发明内容
基于目前illumina公司的solexa测序平台提供的DNA标签文库制备方法,本发明改良了index序列,分别设计了长度为7bp独特的index序列,可以通过接头连接和PCR反应导入组合标签序列,成功的建立了DNA标签文库的建库方法,并应用于solexa DNA测序,提高了DNA标签文库的制备的效率,极大的增大了DNA样品的测序通量,降低了单个样品的solexa测序费用。
标签设计首先需要考虑标签序列之间的可识别性和识别率的问题,然后需要考虑标签序列混合之后的每个位点的GT与AC碱基含量的平衡问题,最后考虑数据产出的可重复性和准确性。在设计标签的过程中,本发明充分考虑到以上几个因素,同时避免了标签的核酸序列出现3或3个以上连续的碱基,这样可以降低序列在合成过程中或测序过程中的错误率。同时尽量避免标签引物自身形成发夹结构,而导致PCR反应扩增效率。
本发明对illumina提供的DNA接头(也称为adapter)和标签PCR引物序列进行优化,将标签设计为长度为7bp的特殊序列,通过标签接头的连接将标签导入,另外将illumina公司提供的的3条DNA标签PCR引物优化为两条PCR引物导入标签,通过接头连接和PCR反应导入组合标签序列。优化后的标签序列,与illumina公司的DNA标签引物相比,提高了PCR扩增反应的效率,并提高了标签序列的识别效率。如图3所示为illumina公司的DNA标签建库流程图,图4为优化后的DNA标签建库实验流程图。
本发明基于目前illumina公司提供的Solexa Paired End测序平台,设计一段长度为7bp的特定标签核酸序列。通过测试PCR标签引物的扩增效率和标签核酸序列的识别率,最后优化并筛选出59条长度为7bp的DNA标签序列(如表2,7bp的DNA标签序列)及DNA标签PCR引物。这些长度为7bp的标签之间的差异在3个碱基,即至少3个碱基序列不同。表3为DNA标签接头序列及其标签序列。表4为PCR1.0标签引物序列及其标签序列。表5为PCR2.0标签引物序列及其标签序列。将长度为7bp的标签嵌DNA标签接头中、PCR1.0标签引物和PCR2.0标签引物中,预测形成的二级结构及稳定的能量值见以下说明;通过DNA标签接头、PCR1.0标签引物和PCR2.0标签引物中的标签进行排列组合,最终可以构建庞大的标签集群,满足高通量测序的需求。当标签的7个碱基中的任意一个碱基出现测序错误或合成错误,都不影响到标签的最终识别。
表2:长度为7bp的DNA标签序列(DNA indexN)
表3:DNA标签接头序列(其由正反2个互补序列DNA Index-NF_adapter和DNA Index-NR_adapter组成)及其标签序列,序列均以5’-3’方向表示。正反2个互补序列DNA Index-NF/R_adapter等摩尔退火后形成DNA标签接头。退火条件为:DNA Index-NF/R_adapter等摩尔量混合后,95℃10min,70℃10min,65℃10min,60℃10min,55℃10min,50℃10min,4℃∞。升温至95℃后,所有降温速度控制为每秒0.1℃缓慢降温,让两条引物序列结合在一起形成Y型结构的PCR-Free标签接头。
使用Lasergene的PrimerSelect软件预测59个DNA标签接头(DNA indexN adapter)的最稳定接头序列(the most stable dimeroverrall)及能量值,其中标签长度为7bp。
DNA index1adapter
The most stable dimer overall:20bp,-40.3kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAACCGCAT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGATTGGCGT 5′
DNA index2adapter
The most stable dimer overall:20bp,-38.3kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAAGAGGCT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGATTCTCCG 5′
DNA index3adapter
The most stable dimer overall:20bp,-37.4kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAAGCTTGT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGATTCGAAC 5′
DNA index4adapter
The most stable dimer overall:20bp,-40.5kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAATGCCGT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGATTACGGC 5′
DNA index5adapter
The most stable dimer overall:20bp,-34.5kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACATATGT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGATGTATAC 5′
DNA index6adapter
The most stable dimer overall:20bp,-36.2kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACCACTCT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGATGGTGAG 5′
DNA index7adapter
The most stable dimer overall:20bp,-36.5kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACCTTCTT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGATGGAAGA 5′
DNA index8adapter
The most stable dimer overall:20bp,-35.0kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACTCAACT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGATGAGTTG 5′
DNA index9adapter
The most stable dimer overall:20bp,-36.7kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGAATCCT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGATCTTAGG 5′
DNA index10adapter
The most stable dimer overall:20bp,-36.5kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGGTCAGT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGATCCAGTC 5′
DNA index11adapter
The most stable dimer overall:20bp,-35.0kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGTCTGAT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGATCAGACT 5′
DNA index12adapter
The most stable dimer overall:20bp,-35.3kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGTTGTTT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACC TCAAGT CTGCACACGAGAAGGC TAGATCAACAA 5′
DNA index13adapter
The most stable dimer overall:20bp,-34.8kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATCATAAT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGATAGTATT 5′
DNA index14adapter
The most stable dimer overall:20bp,-40.1kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATCGCGTT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGATAGCGCA 5′
DNA index15adapter
The most stable dimer overall:20bp,-36.7kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATGCACTT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGATACGTGA 5′
DNA index16adapter
The most stable dimer overall:20bp,-34.8kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATTGATAT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGATAACTAT 5′
DNA index17adapter
The most stable dimer overall:20bp,-37.6kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCAAGGATT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAGTTCCTA 5′
DNA index18adapter
The most stable dimer overall:20bp,-38.8kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCACGACCT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAGTGCTGG 5′
DNA index 19adapter
The most stable dimer overall:20bp,-40.8kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATCCGCT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAGTAGGCG 5′
DNA index20adapter
The most stable dimer overall:20bp,-40.3kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCGCTAAT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAGGCGATT 5′
DNA index21adapter
The most stable dimer overall:20bp,-37.7kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCTACCTT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAGGATGGA 5′
DNA index22adapter
The most stable dimer overall:20bp,-38.9kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCTGAGGT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAGGACTCC 5′
DNA index23adapter
The most stable dimer overall:20bp,-36.9kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGATAGAT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAGCTATCT 5′
DNA index24adapter
The most stable dimer overall:20bp,-42.6kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGCACGGT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAGCGTGCC 5′
DNA index25adapter
The most stable dimer overall:20bp,-40.5kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGCGTTAT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAGCGCAAT 5′
DNA index26adapter
The most stable dimer overall:20bp,-36.9kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGTAATCT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAGCATTAG 5′
DNA index27adapter
The most stable dimer overall:20bp,-34.4kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTAACTAT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAGATTGAT 5′
DNA index28adapter
The most stable dimer overall:20bp,-36.7kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTAGTCGT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAGATCAGC 5′
DNA index29adapter
The most stable dimer overall:20bp,-35.2kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTCTATTT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAGAGATAA 5′
DNA index30adapter
The most stable dimer overall:20bp,-35.6kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTGTGACT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAGACACTG 5′
DNA index31adapter
The most stable dimer overall:20bp,-36.1kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGAACATCT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGACTTGTAG 5′
DNA index32adapter
The most stable dimer overall:20bp,-35.0kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGACTCTAT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGACTGAGAT 5′
DNA index33adapter
The most stable dimer overall:20bp,-37.4kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGAGTGCTT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGACTCACGA 5′
DNA index34adapter
The most stable dimer overall:20bp,-35.8kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGATTAAGT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGACTAATTC 5′
DNA index35adapter
The most stable dimer overall:20bp,-38.3kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCAGGTAT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGACGTCCAT 5′
DNA index36adapter
The most stab1e dimer overall:20bp,-37.6kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCATCACT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGACGTAGTG 5′
DNA index37adapter
The most stable dimer overall:20bp,-41.1kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCGAATT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGACGGCTTA 5′
DNA index38adapter
The most stable dimer overall:20bp,-39.3kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCGATGTT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGACGCTACA 5′
DNA index39adapter
The most stable dimer overall:20bp,-42.9kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCTCGCGT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGACGAGCGC 5′
DNA index40adapter
The most stable dimer overall:20bp,-40.4kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGAGCCTT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGACCTCGGA 5′
DNA index41adapter
The most stable dimer overall:20bp,-39.5kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGCAACAT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGACCGTTGT 5′
DNA index42adapter
The most stable dimer overall:20bp,-39.8kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGCCTAGT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGACCGGATC 5′
DNA index43adapter
The most stable dimer overall:20bp,-38.6kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGTGGACT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGACCACCTG 5′
DNA index44adapter
The most stable dimer overall:20bp,-37.9kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTACGGTT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGACATGCCA 5′
DNA index45adapter
The most stable dimer overall:20bp,-39.5kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTGGCAAT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGACACCGTT 5′
DNA index46adapter
The most stable dimer overall:20bp,-35.8kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTTATTGT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGACAATAAC 5′
DNA index47adapter
The most stable dimer overall:20bp,-39.0kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTAATCGGT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAATTAGCC 5′
DNA index48adapter
The most stable dimer overall:20bp,-34.9kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTATAAGAT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAATATTCT 5′
DNA index49adapter
The most stable dimer overall:20bp,-35.2kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTATCTCTT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAATAGAGA 5′
DNA index50adapter
The most stable dimer overall:20bp,-37.7kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCCAGAGT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAAGGTCTC 5′
DNA index51adapter
The most stable dimer overall:20bp,-39.4kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCGGACAT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAAGCCTGT 5′
DNA index52adapter
The most stable dimer overall:20bp,-37.9kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCGTCTTT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAAGCAGAA 5′
DNA index53 adapter
The most stable dimer overall:20bp,-35.7kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGATTATT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAACTAATA 5′
DNA index54adapter
The most stable dimer overall:20bp,-39.2kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGCCAGTT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAACGGTCA 5′
DNA index55adapter
The most stable dimer overall:20bp,-41.0kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGCTGCCT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAACGACGG 5′
DNA index56adapter
The most stable dimer overall:20bp,-40.3kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGGCGTAT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAACCGCAT 5′
DNA index57adapter
The most stable dimer overall:20bp,-35.9kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTACAAGT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAAATGTTC 5′
DNA index58adapter
The most stable dimer overall:20bp,-39.7kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTGACCGT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAAACTGGC 5′
DNA index59adapter
The most stable dimer overall:20bp,-39.5kcal/mol
5′TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTGGTGCT 3′
::: : ||||||||||||||||||||
3′CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAAACCACG 5′
表4:PCR1.0标签引物序列(PCR1.0_index_N primer)及其标签序列
表5:PCR2.0标签引物序列(PCR2.0_index_N primer)及其标签序列
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。
按图4优化的DNA标签建库流程进行构建DNA标签文库
本发明一方面提供了一组DNA标签,所述DNA标签包括如下或由如下组成:表2所示DNA标签或与之相差1个碱基的DNA标签中的至少5个,或至少10个,或至少15个,或至少20个,至少25个,或至少30个,或至少35个,或至少40个,或45个,或至少50个,或至少55个,或全部59个,
所述DNA标签优选地至少包括表2所示的59个DNA标签的DNAIndex1~DNA Index5,或DNA Index6~DNA Index10,或DNAIndex11~DNA Index15,或DNA Index16~DNA Index20,或DNAIndex21~DNA Index25,或DNA Index26~DNA Index30,或DNAIndex31~DNA Index35,或DNA Index36~DNA Index40,或DNAIndex41~DNA Index45,或DNA Index46~DNA Index50,或DNAIndex51~DNA Index55,或DNA Index55~DNA Index59,或者他们任何两个或多个的组合。
在本发明的一个具体实施方式中,所述DNA标签中所述的相差1个碱基包括标签中1个碱基的取代、添加或删除。
在本发明的一个具体实施方式中,提供了所述的DNA标签用于构建DNA标签文库的用途,其中DNA标签文库的DNA标签接头在3’末端包含所述DNA标签,从而构成各自相对应的DNA标签接头,所述DNA标签接头优选地用作DNA标签文库的接头。
在本发明的一个具体实施方式中,本发明提供的用途中,所述DNA标签插入DNA标签接头中的3’末端中,或通过或不通过连接子连接在DNA接头的3’末端,优选地插入DNA标签接头中的3’末端中;更优选地距离DNA标签接头中的3’末端1个碱基插入DNA标签接头中。
在本发明的一个具体实施方式中,进一步提供了通过上文所述的DNA标签构建的DNA标签文库。
本发明另一方面提供了含有上文所述的DNA标签的一组DNA标签接头,其中DNA标签文库的DNA标签接头在3’末端包含所述的标签,并且优选地用作接头,所述一组所述DNA标签接头包括如下或由如下组成:表3所示59个DNA标签接头或与其所包含的DNA标签序列相差1个碱基的DNA标签接头中的至少5个,或至少10个,或至少15个,或至少20个,至少25个,或至少30个,或至少35个,或至少40个,或45个,或至少50个,或至少55个,或全部59个,
所述DNA标签接头优选地至少包括表3所示的59个DNA标签接头中的DNA Index1F/R_adapter~DNA Index5F/R_adapter,或DNAIndex6F/R_adapter~DNA Index10F/R_adapter,或DNAIndex11F/R_adapter~DNA Index15F/R_adapter,或DNAIndex16F/R_adapter~DNA Index20F/R_adapter,或DNAIndex21F/R_adapter~DNA Index25F/R_adapter,或DNAIndex26F/R_adapter~DNA Index30F/R_adapter,或DNAIndex31F/R_adapter~DNA Index35F/R_adapter,或DNAIndex36F/R_adapter~DNA Index40F/R_adapter,或DNAIndex41F/R_adapter~DNA Index45F/R_adapter,或DNAIndex46F/R_adapter~DNA Index50F/R_adapter,或DNAIndex51F/R_adapter~DNA Index55F/R_adapter,或DNAIndex55F/R_adapter~DNA Index59F/R_adapter,或者他们任何两个或多个的组合。
在本发明的一个具体实施方式中,本发明所提供的DNA标签接头中,所述的相差1个碱基包括标签中1个碱基的取代、添加或删除。
在本发明的一个具体实施方式中,还提供了所述DNA标签接头用于构建DNA标签文库的用途,优选地所述DNA标签接头用作DNA标签文库的接头。
在本发明的一个具体实施方式中,本发明进一步提供了通过所述DNA标签接头构建的DNA标签文库。
本发明另一方面还提供了一组PCR标签引物,所述PCR标签引物与上文所述本发明提供的DNA标签接头相对应,所述PCR标签引物包括上游引物PCR1.0标签引物和下游引物PCR2.0标签引物,其中
所述PCR1.0标签引物包括如下或由如下组成:表4所示59个PCR1.0标签引物或与其所包含的DNA标签序列相差1个碱基的PCR1.0标签引物中的至少5个,或至少10个,或至少15个,或至少20个,至少25个,或至少30个,或至少35个,或至少40个,或45个,或至少50个,或至少55个,或全部59个,
所述PCR1.0标签引物优选地至少包括表3所示的59个PCR1.0标签引物中的PCR1.0_Index_1primer~PCR1.0_Index_5primerr,或PCR1.0_Index_6primer~PCR1.0_Index_10primerr,或PCR1.0_Index_11primer~PCR1.0_Index_15primerr,或PCR1.0_Index_16primer~PCR1.0_Index_20primerr,或PCR1.0_Index_21primer~PCR1.0_Index_25primerr,或PCR1.0_Index_26primer~PCR1.0_Index_30primerr,或PCR1.0_Index_31primer~PCR1.0_Index_35primerr,或PCR1.0_Index_36primer~PCR1.0_Index_40primerr,或PCR1.0_Index_41primer~PCR1.0_Index_45primerr,或PCR1.0_Index_46primer~PCR1.0_Index_50primerr,或PCR1.0_Index_51primer~PCR1.0_Index_55primerr,或PCR1.0_Index_55primer~PCR1.0_Index_59primerr,或者他们任何两个或多个的组合;并且
所述PCR2.0标签引物包括如下或由如下组成:表5所示59个PCR2.0标签引物或与其所包含的DNA标签序列相差1个碱基的PCR2.0标签引物中的至少5个,或至少10个,或至少15个,或至少20个,至少25个,或至少30个,或至少35个,或至少40个,或45个,或至少50个,或至少55个,或全部59个,
所述PCR2.0标签引物优选地至少包括表5所示的59个PCR2.0标签引物中的PCR2.0_Index_1primer~PCR2.0_Index_5primerr,或PCR2.0_Index_6primer~PCR2.0_Index_10primerr,或PCR2.0_Index_11primer~PCR2.0_Index_15primerr,或PCR2.0_Index_16primer~PCR2.0_Index_20primerr,或PCR2.0_Index_21primer~PCR2.0_Index_25primerr,或PCR2.0_Index_26primer~PCR2.0_Index_30primerr,或PCR2.0_Index_31primer~PCR2.0_Index_35primerr,或PCR2.0_Index_36primer~PCR2.0_Index_40primerr,或PCR2.0_Index_41primer~PCR2.0_Index_45primerr,或PCR2.0_Index_46primer~PCR2.0_Index_50primerr,或PCR2.0_Index_51primer~PCR2.0_Index_55primerr,或PCR2.0_Index_55primer~PCR2.0_Index_59primerr,或者他们任何两个或多个的组合。
在本发明的一个具体实施方式中,本发明所提供的PCR标签引物中,所述的相差1个碱基包括标签中1个碱基的取代、添加或删除。
在本发明的一个具体实施方式中,本发明提供了所述PCR标签引物用于构建DNA标签文库的用途。
在本发明的一个具体实施方式中,本发明还提供了通过上文所述的PCR标签引物构建的DNA标签文库。
本发明另一方面进一步提供了一种标签文库的构建方法,所述方法的特征在于使用包含标签的DNA接头来构建标签文库。
在本发明的一个具体实施方式中,本发明提供了一种标签文库的构建方法,所述的方法包括:
1)提供n个DNA样品,n为整数且1≤n≤59的整数,优选地n为整数且2≤n≤59,所述DNA样品来自所有真核和原核DNA样品,包括但不限于人DNA样品;
2)将人基因组DNA打断,其中打断方法包括但不限于超声波打断方法,优选地使打断后的DNA条带集中在180bp左右;
3)末端修复;
4)DNA片段3’末端加“A”碱基;
5)连接DNA标签接头,其中优选地每一个标签接头连接到DNA片段的两端,;
6)将步骤5)得到的连接产物进行凝胶回收纯化,优选地通过2%的琼脂糖胶进行电泳并回收,并将各个DNA样品的回收产物混合在一起;
7)PCR反应,使用步骤6)的回收产物的混合物作为模板,在适于扩增目的核酸的条件下进行PCR扩增,将PCR产物进行胶回收纯化,优选地回收280~300bp的目的片段。
在本发明的一个具体实施方式中,本发明所提供的方法中,DNA标签文库的DNA标签接头包括如下或由如下组成:表3所示59个DNA标签接头或与其所包含的DNA标签序列相差1个碱基的DNA标签接头中的至少5个,或至少10个,或至少15个,或至少20个,至少25个,或至少30个,或至少35个,或至少40个,或45个,或至少50个,或至少55个,或全部59个,
所述DNA标签接头优选地至少包括表3所示的59个DNA标签接头中的DNA Index1F/R_adapter~DNA Index5F/R_adapter,或DNAIndex6F/R_adapter~DNA Index10F/R_adapter,或DNAIndex11F/R_adapter~DNA Index15F/R_adapter,或DNAIndex16F/R_adapter~DNA Index20F/R_adapter,或DNAIndex21F/R_adapter~DNA Index25F/R_adapter,或DNAIndex26F/R_adapter~DNA Index30F/R_adapter,或DNAIndex31F/R_adapter~DNA Index35F/R_adapter,或DNAIndex36F/R_adapter~DNA Index40F/R_adapter,或DNAIndex41F/R_adapter~DNA Index45F/R_adapter,或DNAIndex46F/R_adapter~DNA Index50F/R_adapter,或DNAIndex51F/R_adapter~DNA Index55F/R_adapter,或DNAIndex55F/R_adapter~DNA Index59F/R_adapter,或者他们任何两个或多个的组合。
在本发明的一个具体实施方式中,本发明所提供的方法中,所述的相差1个碱基包括标签中1个碱基的取代、添加或删除。
在本发明的一个具体实施方式中,本发明所提供的方法中,步骤7)PCR反应中使用的引物是如权利要求10或11所述的PCR Primer1.0和PCR Primer 2.0。
在本发明的一个具体实施方式中,本发明进一步还提供了通过上文所述的方法构建的标签文库。
主要实验仪器及试剂
1.1DNA模板准备
pMD18-T质粒载体(日本takara),为模板,使用PrimerPremier5.0软件设计引物,pMD18-T引物1:CGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGG;pMD18-T引物2:TTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCG;PCR扩增产物长度为250bp的片段,使用NanoDrop 1000仪器(美国NanoDrop)检测扩增产物的浓度,然后根据浓度取1ug的该PCR产物作为文库构建的插入片段,补水使其体积至35μL。
pMD18-T质粒DNA模板 2μL
Taq酶 0.5μL
pMD18-T引物1 1μL
pMD18-T引物2 1μL
dNTP混合液 5μL
10×PCR缓冲液 5μL
ddH2O 35.5μL
总体积 50μL
PCR反应条件
98℃ 30s
72℃ 5min
4℃ 保存
然后PCR产物用QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化
1.2末端修复[6]
按照下列的配比准备反应混合:
DNA模板 35μL
T4DNA连接酶缓冲液 50μL
dNTPs混合液 4μL
T4DNA聚合酶 5μL
Klenow DNA聚合酶 1μL
T4多聚核苷酸激酶 5μL
总体积 100μL
将舒适型恒温混匀器调至20℃,反应30min,然后用QIAquickPCR纯化试剂盒进行纯化,最后将样品溶于32μL EB solution。
1.3DNA片段3′末端加“A”碱基
按照下列的配比准备反应混合物:
末端修复后的DNA 32μL
Klenow酶缓冲液 5μL
dATP(1mM) 10μL
Klenow酶(3′到5′外切酶活性)3μL
总体积 50μL
将舒适型恒温混匀器调至37℃,反应30min,然后用MiniElute PCR纯化试剂盒进行纯化,最后将样品溶于10μL EB solution。
1.4连接PCR-Free标签接头
按照下列的配比准备反应混合物,:
DNA 10μL
T4DNA连接酶缓冲液 25μL
DNA标签接头 10μL
T4DNA连接酶 5μL
总体积 50μL
注:DNA标签接头可以为表3中的59条DNA标签接头中的任何一条标签接头(其由正反2个互补序列DNA Index-NF_adapter和DNAIndex-NR_adapter组成)。
将舒适型恒温混匀器调至20℃,反应15min,然后用QIAquickPCR纯化试剂盒进行纯化,最后将样品溶于30μL EB solution。
1.5连接产物的胶回收纯化
将连接产物于2%的琼脂糖胶中进行电泳分离;随后将目的片段条带切胶转移至Eppendorf管中。用QIAquick胶纯化试剂盒进行胶纯化回收,回收产物溶于20μL EB solution。
1.6PCR反应导入标签接头
PCR反应:按照下列的反应体系准备反应混合物,将试剂放置于冰上。
胶回收纯化后的DNA 10μL
Phusion DNA聚合酶 25μL
PCR1.0_indexN primer 1μL
PCR2.0_indexN primer 1μL
ddH2O 13μL
总体积 50μL
注:PCR1.0_indexN引物可以为表4中的59条PCR1.0_indexprimerN中的任何一条标签引物;PCR2.0_index primer可以为表5中的59条PCR2.0_index primerN中的任何一条标签引物;
PCR反应条件
98℃ 30s
72℃ 5min
4℃ 保存
1.7PCR产物的胶回收纯化
将PCR产物于2%琼脂糖胶中电泳分离,切割回收目的片段,用QIAquick胶纯化试剂盒进行胶纯化回收,回收产物溶于30μL EBsolution。
1.8DNA制备产物检测
1)使用Agilent 2100Bioanalyzer检测文库产量。
2)使用QPCR定量检测文库产量。
最后构建完的DNA标签文库可以通过不同的标签组合来判断该文库的标签标签,如图5、图6、图7所示,可以通过DNA标签接头中、PCR1.0 index primer和PCR2.0 index primer中的标签组合来判断样品的标签序列,这样的组合可以达到205379种不同的标签组合(59×59×59种),极大的提高了标签标签的数量。
例如插入片段的信息序列为:
CGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTT
GCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAA
如图5所示则构建的文库序列信息如下
>Index tagA-1:index1+index1+index1
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTTGCGGTTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAACCGCATCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATGCGGTTAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAACCGCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
>Index tagA-2:index2+index1+index1
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTGCCTCTTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAACCGCATCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATGCGGTTAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAACCGCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
>Index tagA-3:index3+index1+index1
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTCAAGCTTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAACCGCATCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATGCGGTTAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAACCGCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
>Index tagA-58:index58+index1+index1
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTCGGTCAAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAACCGCATCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATGCGGTTAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAACCGCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
>Index tagA-59:index59+index1+index1
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTGCACCAAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAACCGCATCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCC
CCTGACGAGCATCACAAAAATGCGGTTAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAACCGCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
例如插入片段的片段信息序列为:
CGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAA
如图6所示则构建的文库序列信息如下
>Index tagB-1:index1+index1+index1
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTTGCGGTTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAACCGCATCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATGCGGTTAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAACCGCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
>Index tagB-2:index1+index2+index1
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTTGCGGTTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAAGAGGCTCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAAGCCTCTTAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAACCGCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
>Index tagB-3:index1+index3+index1
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTTGCGGTTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAACCGCATCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATGCGGTTAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAACCGCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
>Index tagB-58:index1+index58+index1
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTTGCGGTTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAAGCTTGTCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATGCGGTTAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAACCGCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
>Index tagB-59:index1+index59+index1
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTTGCGGTTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAACCGCATCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATGCGGTTAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAACCGCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
例如插入片段的信息为:
CGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAA
如图7所示则构建的文库序列信息如下
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AATGATACGGCGACCACCGAGATCTTGCGGTTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAACCGCATCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATGCGGTTAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAACCGCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
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>Index tagC-3:index1+index1+index3
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTTGCGGTTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAACCGCATCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAACAAGCTTAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAACCGCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
>Index tagC-58:index1+index1+index58
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTTGCGGTTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTGACCGTCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAACGGTCAAAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTGACCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
>Index tagC-59:index1+index1+index59
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTTGCGGTTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTGGTGCTCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAAGCACCAAAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTGGTGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
图8为构建的DNA标签组合文库电泳检测结果,目的片段文库如箭头所指,为800bp;D2000marker条带大小依次为:2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp;1、D2000marker;2、Index tagA-1;3、Index tagA-2;4、Index tagA-3;5、Index tagA-58;6、Index tagA-59;7、Index tagB-2;8、Index tagB-3;9、Index tagB-58;10、Index tagB-59;11、Index tagC-2;12、Index tagC-3;13、Index tagC-58;14、D2000marker;电泳结果显示文库构建正常,能用于DNA index建库,满足solexa测序需求。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导,可以对那些细节进行各种修改和替换,这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
参考文献
1、Paired-End sequencing User Guide;illumina part#1003880
2、Preparing samples for ChIP sequencing for DNA;illuminapart#11257047Rev.A;
3、mRNA sequencing sample preparation Guide;illuminapart#1004898Rev.D
4、Preparing 2-5kb samples for mate pair library sequencing;illumina part#1005363Rev.B;
5、Preparing samples for multiplexed Paired-End sequencing;illumina part#1005361Rev.B;