CN108728516B - 一种肿瘤样品测序参考品的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种肿瘤样品测序参考品的制备方法，属于高通量测序技术领域，所述方法包括以下步骤：对肿瘤细胞系进行单克隆培养获得单克隆细胞系并提取全基因组；测定等位基因频率测定；根据等位基因突变频率与目标等位基因突变频率确定稀释倍数；用阴性细胞倍比稀释所述单克隆细胞系获得混合细胞；提取混合细胞的全基因组，测定等位基因突变频率；根据混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率比较，细化倍比稀释的倍数，用阴性细胞稀释所述单克隆细胞系获得参考品。本发明所述方法采用对细胞株单克隆结合高通量测序确定细胞系的基因背景；使用多步骤逐步细化的倍比稀释法结合流式细胞仪对细胞精确计数，保证参考品制备的高度可重复性。

Description

一种肿瘤样品测序参考品的制备方法

技术领域

本发明属于高通量测序技术领域，尤其涉及一种肿瘤样品测序参考品的制备方法。

背景技术

高通量测序不仅能够明确判断与疾病相关的基因是否发生变异而且能够提供更多量化的信息，在临床诊断应用上日益被人们所接受。但高通量测序技术的临床应用仍然具有一定的挑战性，其中诊断错误率高就是一个主要的问题，为了降低诊断错误率，人们在测序机器性能的升级、实验方案的设计和生信分析流程等几方面进行了不断的努力，但是目前高通量测序的诊断错误率仍然较高。

造成这个现象的重要原因之一：测序过程中所用参考品的质量不足以满足临床检测的要求，这一原因往往被忽视，由于缺乏高质量的参考品从而导致不同检测实验室、不同操作人员、不同测序平台之间的结果无法进行科学系统的比较。高质量的参考品可以更好的解决这些问题，它可以标准化基因组的定性和定量参数，提高临床诊断的准确性、可靠性和标准化，降低诊断错误率，使测序数据能够提供准确且有诊断价值的结果。

一个合格的参考品需要对参考品量化、参考品的等位基因频率和肿瘤相关突变情况有明确的数据；另外对于特定测序项目还需要做到能涵括所要检测的变异类型，突变位点的具体频率等信息。只有做到以上这些要求，才能做到对每次测序检测的准确性和稳定性进行评估。简而言之，测序参考品需要突变信息精确定义、精准量化，并且保证高度稳定。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种操作简便且准确的肿瘤样品高通量测序参考品的制备方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种肿瘤样品测序参考品的制备方法，包括以下步骤：1)对肿瘤细胞系进行单克隆培养获得单克隆细胞系；2)提取所述单克隆细胞系的全基因组；3)利用高通量测序对所述单克隆细胞系的全基因组进行等位基因频率测定获得等位基因突变频率；4)根据步骤3)中获得的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率确定对单克隆细胞系的稀释倍数；5)胰酶消化所述单克隆细胞系后，用流式细胞仪计数获得单克隆细胞系的细胞浓度，以细胞数计，用相应数量的等位基因突变频率为0的阴性细胞按照步骤4)中确定的稀释倍数稀释所述单克隆细胞系获得混合细胞；6)提取步骤5)中所述混合细胞的全基因组，利用高通量测序对所述混合细胞的全基因组进行等位基因测定获得混合细胞的等位基因突变频率；7)将步骤6)中获得的混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率比较，如混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率一致，则按照步骤4)中的稀释倍数，用阴性细胞稀释所述单克隆细胞系获得参考品；若混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率不一致，则细化倍比稀释的倍数；重复步骤5)和6)，直到混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率一致，按照此时的稀释倍数，用阴性细胞稀释所述单克隆细胞系获得参考品。

优选的，所述肿瘤细胞系包括NCI-H1650，NCI-H1975，NCI-H23，NCI-H2087，HCT-15，LS 174T，SW1417或SW48。

优选的，步骤1)获得单克隆细胞系后还包括筛选步骤；所述筛选为提取单克隆细胞系的全基因组，进行3～5次高通量测序获得3～5个等位基因突变频率，筛选等位基因突变频率稳定的单克隆细胞系。

优选的，步骤4)中所述稀释倍数为1.5～2.5倍。

优选的，步骤5)中所述阴性细胞为Hela细胞。

优选的，所述高通量测序采用达安基因的个人化操作基因组测序仪PGMTM。

优选的，所述目标等位基因突变频率为确定肿瘤样品测序检测限所需等位基因突变频率或肿瘤样品测序的阳性质控品所需等位基因突变频率。

优选的，所述目标等位基因突变频率为1％、2％、5％或15％。

优选的，步骤7)获得参考品后还包括提取所述参考品的全基因组，将所述参考品的全基因组在2～4种不同测序平台进行高通量测序测定等位基因突变频率，筛选在不同测序平台测定的等位基因突变频率一致且稳定的参考品。

本发明的有益效果：本发明提供的肿瘤样品测序参考品的制备方法，对肿瘤细胞系进行单克隆培养，最大程度确保细胞系的基因背景清晰；使用高通量测序来对等位基因频率进行测定，在保证了基因背景的清晰的前提下，还能确保本参考品可以应用高通量测序平台上。

本发明采用细胞流式仪计数是保证计数精准、确保后续倍比稀释稳定性和放大大规模生产时的规范性。

进一步的，本发明首次倍比梯度稀释初始采用1.5～2.5倍的倍比稀释系数对于初步确定等位基因频率为1％，2％，5％和15％的稀释范围较为理想，并且为后续的进一步细化倍比稀释提供参考；

本发明中，以细胞数计，先混合细胞进行倍比稀释后，再提取基因组，而不采用先分别提取基因组后混合，重复型好，能够最大程度减少量化的客观性，减少人为引入影响因素。

本发明中细化倍比稀释参数可根据不同情况进行调整，一般考虑接近1％，2％，5％和15％的一侧进行调整；

进一步的，本发明采用不同高通量测序平台检测，考虑目前市面的高通量测序平台较多，故而需在不同测序平台上对参考品的重要参数加以确认。

具体实施方式

本发明提供一种肿瘤样品测序参考品的制备方法，包括以下步骤：1)对肿瘤细胞系进行单克隆培养获得单克隆细胞系；2)提取所述单克隆细胞系的全基因组；3)利用高通量测序对所述单克隆细胞系的全基因组进行等位基因频率测定获得等位基因突变频率；4)根据步骤3)中获得的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率确定稀释倍数；5)胰酶消化所述单克隆细胞系后，用流式细胞仪计数获得单克隆细胞系的细胞浓度，以细胞数计，用相应数量的等位基因突变频率为0的阴性细胞倍比稀释所述单克隆细胞系获得混合细胞；6)提取步骤5)中所述混合细胞的全基因组，利用高通量测序对所述混合细胞的全基因组进行等位基因测定获得混合细胞的等位基因突变频率；7)将步骤6)中获得的混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率比较，如混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率一致，则按照步骤4)中的稀释倍数，用阴性细胞稀释所述单克隆细胞系获得参考品；若混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率不一致，则细化倍比稀释的倍数；重复步骤5)和6)，直到混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率一致，按照此时的稀释倍数，用阴性细胞稀释所述单克隆细胞系获得参考品。

在本发明中，所述所述肿瘤细胞系优选为对临床检测具有明确的参考意义的具有肿瘤热点突变的细胞系；在本发明中，所述肿瘤细胞系优选的包括NCI-H1650，NCI-H1975，NCI-H23，NCI-H2087，HCT-15，LS 174T，SW1417或SW48；本发明中上述肿瘤细胞系优选的来源于美国模式菌种收集中心ATCC；本发明上述8个肿瘤细胞系涵括了肺癌热点突变的5个基因，9个外显子，并且包含了肺癌常见热点突变类型。

本发明对所述对肿瘤细胞系进行单克隆培养获得单克隆细胞系。在本发明中，所述单克隆培养的方法优选的包括以下步骤：将所述肿瘤细胞计数后，分到96孔板里，确保每个孔道中细胞个数为0.5，从而使得一部分孔道中出现单个细胞，部分孔道中无细胞；培养上述细胞，获得单克隆细胞培养系。本发明在获得所述单克隆细胞培养系后，还包括筛选步骤；所述筛选为提取单克隆细胞系的全基因组，进行3～5次高通量测序获得3～5个等位基因突变频率，筛选等位基因突变频率稳定的单克隆细胞系。

本发明在获得所述单克隆细胞系后，提取所述单克隆细胞系的全基因组。在本发明中，所述全基因组提取优选的采用全基因组提取试剂盒实现；在本发明具体实施过程中，采用德国QIAGEN公司的核酸提取试剂盒(名称：QIAamp DNAMini Kit货号：CatNo./ID:51306)。

本发明在获得所述单克隆细胞系的全基因组后，利用高通量测序对所述单克隆细胞系的全基因组进行等位基因频率测定获得等位基因突变频率。在本发明中所述高通量测序优选的采用达安基因的个人化操作基因组测序仪PGMTM。在本发明中，所述等位基因突变频率的测定优选的通过达安基因的个人化操作基因组测序仪PGMTM高通量测序平台结合Thermo的Oncomine Solid Tumor DNApanel实现，在本发明中，所述等位基因突变频率的测定优选的还借助生信分析，本发明中所述生信分析为常规生信分析，结合测序仪器配套的软件进行生物信息学自动分析，最终得到等位基因频率。在本发明中，每个样品优选的单独构建文库并重复测序三次，测序结果完全一致情况下，对等位基因突变频率进行确认。

本发明在获得等位基因突变频率后，根据所述等位基因突变频率与目标等位基因突变频率确定稀释倍数。在本发明中，所述目标等位基因突变频率为确定肿瘤样品测序检测限所需等位基因突变频率或肿瘤样品测序的阳性质控品所需等位基因突变频率。本发明中，所述检测限优选为2％；所述肿瘤样品测序需要在检测限上下个设定一个等位基因突变频率，优选为1％、和5％。在本发明中，所述阳性质控品所需等位基因突变频率优选为15％。在本发明中，所述稀释倍数优选为1.5～2.5倍，更优选为2倍。

本发明在确定稀释倍数后，胰酶消化所述单克隆细胞系，用流式细胞仪计数获得单克隆细胞系的细胞浓度，以细胞数计，用相应数量的等位基因突变频率为0的阴性细胞倍比稀释所述单克隆细胞系获得混合细胞。在本发明中，所述单克隆细胞系的培养物贴壁生长，经胰酶消化后，细胞间蛋白被分解，细胞分散为一个个的单个细胞。本发明中所述胰酶消化的温度优选为37℃，本发明中，所述胰酶消化的时间，以观察到贴壁生长的细胞出现大面积脱落为宜。本发明在所述胰酶消化后，优选的用PBS缓冲液清洗细胞去除细胞碎片和其他杂质；本发明中，所述清洗细胞的次数优选为1～4次，更优选为2～3次；在本发明中，所述清洗细胞具体为向胰酶消化后的细胞培养物中加入PBS缓冲液进行吹吸后离心，所述离心的离心力优选为450～550rpg，所述离心的时间优选为4～6min，本发明在所述离心后弃上清，收集细胞。本发明在清洗细胞后，用流式细胞仪计数获得单克隆细胞系的细胞浓度，以细胞数计，用相应数量的等位基因突变频率为0的阴性细胞倍比稀释所述单克隆细胞系获得混合细胞。在本发明中，所述阴性细胞优选为Hela细胞。本发明中，所述流式细胞仪计数、单克隆细胞系与阴性细胞混合全程优选的在2小时内完成。

本发明在获得混合细胞后，提取所述混合细胞的全基因组，利用高通量测序对所述混合细胞的全基因组进行等位基因测定获得混合细胞的等位基因突变频率。在本发明中，提取所述混合细胞全基因组和高通量测序测定等位基因的方法与前述单克隆细胞系的全基因组提取和高通量测序测定等位基因品率的方法一致，在此不再赘述。

本发明在获得混合细胞等位基因突变频率后，将获得的混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率比较，如混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率一致，则按照上述稀释倍数，用阴性细胞稀释所述单克隆细胞系获得参考品；若混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率不一致，则细化倍比稀释的倍数；重复步骤5)和6)，直到混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率一致，按照此时的稀释倍数，用阴性细胞稀释所述单克隆细胞系获得参考品。在本发明中，所述混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率一致中的“一致”允许存在偏差的范围为1‰～1％。在本发明中，所述细化倍比稀释的倍数优选为1.1～1.5。

本发明在获得参考品后还包括提取所述参考品的全基因组，将所述参考品的全基因组在2～4种不同测序平台进行高通量测序测定等位基因突变频率，筛选在不同测序平台测定的等位基因突变频率一致且稳定的参考品。本发明的上述步骤考虑到测序市场上测序平台的多样性，故而需在不同测序平台上对参考品的重要参数加以确认，增加参考品的普适性。

下面结合实施例对本发明提供的一种肿瘤样品测序参考品的制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种使用细胞系制作肺癌高通量测序参考品的新方法，其包括以下步骤：

1)对购买于美国模式菌种收集中心(ATCC)的细胞系进行单克隆培养筛选，所涉及8种细胞系如下：NCI-H1650，NCI-H1975，NCI-H23，NCI-H2087，HCT-15，LS 174T，SW1417，SW48；细胞系的单克隆筛选采用稀释培养方案，具体如下：细胞计数后分到96孔板里，保证每个孔道中细胞数为0.5，这使得一部分孔中出现单个细胞，对这些进行细胞培养扩增；最后确定单克隆的标准为对培养扩增的细胞进行抽提基因组为模板，进行高通量文库构建，测试其等位基因频率，多次测试频率稳定者为筛选合格的细胞系。

2)对筛选后的肿瘤细胞系进行全基因组提取，采用德国QIAGEN公司的核酸提取试剂盒(名称：QIAamp DNAMini Kit货号：CatNo./ID:51306)进行细胞基因组抽提。

3)使用达安基因的个人化操作基因组测序仪(PGMTM)高通量测序平台结合Thermo的Oncomine Solid Tumor DNApanel对提取的各种肿瘤细胞系的基因组进行等位基因突变频率(allelic frequency)进行测定，从而明确细胞株的基因背景，上述8种细胞的变异位点、cosmicID、变异位点所在外显子和等位基因突变频率结果见表1。

表1细胞系相关信息

4)对贴壁培养的单克隆细胞系进行胰酶37℃消化，当观察到细胞出现大面积脱落时，加入PBS进行吹吸后取出置于15ml离心管中，离心机500rpg进行常温离心5min，弃上清；经过PBS 2轮清洗去除细胞碎片和其他杂质后，使用细胞流式仪进行计数，计数后马上将应取用细胞数换算为对应体积后进行取样混合，全程需在2小时内完成。

5)第一轮倍比梯度稀释使用2倍倍比系数进行混合，其中上述8种肿瘤细胞株为阳性细胞株，不含目标突变位点的Hela细胞为阴性细胞。

6)对混合细胞基因组进行基因组抽提；

7)使用达安基因的个人化操作基因组测序仪(PGMTM)高通量测序平台结合Thermo的Oncomine Solid Tumor DNApanel对提取的各种肿瘤细胞系的基因组进行对混合细胞进行突变频率测定并进行生信分析确定混合细胞基因组中突变位点的突变频率；

8)根据参考品所需突变频率结合对第一轮中结果进行分析，如用于确定检测限所需的5％、2％和1％的突变频率的参考品，而对于建库试剂盒所需的阳性质控品则采用15％的参考品；分析后确定目标突变频率所在的稀释区间，对稀释区间内进行倍比系数细化(如1.3倍，1.4倍)进行细化的倍比稀释，重复5-7步进行混合和频率测定。高通量测序所述参考品目录见表2。

表2高通量测序文库构建试剂盒的各项试剂盒性能评估所需参考品目录

9)如果第二轮不能得到1％，2％，5％和15％的突变频率细胞混合，则还需进行第三轮倍比梯度稀释的细化；

10)测序数据结合步骤5、6、7、8、9中的稀释数据进行分析，确定各种参考品的具体配制方法。

11)按照步骤10)中确定的方案，进行大规模细胞培养，混合，提取基因组。

12)对步骤11)中提取的基因组进行2种不同测序平台并重复三次以上，突变频率测定一致且稳定，则进行标准品的分装记录。

本发明中，对于制备用参考品用细胞株选择上采用对细胞株单克隆筛选并结合高通量测序反复进行高通量测序以确定细胞株的基因背景；使用多步骤逐步细化的倍比梯度稀释法结合细胞流式仪对细胞进行精确计数以保证参考品制备的高度可重复性。

通过步骤1、2、3来完成对肿瘤细胞株的筛选，在对细胞系继续进行单克隆培养筛选，以保证细胞等位基因频率的确定性，对于经过单克隆培养的细胞株等位基因频率仍在较大区间波动的细胞株定位基因背景不明确，从而排除出候选细胞株。

步骤3中对于细胞株的等位基因频率的测定采用目前市场上接受程度较高的Thermo的Oncomine Solid Tumor DNApanel进行文库构建并在达安基因的个人化操作基因组测序仪(PGMTM)进行测序，结合仪器配套的软件进行生物信息学自动分析，最终得到等位基因频率，每个样品需单独建库并重复测序三次，完全一致情况下，方能对等位基因频率进行确认。

步骤5-9中倍比梯度稀释是为了获取具体稀释系数所不可或缺的部分，也是本发明中确认为使用肿瘤细胞株制备肺癌高通量测序参考品最为高效的方法，本发明中具体分步如下：第一轮倍比梯度稀释采用2倍为稀释参数，经测序结果分析确认1％，2％，5％和15％的所在区间后进行第二轮；在第二轮稀释中，设1.5为稀释参数进行细化，同样测序后根据测序结果确认1％，2％，5％和15％的所在区间，如果出现小数点第三位较为接近则认为获取到了理想稀释条件，否则进行下一轮摸索。

步骤10中突变频率最接近1％，2％，5％和15％的稀释方案的最终确认条件为出现小数点第二位一致即认为获取到了理想稀释条件，否则进行下一轮摸索。

本实施例中各个细胞系具体的倍比稀释方案和稀释后的突变频率如表3所示。

表3.各个细胞系具体的倍比稀释方案和稀释后的突变频率

综上所述，本发明引入高通量测序对细胞株等位基因频率进行测定，并结合细胞流式仪全程对细胞精确计数来保证制备肿瘤高通量测序参考品的高度稳定性；同时创新性对细胞采用分步倍比稀释不断细化倍比系数，简单、高效、快捷地确认最接近1％，2％,5％和15％的的突变频率的稀释条件。从而在现有的常规实验室技术平台上实现了使用肿瘤细胞株制备出高精度定性定量的肿瘤高通量测序参考品。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种肿瘤样品测序参考品的制备方法，包括以下步骤：

1)对肿瘤细胞系进行单克隆培养，获得单克隆细胞系；

2)提取所述单克隆细胞系的全基因组，并进行筛选：提取单克隆细胞系的全基因组，进行3-5次高通量测序获得3-5个等位基因突变频率，筛选等位基因突变频率稳定的单克隆细胞系；

3)利用高通量测序对所述单克隆细胞系的全基因组进行等位基因频率测定，获得等位基因突变频率；

4)根据步骤3)中获得的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率，确定对单克隆细胞系的稀释倍数；

5)胰酶消化所述单克隆细胞系后，用流式细胞仪计数获得单克隆细胞系的细胞浓度，以细胞数计，用相应数量的等位基因突变频率为0的阴性细胞按照步骤4)中确定的倍数稀释所述单克隆细胞系，获得混合细胞；

6)提取步骤5)中所述混合细胞的全基因组，利用高通量测序对所述混合细胞的全基因组进行等位基因测定，获得混合细胞的等位基因突变频率；

7)将步骤6)中获得的混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率比较，如混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率一致，则按照步骤4)中的稀释倍数，用阴性细胞稀释所述单克隆细胞系获得参考品；若混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率不一致，则细化稀释的倍数；重复步骤5)和6)，直到混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率一致，按照此时的稀释倍数，用阴性细胞稀释所述单克隆细胞系获得参考品；

提取所述参考品的全基因组，将所述参考品的全基因组在2～4种不同测序平台进行高通量测序测定等位基因突变频率，筛选在不同测序平台测定的等位基因突变频率一致且稳定的参考品。

2.根据权利要求1所述肿瘤样品测序参考品的制备方法，其特征在于，所述肿瘤细胞系包括NCI-H1650，NCI-H1975，NCI-H23，NCI-H2087，HCT-15，LS 174T，SW1417或SW48。

3.根据权利要求1所述肿瘤样品测序参考品的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述稀释倍数为1.5～2.5倍。

4.根据权利要求1所述肿瘤样品测序参考品的制备方法，其特征在于，步骤5)中所述阴性细胞为Hela细胞。

5.根据权利要求1或3所述肿瘤样品测序参考品的制备方法，其特征在于，所述高通量测序采用达安基因的个人化操作基因组测序仪PGMTM。

6.根据权利要求1所述肿瘤样品测序参考品的制备方法，其特征在于，所述目标等位基因突变频率为确定肿瘤样品测序检测限所需等位基因突变频率或肿瘤样品测序的阳性质控品所需等位基因突变频率。

7.根据权利要求6所述肿瘤样品测序参考品的制备方法，其特征在于，所述目标等位基因突变频率为1％、2％、5％或15％。