CN111057768A - 一种肺癌和结直肠癌基因突变石蜡包埋参考品的制备工艺 - Google Patents
一种肺癌和结直肠癌基因突变石蜡包埋参考品的制备工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于肺癌和结直肠癌基因检测的石蜡包埋参考品的制备工艺及其应用。该制备工艺包括以下步骤：A、已知突变基因，突变位点和等位基因突变频率的细胞系的获得；B、肺癌和结直肠癌多基因FFPE参考品的设计；C、细胞的培养与收集；D、细胞的固定与脱水；E、细胞的包埋与切片；F、FFPE切片的HE染色，核酸提取与突变频率或拷贝数的确认。本发明的技术方案能很好的解决临床样本存在的数量少，不可重复获得，性能不稳定，突变位点稀缺，细胞包埋不均一等诸多问题。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断基因检测技术领域，具体涉及一种用于肺癌和结直肠癌多基因突变石蜡包埋参考品的制备工艺及其应用。
背景技术
近年来，分子诊断尤其是基因检测领域发展极为迅速，基因检测涉及无创产前检测，肿瘤易感预测，肿瘤早期诊断，个体化用药，术后监测以及消费型基因检测等。为了评判基因检测类试剂盒的准确性，灵敏度，稳定性等诸多性能，此类试剂盒在研发注册过程中都会采用参考品来对试剂盒的各项性能进行反复的验证。
目前很多试剂盒厂商选用的参考品都是新鲜细胞培养提取的基因组DNA溶液，或者临床来源的样本，但都尚且存在一定的问题：新鲜提取的基因组DNA溶液与临床肿瘤细胞存在很大的异质性，不能很好的模拟临床样本的检测；临床样本中很多基因突变类型来源稀缺，基因突变种类单一，基因突变频率不固定，不能作为试剂盒组分的优质来源；临床上低频突变样本极其罕见，不能很好的验证试剂盒的检测限等性能指标；临床样本都属于珍贵的研究材料，且数量有限，很难作为试剂盒研发注册的长期来源。
现有技术中也出现了一些用于基因检测类试剂盒参考品的石蜡包埋切片(FFPE)，例如：中国专利201910049671.X中公开了一种用于基因检测的FFPE参考品、其制备方法及应用。该发明通过对肿瘤细胞系培养的细胞进行福尔马林固定石蜡包埋，可以更好地模拟临床样本的情况。
中国专利201510130867.3中公开了一种微米级生物材料石蜡切片方法，能简单有效的固定微米级生物材料，如小鼠植入前胚胎。该方法得到了质量较好的小鼠植入前胚胎的石蜡切片，但是该方法中步骤繁琐，尤其是预处理步骤复杂，有进一步优化的空间。
目前市场上鲜有关于稳定，有效，可重复的用于肺癌和结直肠癌基因检测的石蜡包埋参考品的制备工艺，且已公开的工艺中存在很多不足：1、背景细胞系种类多，背景复杂，制作时操作繁琐且失败率高；2、包埋工艺不成熟，细胞包埋不均一，批间批内差异大；3、将不同细胞系分别做成FFPE切片，再进行核酸的提取和多种基因位点的混合，不利于长期储存；
综上，目前市面上无实际可用的肺癌和结直肠癌多基因检测FFPE参考品。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种用于肺癌和结直肠癌多基因突变石蜡包埋参考品的制备工艺及其产品和应用。本发明提供的制备工艺可以解决现有技术中临床上的石蜡切片样本作为参考品数量少，不可重复生产，无法获得低频率突变位点等技术问题。
术语：
1、本发明中，在本领域技术人员显而易见的使用惯例中，数字代表突变位置，单字母代表氨基酸类型，数字前一位字母代表突变前氨基酸类型，数字后一位字母代表突变后氨基酸类型。例如“EGFR T790M”，指EGFR蛋白第790位的苏氨酸突变为甲硫氨酸。
一方面，本发明提供了一种多基因突变石蜡包埋参考品的制备工艺，所述的制备工艺包括以下步骤：
A、已知突变基因，突变位点和等位基因突变频率的细胞系的获得；
B、肺癌和结直肠癌多基因FFPE参考品的设计；
C、细胞的培养与收集；
D、细胞的固定与脱水；
E、细胞的包埋与切片；
F、FFPE切片的HE染色，核酸提取与突变频率或拷贝数的确认。
具体地，所述的步骤A包括以下步骤：
A1、从文献或数据库中查阅相应的含有目标基因突变的细胞系；
A2、获取含有目标突变，遗传稳定的单克隆细胞系；
A3、单克隆细胞系等位基因突变频率的确定；
具体地，所述的步骤A1为从文献或者数据库中查阅相应的含有目标基因突变的细胞系。
进一步具体地，所述的目标基因突变包括但不限于：BRAF V600X，KRASG12X，KRASG13D，KRAS Q61X，NRAS G12X，NRAS G13D，NRAS K117N，NRAS Q61X，EGFR G719X，EGFRG797X，EGFR S768I，EGFR T790M，EGFR L858R，EGFR L861Q，EGFR 19del，EGFR 19indel，EGFR 20ins，PIK3CA E542X，PIK3CA E545X，PIK3CA H1047X，EML4(13)-ALK(20)，EML4(6)-ALK(20)，CD74-ROS1；其中X包括但不限于E，G，K，M，R，A，C，D，R，S，V，H，L，K，R中的一种或多种氨基酸。
具体地，所述的步骤A2为购买的细胞系经过培养，挑取单克隆，确定单克隆细胞系碱基突变位点，选取含有目标基因突变的细胞单克隆。
进一步具体地，所述的购买来源为美国模式培养物集存库(American typeculture collection，ATCC)或其他任何可以获得步骤A1所确定的细胞系的单位；
进一步具体地，所述的确定单克隆细胞系碱基突变位点的方法包括但不限于桑格(Sanger)测序。
具体地，所述的步骤A3可以通过微滴式数字PCR方法实现。
进一步具体地，所述的数字PCR平台包括但不限于Biorad平台，QX平台；优选为QX200平台。
具体地，所述步骤B包括以下步骤：
B1、设计FFPE参考品的突变基因种类和突变频率；
B2、根据每一个突变位点的最终突变频率以及原始细胞(背景清晰的细胞)的突变频率，计算出每一种细胞系所需占的比例；
B3、根据每一种细胞系所占的比例计算出每一个蜡块里每一种细胞系所需要的细胞数量。
优选地，所述的步骤B1中一个FFPE参考品中包括1-20个基因突变位点，突变种类包含单核苷酸位点变异(SNV)、插入或缺失(InDel)、融合(Fusion)或拷贝数变异(CNV)；每个基因突变位点的突变频率可根据需要设定为1-50％，拷贝数设定为2-10。
具体地，所述的步骤B3中每一个蜡块中所含有的细胞总数为100M-500M；优选为500M。
具体地，所述的原始细胞包括但不限于NCI-H1975，PC-9，NCI-H460，A-427，HCT116，AMO-1，NCI-H1299。
具体地，所述的步骤D为：用固定液对新鲜的细胞悬液进行固定。
具体地，所述的固定液优选为多聚甲醛溶液(PFA溶液)；进一步优选为终浓度为8％的PFA溶液。
具体地，所述的步骤E包括：
E1、固定后的细胞悬液与琼脂糖(Agarose)按照一定比例混合；
E2、脱水。
优选地，所述的步骤E1中细胞悬液与琼脂糖的体积比为1:1；琼脂糖溶液的浓度为0.8％-2％，优选为1％。
具体地，脱水采用自动脱水机进行；在一些实施例中，选择徕卡自动脱水机进行。
具体地，所述的步骤F包括以下步骤：
F1、将步骤E获得的脱水后的细胞团块进行石蜡包埋；
F2、冷藏后的蜡块进行切片。
具体地，所述的步骤F2切片的厚度为5-25μm；优选为20μm。
优选地，在步骤F之后还可以包括质检步骤G。
具体地，所述的步骤G为：
G1、对切片进行染色观察；
G2、FFPE切片核酸的提取；
G3、FFPE切片中相应基因位点突变频率的确认。
优选地，所述的步骤G1中采用HE染色法。
优选地，所述的步骤G2中核酸提取使用试剂盒；所述的试剂盒包括但不限于Promega
16FFPE plus LEV Purification Kit(AS4920)、QIAamp DNA FFPETissue Kit(56404)、厦门艾德FFPE DNA提取试剂盒、美基生物HiPure FFPE DNA Kit(D3126-02)。
优选地，所述的步骤G3中采用数字PCR平台对FFPE切片中所涉及到的基因位点进行突变频率的确认；进一步优选地，采用Biorad QX200数字PCR对突变频率进行确认。
优选地，前述制备工艺应用于肺癌和结直肠癌多基因突变石蜡包埋参考品的制备。作为示例性地，前述制备工艺也可应用于包括但不限于肺癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌多基因突变石蜡包埋参考品的制备。
另一方面，本发明提供了一种用于分子诊断领域的FFPE参考品。
具体地，所述的参考品通过前述制备工艺制得。
再一方面，本发明提供了前述FFPE参考品在分子诊断领域的应用。
优选地，所述的参考品应用于肺癌和结直肠癌基因检测。
又一方面，本发明提供了一种癌症基因检测试剂盒，所述的试剂盒包含利用前述制备工艺制得的FFPE参考品。
优选地，所述的试剂盒为一种肺癌和结直肠癌基因检测试剂盒，所述的试剂盒包含利用前述制备工艺制得的FFPE参考品。
又一方面，本发明提供了前述制备工艺制得的FFPE参考品在实验室日常质控和室间质评中的用途。
应用本发明提供的制备工艺，对培养的单克隆细胞进行固定和石蜡包埋，可以很好的模拟临床样本的情况；将含有不同基因突变位点的细胞系按照设定的突变比例混合在一起，制备多种组合，可作为多癌症检测的FFPE参考品；本发明中所述的单克隆细胞系，遗传稳定，可以无限扩大培养，因此可以大规模的稳定的生产。本发明能很好的解决现有技术中临床样本罕见，不可重复获得，性能不稳定，突变位点稀缺，包埋不均一等诸多问题。
附图说明
图1为GW-OPSM003石蜡切片HE染色图。
图2为蜡块不同位置石蜡切片的总DNA提取量。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
针对现有技术中临床样本来源稀缺，基因突变位点较少以及突变频率不固定，无法重复稳定的获得，本发明提供了下述技术方案。
实施例1
根据本发明的一种典型的实施方式，提供了一种用于肺癌和结直肠癌基因检测领域的石蜡切片参考品的制备工艺。该制备工艺包括以下步骤：
A、已知突变基因，位点和频率的细胞系(背景清晰的细胞系)的获得。
A1、从ATCC或者其他机构购买含有已知基因突变(EGFR_L858R，EGFR_T790M，EGFR_E746_A750del，PIK3CA_E545K，KRAS_G12D，KRAS_G13D，KRAS_A146T，NRAS_Q61K)的细胞系：NCI-H1975，PC-9，NCI-H460，A-427，HCT116，AMO-1，NCI-H1299，以及野生型的阴性细胞系GM12878。
A2、培养上述已购买细胞系，挑选单克隆，采用桑格测序和Biorad QX200数字PCR平台对上述单克隆细胞株进行等位基因突变频率(AF)和COSMIC(the Catalogue OfSomatic Mutations In Cancer，癌症的体细胞突变目录)ID的确定。具体的结果如表1所示：
表1：各细胞系基因位点等位基因突变频率AF(％)和COSMIC ID
B、肺癌和结直肠癌石蜡包埋(FFPE)参考品(GW-OPSM003)的设计。
B1、根据肺癌和结直肠癌代表性基因突变位点，设计阳性参考品的突变基因种类和突变频率；采用没有这些基因突变位点的GM12878的野生型作为阴性细胞系
B2、根据每一种细胞系突变频率计算出此阳性参考品中每一种细胞系所占比例；
B3、每一个FFPE蜡块所需要的细胞总数设定为500M，根据每一种细胞系所占的比例计算出每一个蜡块里每一种细胞系所需要的细胞数量。本实施例中结果如下：
| 细胞系 | 细胞数量(M) |
| NCI-H1975 | 33.3 |
| PC-9 | 29.4 |
| NCI-H460 | 50 |
| A-427 | 41.7 |
| HCT116 | 50 |
| AMO-1 | 75.1 |
| NCI-H1299 | 50.0 |
| GM12878 | 170.5 |
C、细胞的培养与收集。
按照步骤B计算的细胞需求数目混合的细胞，采用IMDM培养基+10％血清(+1％双抗)培养体系培养上述细胞，并离心收集细胞沉淀。
D、细胞的固定。
用终浓度为8％的多聚甲醛(PFA)溶液对细胞悬液进行固定。
E、细胞团的制备与脱水。
E1、将固定好的细胞悬液与等体积的1％的琼脂糖溶液混合固定10min-30min。
E2、采用徕卡自动脱水机进行脱水。
F、细胞的包埋与切片。
F1、细胞团经脱水后，放入包埋模具中，采用徕卡HistoCore ArcadiaH+C包埋机，进行包埋。
F2、包埋好的蜡块放置于徕卡RM2255石蜡切片机上，进行切片，石蜡切片厚度为20μm，此次整个蜡块共计切片300片。
G、肺癌和结直肠癌石蜡切片的HE染色，核酸提取与等位基因突变频率的确认。
G1、采用HE染色的方法观察细胞包埋均一性。从图1中GW-OPSM003的HE染色结果可以看出，细胞分散均一性好。
G2、使用Promega
16FFPE plus LEV Purification Kit(AS4920)对GW-OPSM003蜡块不同位置的石蜡切片(P1-P5)进行核酸的提取，采用Qubit dsDNA BR assay(Invitogen)对其进行DNA的定量，结果如图2所示。GW-OPSM003蜡块在不同位置的提取量都满足要求，且不同位置的DNA提取量无显著差异。
G3、采用Biorad QX200对第P1、P3和P5片提取的核酸进行基因突变频率的确认，结果如表2所示：
表2：各基因位点在石蜡切片阳性质控品(GW-OPSM003)不同切片位置的实测突变频率
结果分析：在本实施例中，肺癌和结直肠癌石蜡切片阳性质控品实测突变频率(AF)的波动范围表明参考品符合要求，不同切片位置的等位基因突变频率相对稳定。
从上述蜡块不同位置的HE染色结果，核酸提取量结果和数字PCR结果可以看出本实施例石蜡蜡块细胞包埋均一性好，适合稳定重复的生产；每一片的均一性良好，可以很好地作为参考品来进行日常质控。
上述实施实例并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的组合、变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于肺癌和结直肠癌基因检测领域的石蜡包埋参考品的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：
A、已知突变基因，突变位点和等位基因突变频率的细胞系的获得；
B、肺癌和结直肠癌多基因FFPE参考品的设计；
C、细胞的培养与收集；
D、细胞的固定与脱水；
E、细胞的包埋与切片；
F、FFPE切片的HE染色，核酸提取与突变频率或拷贝数的确认。
2.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，所述的步骤A包括以下步骤：
A1、从文献或数据库中查阅相应的含有目标基因突变的细胞系；
A2、获取含有目标突变，遗传稳定的单克隆细胞系；
A3、单克隆细胞系等位基因突变频率的确定。
3.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，所述的步骤B包括以下步骤：
B1、设计FFPE参考品的突变基因种类和突变频率；
B2、根据每一个突变位点的最终突变频率以及原始细胞(背景清晰的细胞)的突变频率，计算出每一种细胞系所需占的比例；
B3、根据每一种细胞系所占的比例计算出每一个蜡块里每一种细胞系所需要的细胞数量。
4.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，所述的步骤D为采用终浓度为2-10％的PFA溶液对新鲜的细胞悬液进行固定；优选为8％的PFA溶液。
5.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，在步骤F之后还可以包括质检步骤G；所述的步骤G为对步骤F制备得到的FFPE切片进行HE染色、核酸提取、突变位点的突变频率确认。
6.根据权利要求2所述的制备工艺，其特征在于，所述的目标基因突变包括：BRAFV600X、KRAS G12X、KRAS G13D、KRAS Q61X、NRAS G12X、NRAS G13D、NRAS K117N、NRAS Q61X、EGFR G719X、EGFR G797X、EGFR S768I、EGFR T790M、EGFR L858R、EGFR L861Q、EGFR 19del、EGFR 19indel、EGFR 20ins、PIK3CA E542X、PIK3CA E545X、PIK3CA H1047X、EML4(13)-ALK(20)、EML4(6)-ALK(20)、CD74-ROS1；其中X包括E，G，K，M，R，A，C，D，R，S，V，H，L，K，R中的一种或多种氨基酸。
7.根据权利要求3所述的制备工艺，其特征在于，所述的步骤B1中基因突变的类型包括单核苷酸位点变异、插入或缺失、融合或拷贝数变异中的一种或多种；基因突变所包含的位点为1-20个，拷贝数为2-10个；基因突变的频率为1％-50％，优选为5％；所述的的细胞数量为100M-500M，优选为500M。
8.一种用于癌症基因检测的FFPE参考品，其特征在于，所述的参考品通过权利要求1-7所述的制备工艺制备。
9.一种癌症基因检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求8所述的FFPE参考品。
10.权利要求8所述的FFPE参考品在分子诊断领域、实验室日常质控和室间质评中的应用。
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