgagtg tagacgtggt taaagagtta 180
gtgtaagata gtaaagtttc gtttacggtt gttgtcgttt ttgtgtgttt ttttagattt 240
gtttttgtat ttcgtgatgt tgttaggaag tgtttatgtt ttttattgaa tagacgagta 300
agtagaggtt ttaggcggcg aggttatttg tttaggttag agattcgttt ttttggttaa 360
gggtcgtttt agacggtgga gggaggtttt attttcgtgg ttgattttgt agtgtagcgt 420
gacggggtcg ttgtattttt ggatggttta gtgggttttt tttttggtgt atgtgtttaa 480
cgggatattt tgtttttcgt ttcggatgta gttttttagt tggagagtag agatagcgtt 540
tgttttttgg ttttataggt agtagagttg cgggagcgag att 583
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> GNA12基因的正向引物
<400> 7
gtttggtgtt atggagagta g 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> GNA12基因的反向引物
<400> 8
caattccaac tccccttcct 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> AXIN2基因的正向引物
<400> 9
gtggaaagga aagggaggag 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> AXIN2基因的反向引物
<400> 10
ccttaccatc cactctacac 20
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> GNA12基因的正向引物
<400> 11
gttaaagagt tagtgtaaga tag 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> GNA12基因的反向引物
<400> 12
aaacataaac acttcctaac aac 23
Claims (10)
1.一种结直肠癌分子标志物组合，其特征在于，所述结直肠癌分子标志物组合包括由序列表中的SEQ ID NO:1或其反向互补序列所示的AKT1基因，SEQ ID NO:2或其反向互补序列所示的AXIN2基因和SEQ ID NO:3或其反向互补序列所示的GNA12基因中的至少两种，所述AKT1基因、所述AXIN2基因和所述GNA12基因启动子区域在结直肠癌人群中处于低甲基化状态。
2.根据权利要求1所述的结直肠癌分子标志物组合，其特征在于，所述结直肠癌分子标志物组合包括所述AKT1基因中的包含至少1个甲基化CpG位点的序列片段、所述AXIN2基因中的包含至少1个甲基化CpG位点的序列片段、所述GNA12基因中的包含至少1个甲基化CpG位点的序列片段。
3.根据权利要求1所述的结直肠癌分子标志物组合，其特征在于，所述结直肠癌分子标志物组合包括所述AKT1基因、所述AXIN2基因和所述GNA12基因经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的，由SEQ ID NO:4或其反向互补序列所示的经处理的AKT1基因，由SEQ IDNO:4或其反向互补序列所示的经处理的AXIN2基因，和由SEQ ID NO:4或其反向互补序列所示的经处理的GNA12基因。
4.根据权利要求3所述的结直肠癌分子标志物组合，其特征在于，所述结直肠癌分子标志物组合包括所述经处理的AKT1基因中的包含至少1个甲基化CpG位点的序列片段、所述经处理的AXIN2基因中的包含至少1个甲基化CpG位点的序列片段、所述经处理的GNA12基因中的包含至少1个甲基化CpG位点的序列片段。
5.根据权利要求1所述的结直肠癌分子标志物组合，其特征在于，所述结直肠癌分子标志物组合由所述AKT1基因和所述AXIN2基因组成。
6.根据权利要求1所述的结直肠癌分子标志物组合，其特征在于，所述结直肠癌分子标志物组合由所述AXIN2基因和所述GNA12基因组成。
7.根据权利要求1所述的结直肠癌分子标志物组合，其特征在于，所述结直肠癌分子标志物组合由所述AKT1基因、所述AXIN2基因和所述GNA12基因组成。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的结直肠癌分子标志物组合在制备用于检测结直肠癌的试剂中的用途。
9.一种用于检测SEQ ID NO:1或其反向互补序列所示的AKT1基因、SEQ ID NO:2或其反向互补序列所示的AXIN2基因和SEQ ID NO:3或其反向互补序列所示的GNA12基因启动子区域的甲基化状态的引物组，其特征在于，所述引物组包括以下引物序列：
AKT1基因正向引物：GTTTGGTGTTATGGAGAGTAG(SEQ ID NO:7)；
AKT1基因反向引物：CAATTCCAACTCCCCTTCCT(SEQ ID NO:8)；
AXIN2基因正向引物：GTGGAAAGGAAAGGGAGGAG(SEQ ID NO:9)；
AXIN2基因反向引物：CCTTACCATCCACTCTACAC(SEQ ID NO:10)；
GNA12基因正向引物：GTTAAAGAGTTAGTGTAAGATAG(SEQ ID NO:11)；
GNA12基因反向引物：AAACATAAACACTTCCTAACAAC(SEQ ID NO:12)。
10.一种用于检测SEQ ID NO:1或其反向互补序列所示的AKT1基因、SEQ ID NO:2或其反向互补序列所示的AXIN2基因和SEQ ID NO:3或其反向互补序列所示的GNA12基因启动子区域的甲基化状态的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含根据权利要求9所述的引物组。
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