CN110699325A - 基于CRISPR/Cas9技术的血浆肿瘤突变负荷检测质控品的制备方法 - Google Patents

基于CRISPR/Cas9技术的血浆肿瘤突变负荷检测质控品的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于CRISPR/Cas9技术的血浆肿瘤突变负荷检测质控品的制备方法，包括如下步骤：(1)突变细胞株的制备，以CRISPR/Cas9技术作为基础，通过体外转染技术构建带有TP53基因突变的细胞株；(2)不同TMB频率阳性混合克隆的制备与验证；(3)人工模拟血浆游离DNA TMB检测质控品的制备与验证。本发明中，TMB频率精准可控，确保质控品的质量；提供了三个水平的TMB质控物质，有助于构建完整、严密、可靠的二代测序质量控制体系。

Description

基于CRISPR/Cas9技术的血浆肿瘤突变负荷检测质控品的制 备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9技术的血浆肿瘤突变负荷检测质控品的制备方法。
背景技术
CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割，造成DNA双链断裂(DSB,doublestrandbreak)。这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制，通过同源介导的修复(HR,homology-directedrepair)，高保真地实现基因的精确编辑。CRISPR/Cas9技术以自己操作的便捷性，高效的基因编辑能力获得青睐，成为当下科研工作者的新宠儿。各大实验室纷纷加入开发CARISPR/Cas9技术的行列中，媒体也将之评为21世纪最有影响的十大技术之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于CRISPR/Cas9技术的血浆肿瘤突变负荷检测质控品的制备方法，TMB频率精准可控，确保质控品的质量；提供了三个水平的TMB质控物质，有助于构建完整、严密、可靠的二代测序质量控制体系。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种基于CRISPR/Cas9技术的血浆肿瘤突变负荷检测质控品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)突变细胞株的制备
以CRISPR/Cas9技术作为基础，通过体外转染技术构建带有TP53基因突变的细胞株；
(2)不同TMB频率阳性混合克隆的制备与验证；
(3)人工模拟血浆游离DNA TMB检测质控品的制备与验证。
其中，步骤(1)包括如下具体步骤：
(1-1)靶细胞：选择HEK293T细胞株；
(1-2)靶细胞基础TMB水平验证：采用Illmina Miseq测序平台对HEK293T细胞基因组DNA行全外显子测序，分析其基础TMB水平，从而验证其天然低TMB水平；
(1-3)靶基因选择：选择肿瘤基因组TMB作为候选编辑基因；
(1-4)sgRNA设计：利用CHOPCHOP在线工具进行sgRNA的设计，依据靶向性差与切割活性高两项原则构建sgRNA如下：
CACCATTGGCAATGAGCGGTTC，
AGGTCTTGCGGATGTCCACGT，
GCCGACGACAGCCTGAGCAA，
CGCCACAGCCCGCAGACTTC；
(1-5)带有不同sgRNA的CRISPR/Cas9表达载体筛选：构建质粒转染HEK293T细胞，采用T7EI错配酶切方法对sgRNA的切割效率进行鉴定，选取切割效率最高的5～10种sgRNA/Cas9共表达质粒，并进行二代测序验证突变存在，最终完成突变细胞株的构建。
其中，步骤(2)的具体步骤为：
(2-1)将TMB水平定义如下：
Figure BDA0002233054890000021
(2-2)阳性混合克隆验证：采用Illumina Miseq平台对上述细胞提取DNA进行WES测序检测，从而对CRISPR/Cas9的多位点编辑技术进行确认，结果如下：
高TMB水平：29.78±3.65mutations/Mb；
中TMB水平：13.67±2.17mutations/Mb；
低TMB水平：6.54±1.18mutations/Mb；
阴性对照：未检出P53突变。
其中，步骤(3)的具体步骤为：
(3-1)人工模拟血浆游离DNATMB检测质控品的制备：按照比例将含有不同TMB水平的阳性单克隆HEK293细胞及阴性对照HEK293细胞进行混合，获取MAF为1％-5％的细胞混合物；提取前述混合细胞DNA，采用MNase进行消化，并与模拟血浆混合，最终制备获得不同TMB水平的人工模拟血浆游离DNATMB检测质控品；
(3-2)人工模拟血浆游离DNA TMB检测质控品的验证：
(3-2-1)毛细管电泳验证，采用Agilent 2100毛细电泳仪验证质控品DNA片段分布在147～166bp；
(3-2-2)WES验证，采用多平台对质控品进行WES检测，分析并验证各组TMB值，结果如下：
高TMB水平：25.78±4.05mutations/Mb；
中TMB水平：11.45±1.75mutations/Mb；
低TMB水平：5.86±1.03mutations/Mb；
阴性对照：未检出P53突变。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明中，TMB频率精准可控，确保质控品的质量；提供了三个水平的TMB质控物质，有助于构建完整、严密、可靠的二代测序质量控制体系。
附图说明
图1为本发明中HEK293T不包含P53突变、呈野生型的示意图；
图2为本发明中二代测序显示细胞P53存在大量突变的示意图；
图3为本发明中质控品TMB评率验证结果的示意图；
图4为本发明中安捷伦2100质检结果的示意图；
图5为本发明中血浆TMB质控品验证结果的示意图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明提供一种基于CRISPR/Cas9技术的血浆肿瘤突变负荷检测质控品的制备方法，包括如下步骤：
(1)突变细胞株的制备
以CRISPR/Cas9技术作为基础，通过体外转染技术构建带有TP53基因突变的细胞株
(1-1)靶细胞：选择HEK293T细胞株，原因为转染效率高，可单细胞生长，更为重要的是不带有前述肿瘤驱动基因且基础TMB率极低；
(1-2)靶细胞基础TMB水平验证：采用Illmina Miseq测序平台对HEK293T细胞基因组DNA行全外显子测序，分析其基础TMB水平，从而验证其天然低TMB水平，如图1所示；
(1-3)靶基因选择：选择肿瘤基因组TMB作为候选编辑基因；
国内外最新研究显示肿瘤基因组TMB频率与TP53突变具有显著相关性，同时此基因在多种实体瘤中均可发生高频突变，且与肿瘤进展密切相关；故选取此基因作为候选编辑基因；
(1-4)sgRNA设计：参考NCBI网站中“Nucleotide”所获TP53基因的CDS序列，利用CHOPCHOP在线工具进行sgRNA的设计，依据靶向性差与切割活性高两项原则构建sgRNA如下：
CACCATTGGCAATGAGCGGTTC，
AGGTCTTGCGGATGTCCACGT，
GCCGACGACAGCCTGAGCAA，
CGCCACAGCCCGCAGACTTC；
(1-5)带有不同sgRNA的CRISPR/Cas9表达载体筛选：构建质粒转染HEK293T细胞，采用T7EI错配酶切方法对sgRNA的切割效率进行鉴定，选取切割效率最高的5～10种sgRNA/Cas9共表达质粒(针对每一种基因)，并进行二代测序验证突变存在(如图2所示)，最终完成突变细胞株的构建。
(2)不同TMB频率阳性混合克隆的制备与验证
(2-1)将TMB水平定义如下：
Figure BDA0002233054890000051
(2-2)阳性混合克隆验证：采用Illumina Miseq平台对上述细胞提取DNA进行WES测序检测，从而对CRISPR/Cas9的多位点编辑技术进行确认，结果如下：
高TMB水平：29.78±3.65mutations/Mb；
中TMB水平：13.67±2.17mutations/Mb；
低TMB水平：6.54±1.18mutations/Mb；
阴性对照：未检出P53突变。
质控品TMB评率验证结果如图3所示。
(3)人工模拟血浆游离DNA TMB检测质控品的制备与验证
(3-1)人工模拟血浆游离DNATMB检测质控品的制备：按照比例将含有不同TMB水平的阳性单克隆HEK293细胞及阴性对照HEK293细胞进行混合，获取MAF为1％-5％的细胞混合物；提取前述混合细胞DNA，采用MNase进行消化，并与模拟血浆混合，最终制备获得不同TMB水平的人工模拟血浆游离DNATMB检测质控品；
(3-2)人工模拟血浆游离DNA TMB检测质控品的验证：
(3-2-1)毛细管电泳验证，采用Agilent 2100毛细电泳仪验证质控品DNA片段分布在100～140bp，如图4所示。
(3-2-2)WES验证，采用多平台(Illumina、Ion Proton)对质控品进行WES检测，分析并验证各组TMB值，结果如下：
高TMB水平：25.78±4.05mutations/Mb；
中TMB水平：11.45±1.75mutations/Mb；
低TMB水平：5.86±1.03mutations/Mb；
阴性对照：未检出P53突变。
血浆TMB质控品验证结果如图5所示。
本发明中，基于CRISPR-Cas9的基因编辑系统可简便、有效地制备出TMB频率精准可控，确保质控品的质量；此外，提供了三个水平的TMB质控物质，有助于构建完整、严密、可靠的二代测序质量控制体系。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种基于CRISPR/Cas9技术的血浆肿瘤突变负荷检测质控品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)突变细胞株的制备
以CRISPR/Cas9技术作为基础，通过体外转染技术构建带有TP53基因突变的细胞株；
(2)不同TMB频率阳性混合克隆的制备与验证；
(3)人工模拟血浆游离DNA TMB检测质控品的制备与验证。
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9技术的血浆肿瘤突变负荷检测质控品的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括如下具体步骤：
(1-1)靶细胞：选择HEK293T细胞株；
(1-2)靶细胞基础TMB水平验证：采用Illmina Miseq测序平台对HEK293T细胞基因组DNA行全外显子测序，分析其基础TMB水平，从而验证其天然低TMB水平；
(1-3)靶基因选择：选择肿瘤基因组TMB作为候选编辑基因；
(1-4)sgRNA设计：利用CHOPCHOP在线工具进行sgRNA的设计，依据靶向性差与切割活性高两项原则构建sgRNA如下：
CACCATTGGCAATGAGCGGTTC，
AGGTCTTGCGGATGTCCACGT，
GCCGACGACAGCCTGAGCAA，
CGCCACAGCCCGCAGACTTC；
(1-5)带有不同sgRNA的CRISPR/Cas9表达载体筛选：构建质粒转染HEK293T细胞，采用T7EI错配酶切方法对sgRNA的切割效率进行鉴定，选取切割效率最高的5～10种sgRNA/Cas9共表达质粒，并进行二代测序验证突变存在，最终完成突变细胞株的构建。
3.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9技术的血浆肿瘤突变负荷检测质控品的制备方法，其特征在于，步骤(2)的具体步骤为：
(2-1)将TMB水平定义如下：
Figure FDA0002233054880000021
(2-2)阳性混合克隆验证：采用Illumina Miseq平台对上述细胞提取DNA进行WES测序检测，从而对CRISPR/Cas9的多位点编辑技术进行确认，结果如下：
高TMB水平：29.78±3.65mutations/Mb；
中TMB水平：13.67±2.17mutations/Mb；
低TMB水平：6.54±1.18mutations/Mb；
阴性对照：未检出P53突变。
4.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9技术的血浆肿瘤突变负荷检测质控品的制备方法，其特征在于，步骤(3)的具体步骤为：
(3-1)人工模拟血浆游离DNATMB检测质控品的制备：按照比例将含有不同TMB水平的阳性单克隆HEK293细胞及阴性对照HEK293细胞进行混合，获取MAF为1％-5％的细胞混合物；提取前述混合细胞DNA，采用MNase进行消化，并与模拟血浆混合，最终制备获得不同TMB水平的人工模拟血浆游离DNATMB检测质控品；
(3-2)人工模拟血浆游离DNA TMB检测质控品的验证：
(3-2-1)毛细管电泳验证，采用Agilent 2100毛细电泳仪验证质控品DNA片段分布在147～166bp；
(3-2-2)WES验证，采用多平台对质控品进行WES检测，分析并验证各组TMB值，结果如下：
高TMB水平：25.78±4.05mutations/Mb；
中TMB水平：11.45±1.75mutations/Mb；
低TMB水平：5.86±1.03mutations/Mb；
阴性对照：未检出P53突变。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111118167A (zh) * 2020-03-31 2020-05-08 菁良基因科技(深圳)有限公司 一种肿瘤突变负荷标准品及其制备方法和试剂盒
CN111893178A (zh) * 2020-08-24 2020-11-06 重庆市人口和计划生育科学技术研究院 一种α地中海贫血基因检测遗传参考物质及其制备方法
CN114182018A (zh) * 2021-12-17 2022-03-15 北京医院 一种肿瘤突变负荷检测的质控品及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109880910A (zh) * 2019-04-25 2019-06-14 南京世和基因生物技术有限公司 一种肿瘤突变负荷的检测位点组合、检测方法、检测试剂盒及系统

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109880910A (zh) * 2019-04-25 2019-06-14 南京世和基因生物技术有限公司 一种肿瘤突变负荷的检测位点组合、检测方法、检测试剂盒及系统

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JINGYU CAO ET AL.: "An Accurate and Comprehensive Clinical Sequencing Assay for Cancer Targeted and Immunotherapies", 《THE ONCOLOGIST》 *
童琳等: "晚期非小细胞肺癌患者肿瘤突变负荷与靶向治疗疗效相关性", 《中国临床医学》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111118167A (zh) * 2020-03-31 2020-05-08 菁良基因科技(深圳)有限公司 一种肿瘤突变负荷标准品及其制备方法和试剂盒
CN111893178A (zh) * 2020-08-24 2020-11-06 重庆市人口和计划生育科学技术研究院 一种α地中海贫血基因检测遗传参考物质及其制备方法
CN114182018A (zh) * 2021-12-17 2022-03-15 北京医院 一种肿瘤突变负荷检测的质控品及其制备方法
CN114182018B (zh) * 2021-12-17 2023-10-03 北京医院 一种肿瘤突变负荷检测的质控品及其制备方法

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