CN107345253A - 肺癌临床用药基因检测标准品及其应用 - Google Patents

肺癌临床用药基因检测标准品及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肺癌临床用药基因检测标准品及其应用。其中，该肺癌临床用药基因检测标准品包括：最低检出限参考品，最低检出限参考品至少包括两个不同级别的变异频率的DNA混合物，每个级别的变异频率的DNA混合物包括以下突变位点：EGFR基因G719S、E746_A750del、S768I、T790M、L858R突变位点；EML4‑ALK基因E6；E20和E13；E20突变位点；SLC34A2‑ROS1基因E4；E32突变位点。应用本发明的技术方案，根据结果可以判断该试剂盒能够检出基因突变及基因频次，验证现有试剂盒检测结果的准确性，也为临床用药提供更准确的指导。

Description

肺癌临床用药基因检测标准品及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种肺癌临床用药基因检测标准品及其应用。
背景技术
靶向治疗，是在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点(该位点可以是肿瘤细胞内部的一个蛋白分子，也可以是一个基因片段)，来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特意地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞，所以分子靶向治疗又被称为“生物导弹”。靶向治疗是指以标准化的生物标记物来识别是否存在某种疾病特定的控制肿瘤生长的基因或基因谱，以此确定针对特异性靶点的治疗方法。
但是，由于与肿瘤或癌症相关的基因突变在不同的个体中是不同的，对于不同的基因或不同的位点突变，其对于某种药物的敏感性是不同的，也就是说某些患者可能对某种药物存在天然的耐药性。另外，在靶向治疗的过程，肿瘤有可能产生其他位点的基因突变，而抑制靶向药物的治疗作用，产生获得性耐药性。而耐药性一旦产生，继续用已经不具备治疗的作用的靶向药物，对患者无任何好处，还会增加副作用。为了更好的指导临床用药，需要对患者的基因突变位点进行检测。
市场上已经有很多基因突变位点的检测试剂盒，但是，其检测结果均可能出现假阳性或假阴性，目前并无统一的标准对其进行验证或检测。
发明内容
本发明旨在提供一种肺癌临床用药基因检测标准品及其应用，以解决现有技术中肺癌临床用药基因检测试剂盒的检测灵敏度无法进行标准化评估的技术问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种肺癌临床用药基因检测标准品。该肺癌临床用药基因检测标准品包括：最低检出限参考品，最低检出限参考品至少包括两个不同级别的变异频率的DNA混合物，每个级别的变异频率的DNA混合物包括以下表1所示的突变位点：
表1
进一步地，最低检出限参考品包括L1级别的变异频率的DNA混合物和L2级别的变异频率的DNA混合物，其中，L1级别的变异频率的DNA混合物中，各突变位点的变异频率在2.1～4.6％之间，L2级别的变异频率的DNA混合物中，各突变位点的变异频率在0.9～2.5％之间。
进一步地，L1级别的变异频率的DNA混合物和L2级别的变异频率的DNA混合物中，各突变位点的变异频率如下表2所示：
表2
进一步地，肺癌临床用药基因检测标准品还包括L3级别的变异频率的DNA混合物，L3级别的变异频率的DNA混合物中各突变位点的变异频率在0.5～1.4％；优选的，L3级别的变异频率的DNA混合物中各突变位点的变异频率如表3所示：
表3
进一步地，肺癌临床用药基因检测标准品还包括L4级别的变异频率的DNA混合物，L4级别的变异频率的DNA混合物中各突变位点的变异频率在0.09～0.39％；优选的，L4级别的变异频率的DNA混合物中各突变位点的变异频率如表4所示：
表4
进一步地，每个级别的变异频率的DNA混合物的浓度均为5ng/μL。
进一步地，最低检出限参考品中的DNA混合物包括肿瘤细胞系的DNA；优选采用的肿瘤细胞系包括PC-9细胞系、NCI-H1975细胞系、KYSE450细胞系、SW48细胞系、NCI-H2228细胞系、NCI-H3122细胞系以及HCC78细胞系；更优选地，肿瘤细胞系的DNA是通过采用BEAS-2B细胞系DNA进行突变频率稀释的。
进一步地，肺癌临床用药基因检测标准品还包括阴性参考品；优选的，阴性参考品为最低限检测参考品中的突变位点为阴性的DNA；更优选，阴性参考品中DNA的浓度为5ng/μL；更优选的，阴性参考品中DNA为细胞系DNA；
进一步优选，细胞系DNA为BEAS-2B细胞系DNA、AMO-1细胞系DNA、NCI-H596细胞系DNA和NCI-H929细胞系DNA。
进一步地，肺癌临床用药基因检测标准品还包括阳性参考品；优选的，阳性参考品为表1所示的突变位点的DNA混合物；更优选，阳性参考品中的DNA混合物中各突变位点的变异频率如表2的L1级别所示。
进一步地，肺癌临床用药基因检测标准品还包括至少两个级别的变异频率的重复性参考品；优选的，重复性参考品为表1所示的突变位点的DNA混合物；更优选，重复性参考品为表2所示的L1级别的变异频率的重复性参考品和L2级别的变异频率的重复性参考品。
根据本发明的另一方面，提供了一种肺癌临床用药基因检测标准品在检验肺癌基因检测试剂盒的检测灵敏度方面的应用。
应用本发明的技术方案，肺癌临床用药基因检测标准品中包括最低检出限参考品，所述最低检出限参考品至少包括两个不同级别的变异频率的DNA混合物，采用不同厂家的试剂盒检测该标准品，根据结果可以判断该试剂盒能够检出基因突变及基因频次，验证现有试剂盒检测结果的准确性，也为临床用药提供更准确的指导。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
针对现有技术中肺癌临床用药基因检测试剂盒的检测灵敏度无法进行标准化评估的技术问题。根据本发明一种典型的实施方式，提供一种肺癌临床用药基因检测标准品。该肺癌临床用药基因检测标准品包括：最低检出限参考品，最低检出限参考品至少包括两个不同级别的变异频率的DNA混合物，每个级别的变异频率的DNA混合物包括以下表1所示的突变位点：
表1
应用本发明的技术方案，肺癌临床用药基因检测标准品(本申请中也简称为标准品)中包括最低检出限参考品，所述最低检出限参考品至少包括两个不同级别的变异频率的DNA混合物，采用不同厂家的试剂盒检测该标准品，根据结果可以判断该试剂盒能够检出基因突变及基因频次，验证现有试剂盒检测结果的准确性，也为临床用药提供更准确的指导。
为了对能够检测不同变异频率的试剂盒进行更好的验证，最低检出限参考品中DNA混合物的变异频率级别可以根据实际情况进行调整。根据本发明一种典型的实施方式，最低检出限参考品包括L1级别的变异频率的DNA混合物和L2级别的变异频率的DNA混合物，其中，L1级别的变异频率的DNA混合物中，各突变位点的变异频率在2.1～4.6％之间，L2级别的变异频率的DNA混合物中，各突变位点的变异频率在0.9～2.5％之间。
优选的，L1级别的变异频率的DNA混合物和L2级别的变异频率的DNA混合物中，各突变位点的变异频率如下表2所示：
表2
理论上，作为标准品的同一级别的变异频率的DNA混合物中，各突变位点的变异频率最好一致，这样各突变位点在相同检测条件下被检出的概率就越接近，标准品检测结果就越可信。但在实际操作中，难以实现各突变位点的变异频率完全一致这一理想的状态。本申请经过无数次的实验验证，同一级别的变异频率的DNA混合物中，各突变位点的变异频率在上述范围内，也具有各突变位点在同样检测检测条件下都能被检出的优势。因而，将上述标准品用于检验各肺癌突变基因检测试剂盒的准确性和灵敏度，结果更可靠。
为了进一步提高该标准品对不同试剂盒的检测灵敏度，优选的，标准品还包括L3级别的变异频率的DNA混合物，L3级别的变异频率的DNA混合物中各突变位点的变异频率在0.5～1.4％；优选的，L3级别的变异频率的DNA混合物中各突变位点的变异频率如表3所示：
表3
上述标准品中，采用三个不同级别的变异频率的DNA混合物作为最低限检测参考品，能够将变异频率在0.5～1.4％的上述基因的突变都能检测到，进而能够进一步区分或验证某些检测灵敏度更低的检测试剂盒。例如，某些检测试剂盒的检测灵敏度仅能达到1％以上，当采用该试剂盒检测的样本中，目的基因的突变频率低于1％时，则可以确定是该试剂盒本身检测局限性导致，而非该样本为阴性。因而，不仅能够判断不同试剂盒的优劣，而且能够更准确地判断相应的检测结果，从而为临床用药提供更可靠的指导。
优选的，标准品还包括L4级别的变异频率的DNA混合物，L4级别的变异频率的DNA混合物中各突变位点的变异频率在0.09～0.39％；优选的，L4级别的变异频率的DNA混合物中各突变位点的变异频率如表4所示：
表4
更优选的，每个级别的变异频率的DNA混合物的浓度均为5ng/μL。将DNA混合物的浓度控制在该浓度范围内，能进一步确保各突变位点被检出。
根据本发明一种典型的实施方式，最低检出限参考品中的DNA混合物包括肿瘤细胞系的DNA；优选采用的肿瘤细胞系包括PC-9细胞系、NCI-H1975细胞系、KYSE450细胞系、SW48细胞系、NCI-H2228细胞系、NCI-H3122细胞系以及HCC78细胞系；更优选地，肿瘤细胞系的DNA是通过采用BEAS-2B细胞系DNA进行突变频率稀释的。上述各肿瘤细胞系均为市售产品。通过采用采用含有上述突变位点的细胞系的DNA来形成各级别的变异频率的DNA混合物，使得该标准品更接近于待检样品中DNA的真实存在状态，因而，检测结果也较合成的DNA更准确。
根据本发明一种典型的实施方式，肺癌临床用药基因检测标准品还包括阴性参考品；优选的，阴性参考品为最低限检测参考品中的突变位点为阴性的DNA；更优选，阴性参考品中DNA的浓度为5ng/μL；更优选的，阴性参考品中DNA为细胞系DNA，超声打断的产物；进一步优选，细胞系DNA为BEAS-2B细胞系DNA、AMO-1细胞系DNA、NCI-H596细胞系DNA和NCI-H929细胞系DNA。采用上述几种细胞系的DNA来形成本申请的阴性参考品具有使参考品的DNA存在状态与待检样本的DNA存在状态更接近的优势。
为了使本申请的标准品在使用时更便利，并进一步提高检验的准确性，根据本发明一种典型的实施方式，标准品还包括阳性参考品；优选的，阳性参考品为表1所示的突变位点的DNA混合物；更优选，阳性参考品中的DNA混合物中各突变位点的变异频率如表2的L1级别所示。其具体使用浓度也可以根据实际需要进行合理设置。
根据本发明一种典型的实施方式，标准品还包括至少两个级别的变异频率的重复性参考品；优选的，重复性参考品为表1所示的突变位点的DNA混合物；更优选，重复性参考品为表2所示的L1级别的变异频率的重复性参考品和L2级别的变异频率的重复性参考品。通过上述重复性参考品能够检验重复检验结果的准确性，是结果更可靠。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种如上述任一种标准品在检验肺癌基因检测试剂盒的检测灵敏度方面的应用。应用本申请的标准品，不但可以根据结果判断该试剂盒能够检出基因突变及基因频次，验证现有试剂盒检测结果的准确性，也为临床用药提供更准确的指导。
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
一、标准品的配制
(1)原料
从南京科佰生物科技有限公司购买7种肿瘤细胞系(PC-9、NCI-H1975、KYSE450、SW48、NCI-H2228、NCI-H3122、HCC78)作为肺癌用药基因检测试剂(可逆末端终止测序法)国家参考品的阳性参考品原料。从南京科佰生物科技有限公司购买了1种正常细胞系(BEAS-2B)和3种肿瘤细胞系(AMO-1、NCI-H596、NCI-H929)作为肺癌用药基因检测试剂(可逆末端终止测序法)国家参考品的阴性参考品原料。对上述细胞进行培养后进行基因组DNA提取，并于-20℃保存。
(2)阴性参考品配制
对BEAS-2B细胞系DNA、AMO-1细胞系DNA、NCI-H596细胞系DNA和NCI-H929细胞系DNA分别进行Qubit定量得到细胞系DNA的浓度(ng/μl)，根据浓度，每种细胞系DNA各取30μg进行超声打断，打断后用ddH2O稀释至5ng/μl作为阴性参考品N1、N2、N3、N4。
(3)阳性参考品、重复性参考品、最低检出限参考品配制
将上述包含8种突变位点的7种细胞系DNA进行Qubit定量及ddPCR检测。根据浓度及突变频率检测结果，将7种细胞系DNA进行混合，使其混合后8个突变位点频率相近。详细信息如下表5：
表5
将上述7种细胞系DNA按比例进行混合，配制53.94μg各位点频率约为5.78％的阳性参考品母液，详细信息如下表6：
表6
再用各位点均为野生型的BEAS-2B细胞系DNA对各位点频率约为5.78％的阳性参考品母液进行稀释，将各位点的突变频率分别稀释成2％、1％、0.5％、0.1％，超声打断后再用ddH2O将DNA浓度稀释至5ng/μl。将理论频率为2％的DNA混合液作为阳性参考品P1、重复性参考品R1、最低检出限参考品L1；将理论频率为1％的DNA混合液作为重复性参考品R2、最低检出限参考品L2；将理论频率为0.5％的DNA混合液作为最低检出限参考品L3；将理论频率为0.1％的DNA混合液作为最低检出限参考品L4。使用0.5mL规格的螺口冷冻管分装后贴好标签于-20℃冷冻保存。
二、对各标准品的突变频次进行检测
对各标准品进行ddPCR检测，检测结果如下表7：
表7
三、标准品在检验肺癌基因检测试剂盒的检测灵敏度方面的应用
采用Kapa Biosystems公司生产的建库试剂盒(KK8504)和康为公司生产的文库构建试剂盒(CW2585T)及罗氏公司生产的捕获试剂盒(07145594001)进行检验进行实验，步骤如下：
1.末端修复及加A
取处理后的DNA样品和试剂依次加入配制混合液1(见表8)，涡旋震荡混匀后，于PCR仪中20℃孵育30分钟，65℃孵育30分钟。
表8
组分 加入量
DNA样品 大于等于20ng
末端修复&加A缓冲液 7μl
末端修复&加A酶 3μl
水 补足至60μl
2.添加接头
向末端修复&加A后的混合液1中依次加入试剂配制混合液2(见表9)，用移液器吹打混匀后，于PCR仪中20℃孵育15分钟。
表9
2接头的使用浓度根据如下表10进行调整：
表10
模板DNA量/ng 接头的浓度/μM
1000 15
500 15
250 15
100 15
50 15
25 7.5
10 3
5 1.5
2.5 0.75
1 0.3
3.添加接头后纯化
(1)将添加接头后的110μl混合液转移至新的1.5ml离心管中，向其中加入88μl纯化磁珠，用移液器吹打混匀，室温静置5～15分钟，使DNA和磁珠充分结合。
(2)将离心管置于磁力架上至溶液澄清后，用移液器吸去上清。
(3)向离心管中加入200μl 80％乙醇，室温静置30秒，用移液器吸去上清。
(4)重复上一步，室温静置3～5分钟至乙醇完全挥发。
注：避免磁珠过干。
(5)乙醇完全挥发后，从磁力架上取下离心管，每个离心管中分别依次加入22μl水，用移液器吹打混匀，室温静置2分钟。
(6)将离心管置于磁力架上至溶液上清澄清后，取1μl上清用于Qubit定量。
4.文库富集
(1)按表11要求依次加入试剂配制混合液3于PCR管中。
表11
组分 加入量(μl)
上清 20
2×HiFi热启动酶缓冲液 25
Pre-PCR引物 5
合计 50
(2)调整移液器至最佳量程上下吹打混匀液体并盖好PCR管盖，短暂离心。
(3)将配制好的混合液3置于PCR仪，按以下表12反应程序扩增：
表12
3具体循环数可根据如下表13进行调整：
表13
PCR模板DNA量/ng 循环数
0.5 12-13
1 11-12
5 9-11
10 7-9
50 5-6
100 3-4
500 1-2
注：扩增后的产物于4℃或-20℃保存，但不超过72小时。
(4)扩增后纯化及片段大小分选
①将50μl扩增产物转移至新的1.5ml离心管中，加入50μl纯化磁珠，涡旋震荡混匀。室温静置15分钟。
②将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。
③向离心管中加入200μl 80％乙醇，室温静置30秒，用移液器吸去上清。
④重复上一步，室温静置3～5分钟至乙醇完全挥发。
注：避免磁珠过干。
⑤从磁力架上取下离心管，加50μl水，用移液器吹打混匀，室温静置2分钟。
⑥将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器移取50μl上清至新的离心管中。
⑦向上述50μl上清中加入35μl纯化磁珠，涡旋震荡混匀，室温静置10分钟。
⑧将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸取上清约85μl于新的离心管中
注：此步需小心留取上清，而非弃上清。
⑨向上述85μl上清中，加入10μl纯化磁珠，涡旋震荡混匀，室温静置10分钟。
⑩将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。
向离心管中加入200μl 80％乙醇，室温静置30秒，用移液器吸去上清。
重复上一步，室温静置数秒至乙醇完全挥发。
注：避免磁珠过干。
乙醇完全挥发后，从磁力架上取下离心管，加52μl水，用移液器吹打混匀，室温静置2分钟。
将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸取1μl进行Qubit定量检测，吸取50μl上清至新的离心管中。
DNA文库样品质量分析：对文库样品进行Qubit定量，浓度应不小于2.5ng/μl；用2100生物分析仪分析文库大小，应在于150～500bp之间。
注：纯化后的文库溶液应在-20℃条件下保存，于7天内完成后续处理。
5.文库杂交和捕获
(1)按表14要求依次加入试剂配制混合液4于新的1.5ml离心管中：
表14
组分 加入量
DNA文库混合样品 1μg4
杂交通用引物 1000pmol
杂交Index引物 1000pmol5
COT DNA 5μl
4根据文库样品浓度计算样本量，按下表15等质量加入文库样本。1个捕获样本至少加入8个文库，至多加入12个文库：
表15
组分 加入量
DNA文库样品1 125
DNA文库样品2 125
DNA文库样品3 125
DNA文库样品4 125
DNA文库样品5 125
DNA文库样品6 125
DNA文库样品7 125
DNA文库样品8 125
5应加入与接头相对应的杂交Index引物，加入量根据以下表16格调整：
表16
(2)用移液器吹打混匀后，用真空离心浓缩仪在60℃、1350r/min下进行干燥，直至液体完全蒸干。
(3)待液体蒸干后，按下表17加入试剂配制混合液5：
表17
组分 加入量(μl)
2×杂交缓冲液 7.5
杂交组分A 3
合计 10.5
(4)向干燥后的混合液4中，加入10.5μl混合液5配成杂交混合液，涡旋震荡混匀，短暂离心以去除管壁残留。于恒温金属浴仪95℃孵育10分钟使DNA变性，短暂离心以去除管壁残留。
(5)用移液器将杂交混合液转移至新的PCR管中，加入4.5μl探针，涡旋震荡混匀，短暂离心以去除管壁残留。于PCR仪47℃孵育16～20小时，同时PCR仪加热盖温度设置为57℃以上。
6.文库清洗
(1)缓冲液的稀释方法(见表18)：
表18
组分 超纯水加入量(μl)
30μl-10×洗脱缓冲液I 270
20μl-10×洗脱缓冲液II 180
20μl-10×洗脱缓冲液III 180
40μl-10×洗脱缓冲液IV 360
200μl-2.5×磁珠洗脱缓冲液 300
(2)取100μl 1×洗脱缓冲液I和400μl 1×洗脱缓冲液IV在47℃预热至少2小时。
(3)取100μl捕获磁珠于新的1.5ml离心管中，将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。
(4)从磁力架上取下离心管，加入200μl 1×磁珠洗脱缓冲液，涡旋震荡混匀。将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。
(5)重复上一步。
(6)向离心管加入100μl 1×磁珠洗脱缓冲液，涡旋震荡混匀。将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。
(7)取杂交后的文库样品15μl，加入到磁珠离心管中，用移液器吹打混匀，于PCR仪47℃孵育45分钟。每间隔15分钟涡旋震荡3秒，使磁珠处于悬浮状态。
(8)孵育结束后，向离心管中加入100μl 47℃预热的1×洗脱缓冲液I，涡旋震荡混匀。
(9)将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。
(10)从磁力架上取下离心管，加入200μl 47℃预热的1×洗脱缓冲液IV，用移液器吹打混匀。于恒温金属浴仪47℃孵育5分钟。
(11)重复一次(9)-(10)的步骤。
(12)将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。
(13)从磁力架上取下离心管，每个离心管中分别依次加入200μl未加热的1×洗脱缓冲液I，涡旋震荡2分钟。将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。
(14)从磁力架上取下离心管，每个离心管中分别依次加入200μl 1×洗脱缓冲液II，涡旋震荡1分钟。将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。
(15)从磁力架上取下离心管，每个离心管中分别依次加入200μl 1×洗脱缓冲液III，涡旋震荡30秒。将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。
(16)从磁力架上取下离心管，加入40μl水，用移液器吹打混匀。将混匀后的液体标记为“1”。
7.捕获样本富集及纯化
(1)按下表19要求配制混合液6
表19
(2)将混合液6与“1”混合，涡旋震荡混匀。按50μl/管分装量分装到两个新的PCR管中，按以下表20反应程序扩增：
表20
注：扩增后的产物可于2～8℃保存，但不超过72小时。
(3)将100μl扩增产物转移至新的1.5ml离心管中，加入180μl纯化磁珠，涡旋震荡混匀。室温静置15分钟。
(4)将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。
(5)向离心管中加入200μl 80％乙醇，室温静置30秒，用移液器吸去上清。
(6)重复上一步，室温静置3～5分钟至乙醇完全挥发。
注：避免磁珠过干。
(7)乙醇完全挥发后，从磁力架上取下离心管，分别加入52μl水。用移液器吹打混匀，室温静置2分钟。
(8)将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器转移50μl上清于新的离心管中。此时捕获的文库样品处于上清中。
注：纯化后的文库溶液应在-20℃以下保存7天。
8.上机测序
使用Illumina公司生产的NextSeq 500测序仪及相关配套试剂进行上机测序。
经过生物信息学分析，得出下列结论：
对阴性参考品进行NGS测序，结果如表21：
表21
阳性参考品NGS检测结果如表22：
表22
阳性参考品符合率：
对P1进行检测，EGFR G719S/E746_A750del/S768I/T790M/L858R、EML4基因6号外显子和ALK基因20号外显子融合、EML4基因13号外显子和ALK基因20号外显子融合、SLC34A2基因4号外显子和ROS1基因32号外显子融合8个位点均可检出。
阴性参考品符合率：
对N1、N2、N3、N4分别进行检测，EGFR G719S/E746_A750del/S768I/T790M/L858R、EML4基因6号外显子和ALK基因20号外显子融合、EML4基因13号外显子和ALK基因20号外显子融合、SLC34A2基因4号外显子和ROS1基因32号外显子融合8个位点均为阴性。
重复性：
对R1和R2重复检测10次，EGFR G719S/E746_A750del/S768I/T790M/L858R、EML4基因6号外显子和ALK基因20号外显子融合、EML4基因13号外显子和ALK基因20号外显子融合、SLC34A2基因4号外显子和ROS1基因32号外显子融合8个位点均可检出。
最低检出限：
对L1、L2、L3进行检测，EGFR G719S/E746_A750del/S768I/T790M/L858R、EML4基因6号外显子和ALK基因20号外显子融合、EML4基因13号外显子和ALK基因20号外显子融合、SLC34A2基因4号外显子和ROS1基因32号外显子融合8个位点均可检出；对L4进行检测，EGFRG719S/E746_A750del/S768I/T790M/L858R、EML4基因6号外显子和ALK基因20号外显子融合、EML4基因13号外显子和ALK基因20号外显子融合、SLC34A2基因4号外显子和ROS1基因32号外显子融合8个位点可检出或全检不出。
而且，对上述两个公司的检测试剂盒中的各突变位点的检测结果如下：
Kapa建库试剂盒+罗氏捕获试剂盒的检测结果见下表23：
表23
康为建库试剂盒+罗氏捕获试剂盒检测结果见表24：
表24
综上所述，KAPA建库试剂盒+罗氏捕获试剂盒对于L1～L3的8个位点均能够稳定检出，L4中EGFR G719S、EGFR L8589R及三个融合突变未检出，因此认为该试剂盒针对上述5个位点的检出能力在L3水平。康为建库试剂盒+罗氏捕获试剂盒对于L1～L2的8个位点均能够稳定检出，L3及L4各位点均未检出因此认为该试剂盒的8个位点检出能力在L2水平。比较两种试剂盒对于标准品检测结果能够发现，KAPA建库试剂盒检测限低于康为建库试剂盒。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本申请的上述肺癌临床耐药基因检测的标准品，通过包含上述肺癌突变相关的多个基因突变位点的DNA混合物作为最低检测限参考品，且该标准品中包括至少两个级别的变异频率的DNA混合物，能够检验不同厂家的试剂盒在检测相应基因突变时，是否能检测出突变，以及所能检测的突变频率，从而能够验证各试剂盒的检测结果的准确性和可靠性，进而为临床用药提供相对准确的指导意义。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种肺癌临床用药基因检测标准品，其特征在于，所述肺癌临床用药基因检测标准品包括：最低检出限参考品，所述最低检出限参考品至少包括两个不同级别的变异频率的DNA混合物，每个级别的所述变异频率的DNA混合物包括以下表1所示的突变位点：
表1
2.根据权利要求1所述的肺癌临床用药基因检测标准品，其特征在于，所述最低检出限参考品包括L1级别的变异频率的DNA混合物和L2级别的变异频率的DNA混合物，其中，L1级别的变异频率的DNA混合物中，各所述突变位点的变异频率在2.1～4.6％之间，所述L2级别的变异频率的DNA混合物中，各所述突变位点的变异频率在0.9～2.5％之间。
3.根据权利要求2所述的肺癌临床用药基因检测标准品，其特征在于，所述L1级别的变异频率的DNA混合物和所述L2级别的变异频率的DNA混合物中，各所述突变位点的变异频率如下表2所示：
表2
4.根据权利要求2所述的肺癌临床用药基因检测标准品，其特征在于，所述肺癌临床用药基因检测标准品还包括L3级别的变异频率的DNA混合物，所述L3级别的变异频率的DNA混合物中各所述突变位点的变异频率在0.5～1.4％；优选的，所述L3级别的变异频率的DNA混合物中各所述突变位点的变异频率如表3所示：
表3
5.根据权利要求4所述的肺癌临床用药基因检测标准品，其特征在于，所述肺癌临床用药基因检测标准品还包括L4级别的变异频率的DNA混合物，所述L4级别的变异频率的DNA混合物中各所述突变位点的变异频率在0.09～0.39％；优选的，所述L4级别的变异频率的DNA混合物中各所述突变位点的变异频率如表4所示：
表4
6.根据权利要求1至5中任一项所述的肺癌临床用药基因检测标准品，其特征在于，每个级别的所述变异频率的DNA混合物的浓度均为5ng/μL。
7.根据权利要求6所述的肺癌临床用药基因检测标准品，其特征在于，所述最低检出限参考品中的DNA混合物包括肿瘤细胞系的DNA；优选采用的所述肿瘤细胞系包括PC-9细胞系、NCI-H1975细胞系、KYSE450细胞系、SW48细胞系、NCI-H2228细胞系、NCI-H3122细胞系以及HCC78细胞系；更优选地，所述肿瘤细胞系的DNA是通过采用BEAS-2B细胞系DNA进行突变频率稀释的。
8.根据权利要求1所述的肺癌临床用药基因检测标准品，其特征在于，所述肺癌临床用药基因检测标准品还包括阴性参考品；
优选的，所述阴性参考品为所述最低限检测参考品中的所述突变位点为阴性的DNA；
更优选，所述阴性参考品中DNA的浓度为5ng/μL；
更优选的，所述阴性参考品中DNA为细胞系DNA；
进一步优选，所述细胞系DNA为BEAS-2B细胞系DNA、AMO-1细胞系DNA、NCI-H596细胞系DNA和NCI-H929细胞系DNA。
9.根据权利要求3所述的肺癌临床用药基因检测标准品，其特征在于，所述肺癌临床用药基因检测标准品还包括阳性参考品；
优选的，所述阳性参考品为表1所示的突变位点的DNA混合物；
更优选，所述阳性参考品中的DNA混合物中各所述突变位点的变异频率如表2的L1级别所示。
10.根据权利要求3所述的肺癌临床用药基因检测标准品，其特征在于，所述肺癌临床用药基因检测标准品还包括至少两个级别的变异频率的重复性参考品；
优选的，所述重复性参考品为表1所示的突变位点的DNA混合物；
更优选，所述重复性参考品为表2所示的L1级别的变异频率的重复性参考品和L2级别的变异频率的重复性参考品。
11.如权利要求1至10中任一项所述的肺癌临床用药基因检测标准品在检验肺癌基因检测试剂盒的检测灵敏度方面的应用。
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