CN102409046B - 小分子rna标签 - Google Patents

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Abstract

本发明基于目前illumina公司提供的Solexa Single End测序平台，针对小分子RNA样品，设计了特定序列作为标签。本发明提供了使用所设计的标签，利用PCR方法构建小分子RNA标签文库的方法。本发明的这些标签及其PCR引物可以应用于任何小分子RNA标签的文库构建。

Description

小分子RNA标签
技术领域
本发明涉及核酸测序技术领域，特别是小分子RNA测序技术领域。另外，本发明还涉及基于通过PCR引入分子标签的技术，以及小分子RNA文库制备方法。本发明的方法特别适用于第二代测序技术，尤其是solexa测序技术。
背景技术
小分子RNA(small RNA)是生物体内一类重要的特殊分子，诱导基因沉默，参与细胞生长、发育、基因转录和翻译等诸多生命活动的调控过程。基于solexa高通量测序技术的小RNA数字化分析，采用边合成边测序(SBS-sequencing by synthesis)，可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。并具有所需样品量少，高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点，一次性获得数百万条小分子RNA序列，能够快速全面地鉴定该物种在该状态下的小分子RNA和发现新的小分子RNA，构建样品之间的小分子RNA差异表达谱，为小分子RNA功能研究提供有力工具。
目前illumina公司的Solexa测序平台提供的小分子RNA文库制备方法有两种，分别为方法一(Preparing Samples for analysis of smallRNA)和方法二(Preparing Samples for Small RNA Sequencing Usingthe Alternative v1.5Protocol)。方法一，从总RNA中首先分离长度为18～30nt的小分子RNA，然后将分离的小分子RNA分别依次与5’接头(也称为adapter)、3’接头连接，每次连接完接头后都需要切胶回收连接的目的片段，随后将带有已知接头的目的片段进行逆转录反应，通过PCR反应扩增带有接头的目的片段，最后切胶回收带有接头的目的片段文库[1]，如图1(a)；方法二，从总RNA中首先分离长度为18～30nt的小分子RNA，然后将分离的小分子RNA依次与3’接头、5’接头连接，其中方法二的接头连接顺序与方法一不同，且3’接头与方法一的3’接头序列的5’末端位点修饰不同，此外方法二中，连接完接头后不需要切胶回收目的片段，随后将带有已知接头的目的片段进行逆转录反应，通过PCR反应扩增带有接头的目的片段，最后切胶回收含有目的片段文库[2]，如图1(b)。
方法一使用T4RNA连接酶1来将目的片段分别和5’接头、3’接头发生连接反应，其中T4RNA连接酶1在含有ATP的10×T4RNA连接酶1缓冲液反应体系中，20℃连接6小时。该方法的缺点是费时费力，每次将目的片段与接头连接反应后需要通过PAGE电泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳)来选择纯化回收的目的片段，在操作过程中也较容易造成RNA的降解。
方法二将3’接头的5’末端进行预腺苷酰化处理，使用T4RNA连接酶2截短型(T4RNL2truncated)将目的片段与3’接头进行连接反应，该酶可特异性地将DNA或RNA的预腺苷酰化5’末端连接到RNA 3’末端。连接时不需要ATP，但需要预腺苷酰化底物。与全长的T4RNA连接酶2不同，T4RNL2截短型酶不能将底物的5’末端腺苷酰化，因此无法将RNA或DNA的5’磷酸末端连接到RNA3’端[3-5]。
综上所述，方法一与方法二的最大区别在于，方法二在连接3’接头使用的连接酶为T4RNA连接酶2截短型，而方法一使用的是T4RNA连接酶1。由于T4RNA连接酶2截短型可以特异识别预腺苷酰化的修饰位点，所以将3’接头的5’端的碱基进行预腺苷酰化修饰，该连接酶特异识别该位点后进行正确的连接反应。此外该连接酶还大大缩短了连接反应的时间，而且连接3’接头后不需要切胶选择目的片段分子，便可直接与5’接头进行连接，连接5’接头后也不需要切胶选择目的片段分子，可直接进行RT-PCR反应，所以方法二相对方法一更省时省力。
方法一和方法二这两种文库制备的方法只能对单个文库样品进行Solexa Single End测序，不能将Solexa小分子RNA文库样品混合测序。因为随着solexa测序通量的增加，1个测序泳道(lane)所产出的数据远远大于目的片段所需求的数据量，如果所构建的文库样品不能进行混合测序，将在一定程度上“浪费测序资源”和影响到测序通量。
因此，现在需要一种利用Solexa测序的高通量，而能将小分子RNA文库样品混合进行测序的方法，从而提高小分子RNA测序的效率和通量。
发明内容
基于目前illumina公司的solexa测序平台提供的小分子RNA文库制备方法，本发明针对小分子RNA样品，设计了独特的标签序列，利用PCR技术，成功的建立了小分子RNA标签文库(small RNA indexlibrary)的构建方法，并成功用于测序，增大了小分子RNA样品的测序通量，降低了小分子RNA测序成本。
构建小分子RNA文库并测序，需要保证结果可靠，可重复性高。即同样的RNA样品构建不同标签的小分子RNA文库，需要保证不同标签构建的小分子RNA文库的数据产出的结果一致，保证实验结果可靠且重复性高。本发明基于目前illumina公司的solexa测序平台提供的小分子RNA文库制备方法[1，2]，将一段特定长度的核苷酸序列嵌入PCR引物或接头中，同时考虑PCR引物的扩增效率和实验结果的可重复性，经过在模式植物“水稻样品”与模式动物“人血液样品”中的验证，最后筛选出合适的标签序列标签，确保数据的准确性和可重复性。
在标签混合量少于12个(样品)的情况下，必须考虑到混合后的标签上的每个碱基位点的GT含量。因为solexa测序过程中，碱基G和T的激发荧光一样，碱基A和C的激发光是一样的，因此必须考虑碱基“GT”含量与碱基“AC”含量的“平衡”，最适碱基“GT”含量为50％，能保证标签识别率最高和错误率最低。因此设计并使用合适的标签引物就十分必要了，不仅能灵活应用于小分子RNA样品的测序，也能提高目前小分子RNA样品的测序通量。
标签设计需要考虑标签序列之间的可识别性和识别率的问题，同时也需要考虑标签序列混合之后的每个位点的“GT”与“AC”碱基含量的“平衡”问题，最后考虑数据产出的可重复性和准确性。在设计标签的过程中，本发明充分考虑到以上因素，同时避免了标签序列出现3或3个以上连续的碱基的出现，因为3个或3个以上连续的碱基会增加序列在合成过程中或测序过程中的错误率，标签序列本身嵌入PCR引物或接头中，也要尽可能的避免出现发夹结构或与测序引物及其反向互补序列相同的现象，所以标签设计需要综合考虑以上因素，才能保证标签设计成功。
构建小分子RNA标签文库可以分为以下2个方案：
方案一、将特定长度的核苷酸序列(即标签)嵌入5接头的3’末端中，将带有标签的接头与目的片段进行连接反应，构建标签文库。如图-2所示，从总RNA中首先分离长度为18～30nt的小分子RNA，将分离的小分子RNA先与3’接头连接，然后与5’标签接头连接(5’接头的3’末端中嵌入标签序列)，随后将带有已知接头的目的片段进行RT-PCR反应，通过PCR反应扩增带有标签接头的目的片段，最后切胶回收含有标签的目的片段文库。这样构建的小分子RNA标签文库在测序过程中，solexa需要先对标签序列进行测序，随后针对目的片段序列进行测序。针对该方案一，分别以模式植物样品(拟南芥)和模式动物样品(人)的RNA进行测试(参见实施例4和5)，使用不同的5’标签接头与目的片段进行连接反应，构建标签文库，实验结果显示由于不同的接头对目的片段的连接效率不一致，导致小RNA基因表达结果不一致，存在影响数据的稳定性与可重复性的风险。如图3(a)所示，使用拟南芥样品分别构建不同的小分子RNA标签文库(实施例4)。由于使用同样的拟南芥样品和使用不同的标签，理想的实验结果是标签的不同不会造成实验分析结果的差异。而实验结果显示，与不同的5’标签接头连接构建的小分子RNA标签文库分析的基因表达差异“小于等于2”的miRNA(microRNA，微小RNA)较少，而大部分的miRNA表达差异大于2，多数miRNA的基因表达差异较大，造成实验结果的可重复性差。如图3(b)所示，使用“人RNA”样品分别构建不同的小分子RNA标签文库(实施例5)。由于使用同样的“人RNA”样品和使用不同的标签标签，理想的实验结果是标签的不同不会造成实验分析结果的差异。而实验结果(图3)显示，与不同的5’标签接头连接构建的小分子RNA标签文库分析的基因表达差异“小于等于2”的miRNA较少，而大部分的miRNA表达差异大于2，多数miRNA的基因表达差异较大，造成实验结果的可重复性差。因此将标签嵌入5’接头的3’末端中，存在造成数据结果可重复性差的缺陷，故我们采用方案二来构建小分子RNA标签文库。
方案二、将特定长度的核苷酸序列(即标签)嵌入PCR引物中，这样可以通过使用不同标签PCR引物进行构建小分子RNA标签文库，标签可以嵌入PCR引物中的任意一条引物中。因此可以有两种方式将标签嵌入PCR引物中。如图4所示，由于将标签嵌入PCR引物中，在连接完5’接头和3’接头后，通过RT-PCR反应，可以使用不同的标签PCR引物构建不同的小分子RNA标签文库。我们使用了模式植物“水稻样品”与模式动物“人血液样品”分别构建小分子RNA标签文库(参见实施例6和7)，结果显示：针对同样的样品，构建不同的标签文库，数据结果稳定性与可重复性均比较好，如图5(a)与图5(b)所示，不同的小分子RNA标签文库之间的多数miRNA的基因表达差异较小。
目前solexa测序错误率在2％左右，为了保证数据的准确性，我们通常需要剔除在index上测序出现错误的序列，即选择与标签完全配对的序列。当标签为6个碱基长度的特定核苷酸序列时，保证标签序列之间的差异在3个或3个碱基以上，这种设计可以纠正6个碱基的标签序列上面的任意一个碱基错误，将出现一个碱基错误的产出数据也列为有效数据，保证标签的识别率为98％以上。
例如数据产出的时的标签(以标签2(index 2)和标签11(index 11)为例)统计信息如下所示，测序结果与预期标签完全配对的有96.76％，而由于测序错误导致标签与预期标签序列有1个碱基差异的占2.12％。而0错误匹配(mismatch)与1错误匹配得到的数据占总数据的98.88％，即该数据的标签识别率在98.88％。
ID     Index   0mismatch    1mismatch
2      ACGGCT  46.41％      0.72％
11     CGTCAA  50.35％      1.40％
other_reads(其他读数)       1.12％
CGGCCA                      0.11％
CGGTCA                      0.07％
综上所述，将标签嵌入5’接头的3’末端，在solexa测序反应过程，只需要通过一条测序引物(也称为Read 1 Seq primer)，便可将标签与目的片段的序列一同测出，如图6。如将标签嵌入PCR引物中，需要先用测序引物Read1 Seq primer将目的片段先测出来，然后通过标签测序引物(也称为Index Seq primer)将标签测序出来，测序反应需要两条测序引物，如图7。而方案一通过实验证实，不同的标签接头在连接反应中会发生偏向性连接，导致每个不同的标签接头与目的片段的连接效率不一样，最终影响到数据的稳定性与可重复性，所以方案一较方案二差，我们选择较优的方案二进行构建小分子RNA标签文库。
本发明基于目前illumina公司提供的Solexa Single End测序平台，设计一段长度为6bp的特定序列作为标签，考虑到PCR引物的扩增效率，优化并筛选出16条标签序列，这些标签之间的差异在3个碱基，当标签的6个碱基中的任意一个碱基出现测序错误或合成错误，都不影响到标签的最终识别。
分析避免出现引物发夹结构或与测序引物及其反向互补序列相同的现象及通过实验筛选出以下16条对应PCR引物。表1为我们优化筛选出来的16条标签(也称为IndexN)序列，表2是其对应的PCR引物(也称为IndexN_PCR_2.0)。标签对应的PCR引物实际上由3部分序列构成，分别为序列1(也称为solexa芯片互补序列)、序列2(也称为标签互补序列)、和序列3(也称为接头互补序列)：例如标签1(即index1 AAGTCG)所对应的Index1_PCR_2.0引物，是分别由以下3部分组成。
序列1：AATGATACGGCGACCACCGACAGC；
序列2：AAGTCG；
序列3：CGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC；
这些标签及其PCR引物可以应用于任何小分子RNA标签的文库构建。这种标签策略应用于小RNA样品的文库构建并用于solexa测序的方法，目前尚未有报道。
表1标签序列
  Index1   AAGTCG
  Index2   ACGGCT
  Index3   CATTAG
  Index4   CCTGAT
  Index5   GGACTA
  Index6   GTAATC
  Index7   TGCCGA
  Index8   TTCAGC
  Index9   AGGCAC
  Index10   ATGACC
  Index11   CGTCAA
  Index12   CTTACA
  Index13   GAATGT
  Index14   GCAGTT
  Index15   TACTGG
  Index16   TCCGTG
表2标签序列所对应的PCR引物
Figure BSA00000293338800071
表3基于方案一的小分子RNA 5’标签接头
  small RNA adapter Index1   GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCAAGUCG
  small RNA adapter Index2   GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCACGGCU
  small RNA adapter Index3   GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCCAUUAG
  small RNA adapter Index4   GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCCCUGAU
  small RNA adapter Index5   GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCGGACUA
  small RNA adapter Index6   GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCGUAAUC
  small RNA adapter Index7   GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCUGCCGA
  small RNA adapter Index8   GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCUUCAGC
  small RNA adapter Index9   GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCAGGCAC
  small RNA adapter Index10   GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCAUGACC
  small RNA adapter Index11   GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCCGUCAA
  small RNA adapter Index12   GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCCUUACA
  small RNA adapter Index13   GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCGAAUGU
  small RNA adapter Index14   GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCGCAGUU
  small RNA adapter Index15   GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCUACUGG
  small RNA adapter Index16   GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCUCCGUG
本发明一方面提供了一组标签，其为6个碱基长度的核苷酸序列，且标签序列之间的差异在3个或3个碱基以上，所述一组标签包括如下或由如下组成：表1所示16个标签或与之相差1个碱基的标签中的至少2个，或至少3个，或至少4个，或至少5个，至少6个，或至少7个，或至少8个，或至少9个，或10个，或至少11个，或至少12个，或至少13个，或至少14个，或至少15个，或全部16个，
所述一组标签优选地至少包括表1所示的16个标签中的Index1和Index2，或Index3和Index4，或Index5和Index6，或Index7和Index8，或Index9和Index10，或Index11和Index12，或Index13和Index14，或Index15和Index16，或者他们任何两个或多个的组合。
在本发明的一个具体实施方式中，相差1个碱基包括标签中1个碱基的取代、添加和删除。
在本发明的一个具体实施方式中，本发明所提供的标签用于小分子RNA文库构建并测序，其中所述标签包含在用于扩增目的序列的PCR引物中，从而构成各自相对应的标签PCR引物。
在本发明的一个具体实施方式中，其中所述标签嵌入用于扩增目的序列的PCR引物中，或者通过或不通过连接子与用于扩增目的序列的PCR引物的5’端或3’端相连，优选地是不通过连接子与用于扩增目的序列的PCR引物的5’端相连，从而构成各自相对应的标签PCR引物。
在本发明的一个具体实施方式中，其中所述标签通过连接子与用于扩增目的序列的PCR引物的5’端相连，从而构成各自相对应的标签PCR引物，其中所述连接子是1-10个碱基的序列，优选地1-5个碱基地序列，更优选1-3个碱基的序列。
本发明另一方面提供了使用所述的标签构建的小分子RNA文库。
本发明另一方提供了所述的标签所对应的一组标签PCR引物，其含有本发明所述的标签，所述一组标签PCR引物包括如下或由如下组成：表2所示16个标签PCR引物或与其中包含的标签序列相差1个碱基地标签PCR引物中的至少2个，或至少3个，或至少4个，或至少5个，至少6个，或至少7个，或至少8个，或至少9个，或10个，或至少11个，或至少12个，或至少13个，或至少14个，或至少15个，或全部16个，
所述一组标签PCR引物优选地至少包括表2所示的16个标签中的Index1_PCR_2.0和Index2_PCR_2.0，或Index3_PCR_2.0和Index4_PCR_2.0，或Index5_PCR_2.0和Index6_PCR_2.0，或Index7_PCR_2.0和Index8_PCR_2.0，或Index9_PCR_2.0和Index10_PCR_2.0，或Index11_PCR_2.0和Index12_PCR_2.0，或Index13_PCR_2.0和Index14_PCR_2.0，或Index15_PCR_2.0和Index16_PCR_2.0或者他们任何两个或多个的组合。
在本发明的一个具体实施方式中，本发明所提供的标签PCR引物用于小分子RNA文库构建并测序的用途。
在本发明的一个方面中，本发明提供了使用表2所示的标签PCR引物构建的小分子RNA文库。
本发明另一方面提供了一种用于小分子RNA文库的构建并测序方法，其包括：
1)提供n个总RNA样品并通过回收18～30nt的小RNA，n为整数，且1≤n≤16，优选地2≤n≤16，所述样品包括但不限于来自植物如水稻、拟南芥和动物如小鼠、人，所述的回收可以通过例如电泳，特别是变性PAGE电泳；
2)添加接头：在适合于连接接头的条件下，将分离的小分子RNA分别与5’接头、3’接头连接，连接顺序可以是先5’接头后3’接头，也可以是先3’接头后5’接头；
3)构建文库：随后将带有已知接头的目的片段进行逆转录反应，通过PCR反应扩增带有接头的目的片段，其中对于每一个样品，使用一个标签PCR引物，所述标签PCR引物是含有上文表1所述的标签的标签PCR引物，特别是上文表2所述的标签PCR引物，最后切胶回收带有接头的目的片段，所述片段优选的是约100bp；
4)混合：当n＞1时，将各样品的PCR扩增产物混合在一起；当n＝1时，直接进行步骤5)；
5)测序：将各样品的PCR扩增产物的混合物利用Solexa测序技术进行测序，其中需要小分子RNA测序引物和小分子RNA标签测序引物分别对目的片段和标签进行测序。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的方法中标签PCR引物包括如下或由如下组成：表2所示16个标签PCR引物或与其中包含的标签序列相差1个碱基地标签PCR引物中的至少2个，或至少3个，或至少4个，或至少5个，至少6个，或至少7个，或至少8个，或至少9个，或10个，或至少11个，或至少12个，或至少13个，或至少14个，或至少15个，或全部16个，并且
所述一组标签PCR引物优选地至少包括表2所示的16个标签中的Index1_PCR_2.0和Index2_PCR_2.0，或Index3_PCR_2.0和Index4_PCR_2.0，或Index5_PCR_2.0和Index6_PCR_2.0，或Index7_PCR_2.0和Index8_PCR_2.0，或Index9_PCR_2.0和Index10_PCR_2.0，或Index11_PCR_2.0和Index12_PCR_2.0，或Index13_PCR_2.0和Index14_PCR_2.0，或Index15_PCR_2.0和Index16_PCR_2.0或者他们任何两个或多个的组合。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的方法中小分子RNA测序引物和小分子RNA标签测序引物分别为Small RNA SequencingPrimer：5′CGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC，和Small RNA Index Sequencing Primer：5′ATGATACGGCGACCACCGACAGC。
本发明另一方提供了使用所述的方法构建的小分子RNA文库。
附图说明
图1：Illumina公司提供的小分子RNA建库流程示意图。分别是(a)方法一(Preparing Samples for analysis of small RNA)；和(b)方法二(Preparing Samples for Small RNA Sequencing Using theAlternative v1.5Protocol)。
图2：将标签嵌入5’接头中(方案一)的建库流程示意图。
图3：使用方案一构建小分子RNA文库，进行Solexa测序后拟南芥(Arabidopsis thaliana)miRNA(a)和人(Homo sapiens)miRNA(b)的表达差异。Foldchange代表差异的倍数，其中分别将拟南芥和人的miRNA与已知miRNA的进行比对，然后将通过比对认为与上已知miRNA分子相符的miRNA分子进行相关性分析，如果同一个样品进行构建文库，数据结果稳定(即数据没有大的偏差)，foldchange一般都是小于2(±1)，而foldchange一般都是大于4，表示数据偏差较大。图3(a)两个文库之间178个miRNA基因表达水平，125个基因的表达差异在4倍以上(70.2％的miRNA基因表达存在较大差异)。两个文库之间430个miRNA基因表达水平，184个基因的表达差异在4倍以上(42.8％的miRNA基因表达存在较大差异)。所以该方法构建的小RNA标签文库测序结果与小RNA非标签文库的数据差异较大。
图4：将标签嵌入PCR引物中(方案二)的建库流程示意图。
图5：使用方案二构建小分子RNA文库，进行Solexa测序后拟南芥miRNA(a)和人miRNA(b)的表达差异。Foldchange代表差异的倍数，分别将水稻和人的miRNA与已知miRNA的进行比对，然后将比对上数据库的miRNA分子进行相关性分析，如果同一个样品进行构建文库，数据结果稳定(即数据没有大的偏差)，foldchange一般都是小于2(±1).而foldchange一般都是大于4，表示数据偏差较大。图5(a)两个文库之间323个miRNA基因表达水平，7个基因的表达差异在4倍以上(2.2％的miRNA基因表达存在较大差异)。图5(b)两个文库之间375个miRNA基因表达水平，11个基因的表达差异在4倍以上(2.9％的miRNA基因表达存在较大差异)。所以该方法构建的小RNA标签文库测序结果与小RNA非标签文库的数据差异较小。
图6：将标签嵌入5’接头中的小分子RNA标签文库(方案一)的solexa测序示意图。其中Read1表示测序反应1所测出来的序列，Read 1 Seq Primer表示测序引物。
图7：将标签嵌入PCR引物中(方案二)的文库solexa测序示意图。其中Read1表示测序反应1所测出来的序列，Read 1 Seq Primer表示测序引物；Index Seq Primer表示标签测序引物。
图8：小鼠RNA样品的小分子RNA标签文库与对照文库的数据相关性分析。使用小鼠RNA分别用标签1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16进行构建小分子RNA标签文库，通过solexa测序，将小RNA标签文库与对照文库的数据进行相关性分析，横坐标显示的是不同小RNA标签文库的基因表达量以2为底取对数，纵坐标显示的是同一个标准小RNA文库的基因表达量以2为底取对数，然后计算两种基因表达量的相关系数。如果两者重复性越高，其pearson系数越接近1。结果均在0.99左右，说明数据相关性非常好，建库方法也非常稳定。从上至下，从左至右分别是小RNA标签文库1-16与对照文库的相关性分析的图。例如mouse-Index1是数据相关性分析图，用点表示相关性数据，分别以标签1(index1)所得数据表达量为横坐标，对照文库所得数据表达量为纵坐标，两者数据越相近，相关性数值越接近1(即点越接近坐标的对角线)。
图9：在实施例2和3中各自所建立2个小鼠对照小RNA文库和16个小鼠小分子RNA标签文库中，分析各类RNA在总数据量中所占的比例情况。其中使用小鼠RNA分别用标签1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16进行构建小分子RNA标签文库，分别分析小分子RNA标签文库中各种类型的RNA成分比例，例如scRNA、srpRNA、snRNA、rRNA、snoRNA、tRNA、miRNA等，16个小分子RNA标签文库的各种类型RNA成本比例基本一致，且与小鼠对照文库各种类型的NRA成分比例基本一致，说明该方法构建的文库产出的数据非常稳定，产出的数据差异也较小。从左至右，从上至下分别是实施例1和2中所建立的2个小鼠对照小RNA文库和16个小鼠小分子RNA标签文库(index1-16)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
在本发明的实施例中采用的核酸序列如下：
小分子RNA寡核苷酸序列
Small RNA RT Primer(也称为小分子RNA RT引物)
5′CAAGCAGAAGACGGCATACGA
Small RNA 5′RNA Adapter(也称为小分子RNA 5’RNA接头)
5′GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC
Small RNA 3′RNA Adapter-1(也称为小分子RNA 3’RNA接头-1)
5′P-UCGUAUGCCGUCUUCUGCUUGU
Small RNA 3′RNA Adapter-2(也称为小分子RNA 3’RNA接头-2)
5′rApp/ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG/3ddC/
Small RNA PCR Primer 1(也称为小分子RNA PCR引物1)
5′CAAGCAGAAGACGGCATACGA
Small RNA PCR Primer 2(也称为小分子RNA PCR引物2)
5′AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA
Small RNA Sequencing Primer(也称为小分子RNA测序引物)
5′CGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC
Small RNA Index Sequencing Primer(也称为小分子RNA标签测序引物)
5′ATGATACGGCGACCACCGACAGC
Small RNA PCR Index Primer 2(也称为小分子RNA PCR标签引物2)
Index1_PCR_Primer    (index1序列：AAGTCG)
AATGATACGGCGACCACCGACAGCAAGTCGCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC
Index2_PCR_Primer    (index2序列：ACGGCT)
AATGATACGGCGACCACCGACAGCACGGCTCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC
Index3_PCR_Primer    (index3序列：CATTAG)
AATGATACGGCGACCACCGACAGCCATTAGCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC
Index4_PCR_Primer    (index4序列：CCTGAT)
AATGATACGGCGACCACCGACAGCCCTGATCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC
Index5_PCR_Primer    (index5序列：GGACTA)
AATGATACGGCGACCACCGACAGCGGACTACGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC
Index6_PCR_Primer    (index6序列：GTAATC)
AATGATACGGCGACCACCGACAGCGTAATCCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC
Index7_PCR_Primer    (index7序列：TGCCGA)
AATGATACGGCGACCACCGACAGCTGCCGACGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC
Index8_PCR_Primer    (index8序列：TTCAGC)
AATGATACGGCGACCACCGACAGCTTCAGCCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC
Index9_PCR_Primer    (index9序列：AGGCAC)
AATGATACGGCGACCACCGACAGCAGGCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC
Index10_PCR_Primer    (index10序列：ATGACC)
AATGATACGGCGACCACCGACAGCATGACCCGACAGGTT
CAGAGTTCTACAGTCCGACGATC
Index11_PCR_Primer    (index11序列：CGTCAA)
AATGATACGGCGACCACCGACAGCCGTCAACGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC
Index12_PCR_Primer    (index12序列：CTTACA)
AATGATACGGCGACCACCGACAGCCTTACACGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC
Index13_PCR_Primer    (index13序列：GAATGT)
AATGATACGGCGACCACCGACAGCGAATGTCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC
Index14_PCR_Primer    (index14序列：GCAGTT)
AATGATACGGCGACCACCGACAGCGCAGTTCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC
Index15_PCR_Primer    (index15序列：TACTGG)
AATGATACGGCGACCACCGACAGCTACTGGCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC
Index16_PCR_Primer    (index16序列：TCCGTG)
AATGATACGGCGACCACCGACAGCTCCGTGCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC
Small RNA 5′RNA index adapter(也称为小分子RNA5’RNA标签接头)(基于方案一)：
small RNA Index1adapter
GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCAAGUCG
small RNA Index2adapter
GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCACGGCU
small RNA Index3adapter
GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCCAUUAG
small RNA Index4adapter
GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCCCUGAU
small RNA Index5adapter
GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCGGACUA
small RNA Index6adapter
GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCGUAAUC
small RNA Index7adapter
GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCUGCCGA
small RNA Index8adapter
GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCUUCAGC
small RNA Index9adapter
GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCAGGCAC
small RNA Index 10adapter
GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCAUGACC
small RNA Index11adapter
GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCCGUCAA
small RNA Index12adapter
GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCCUUACA
small RNA Index13adapter
GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCGAAUGU
small RNA Index14adapter
GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCGCAGUU
small RNA Index15adapter
GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCUACUGG
small RNA Index16adapter
GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCUCCGUG
主要实验仪器及试剂
Figure BSA00000293338800171
Figure BSA00000293338800191
配制试剂
DEPC-treated water(焦碳酸二乙酯处理水)：1000mL去离子水中加入1000μL DEPC(千分之一体积)，剧烈晃动5分钟，至底部油状液滴均匀分散不见为止。37℃放置过夜(至少2小时)或室温下过夜，121℃高压灭菌30分钟，主要用于部分RNase Free(无RNA酶)的缓冲液配制。
1×TBE(RNase Free)：1000mL DEPC-treated water中加入10.8gTris-base，5.5g硼酸，4mL 0.5M EDTA(pH8.0)，121℃高压灭菌20分钟。
3％H2O2(RNase free)：用DEPC-treated water稀释30％H2O2配置，现用现配。
0.3M NaCl：940μL DEPC-treated water(Ambion)加入60μL 5MNaCl。
80％ETOH、75％ETOH、70％ETOH：用DEPC-treated water(Ambion)和100％乙醇配制不同浓度ETOH。
1×NEBuffer 2：用DEPC-treated water(Ambion)或pure water稀释NEBuffer 2(10×)。
实施例1
方法一建库方法：
1)取10ug小鼠总RNA，与等体积的2×gelloading dye(含甲酰胺)混合，65℃变性5分钟，然后置于冰上。然后将样品加入15％变性PAGE胶的点样孔中。同时取1μL 10bp DNA ladder和2μL 14～30ssRNAladder marker分别与6×loading buffer混匀后加入点样孔中电泳。
2)电泳结束后，回收18～30nt的小分子RNA，向回收的碎胶中加入400μL的0.3M NaCl。置于混匀器上，室温温和洗脱4个小时。将管内的胶块和洗脱液全部转移至Spin-X管内，室温14000rpm离心2分钟，弃碎胶。加入3μL糖原，1000-1500μL 100％乙醇(加入乙醇的体积是洗脱液的2.5-3倍，如果洗脱液的量加大，乙醇的量也要加大)，混匀后于-80℃冻存1小时。14000rpm 4℃离心30分钟，弃上清，加入70％乙醇冲洗沉淀一次，14000rpm离心3分钟，吸弃上清。加入DEPC-treatedwater(Ambion)溶解RNA。
3)5′接头连接，以下为反应体系。
RNA                                    6μL
Small RNA 5′RNA Adapter(10μM)        1.0μL
T4RNA ligation buffer(10×)    1μL
RNase OUT(40U/μL)             1μL
T4RNA ligase(10U/μL)          1μL
总体积为10μL，混匀离心，于20℃连接6个小时。
4)向连接产物中加入等体积的2×gel loading dye，65℃变性5分钟，然后将样品迅速放置冰上，另取1μL 10bp ladder与loading dye混合。将样品于15％变性PAGE胶中电泳。
5)电泳后，回收连接上5’接头的小分子RNA目的片段。向回收的碎胶中加入300μL-500μL的0.3M NaCl。置于混匀器上，室温温和洗脱4个小时。将管内的胶块和洗脱液全部转移至Spin-X管内，室温14000rpm离心2分钟，弃碎胶。加入3μL糖原，1200μL 100％乙醇，混匀后于-80℃冻存1小时。14000rpm 4℃离心30分钟，弃上清，加入70％乙醇冲洗沉淀一次，14000rpm离心3分钟，吸弃上清。加入DEPC-treatedwater溶解RNA。
6)3’接头连接，按以下10μL连接体系进行反应。
5′连接产物                                      6.5μL
Small RNA 3′RNA adapter-1(10μM)                0.5-1.0μL
10×Ligation Buffer                              1μL
T4RNA ligase(10U/μL)                            1μL
RNase OUT(40U/μL)                               1μL
总体积为10μL，混匀后离心，20℃连接6个小时然后4℃保存(或者16℃过夜连接)。
7)向连接产物中加入等体积)2×gel loading dye，65℃变性5分钟，然后将样品迅速放置冰上，另取1μL 10bp ladder与loading dye混合。将样品于10％变性PAGE胶中电泳。
8)电泳后，回收连接完3’接头的小分子RNA连接产物。向含目的片段的碎胶中加入300μL-500μL的0.3M NaCl。置于混匀器上，室温温和洗脱4个小时。将管内的胶块和洗脱液全部转移至Spin-X管内，室温14000rpm离心2分钟，弃碎胶。加入3μL糖原，2.5体积的100％乙醇，混匀后于-80℃冻存1小时。14000rpm 4℃离心30分钟，弃上清，加入70％乙醇冲洗沉淀一次，14000rpm离心3分钟，吸弃上清。加入DEPC-treated water(Ambion)溶解RNA。
9)RT-PCR反应向10μL RNA加入1μL RT-Primer(100μM)，于65℃加热10min，离心冷至室温，按顺序加入以下试剂。
5×First Strand Buffer   4.0μL；
10mM dNTP                1μL；
100mM DTT                2μL；
RNase OUT(40U/μL)       1μL
混匀后离心于42℃放置3分钟。再加入1μL Superscript II(200U/μL)，总体积为20μL混匀后瞬时离心，于42℃反应1个小时。70℃变性15分钟，瞬时离心，然后冰上急冷。
然后进行PCR扩增反应：
PCR反应体系(50μL)：
RT-reaction mix                    10μL
Small RNA PCR Primer1(10μM)       1μL
Small RNA PCR Index Primer2(10μM) 1μL
2×Phusion HF master mix           25μL
H2O                               13μL
反应条件：
98℃/30sec；
98℃/10sec，65℃/30sec，72℃/15sec；15个循环；
72℃/10min；
4℃放置(hold)。
10)PCR产物中加入等体积6×loading dye；取1μL 25bp ladder与6×loading dye混合。将样品于6％变性PAGE胶中电泳。
11)切下约100bp的PCR产物条带。在回收碎胶中加入100～200uL1×NEB 2，室温下混匀器或thermomix上2小时，洗脱DNA。将管内的胶块和洗脱液全部转移至Spin-X管内，室温14000rpm离心2分钟，弃碎胶。向洗脱液中加入1ul完全融化的Pellet Paint，10～20ul 3MNaAC(NaAc的体积＝1/10倍的洗脱液体积)，325～650ul 100％-20℃乙醇。混匀后4℃14000rpm离心25～30分钟。离心后弃上清，用500uL75％乙醇洗涤沉淀，晾干，用20ul EB solution溶解沉淀。使用Agilent2100和QPCR检测文库浓度，最后进行solexa测序。
实施例2
利用方法二的建库方法：
1)取5ug小鼠肝脏总RNA，与等体积的2×gel loading dye混合，65℃变性5分钟，然后置于冰上。然后将样品加入15％变性PAGE胶的点样孔中。同时取1μL 10bp DNA ladder和2μL 14～30ssRNA laddermarker与6×loading buffer混匀后加入点样孔中电泳。
2)电泳结束后，回收18～30nt的小分子RNA。向含有回收碎胶中加入400μL的0.3M NaCl。置于混匀器上，室温温和洗脱4个小时。将管内的胶块和洗脱液全部转移至Spin-X管内，室温14000rpm离心2分钟，弃碎胶。加入3μL糖原，1000-1500μL 100％乙醇(加入乙醇的体积是洗脱液的2.5-3倍，混匀后于-80℃冻存1小时。14000rpm 4℃离心30分钟，弃上清，加入70％乙醇冲洗沉淀一次，14000rpm离心3分钟，吸弃上清。加入DEPC-treated water(Ambion)溶解RNA。
3)3’接头连接。
Small RNA(18～30nt)                    5μL
Small RNA 3′RNA Adapter-1(10μM)      1.0μL
70℃变性5分钟，然后将样品迅速放置冰上。
然后加入以下试剂
10×T4RNL2truncated Reaction Buffer    1.0μL
100mM MgCl2                            0.8μL
T4RNA Ligase 2，truncated              1.5μL
RNase OUT                              0.5μL
22℃放置1小时。
4)将Small RNA 5′RNA Adapter 70℃变性5分钟，然后将样品迅速放置冰上。
然后往3’接头连接产物加入以下试剂
10mM ATP                    1.0μL
Small RNA 5′RNA Adapter    0.5μL
T4RNA ligase                1μL
于20℃连接2个小时。
5)RT-PCR反应。
向5μL RNA纯化的连接产物中加入1μL Small RNA RT-primer(100μM)，于65℃加热10min，离心迅速放置冰上，按顺序加入以下试剂。
5×First strand buffer     2μL；
12.5mM dNTP                0.5μL；
100mM DTT                  1μL；
RNase OUT(40U/μL)         0.5μL
混匀后离心于48℃放置3分钟。再加入1μL Superscript II(200U/μL)，总体积为20μL混匀后瞬时离心，于44℃反应1个小时。70℃变性15分钟，瞬时离心，然后冰上急冷。
PCR反应体系(50μL)：Small RNA PCR Index Primer 2(
RT-reaction mix                     10μL
Small RNA PCR Primer 1(10μM)       1μL
Small RNA PCR Primer 2(10μM)       1μL
2×Phusion HF master mix            25μL
H2O                                 13μL
反应条件：
98℃/30sec；
98℃/10sec，60℃/30sec，72℃/15sec；15个循环；
72℃/10min；
4℃放置。
6)PCR产物中加入等体积6×loading dye；取1μL 25bp ladder与6×loading dye混合。将样品于6％变性PAGE胶中电泳。
7)切下约100bp的条带。回收的碎胶中加入100ul 1×Gel ElutionBuffer，室温下混匀器或thermomix上2小时，洗脱DNA。将管内的胶块和洗脱液全部转移至Spin-X管内，室温14000rpm离心2分钟，弃碎胶。向洗脱液中加入1ul glycogen，1/10体积的3M NaAC，325ul100％-20℃乙醇。混匀后4℃14000rpm离心30分钟。离心后弃上清，再用500ul 70％乙醇洗涤沉淀，晾干，用10ul EB solution溶解沉淀。
8)使用Agilent 2100和QPCR检测文库浓度，最后进行solexa测序。
实施例3
利用方法二的建库方法：
1)取5ug小鼠肝脏总RNA，与等体积的2×gel loading dye混合，65℃变性5分钟，然后置于冰上。然后将样品加入15％变性PAGE胶的点样孔中。同时取1μL 10bp DNA ladder和2μL 14～30ssRNAladder marker与6×loading buffer混匀后加入点样孔中电泳。
2)电泳结束后，回收18～30nt的小分子RNA。向含有回收碎胶中加入400μL的0.3M NaCl。置于混匀器上，室温温和洗脱4个小时。将管内的胶块和洗脱液全部转移至Spin-X管内，室温14000rpm离心2分钟，弃碎胶。加入3μL糖原，1000-1500μL 100％乙醇(加入乙醇的体积是洗脱液的2.5-3倍，混匀后于-80℃冻存1小时。14000rpm 4℃离心30分钟，弃上清，加入70％乙醇冲洗沉淀一次，14000rpm离心3分钟，吸弃上清。加入DEPC-treated water(Ambion)溶解RNA。
3)3’接头连接。
Small RNA(18～30nt)                5μL
Small RNA 3′RNA Adapter-2(10μM)  1.0μL
70℃变性5分钟，然后将样品迅速放置冰上。
然后加入以下试剂
10×T4RNL2truncated Reaction Buffer    1.0μL
100mM MgCl2                  0.8μL
T4RNA Ligase 2，truncated    1.5μL
RNase OUT                    0.5μL
22℃放置1小时。
4)将Small RNA 5′RNA Adapter 70℃变性5分钟，然后将样品迅速放置冰上。
然后往3’接头连接产物加入以下试剂
10mM ATP                    1.0μL
Small RNA 5′RNA Adapter    0.5μL
T4RNA ligase                1μL
于20℃连接2个小时。
5)RT-PCR反应。
向5μL RNA纯化的连接产物中加入1μL Small RNA RT-primer(100μM)，于65℃加热10min，离心迅速放置冰上，按顺序加入以下试剂。
5×First strand buffer     2μL；
12.5mM dNTP                0.5μL；
100mM DTT                  1μL；
RNase OUT(40U/μL)         0.5μL
混匀后离心于48℃放置3分钟。再加入1μL Superscript II(200U/μL)，总体积为20μL混匀后瞬时离心，于44℃反应1个小时。70℃变性15分钟，瞬时离心，然后冰上急冷。
PCR反应体系(50μL)：
RT-reaction mix                    10μL
Small RNA PCR Primer 1(10μM)      1μL
Small RNA PCR Index Primer 2(10μM)1μL
2×Phusion HF master mix           25μL
H2O                                13μL
反应条件：
98℃/30sec；
98℃/10sec，60℃/30sec，72℃/15sec；15个循环；
72℃/10min；
4℃放置。
6)PCR产物中加入等体积6×loading dye；取1μL 25bp ladder与6×loading dye混合。将样品于6％变性PAGE胶中电泳。
7)切下约100bp的条带。回收的碎胶中加入100ul 1×Gel ElutionBuffer，室温下混匀器或thermomix上2小时，洗脱DNA。将管内的胶块和洗脱液全部转移至Spin-X管内，室温14000rpm离心2分钟，弃碎胶。向洗脱液中加入1ul glycogen，1/10体积的3M NaAC，325ul100％-20℃乙醇。混匀后4℃14000rpm离心30分钟。离心后弃上清，再用500ul 70％乙醇洗涤沉淀，晾干，用10ul EB solution溶解沉淀。
8)使用Agilent 2100和QPCR检测文库浓度，最后进行solexa测序。
实施例2和实施例3分别构建小鼠小分子RNA文库(对照文库)和小鼠小分子RNA标签文库，使用solexa测序方法进行测序。数据分析结果如下，基于方法二构建小分子RNA标签文库，使用模式生物“小鼠RNA”样品，分别构建非index文库(非index构建的文库即按illumina公司提供的protocol构建的常规文库)和index1、index2、index3、index4、index5、index6、index7、index8、index9、index10、index11、index12、index13、index14、index15、index16。“小鼠RNA”样品构建的非标签文库做为对照(control)文库与16个小分子RNA标签文库产出的数据分别进行相关性分析。结果显示以上16个标签PCR引物构建的小分子RNA标签文库的数据结果与非标签文库数据结果的相关性为0.94～0.99(如图8)，如图9所示，16个小分子RNA标签文库中的各种小分子RNA的成分比例均没有发生的变化，即没有产生数据偏向性，且数据稳定性与可重复性均较理想。综上所述，16条标签PCR引物构建的小分子RNA标签文库质量稳定，可以应用于各种构建小分子RNA标签文库之中。
实施例4
根据方案一，使用拟南芥叶片总RNA构建标签文库，具体操作方法如下。
1)取5ug拟南芥叶片总RNA，与等体积的2×gel loading dye混合，65℃变性5分钟，然后置于冰上。然后将样品加入15％变性PAGE胶的点样孔中。同时取1μL 10bp DNA ladder和2μL 14～30ssRNAladder marker与6×loading buffer混匀后加入点样孔中电泳。
2)电泳结束后，回收18～30nt的小分子RNA。向含有回收碎胶中加入400μL的0.3M NaCl。置于混匀器上，室温温和洗脱4个小时。将管内的胶块和洗脱液全部转移至Spin-X管内，室温14000rpm离心2分钟，弃碎胶。加入3μL糖原，1000-1500μL 100％乙醇(加入乙醇的体积是洗脱液的2.5-3倍，混匀后于-80℃冻存1小时。14000rpm 4℃离心30分钟，弃上清，加入70％乙醇冲洗沉淀一次，14000rpm离心3分钟，吸弃上清。加入DEPC-treated water(Ambion)溶解RNA。
3)3’接头连接。
Small RNA(18～30nt)                    5μL
Small RNA 3′RNA Adapter-2(10μM)      1.0μL
70℃变性5分钟，然后将样品迅速放置冰上。
然后加入以下试剂
10×T4RNL2truncated Reaction Buffer    1.0μL
100mM MgCl2                            0.8μL
T4RNA Ligase 2，truncated              1.5μL
RNase OUT                              0.5μL
22℃放置1小时。
4)5’标签接头连接。
将Small RNA 5′RNA index3Adapter 70℃变性5分钟，然后将样品迅速放置冰上。
然后往3’接头连接产物加入以下试剂
10mM ATP                        1.0μL
Small RNA 5′RNA index3Adapter  0.5μL
T4RNA ligase                    1μL
于20℃连接2个小时。
5)RT-PCR反应。
向5μL RNA纯化的连接产物中加入1μL Small RNA RT-primer(100μM)，于65℃加热10min，离心迅速放置冰上，按顺序加入以下试剂。
5×First strand buffer    2μL；
12.5mM dNTP               0.5μL；
100mM DTT                 1μL；
RNase OUT(40U/μL)        0.5μL
混匀后离心于48℃放置3分钟。再加入1μL Superscript II(200U/μL)，总体积为20μL混匀后瞬时离心，于44℃反应1个小时。70℃变性15分钟，瞬时离心，然后冰上急冷。
PCR反应体系(50μL)：
RT-reaction mix                10μL
Small RNA PCR Primer 1(10μM)  1μL
Small RNA PCR Primer 2(10μM)  1μL
2×Phusion HF master mix       25μL
H2O                            13μL
反应条件：
98℃/30sec；
98℃/10sec，60℃/30sec，72℃/15sec；15个循环；
72℃/10min；
4℃放置。
6)PCR产物中加入等体积6×loading dye；取1μL 25bp ladder与6×loading dye混合。将样品于6％变性PAGE胶中电泳。
7)切下约100bp的条带。回收的碎胶中加入100ul1×Gel ElutionBuffer，室温下混匀器或thermomix上2小时，洗脱DNA。将管内的胶块和洗脱液全部转移至Spin-X管内，室温14000rpm离心2分钟，弃碎胶。向洗脱液中加入1ul glycogen，1/10体积的3M NaAC，325ul100％-20℃乙醇。混匀后4℃14000rpm离心30分钟。离心后弃上清，再用500ul 70％乙醇洗涤沉淀，晾干，用10ul EB solution溶解沉淀。
8)使用Agilent 2100和QPCR检测文库浓度，最后进行solexa测序。
如图3(a)所示，将使用Small RNA 5′RNA index3Adapter构建的小RNA标签文库测序结果和未使用标签构建的拟南芥小RNA文库测序结果进行比较。构建的拟南芥小RNA index3文库通过Solexa测序出5954859条高质量的小RNA序列，未使用标签构建的拟南芥小RNA文库通过solexa测序出6119477条高质量的小RNA序列。我们挑选其中miRNA基因，分析其表达量的差异程度。表达量差异大于4(foldchange＞4)，表达差异在2～4之间的差异(foldchange＞2&＜4)，差异在小于2(foldchange＜2)。两个文库之间178个miRNA基因表达水平，125个基因的表达差异在4倍以上(70.2％的miRNA基因表达存在较大差异)。所以该方法构建的小RNA标签文库测序结果与小RNA非标签文库的数据差异较大。
实施例5
根据方案一，使用人血RNA构建文库，具体操作方法如下。
1)取5ug人血总RNA，与等体积的2×gel loading dye混合，65℃变性5分钟，然后置于冰上。然后将样品加入15％变性PAGE胶的点样孔中。同时取1μL 10bp DNA ladder和2μL 14～30ssRNA ladder marker与6×loading buffer混匀后加入点样孔中电泳。
2)电泳结束后，回收18～30nt的小分子RNA。向含有回收碎胶中加入400μL的0.3M NaCl。置于混匀器上，室温温和洗脱4个小时。将管内的胶块和洗脱液全部转移至Spin-X管内，室温14000rpm离心2分钟，弃碎胶。加入3μL糖原，1000-1500μL 100％乙醇(加入乙醇的体积是洗脱液的2.5-3倍，混匀后于-80℃冻存1小时。14000rpm 4℃离心30分钟，弃上清，加入70％乙醇冲洗沉淀一次，14000rpm离心3分钟，吸弃上清。加入DEPC-treated water(Ambion)溶解RNA。
3)3’接头连接。
Small RNA(18～30nt)                  5μL
Small RNA 3′RNA adapter-2(10μM)    1.0μL
70℃变性5分钟，然后将样品迅速放置冰上。
然后加入以下试剂
10×T4RNL2truncated Reaction Buffer    1.0μL
100mM MgCl2                            0.8μL
T4RNA Ligase 2，truncated              1.5μL
RNase OUT                              0.5μL
22℃放置1小时。
4)将Small RNA 5′RNA index8adapter 70℃变性5分钟，然后将样品迅速放置冰上。
然后往3’接头连接产物加入以下试剂
10mM ATP                          1.0μL
Small RNA 5′RNA index8adapter    0.5μL
T4RNA ligase                      1μL
于20℃连接2个小时。
5)RT-PCR反应。
向5μL RNA纯化的连接产物中加入1μL Small RNA RT-primer(100μM)，于65℃加热10min，离心迅速放置冰上，按顺序加入以下试剂。
5×First strand buffer        2μL；
12.5mM dNTP                   0.5μL；
100mM DTT                     1μL；
RNase OUT(40U/μL)            0.5μL
混匀后离心于48℃放置3分钟。再加入1μL Superscript II(200U/μL)，总体积为20μL混匀后瞬时离心，于44℃反应1个小时。70℃变性15分钟，瞬时离心，然后冰上急冷。
PCR反应体系(50μL)：
RT-reaction mix                   10μL
Small RNA PCR Primer 1(10μM)     1μL
Small RNA PCR Primer 2(10μM)     1μL
2×Phusion HF master mix          25μL
H2O                               13μL
反应条件：
98℃/30sec；
98℃/10sec，60℃/30sec，72℃/15sec；15个循环；
72℃/10min；
4℃放置。
6)PCR产物中加入等体积6×loading dye；取1μL 25bp ladder与6×loading dye混合。将样品于6％变性PAGE胶中电泳。
7)切下约100bp的条带。回收的碎胶中加入100ul 1×Gel ElutionBuffer，室温下混匀器或thermomix上2小时，洗脱DNA。将管内的胶块和洗脱液全部转移至Spin-X管内，室温14000rpm离心2分钟，弃碎胶。向洗脱液中加入1ul glycogen，1/10体积的3M NaAC，325ul 100％-20℃乙醇。混匀后4℃14000rpm离心30分钟。离心后弃上清，再用500ul70％乙醇洗涤沉淀，晾干，用10ul EB solution溶解沉淀。
8)使用Agilent 2100和QPCR检测文库浓度，最后进行solexa测序。
如图3(b)所示，将使用Small RNA 5′RNA index8adapter(标签8)构建的小RNA标签文库测序结果和未使用标签构建的人小RNA文库测序结果进行比较。构建的人小RNA index8文库通过Solexa测序出5925097条高质量的小RNA序列，未使用标签构建的人小RNA文库通过solexa测序出6169468条高质量的小RNA序列。我们挑选其中miRNA基因，分析其表达量的差异程度。表达量差异大于4的(foldchange＞4)，表达差异在2～4之间的差异(foldchange＞2&＜4)，差异在小于2(foldchange＜2)。两个文库之间430个miRNA基因表达水平，184个基因的表达差异在4倍以上(42.8％的miRNA基因表达存在较大差异)。所以该方法构建的小RNA标签文库测序结果与小RNA非标签文库的数据差异较大。
实施例6
根据方案二，使用水稻RNA构建文库，操作方法如下。
1)取5ug水稻总RNA，与等体积的2×gel loading dye混合，65℃变性5分钟，然后置于冰上。然后将样品加入15％变性PAGE胶的点样孔中。同时取1μL 10bp DNA ladder和2μL 14～30ssRNA laddermarker与6×loading buffer混匀后加入点样孔中电泳。
2)电泳结束后，回收18～30nt的小分子RNA。向含有回收碎胶中加入400μL的0.3M NaCl。置于混匀器上，室温温和洗脱4个小时。将管内的胶块和洗脱液全部转移至Spin-X管内，室温14000rpm离心2分钟，弃碎胶。加入3μL糖原，1000μL 100％乙醇(加入乙醇的体积是洗脱液的2.5-3倍，混匀后于-80℃冻存1小时。14000rpm 4℃离心30分钟，弃上清，加入70％乙醇冲洗沉淀一次，14000rpm离心3分钟，吸弃上清。加入DEPC-treated water(Ambion)溶解RNA。
3)3’接头连接。
Small RNA(18～30nt)                 5μL
Small RNA 3′RNA adapter-2(10μM)   1.0μL
70℃变性5分钟，然后将样品迅速放置冰上。
然后加入以下试剂
10×T4RNL2truncated Reaction Buffer    1.0μL
100mM MgCl2                            0.8μL
T4RNA Ligase 2，truncated              1.5μL
RNase OUT                              0.5μL
22℃放置1小时。
4)将Small RNA 5′RNA Adapter 70℃变性5分钟，然后将样品迅速放置冰上。
然后往3’接头连接产物加入以下试剂
10mM ATP                    1.0μL
Small RNA 5′RNA adapter    0.5μL
T4RNA ligase                1μL
于20℃连接2个小时。
5)RT-PCR反应。
向5μL RNA纯化的连接产物中加入1μL Small RNA RT-primer(100μM)，于65℃加热10min，离心迅速放置冰上，按顺序加入以下试剂。
5×First strand buffer    2μL；
12.5mM dNTP               0.5μL；
100mM DTT                 1μL；
RNase OUT(40U/μL)        0.5μL
混匀后离心于48℃放置3分钟。再加入1μL Superscript II(200U/μL)，总体积为20μL混匀后瞬时离心，于44℃反应1个小时。70℃变性15分钟，瞬时离心，然后冰上急冷。
PCR反应体系(50μL)：
RT-reaction mix                10μL
Small RNA PCR Primer 1(10μM)  1μL
Index1_PCR_Primer(10μM)       1μL
2×Phusion HF master mix       25μL
H2O                            13μL
反应条件：
98℃/30sec；
98℃/10sec，60℃/30sec，72℃/15sec；15个循环；
72℃/10min；
4℃放置hold。
6)PCR产物中加入等体积6×loading dye；取1μL 25bp ladder与6×loading dye混合。将样品于6％变性PAGE胶中电泳。
7)切下约100bp的条带。回收的碎胶中加入100ul 1×Gel ElutionBuffer，室温下混匀器或thermomix上2小时，洗脱DNA。将管内的胶块和洗脱液全部转移至Spin-X管内，室温14000rpm离心2分钟，弃碎胶。向洗脱液中加入1ul glycogen，1/10体积的3M NaAC，325ul100％-20℃乙醇。混匀后4℃14000rpm离心30分钟。离心后弃上清，再用500ul 70％乙醇洗涤沉淀，晾干，用10ul EB solution溶解沉淀。
8)使用Agilent 2100和QPCR检测文库浓度，从水稻样品总RNA为模板构建小分子RNA文库，进行小分子RNA的测序。
如图5(a)所示，将使用Index1_PCR_Primer(标签1)构建的小RNA标签文库测序结果和未使用标签构建的水稻小RNA文库测序结果进行比较。构建的水稻小RNA index1文库通过Solexa测序出6931837条高质量的小RNA序列，未使用标签构建的水稻小RNA文库通过solexa测序出8050236条高质量的小RNA序列。我们挑选其中miRNA基因，分析其表达量的差异程度。表达量差异大于4的为红色标记(foldchange＞4)，表达差异在2～4之间的差异为绿色标记(foldchange＞2&＜4)，差异在小于2的为蓝色标记。两个文库之间323个miRNA基因表达水平，7个基因的表达差异在4倍以上(2.2％的miRNA基因表达存在较大差异)。所以该方法构建的小RNA标签文库测序结果与小RNA非标签文库的数据差异较小。
实施例7
根据方案二，使用人血RNA构建文库，具体操作方法如下。
1)取5ug人血总RNA，与等体积的2×gel loading dye混合，65℃变性5分钟，然后置于冰上。然后将样品加入15％变性PAGE胶的点样孔中。同时取1μL 10bp DNA ladder和2μL 14～30ssRNA laddermarker与6×loading buffer混匀后加入点样孔中电泳。
2)电泳结束后，回收18～30nt的小分子RNA。向含有回收碎胶中加入400μL的0.3M NaCl。置于混匀器上，室温温和洗脱4个小时。将管内的胶块和洗脱液全部转移至Spin-X管内，室温14000rpm离心2分钟，弃碎胶。加入3μL糖原，1000μL 100％乙醇(加入乙醇的体积是洗脱液的2.5-3倍，混匀后于-80℃冻存1小时。14000rpm 4℃离心30分钟，弃上清，加入70％乙醇冲洗沉淀一次，14000rpm离心3分钟，吸弃上清。加入DEPC-treated water(Ambion)溶解RNA。
3)3’接头连接。
Small RNA(18～30nt)                    5μL
Small RNA 3′RNA adapter-2(10μM)      1.0μL
70℃变性5分钟，然后将样品迅速放置冰上。
然后加入以下试剂
10×T4RNL2truncated Reaction Buffer    1.0μL
100mM MgCl2                            0.8μL
T4RNA Ligase 2，truncated              1.5μL
RNase OUT                              0.5μL
22℃放置1小时。
4)将Small RNA 5′RNA Adapter 70℃变性5分钟，然后将样品迅速放置冰上。
然后往3’接头连接产物加入以下试剂
10mM ATP                        1.0μL
Small RNA 5′RNA adapter        0.5μL
T4RNA ligase                    1μL
于20℃连接2个小时。
5)RT-PCR反应。
向5μL RNA纯化的连接产物中加入1μL Small RNA RT-primer(100μM)，于65℃加热10min，离心迅速放置冰上，按顺序加入以下试剂。
5×First strand buffer    2μL；
12.5mM dNTP               0.5μL；
100mM DTT                 1μL；
RNase OUT(40U/μL)        0.5μL
混匀后离心于48℃放置3分钟。再加入1μL Superscript II(200U/μL)，总体积为20μL混匀后瞬时离心，于44℃反应1个小时。70℃变性15分钟，瞬时离心，然后冰上急冷。
PCR反应体系(50μL)：
RT-reaction mix                10μL
Small RNA PCR Primer 1(10μM)  1μL
Index5_PCR_Primer(10μM)       1μL
2×Phusion HF master mix       25μL
H2O                            13μL
反应条件：
98℃/30sec；
98℃/10sec，60℃/30sec，72℃/15sec；15个循环；
72℃/10min；
4℃放置。
6)PCR产物中加入等体积6×loading dye；取1μL 25bp ladder与6×loading dye混合。将样品于6％变性PAGE胶中电泳。
7)切下约100bp的条带。回收的碎胶中加入100ul1×Gel ElutionBuffer，室温下混匀器或thermomix上2小时，洗脱DNA。将管内的胶块和洗脱液全部转移至Spin-X管内，室温14000rpm离心2分钟，弃碎胶。向洗脱液中加入1ul glycogen，1/10体积的3M NaAC，325ul100％-20℃乙醇。混匀后4℃14000rpm离心30分钟。离心后弃上清，再用500ul 70％乙醇洗涤沉淀，晾干，用10ul EB solution溶解沉淀。
8)使用Agilent 2100和QPCR检测文库浓度，从小鼠样品总RNA为模板构建小分子RNA文库，进行小分子RNA的测序。
如图5(b)所示，将使用Index5_PCR_Primer(标签5)构建的小RNA标签文库测序结果和未使用标签构建的人小RNA文库测序结果进行比较。构建的人小RNA index5文库通过Solexa测序出6295081条高质量的小RNA序列，未使用标签构建的人小RNA文库通过solexa测序出7999586条高质量的小RNA序列。我们挑选其中miRNA基因，分析其表达量的差异程度。表达量差异大于4的为红色标记(foldchange＞4)，表达差异在2～4之间的差异为绿色标记(foldchange＞2&＜4)，差异在小于2的为蓝色标记。两个文库之间375个miRNA基因表达水平，11个基因的表达差异在4倍以上(2.9％的miRNA基因表达存在较大差异)。所以该方法构建的小RNA标签文库测序结果与小RNA非标签文库的数据差异较小。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
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Figure ISA00000293339000011
Figure ISA00000293339000021
Figure ISA00000293339000041
Figure ISA00000293339000051
Figure ISA00000293339000061
Figure ISA00000293339000071
Figure ISA00000293339000081

Claims (29)

1.一组标签，所述一组标签至少包括表1所示的16个标签中的Index1、Index2、Index3和Index4。
2.权利要求1所述的一组标签，其还包括表1所示的16个标签中的Index5和Index6。
3.权利要求1所述的一组标签，其还包括表1所示的16个标签中的Index7和Index8。
4.权利要求1所述的一组标签，其还包括表1所示的16个标签中的Index9和Index10。
5.权利要求1所述的一组标签，其还包括表1所示的16个标签中的Index11和Index12。
6.权利要求1所述的一组标签，其还包括表1所示的16个标签中的Index13和Index14。
7.权利要求1所述的一组标签，其还包括表1所示的16个标签中的Index15和Index16。
8.权利要求1-7中任一项所述的一组标签用于小分子RNA文库构建并测序的用途，其中所述标签包含在用于扩增目的序列的PCR引物中，从而构成各自相对应的标签PCR引物。
9.权利要求8所述的用途，其中所述标签嵌入用于扩增目的序列的PCR引物中，或者通过或不通过连接子与用于扩增目的序列的PCR引物的5’端或3’端相连，从而构成各自相对应的标签PCR引物。
10.权利要求9的用途，其中所述标签是不通过连接子与用于扩增目的序列的PCR引物的5’端相连。
11.使用权利要求1-7中任一项所述的一组标签构建的小分子RNA文库。
12.一组标签PCR引物，其包含权利要求1-7中任一项所述的一组标签，
所述一组标签PCR引物至少包括表2所示的16个标签中的Index1_PCR_2.0、Index2_PCR_2.0、Index3_PCR_2.0和Index4_PCR_2.0。
13.权利要求12所述的一组标签PCR引物，其还包括表2所示的16个标签中的Index5_PCR_2.0和Index6_PCR_2.0。
14.权利要求12所述的一组标签PCR引物，其还包括表2所示的16个标签中的Index7_PCR_2.0和Index8_PCR_2.0。
15.权利要求12所述的一组标签PCR引物，其还包括表2所示的16个标签中的Index9_PCR_2.0和Index10_PCR_2.0。
16.权利要求12所述的一组标签PCR引物，其还包括表2所示的16个标签中的Index11_PCR_2.0和Index12_PCR_2.0。
17.权利要求12所述的一组标签PCR引物，其还包括表2所示的16个标签中的Index13_PCR_2.0和Index14_PCR_2.0。
18.权利要求12所述的一组标签PCR引物，其还包括表2所示的16个标签中的Index15_PCR_2.0和Index16_PCR_2.0。
19.使用权利要求12-18中任一项所述的一组标签PCR引物构建的小分子RNA文库。
20.权利要求12-18中任一项所述的一组标签PCR引物用于小分子RNA文库构建并测序的用途。
21.一种用于小分子RNA文库的构建并测序方法，其包括：
1)提供n个总RNA样品并回收18～30nt的小RNA，n为整数，且1≤n≤16，所述样品包括但不限于来自植物和动物，所述的回收通过电泳；
2)添加接头：在适合于连接接头的条件下，将分离的小分子RNA分别与5’接头、3’接头连接，连接顺序是先5’接头后3’接头，或者是先3’接头后5’接头；
3)构建文库：随后将带有接头的目的片段进行逆转录反应，通过PCR反应扩增带有接头的目的片段，其中对于每一个样品，使用一个标签PCR引物，所述标签PCR引物是如权利要求12-18中任一项所述中所述的标签PCR引物，最后切胶回收带有接头的目的片段；
4)混合：当n＞1时，将各样品的PCR扩增产物混合在一起；当n＝1时，直接进行步骤5)；
5)测序：将各样品的PCR扩增产物的混合物利用测序技术进行测序，其中需要小分子RNA测序引物和小分子RNA标签测序引物分别对目的片段和标签进行测序。
22.权利要求21所述的方法，其中步骤1)中，2≤n≤16。
23.权利要求21所述的方法，其中步骤1)中，植物是水稻或拟南芥。
24.权利要求21所述的方法，其中步骤1)中，动物是小鼠或人。
25.权利要求21所述的方法，其中步骤1)中，所述电泳是变性PAGE电泳。
26.权利要求21所述的方法，其中步骤3)中，所述目的片段是约100bp。
27.权利要求21所述的方法，其中步骤5)中，测序技术是Solexa测序技术。
28.权利要求21所述的方法，其中小分子RNA测序引物和小分子RNA标签测序引物分别为Small RNA Sequencing Primer：5′CGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC，和Small RNAIndex Sequencing Primer：5′ATGATACGGCGACCACCGACAGC。
29.通过权利要求21所述的方法构建的小分子RNA文库。
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