CN111307561B - 一种用于基因检测的石蜡包埋参考品及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例公开了一种用于基因检测的石蜡包埋参考品及其制备方法与应用，该方法包括以下步骤：含有特定突变位点的细胞系的获得：a、通过基因编辑的方式，获得背景细胞系目标基因位点的突变；b、筛选出具有目标基因突变和遗传稳定的单克隆细胞株；c、对所述具有目标基因突变和遗传稳定的单克隆细胞株进行等位基因突变频率(AF)的确定；任意AF的目标位点参考品的设计；细胞的培养与收集；对收集后的细胞作石蜡包埋处理。该产品和方法能很好的解决临床样本不易获取、不可重复稳定获得、性能不稳定、突变位点有限、突变频率不可控、包埋不均一等诸多问题。
Description
技术领域
本发明涉及体外分子诊断和基因检测技术领域，尤其涉及一种用于基因检测的石蜡包埋参考品及其制备方法与应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
目前很多分子检测相关试剂盒厂商采用的参考品都是采用新鲜细胞培养提取的基因组DNA溶液，或者临床来源的样本。由于新鲜提取的基因组DNA溶液与临床肿瘤组织在样本形式上差异巨大，不能很好的模拟临床样本的检测，无法对临床样本的核酸提取过程进行质控；虽然一些临床样本也被用来作为参考，但临床样本中很多基因突变类型来源不稳定，基因突变频率存在组织异质性，不能作为试剂盒组分的优质来源；临床样本基因突变频率不可改变，低频突变样本极其罕见，不能很好的验证试剂盒的检测限等性能指标；临床样本都属于一次性材料，无法长期稳定供应，且数量有限，很难作为试剂盒研发注册的长期来源。王晓红等申请的专利《用于基因检测的FFPE参考品、其制备方法及应用》(申请号201910049671.X)也并不是真正的FFPE形式的参考品，因为其参考品的形式为DNA混合液。
目前市场上鲜有报道过可长期稳定供应、突变位点和突变频率可精确定制的用于肿瘤基因检测的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)形式的参考品的制备方法，发明人经过研究发现，已报道过的方法中存在很多不足：1.临床样本不易获取，不可重复获得。2.临床样本的突变位点有限。3.临床样本存在组织异质性，不同切片的突变细胞不均一。4.临床样本的突变频率不可控，无法根据需要指定突变频率。
因此，亟需一种可长期稳定供应、突变位点和突变频率可精确定制的用于基因检测的FFPE形式的参考品及其制备方法。
发明内容
针对上述技术问题，本发明实施例提供了一种用于基因检测的福尔马林固定石蜡包埋形式的参考品及其制备方法与应用，其能很好的解决临床样本不易获取、不可重复获得、突变位点有限、存在组织异质性、突变频率不可控等诸多问题。
本发明实施例的第一方面提供一种石蜡包埋参考品的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)含有特定突变位点的细胞系的获得：
a、对背景细胞系目标基因的目标位点进行基因编辑；
b、挑选遗传稳定的单克隆细胞株；
c、筛选出具有目标基因位点突变的单克隆细胞株；
d、对所述具有目标基因位点突变和遗传稳定的单克隆细胞株进行等位基因突变频率(AF)的确定；
(2)任意AF的目标位点参考品的设计；
(3)细胞的培养、收集和混合；
(4)对细胞作福尔马林固定石蜡包埋处理:以福尔马林作为固定剂，以石蜡作为包埋剂，进行固定、包埋、切片，获得石蜡包埋参考品。
实际操作中，上述步骤的顺序不受序号限制，可根据实际情况进行调整，例如实际操作中，步骤(2)可以调整在步骤(1)之前。
可选地，步骤(1)a中，所述背景细胞系为从ATCC或其它供应商购买得到商业化细胞系；如GM12878、A549、SW48、LS180、HCT116、BT-474、Hs-746T等。
可选地，步骤(1)a中，选择目标位点为野生型的的商业化细胞系作为背景细胞系(野生型细胞系)。
在本发明的一个或多个实施方式中，步骤(1)a中，选择GM12878细胞系作为背景细胞系。
可选的，步骤(1)a中，对目标基因的目标位点进行基因编辑，以期产生特定的突变。
可选的，步骤(2)中，将目标位点的多个不同AF的参考品组合在一起，可以设计成目标位点的AF梯度参考品。
本发明中所述的基因编辑方法，可以获得绝大多数临床上热门的肿瘤基因突变位点，例如表皮生长因子受体基因(EGFR)的G719A突变等。
在本发明的一个或多个实施方式中，具体的方法是：针对目标基因的目标位点，设计特异的向导RNA(guide RNA，gRNA)，并构建向导RNA的表达载体。同时，设计并合成单链DNA，用作基因编辑修复的模板。将向导RNA的表达载体和单链DNA共转染至目标细胞。
可选的，步骤(1)a中，目标基因包括但不仅仅限于肿瘤基因，所述肿瘤基因包括但不限于EGFR、KRAS、NRAS、BRAF、HER2、ALK、RB、TP53、PTEN、KIT、PDGFRA等。
可选地，步骤(1)b中，采用单克隆技术挑选遗传稳定的单克隆细胞株。
在本发明的一个或多个实施方式中，具体的方法是：待细胞的汇合度达到70％-90％时，消化并收集细胞。对细胞准确计数，按照倍比稀释的方法，用培养基将活细胞稀释至5个/mL，并将细胞混匀。取10mL细胞悬液，均匀分到一块96孔板中。待细胞克隆形成时，即获得单克隆细胞株。
可选的，步骤(1)c中，采用Sanger测序对步骤c中的单克隆细胞株进行突变位点确认。
在本发明的一个或多个实施方式中，Sanger测序服务由生工生物提供。
可选的，步骤(1)d中，采用数字PCR平台对所述具有目标基因突变和遗传稳定的单克隆细胞株进行AF确定，数字PCR检测突变频率更为精准。
在本发明的一个或多个实施方式中，采用BioRad QX200数字PCR平台。数字PCR采用BioRad的操作说明进行，不再赘述。
本发明中的基因编辑的细胞系，可以无限扩大培养，因此可以大规模的稳定的生产。
可选的，步骤(2)中，对于一个设定的目标基因位点而言，存在该位点未突变的野生型细胞和该位点突变的突变体细胞，因此将野生型细胞和突变型细胞按照设定数量比例混合，从而可以设计该位点的任意AF的参考品。
在本发明的一个或多个实施方式中，可设计但不限于0％、1％、2％、5％、10％、50％的AF参考品组成的AF梯度参考品。每种AF的石蜡参考品需要的细胞总数为100×106-500×106个。优选地，每种AF的石蜡参考品的细胞总数为200×106个。
可选的，步骤(3)中，培养突变型细胞(即所述具有目标基因突变和遗传稳定的单克隆细胞株)和/或野生型细胞，离心收集细胞，对细胞进行计数，根据步骤(2)中的设计方案，将不同数量比例的野生型细胞系和突变型细胞系混合。
将基因编辑过的特定基因位点突变的突变型细胞系与野生型细胞系按照设定数量比例混合在一起，可以制备成具有任意突变频率的FFPE参考品。
可选的，步骤(4)中，具体的方法包括：
A、细胞的固定；
B、细胞团的制备；
C、细胞团的脱水；
D、细胞的包埋与切片。
在本发明的一个或多个实施方式中，步骤A中，采用福尔马林溶液对细胞进行固定。
在本发明的一个或多个实施方式中，步骤B中，固定后的细胞悬液与琼脂糖凝胶按照设定比例混合。
在本发明的一个或多个实施方式中，步骤C中，制备好的细胞团使用脱水机进行脱水或手工脱水。
在本发明的一个或多个实施方式中，步骤D中，细胞团采用常规的脱水程序脱水，细胞团经脱水后，放入包埋模具中，采用包埋机，进行包埋；然后对包埋好的蜡块进行切片，FFPE切片厚度为3-30μm；优选地，FFPE切片厚度为15μm。
对培养的基因编辑的细胞进行福尔马林固定石蜡包埋，可以很好的模拟临床样本的情况。
本发明实施例第二方面提供了一种采用上述方法制备得到的石蜡包埋参考品。
本发明实施例第三方面提供了所述石蜡包埋参考品在实验室室内质控和/或室间质评的应用。
可选的，所述石蜡包埋参考品在实验室室内质控和/或室间质评和/或制备基因突变检测试剂盒或质控品中的应用。
可选的，所述基因包括但不仅仅限于肿瘤基因，所述肿瘤基因包括但不限于EGFR、KRAS、NRAS、BRAF、HER2、ALK等。
在本发明实施例第四方面提供了一种用于基因检测试剂盒，所述试剂盒包括所述石蜡包埋参考品。
在本发明实施例第五方面提供了所述基因突变检测试剂盒在基因检测中的应用。
与本发明人知晓的相关技术相比，本发明其中的一个技术方案具有如下有益效果：
本发明实施例提供的技术方案中，使用商业化的细胞作为野生型，可以长期稳定获得，而现有技术中使用的是临床样本，无法稳定获得，因此相对于现有技术，本发明实施例中用以基因突变检测的石蜡包埋参考品可以无限扩大培养，以及可以大规模的稳定生产。
本发明实施例提供的技术方案中，在野生型细胞系基础上，通过基因编辑可以获得大部分目标位点突变的细胞系，而现有技术受临床样本可获得性的限制，难以获得大部分目标位点。
本发明实施例提供的技术方案中，利用细胞单克隆技术，获取含有目标突变，遗传稳定的单克隆细胞系，而现有技术采用临床样本，存在异质性强的问题，突变频率不稳定。
本发明实施例提供的技术方案中，将突变细胞系与野生型细胞系按照不同比例混合，制备成FFPE蜡块，得到含有不同突变频率(从0％-100％)的FFPE参考品，而现有技术中的临床样本的基因突变频率不能根据需要进行改变。
本发明实施例提供的技术方案中，采用数字PCR，对FFPE中的突变频率进行精确定量。
附图说明
构成本发明一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中的经基因编辑的单克隆细胞株的Sanger测序结果。
图2为本发明实施例2中的50％EGFR T790M FFPE蜡块切片的HE染色图片。
图3为本发明实施例3中的FFPE蜡块不同位置蜡片的DNA提取量。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
术语解释：
野生型(Wild Type)：野生型和突变型是相对来说的，在目前的研究中把从大自然中获得的个体，也就是非人工诱变的，作为野生型，那么它所携带的就是野生型的基因组。
突变型(Mutant Type)：突变型是相对野生型来说的，即在野生型的遗传背景下，对特定基因的特定位点进行特定的突变而获得的细胞个体。作为突变型，那么它所携带的就是突变型的基因组。
等位基因突变频率(Allele Frequency，AF)：对于某个特定位点而言，突变基因型占总的基因型的比例。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1石蜡包埋AF梯度参考品的制备
(1)含有特定突变位点的细胞系的获得
a、选择商业化的细胞系作为背景细胞系。在本实施例中，选择GM12878细胞系作为背景细胞系(野生型)。
b、对目标基因的目标位点进行基因编辑。
在本实施例中，对表1中的目标基因位点进行基因编辑。对这些目标位点进行基因编辑的sgRNA序列如表1所示。
表1目标基因位点
| 目标位点 | sgRNA序列 |
| EGFR G719A | AAAGATCAAAGTGCTGGCTC |
| EGFR T790M | GAGCTGCGTGATGAGCTGCA |
| EGFR L861Q | CTCTTCCGCACCCAGCAGTT |
| KRAS G12C | GAATATAAACTTGTGGTAGT |
| BRAF V600E | TAGCTACAGTGAAATCTCGA |
c、采用单克隆技术获得遗传稳定的单克隆细胞株。具体方法是：待细胞的汇合度达到70％-90％时，消化并收集细胞。对细胞准确计数，按照倍比稀释的方法，用培养基将活细胞稀释至5个/mL，并将细胞混匀。取10mL细胞悬液，均匀分到一块96孔板中。待细胞克隆形成时，即获得单克隆细胞株。
d、采用Sanger测序对上述基因编辑的单克隆细胞株进行突变位点确认，筛选出具有目标基因位点突变的单克隆细胞株。用于鉴定单克隆细胞株的Sanger测序引物如表2所示。
表2用于鉴定单克隆细胞株的Sanger测序引物
| 目标位点 | 鉴定引物F(5’-3’) | 鉴定引物R(5’-3’) |
| EGFR G719A | AATAGGCGTGGAAACAGACATAG | GCCTTTGGTCTGTGAATTGGT |
| EGFR T790M | TTTGCAGGCACAGCTTTTCC | ATGTGAGGATCCTGGCTCCT |
| EGFR L861Q | CCTGGCATGAACATGACCCT | CATCCTCCCCTGCATGTGTT |
| KRAS G12C | GCTGTATCGTCAAGGCACTCT | GCAGAACAGCAGTCTGGCTA |
| BRAF V600E | TCAAACTGATGGGACCCACT | TCCTAACACATTTCAAGCCCCA |
图1是本实施例中基因编辑的单克隆细胞株的Sanger测序结果，确认基因编辑的单克隆细胞株携带所述特定基因位点突变。
e、采用BioRad QX200数字PCR平台对上述基因编辑的单克隆细胞株进行等位基因突变频率(AF)确定。结果如表3所示。
表3通过数字PCR确定的等位基因突变频率
| 目标基因位点 | 突变频率 |
| EGFR G719A | 50％ |
| EGFR T790M | 50％ |
| EGFR L861Q | 50％ |
| KRAS G12C | 50％ |
| BRAF V600E | 50％ |
(2)梯度参考品的设计：对于一个特定的基因突变位点而言，将野生型细胞和突变型细胞按照一定比例混合，可以得到不同AF的石蜡参考品。每种AF的石蜡参考品需要的细胞总数为100×106个。例如，可设计EGFR T790M位点AF分别为0％、1％、2％、5％、10％、50％的AF梯度参考品。例如，针对特定的EGFR T790M，1％AF的参考品是将数量比例为1:99的EGFR T790M突变型细胞和野生型细胞进行混合。
(3)细胞培养、收集和混合：
按照上述细胞需求数目，采用FBS培养基培养上述细胞，培养结束后离心收集细胞，然后对细胞进行计数；根据设计需求，按照设计好的比例和细胞数量将2种细胞进行混合。
(4)细胞的固定：用福尔马林溶液对细胞进行固定。固定时间为30min。细胞固定后，用70％(v/v)的乙醇重悬细胞，洗去残留的福尔马林溶液。
(5)细胞团的制备：将上述固定好的细胞悬液与等体积的琼脂糖凝胶溶液混合、固定成型。
(6)细胞团的脱水：使用Leica全自动脱水机进行脱水处理。
(7)细胞的包埋与切片：细胞团经脱水后，放入包埋模具中，采用徕卡HistoCoreArcadia H+C包埋机，进行包埋。包埋以后，蜡块放置于4℃环境下冷藏8h。包埋好的蜡块放置于徕卡RM2255石蜡切片机上，进行切片，FFPE切片厚度为15μm。即获得福尔马林固定石蜡包埋参考品。
实施例2用HE染色的方法对切片进行染色观察细胞包埋的均一性
采用实施例1的方法制备得到AF为50％EGFR T790M FFPE蜡块，从50％EGFR T790MFFPE蜡块随机取不同部位的蜡片进行HE染色，观察细胞包埋均一性。结果如图2所示，显示细胞分散均一性良好。
实施例3石蜡包埋参考品的蜡片DNA提取量检测
采用实施例1的方法制备得到AF为10％的EGFR T790M FFPE蜡块，从AF为10％的EGFR T790M FFPE蜡块随机取不同部位的蜡片，采用FFPE核酸提取试剂盒16FFPE plus LEV Purification Kit(Promega)进行FFPE切片DNA的提取，提取方法和具体步骤参照FFPE核酸提取试剂盒中的说明书。每片蜡片DNA提取量如图3所示，显示DNA提取量均大于400ng。
实施例4石蜡包埋参考品的AF检测
采用实施例1的方法制备得到的6种不同AF梯度的EGFR T790M的FFPE参考品。随机抽取蜡片，采用BioRad QX200数字PCR平台对突变频率进行确认，结果如表4，结果显示实测AF都符合预期，且在一定的范围内波动，不同切片位置的AF相对稳定，表明采用实施例1的方法制备的FFPE参考品符合设定的要求。
表4不同蜡片的AF
实施例5采用三批次生产进行批次间的稳定性测试
AF为10％EGFR T790M FFPE参考品按照实施例1中的方法进行三批次生产，对每批次的蜡块随机取5片蜡片进行DNA提取，并BioRad QX200数字PCR对突变频率进行确认。结果如表5。
表5不同批次蜡片的突变频率
结果显示实测AF都符合预期，并在质检要求范围内；同批次随机抽取不同位置的蜡片间的AF相对稳定，不同批次间蜡块的AF也相对稳定。说明三批次10％EGFR T790M FFPE参考品的制备工艺稳定，参考品的性能稳定。结果表明，采用实施例1的方法，可以长期稳定地制备FFPE参考品。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种石蜡包埋参考品的制备方法，其特征是，该方法包括以下步骤：
含有特定突变位点的细胞系的获得：
a、对背景细胞系目标基因的目标位点进行基因编辑，所述背景细胞系为从供应商购买得到商业化细胞系；
b、挑选遗传稳定的单克隆细胞株；
c、筛选出具有目标基因位点突变的单克隆细胞株；
d、对所述具有目标基因位点突变和遗传稳定的单克隆细胞株进行等位基因突变频率(AF)的确定；
任意AF的目标位点参考品的设计；
细胞的培养、收集，对于一个设定的目标基因突变位点而言，将突变型细胞系和野生型细胞系按照设定数量[X:(100-X)]比例混合，从而获得AF为X％的目标突变的参考品；
细胞石蜡包埋处理；
即可获得石蜡包埋参考品。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，在含有特定突变位点的细胞系的获得a步骤中，所述背景细胞系包括GM12878、A549、SW48、LS180、HCT116、BT-474、Hs-746T；
在含有特定突变位点的细胞系的获得a步骤中，采用基因编辑的方法，获得目标基因的不同位点的突变；
在含有特定突变位点的细胞系的获得a步骤中，目标基因包括肿瘤基因，所述肿瘤基因包括EGFR、KRAS、NRAS、BRAF、HER2、ALK、RB、TP53、PTEN、KIT、PDGFRA；
在含有特定突变位点的细胞系的获得b步骤中，采用单克隆技术筛选出遗传稳定的单克隆细胞株；
在含有特定突变位点的细胞系的获得c步骤，采用Sanger测序对步骤b中的单克隆细胞株进行突变位点确认；
在含有特定突变位点的细胞系的获得d步骤中，采用数字PCR平台对所述具有目标基因突变和遗传稳定的单克隆细胞株进行AF确定。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，在任意AF的目标位点参考品的设计步骤中，设计0％、1％、2％、5％、10％、50％的AF的目标位点的参考品；将目标位点的多个不同AF的参考品组合在一起，设计成目标位点的AF梯度参考品。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，在细胞的培养、收集步骤中，培养突变型细胞和/或野生型细胞，收集细胞，对细胞进行计数，根据目标基因参考品的设计中的设计方案，将不同数量比例的野生型细胞和突变型细胞混合。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，在细胞石蜡包埋处理步骤中，以石蜡作为包埋剂，进行包埋、切片，即可获得石蜡包埋参考品；
具体的方法包括：
A、细胞的固定；
B、细胞团的制备；
C、细胞团的脱水；
D、细胞的包埋与切片。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是，步骤A中，采用福尔马林溶液对细胞进行固定；
步骤B中，固定后的细胞悬液与琼脂糖凝胶按照设定比例混合；
步骤C中，使用脱水机进行脱水或手工脱水；
步骤D中，细胞团经脱水后，放入包埋模具中，采用包埋机，进行包埋；然后对包埋好的蜡块进行切片，FFPE切片厚度为3-30μm。
7.一种采用权利要求1～6中任一项所述的方法制备得到的石蜡包埋参考品。
8.权利要求7所述的石蜡包埋参考品在制备基因检测试剂盒和/或实验室日常质控品和/或室间质评中的应用。
9.一种基因检测试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括权利要求7所述的石蜡包埋参考品。
10.权利要求9所述的基因检测试剂盒在基因检测中的应用。
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