CN111118167A - 一种肿瘤突变负荷标准品及其制备方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种肿瘤突变负荷标准品及其制备方法和应用,以6对配对细胞系提取的基因组DNA按照一定比例混合而成,并通过全外显子测序对梯度参考品进行测序,经过特定的生物信息算法计算出相应梯度参考品的肿瘤突变负荷值;而检测限参考品则通过使用配对样品中的正常细胞样品稀释肿瘤细胞样品,并使用微滴式数字PCR的方法验证稀释比例,确保混合符合预期,以此最大程度模拟临床样品的复杂性及检验检测系统的特异及灵敏性;本产品可以用于肿瘤突变负荷检测产品的性能评价,也可以用于肿瘤突变负荷的算法优化或检测流程优化。适用于高通量中的全外显子、靶向基因组或外显子组子集的测序策略。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤基因突变检测领域,具体涉及一种肿瘤突变负荷(TumorMutation Burden,TMB)标准品及其制备方法和试剂盒。
背景技术
近年来,受国家政策的大力推动和技术的不断更替,分子诊断尤其是基因检测领域发展极为迅速,基因检测涉及无创产前检测,肿瘤易感预测,肿瘤早期诊断,个体化用药,术后监测以及消费型基因检测等。由于市场容量巨大,近年来,市场上出现了越来越多的此类基因检测的试剂盒。而肿瘤突变负荷(Tumor Mutation Burden,TMB)作为一个潜在的生物标志物而出现,业内公司也争相推出相关检测。如何测准肿瘤突变负荷也是一直困扰相关检测行业的一大难题。
TMB定义为一份肿瘤样本中,所评估基因的外显子编码区每兆碱基中发生置换和插入/缺失突变的总数。在不同的癌症中体细胞突变的数量从0.01突变/Mb~超过400突变/Mb不等。而这些突变中有些会转录表达多肽抗原表位或肿瘤新抗原。早期关于TMB的研究都是采用全外显子测序(WES)方法对肿瘤DNA和对照的胚系DNA进行分析。2018年欧洲肿瘤医学协会会议(ESMO)上,Foundation Medicine(FMI)展示的研究结果是在全球范围内首次在III期临床试验中证实:无论PD-L1表达水平如何,只要非小细胞肺癌患者的TMB高,联合免疫治疗都能够给他们带来无进展生存期显著获益。也是首个证实TMB可以作为免疫治疗效果预测伴随诊断方法的前瞻性临床研究。另一项并列开展中的CheckMate568也表明,在接受Nivolumab加ipilimumab治疗的非小细胞肺癌患者,TMB≥10 mut/Mb的患者中位无进展生存期几乎是TMB<10 mut/Mb患者的3倍(7.1月 vs 2.6月),无论PD-L1表达水平如何。正是基于这些研究成果,在2019年推出的非小细胞肺癌NCCN指南中,TMB赫然在列,成为非小细胞肺癌患者接受免疫治疗的推荐检测方法。
TMB作为潜在生物标志物来预测免疫治疗的疗效预测。有些TMB非常高的患者对免疫治疗也没有反应,有些TMB低的患者使用免疫检查点抑制剂效果却很好。这意味着,除了TMB之外,患者对免疫治疗的响应程度还与其他多种因素有关。这也提示,将TMB与其他的标志物联合使用可能会提升TMB的预测能力。但目前针对TMB的检测存在诸多问题,比如利用在靶向基因组或外显子组子集进行TMB的计算,同义突变及非同义突变是否同时纳入计算存在争议,不同的样品的类型、处理方法和不同的生物信息学算法也影响着TMB值。TMB检测亟需一个标准化的参考品去校准及优化。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的问题,本发明的一个目的在于提供一种肿瘤突变负荷(TMB)检测的标准品,所述标准品含有选自如下6对配对细胞系的基因组DNA(gDNA):
其中,细胞系编号GW-PX-T和GW-PX-N中“X”代表上述6对细胞系中的任意一对,“T”代表肿瘤细胞,“N”代表配对细胞,所述GW-PX-T基因组DNA所占的体积比例为1%~99%,所述GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例为99%~1%。
优选地,所述的标准品包含TMB梯度参考品、检测限参考品及重复性参考品;标准品需要最大限度模拟临床样本的实际情况,因为临床取样的样本不会是100%的肿瘤细胞,因此本发明的试剂盒将肿瘤细胞与正常配对细胞按照不同比例进行混合,以最大限度模拟临床样品客观情况。较佳地,所述TMB梯度参考品的TMB检测值约为3~23;较佳地,所述检测限参考品和/或重复性参考品的GW-PX-T基因组DNA所占的体积比例为1%~99%,GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例为99%~1%。
优选地,所述gDNA根据高通量全外显子测序数据分析,所述的TMB检测包含突变过滤的步骤,使用下表的过滤参数对检测出的变异进行过滤:
所述TMB检测值=过滤后的体细胞突变/全外显子编码区大小(兆碱基)。
本发明的另一个目的在于提供一种肿瘤突变负荷检测标准品的制备方法,包括如下步骤:
(1)筛选ATCC的配对细胞系
选择如下GW-P1~GW-P6中6对配对细胞系中的一对或多对:
其中,细胞系编号GW-PX-T和GW-PX-N中“X”代表上述6对细胞系中的任意一对,“T”代表肿瘤细胞,“N”代表配对细胞;购买的细胞会经过单克隆技术挑选遗传稳定的单克隆细胞株。在本发明的一个或多个实施方式中,具体的方法是:待细胞的汇合度达到70%-90%时,消化并收集细胞。对细胞准确计数,按照倍比稀释的方法,用培养基将活细胞稀释至5个/mL,并将细胞混匀。取10mL细胞悬液,均匀分到一块96孔板中。待细胞克隆形成时,即获得单克隆细胞株。
(2)gDNA制备:
每株细胞系首先进行了STR分型鉴定,以确认细胞类型符合预期;
gDNA的提取使用Promega Maxwell® 16 Cell LEV Purification Kit(货号AS1140)试剂盒说明书中推荐的提取方法进行提取;
(3)DNA浓度测定
使用分光光度计对提取的产物进行DNA浓度的测定,浓度测定,应当连续进行3次重复检测,应满足如下条件:
浓度:平均浓度20.0 ng/μL≤x≤60.0 ng/μL,
OD260/280:测定值1.8≤x≤2.0,判定合格,
OD260/230:测定值1.5≤x≤5.0,判定合格;
(4)混合和稀释
①将同一编码和批号细胞沉淀提取的gDNA进行混合,混合前需确认:
待混合gDNA为同一编码和批号的细胞沉淀提取的;
待混合gDNA浓度测定的OD260/280、OD260/230结果合格;
②选择合适体积的管子进行混合;
③测定混合后的浓度及OD值;
④稀释:混合后进行浓度测定,目标稀释浓度为25 ng/μL;
(5)配对细胞系的混合和质检,将上述6对细胞系的基因组DNA按照不同体积比例进行混合,进行高通量全外显子测序,根据测序数据进行分析,每一对细胞系挑选一个或多个突变位点设计特异性的探针和引物,采用微滴式数字PCR(ddPCR)对原材料原始的突变频率进行确认;
(6)参考品TMB值检测和TMB值计算。
优选地,所述方法的步骤(5)中所述混合的比例为所述GW-PX-T基因组DNA所占的体积比例为1%~99%,所述GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例为99%~1%。
优选地,所述方法的标准品包含TMB梯度参考品、检测限参考品及重复性参考品;较佳地,所述TMB梯度参考品的TMB检测值约为3~23;较佳地,所述检测限参考品和/或重复性参考品的GW-PX-T基因组DNA所占的体积比例为1%~99%,GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例为99%~1%。
优选地,所述方法的步骤(5)中所述特异性的探针和引物选自如下任一种或多种:
优选地,所述方法的步骤(5)中所述ddPCR的检测步骤包括如下:
①配置反应的预混液如下:
②微滴发生:将上述配置的预混液加入到微滴发生卡的中层孔位中,微滴生成油加入到卡的下排孔位中,在微滴生成卡的两侧套上橡胶皮套,将微滴生成卡移除操作间放置于微滴生成仪内,并关闭盖子,等待微滴生成完成;
③微滴转移:用移液枪将生成的微滴转移到96孔PCR反应板内,将枪头的位置保持在一定倾斜度角防止卡的底部阻塞枪头;
④封膜:当所有样品的微滴转移完成以后,放置一片铝膜置于96孔板的表面,用热封仪进行封膜;
⑤PCR:将96孔板放置于PCR仪上,并关紧盖子,仪器升降温速度调到2~3℃/s,按照如下程序运行:
⑥信号收集:当PCR程序完成,将96孔板转移到QX200微滴读取仪上,在电脑上,打开“QuantaSoft”软件,并选择包含样品的孔,在相应的位置进行设置;
⑦数据分析:当数据读取完成以后,打开要分析的实验数据,选择“Analyze”对结果进行分析。
优选地,所述方法中步骤(6)包括如下步骤:
①数据质控:使用Fastp(https://github.com/OpenGene/fastp)对低质量的数据进行过滤;
②比对参考基因组:使用BWA(http://bio-bwa.sourceforge.net/)比对参考基因组(GRCh37/hg19);
③数据处理:数据使用samtools(http://samtools.sourceforge.net/)和gencore(https://github.com/OpenGene/gencore)进行sort和去除duplicate;
④变异检测:使用VarScan 2(http://dkoboldt.github.io/varscan/);
⑤突变注释:使用ANNOVAR(http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)对突变进行注释;
⑥突变过滤:使用下表的过滤参数对检测出的变异进行过滤
⑦TMB值计算:TMB =过滤后的体细胞突变/全外显子编码区大小(兆碱基)。
本发明的另一个目的在于提供含有上述标准品或上述方法制备的标准品的试剂盒。
本发明的另一个目的在于提供上述标准品或上述试剂盒的应用,所述应用选自如下任一种或多种:
(1)作为TMB检测标准品的应用;
(2)评价TMB检测产品或平台的应用;
(3)校准TMB检测结果的应用;
(4)优化TMB检测方法或体系的应用。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
目前认为配对样品可以有效检测出胚系突变,而检测方案则推荐使用全外显子测序数据计算的TMB值。本发明的标准品及试剂盒以6对配对细胞系提取的DNA按照一定比例混合而成,并通过全外显子测序对梯度参考品进行测序,经过特定的生物信息算法计算出相应梯度参考品的肿瘤突变负荷值;而检测限参考品则通过使用配对样品中的正常细胞样品稀释肿瘤细胞样品,并使用ddPCR的方法验证稀释比例,确保混合符合预期,以此最大程度模拟临床样品的复杂性及检验检测系统的特异及灵敏性;本产品可以用于肿瘤突变负荷检测产品的性能评价,也可以用于肿瘤突变负荷的算法优化或检测流程优化。适用于高通量中的全外显子、靶向基因组或外显子组子集的测序策略。本发明试剂盒检测出的TMB值与理论值的线性关系的拟合度,R2为0.997,说明拟合度表现良好,TMB值测量准确。本发明成功建立了一种肿瘤突变负荷检测的标准品及其试剂盒,具有广泛的应用前景和巨大的产业应用价值。
附图说明
图1是本发明的方法中TMB检测数据分析流程图。
图2是本发明试剂盒检测出的TMB值的线性关系的拟合度,R2为0.997,说明拟合度表现良好,TMB值测量准确。
图3是本发明试剂盒检校验Illumina测序平台的TMB检测值的拟合度,结果表明本发明TMB检测标准品试剂盒在市面主流测序平台展示出良好的适用性。
图4是本发明试剂盒检校验MGI测序平台的TMB检测值的拟合度,结果表明本发明TMB检测标准品试剂盒在市面主流测序平台展示出良好的适用性。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明,以使本领域技术人员能够更好地理解本发明并予以实施,但实施例并不作为本发明的限定。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1配对细胞鉴定及其基因组DNA提取
本发明的各组分的基因组DNA(genomic DNA,gDNA)来源于美国模式培养物集存库(American type culture collection,ATCC)特定培养的细胞系。细胞系对应列表如下所示:
购买的细胞会经过单克隆技术挑选遗传稳定的单克隆细胞株。在本发明的一个或多个实施方式中,具体的方法是:待细胞的汇合度达到70%~90%时,消化并收集细胞。对细胞准确计数,按照倍比稀释的方法,用培养基将活细胞稀释至5个/mL,并将细胞混匀。取10mL细胞悬液,均匀分到一块96孔板中。待细胞克隆形成时,即获得单克隆细胞株。每株细胞系进行了STR分型鉴定,以确认细胞类型符合预期,鉴定结果如上表所示。
(1)基因组DNA制备
gDNA的提取使用Promega Maxwell® 16 Cell LEV Purification Kit(货号AS1140)试剂盒说明书中推荐的提取方法进行提取。
(2)浓度测定
①使用分光光度计对提取的产物进行DNA浓度的测定。
②浓度测定,应当连续进行3次重复检测,应满足如下条件:
浓度:平均浓度20.0 ng/μL≤x≤60.0 ng/μL;
OD260/280:测定值1.8≤x≤2.0,判定合格;
OD260/230:测定值1.5≤x≤5.0,判定合格。
(3)混合
①将同一编码和批号细胞沉淀提取的gDNA进行混合,混合前需确认:
待混合gDNA为同一编码和批号的细胞沉淀提取的;
待混合gDNA浓度测定的OD260/280、OD260/230结果合格;
②选择合适体积的管子进行混合(≥1.6mL应当用50mLBD管进行混合);
③测定混合后的浓度及OD值。
(4)稀释
混合后进行浓度测定,目标稀释浓度为25 ng/μL。
实施例2配对细胞系的基因组DNA混合和质检
本发明的试剂盒检测限参考品及重复性参考品的混合和质检的方法如下:
将上述6对细胞系的基因组DNA按照不同体积比例进行混合,混合时,肿瘤细胞GW-PX-T(X代表6对细胞系中的任意一对)基因组DNA所占的体积比例分别为1%~99%,配对白细胞GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例分别为99%~1%。根据高通量全外显子测序数据的分析结果,每一对细胞挑选一个突变位点设计特异性的探针和引物,序列信息如下表所示:
采用ddPCR(BIO-RAD QX200平台)对原材料原始的突变频率进行确认。具体的ddPCR实验流程如下:
①按照下表中的反应组分配置反应的预混液,每一个位点每个样本做三个复孔,考虑移液损耗,故每个位点每个样本配置3.3个反应的量。详细的配置组分及其加入量见下表:
②微滴发生。将上述配置的预混液加入到微滴发生卡的中层孔位中,每一个孔加入20μL,将70μL微滴生成油加入到卡的下排孔位中,在微滴生成卡的两侧套上橡胶皮套,将微滴生成卡移除操作间放置于微滴生成仪内,并关闭盖子,等待微滴生成完成。
③微滴转移。将适当量程的移液枪调至40μL,将生成的微滴非常小心的转移到96孔PCR反应板内。将枪头的位置保持在斜4度角防止卡的底部阻塞枪头。
④封膜。当所有样品的微滴转移完成以后,放置一片铝膜置于96孔板的表面,用热封仪进行封膜。
⑤PCR。将96孔板放置于PCR仪上,并关紧盖子,按照如下程序运行,仪器升降温速度调到2-3℃/s。
⑥信号收集。当PCR程序完成,将96孔板转移到QX200微滴读取仪上(需提前半小时开机预热),在电脑上,打开“QuantaSoft”软件,并选择包含样品的孔,在相应的位置设置好每一个孔的名称,实验用的Supermix,对于SNP类型的实验,将实验类型设置为ABS,将“Assay 1”设置为“Mut”,“type”设置为“Ch1 Unknown”,将“Assay 2”设置为“WT”,“type”设置为“Ch2 Unknown”,选择“RUN”。
⑦数据分析。当数据读取完成以后,打开要分析的实验数据,选择“Analyze”即可对结果进行分析。
每一对细胞系选取一个特异性的基因位点用于ddPCR验证,检测得到的对应细胞系含有的突变位点及频率如下表所示:
实施例3参考品TMB值检测
(1)GW-P1至GW-P6按照下表进行全外显子高通量测序:
(2)分析方法及参数
按附图1所示流程图操作,具体如下:
①数据质控:使用Fastp(https://github.com/OpenGene/fastp)对低质量的数据进行过滤。fastp -i read1.fastq –I read2.fastq -f 1 -F 1 -t 1 -T 1 -3 -M 25 –oread1_trimed.fastq –O read1_trimed.fastq
②比对参考基因组:使用BWA(http://bio-bwa.sourceforge.net/)比对参考基因组(GRCh37/hg19)
bwa mem [-pP] [-t nThreads] [-k 32] [-w 100] [-d 100] [-r 1.5] [-A 1] [-B0] [-O 6] [-E 1] [-L 5] [-U 9] [-v 3] ref.fasta read1_trimed.fastq read1_trimed.fastq> sample1_map.sam
③数据处理:数据使用samtools(http://samtools.sourceforge.net/)和gencore(https://github.com/OpenGene/gencore)进行sort和去除duplicate
samtools view -bS sample1_map.sam > sample1_map.bam
samtools sort -o sort.bam sample1_map.bam
gencore -i sample1_map_sort.bam -o sample1_ map_sort._gencore.bam -rhg19.fa -s 1 -j gencore.json –h gencore.html
④变异检测:使用VarScan 2(http://dkoboldt.github.io/varscan/)
⑤突变注释:使用ANNOVAR(http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)对突变进行注释
table_annovar.pl wes.vcf /annovar/humandb/ -buildver hg19 -out wes.anno -remove -protocol refGene,cytoBand,genomicSuperDups,esp6500siv2_all,1000g2015aug_all,1000g2015aug_afr,operation g,r,r,f,f,f,f,f,f,f,f,f -nastring. -vcfinput
⑥突变过滤:使用下表的过滤参数对检测出的变异进行过滤
⑦TMB值计算:TMB=过滤后的体细胞突变/全外显子编码区大小(兆碱基)。
实施例4TMB检测标准品试剂盒
本发明试剂盒包括TMB梯度参考品、检测限参考品及重复性参考品。TMB梯度参考品设置的从~3至~23的TMB值梯度,可以作为研发TMB检测流程的参考,提高TMB检测流程的准确性,而检测限及重复性参考品不仅能模拟临床样品的真实情况,有助于确定TMB检测流程的检测限及稳定性,而且也是体外诊断试剂盒开发和申报过程中向监管机构提供的必备原料之一。本实施例采美国癌症基因体图谱计划TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库对应细胞系的全外显子测序数据按照实施例3中的生物信息学分析方法得出理论检测值,将实施例1中提取配对细胞的gDNA按照实施例3进行全外显子测序和生物信息学分析,得出实测值,再将理论值及实测值进行拟合度比较。
TMB梯度参考品,由下表配对组分组成:
检测限参考品及重复性参考品,由下表配对组分组成:
附图2展示的是该试剂盒检测出的TMB实测值与理论值线性关系的拟合度,R2为0.9961,说明拟合度表现良好,实施例3中的测序及分析方法可以准确测量对应配对标准品的TMB值。
实施例5本发明试剂盒的性能检测
本实施例目的在于验证检测限及重复性参考品检测的实施例。在本专利宣称的范围内,挑选了上述6对细胞系的基因组DNA按照不同体积比例进行混合并检测,测序及分析方法按照实施例3所述,其中肿瘤细胞GW-PX-T基因组DNA所占的体积比例为20%、40%、60%、80%、99%时的具体TMB检测值及其拟合度R2值,具体组分配比及实测值如表1~表5所示:
表1 肿瘤细胞gDNA所占的体积比为20%时
表2 肿瘤细胞gDNA所占的体积比为40%时
表3 肿瘤细胞gDNA所占的体积比为60%时
表4 肿瘤细胞gDNA所占的体积比为80%时
表5 肿瘤细胞gDNA所占的体积比为99%时
根据以上实施例进行了TMB检测,其TMB检测结果与实施例4中的实测值进行拟合度分析,R2均大于0.99,说明拟合度表现良好,检测限及重复性参考品TMB检测能准确反馈梯度检测参考品的TMB值。
实施例6本发明试剂盒的不同测序平台测试
本实施例目的在于验证本标准品在市面主流的两个测序平台Illumina和MGI,及不同主流靶向捕获平台的检测结果。在本专利宣称的范围内,挑选了上述6对细胞系的基因组DNA采用KAPA DNA HyperPlus和MGIEasy建库试剂盒及其推荐的流程进行文库构建,构建好的文库进行IDT全外显子探针捕获,然后分别在Illumina和MGI测序平台进行高深度测序。通过获取其测序数据使用并使用本发明中实施例3的生物信息学分析流程检测TMB值,随后将这些检测值与实施例4中的梯度参考品的TMB理论值进行拟合度分析,具体组实测值如下表所示,以及其拟合度如附图3和附图4所示。
根据以上实施例进行了TMB检测,结果如附图3和附图4所示,Illumina测序平台和MGI测序平台测序数据的TMB检测值与实施例4的梯度参考品的TMB理论值拟合度分别为0.8669和0.9318,说明本发明TMB检测标准品试剂盒拟合度表现良好,标准品在市面主流测序平台展示出良好的适用性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种肿瘤突变负荷检测的标准品,其特征在于,所述标准品包括以下六对配对细胞系的基因组DNA:
细胞系编号GW-P1-T:细胞系名称NCI-H1770;
细胞系编号GW-P1-N:细胞系名称NCI-BL1770;
细胞系编号GW-P2-T:细胞系名称NCI-H1184;
细胞系编号GW-P2-N:细胞系名称NCI-BL1184;
细胞系编号GW-P3-T:细胞系名称NCI-H128;
细胞系编号GW-P3-N:细胞系名称NCI-BL128;
细胞系编号GW-P4-T:细胞系名称NCI-H2171;
细胞系编号GW-P4-N:细胞系名称NCI-BL2171;
细胞系编号GW-P5-T:细胞系名称COLO 829;
细胞系编号GW-P5-N:细胞系名称COLO 829BL;
细胞系编号GW-P6-T:细胞系名称NCI-H209;
细胞系编号GW-P6-N:细胞系名称NCI-BL209;
其中,细胞系编号GW-PX-T和GW-PX-N中“X”代表上述六对细胞系中的任意一对,“T”代表肿瘤细胞,“N”代表配对细胞,所述GW-PX-T基因组DNA所占的体积比例为1%~99%,所述GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例为99%~1%;所述的标准品包含TMB梯度参考品、检测限参考品、重复性参考品;所述TMB梯度参考品的TMB检测值为3~23;所述检测限参考品和/或重复性参考品的GW-PX-T基因组DNA所占的体积比例为1%~99%,GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例为99%~1%。
2.一种TMB检测标准品的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)筛选ATCC的配对细胞系
选择如下GW-P1~GW-P6中六对配对细胞系中的一对或多对:
细胞系编号GW-P1-T:细胞系名称NCI-H1770;
细胞系编号GW-P1-N:细胞系名称NCI-BL1770;
细胞系编号GW-P2-T:细胞系名称NCI-H1184;
细胞系编号GW-P2-N:细胞系名称NCI-BL1184;
细胞系编号GW-P3-T:细胞系名称NCI-H128;
细胞系编号GW-P3-N:细胞系名称NCI-BL128;
细胞系编号GW-P4-T:细胞系名称NCI-H2171;
细胞系编号GW-P4-N:细胞系名称NCI-BL2171;
细胞系编号GW-P5-T:细胞系名称COLO 829;
细胞系编号GW-P5-N:细胞系名称COLO 829BL;
细胞系编号GW-P6-T:细胞系名称NCI-H209;
细胞系编号GW-P6-N:细胞系名称NCI-BL209;
其中,细胞系编号GW-PX-T和GW-PX-N中“X”代表上述六对细胞系中的任意一对,“T”代表肿瘤细胞,“N”代表配对细胞;
(2)gDNA制备
每株细胞系首先进行了STR分型鉴定,以确认细胞类型符合预期;然后,提取gDNA;
(3)DNA浓度测定
使用分光光度计对提取的产物进行DNA浓度的测定,浓度测定,应当连续进行重复检测,应满足如下条件:
浓度:平均浓度20.0ng/μL≤x≤60.0ng/μL,
OD260/280:测定值1.8≤x≤2.0,判定合格,
OD260/230:测定值1.5≤x≤5.0,判定合格;
(4)混合和稀释
①将同一编码和批号细胞沉淀提取的gDNA进行混合,混合前需确认:
待混合gDNA为同一编码和批号的细胞沉淀提取的;
待混合gDNA浓度测定的OD260/280、OD260/230结果合格;
②选择合适体积的管子进行混合;
③测定混合后的浓度及OD值;
④稀释:混合后进行浓度测定,目标稀释浓度为20-60ng/μL;
(5)配对细胞系的混合和质检,将上述六对细胞系的基因组DNA按照不同体积比例进行混合,根据高通量全外显子测序数据进行分析,每一对细胞系挑选一个或多个突变位点设计特异性的探针和引物,采用微滴式数字PCR对原材料原始的突变频率进行确认;
(6)参考品TMB值检测和TMB值计算。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤(5)中所述混合的比例为所述GW-PX-T基因组DNA所占的体积比例为1%~99%,所述GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例为99%~1%。
4.根据权利要求2或3所述的方法,其特征在于,所述标准品包含TMB梯度参考品、检测限参考品及重复性参考品;所述TMB梯度参考品的TMB检测值为3~23;所述检测限参考品和/或重复性参考品的GW-PX-T基因组DNA所占的体积比例为1%~99%,GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例为99%~1%。
5.根据权利要求2或3所述的方法,其特征在于,所述步骤(5)中所述特异性的探针和引物选自如下任一种或多种,以5’到3’端序列表示:
AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT;
GCTGTATCGTCAAGGCACTCTT;
GGTGAAACCTGTTTGTTGGACATAC;
CCTGTCCTCATGTATTGGTCTCTCA;
CCGGACGATATTGAACAATGG;
GAGCAGCCTCTGGCATTCTG;
TCCTGAGTACGACTTCCAAC;
CTTAGGCCCTGGAGATGTAC;
GGAGTAGGGAGGCATAGTAATG;
CATCGGTTCCCACTGTCAG;
CGGACCAATGTGCCAGAC;
CAGCATCTCACTCTGGACTG;
TTGGAGCTGGTGGCGTA;
TTGGAGCTGCTGGCGTA;
TCCTCAATGATACCGAG;
TCCTCAGTGATACCGAG;
CATGGCCATCTACA;
ATGGCCATCTGCA;
CTGTACTCTTCTTGTCCAGC;
CTGTACTCTTCTTTTCCAGC;
CAGGTCCAGATGAA;
CAGGTCCAGATTAA;
CGACACTTTGTTCCAA;
CGACACTTTGATCCAA;
CCTTTCACCAGGCGG;
TTCCTTTCACCAGGTGG;
CGTGGGCTACCGCT;
TGGGCTACCACTAC。
6.根据权利要求2或3所述的方法,其特征在于,所述步骤(5)中所述微滴式数字PCR的检测步骤包括如下:
①配置反应的预混液;
②微滴发生:将上述配置的预混液加入到微滴发生卡的中层孔位中,微滴生成油加入到卡的下排孔位中,在微滴生成卡的两侧套上橡胶皮套,将微滴生成卡移除操作间放置于微滴生成仪内,并关闭盖子,等待微滴生成完成;
③微滴转移:用移液枪将生成的微滴转移到96孔PCR反应板内,将枪头的位置保持在一定倾斜度角防止卡的底部阻塞枪头;
④封膜:当所有样品的微滴转移完成以后,放置一片铝膜置于96孔板的表面,用热封仪进行封膜;
⑤ PCR:将96孔板放置于PCR仪上,并关紧盖子,仪器升降温速度调到2~3℃/s;
⑥信号收集:当PCR程序完成,将96孔板转移到QX200微滴读取仪上,在电脑上,打开“QuantaSoft”软件,并选择包含样品的孔,在相应的位置进行设置;
⑦数据分析:当数据读取完成以后,打开要分析的实验数据,选择“Analyze”对结果进行分析。
7.根据权利要求2或3所述的方法,其特征在于,所述步骤(6)包括如下步骤:
①数据质控:使用Fastp对低质量的数据进行过滤;
②比对参考基因组:使用BWA比对参考基因组;
③数据处理:数据使用samtools和gencore进行sort和去除duplicate;
④变异检测:使用VarScan2;
⑤突变注释:使用ANNOVAR对突变进行注释;
⑥突变过滤:使用过滤参数对检测出的变异进行过滤;
⑦ TMB值计算:过滤后的体细胞突变/全外显子编码区大小(兆碱基)=TMB。
8.含有权利要求1所述标准品,或权利要求2-7任一项所述方法制备的标准品的试剂盒。
9.权利要求1所述标准品、或权利要求2-7任一项所述方法制备的标准品、或权利要求8所述试剂盒的应用,所述应用选自如下任一种或多种:
(1)作为TMB检测标准品的应用;
(2)评价TMB检测产品或平台的应用;
(3)校准TMB检测结果的应用;
(4)优化TMB检测方法或体系的应用。
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