CN105177124A - 一种细胞源性质控品的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞系质控品制备方法,具体讲,涉及一种细胞源性质控品的制备方法。所述制备方法包括如下步骤:细胞的准备和细胞的石蜡包埋;其中,细胞的准备包括细胞的复苏、细胞传代培养和细胞的收集;细胞的石蜡包埋包括细胞收集、细胞固定、细胞脱水、石蜡包埋。所述制备方法是直接用含有相关基因片段的细胞来制备质控品,其质控品本身就是来源于含有相同突变的肿瘤细胞,和样本的来源相同,其与要检测的样本本身同源性更好,与样本更接近,使得检测结果更具有说服力,适合于大范围推广。
Description
技术领域
本发明涉及细胞系质控品制备方法,具体讲,涉及一种细胞源性质控品的制备方法及其应用。
背景技术
随着生物技术及分子生物学的发展,各种疾病诊断试剂盒也越来越多,随着技术的成熟,其中的质控品部分是检测试剂盒非常重要的组成部分,特别是定量检测试剂盒。目前市面上的试剂盒质控品主要使用的是质粒,质粒适用范围广,几乎所有的基因检测类试剂盒质控品均可选择使用质粒。但是质粒制备不仅过程繁琐,而且需要在-20℃下低温储存,随着冻融次数增加,降解情况严重,稳定性不好,给试剂盒质控带来诸多不便;同时质粒作为一种质控品,与待检样本同源性存在较大差异,特别是一些需要定量检测的产品,用质粒进行定量不具有说服力;并且对于不同批次间的产品,也会由于质粒的生产时间不同而导致检测结果的不同,给疾病检测带来诸多不便。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明提供一种细胞源性质控品的制备方法;
本发明提供一种细胞源性质控品在肿瘤基因突变检测中的应用。
为解决上述技术问题,本发明采用技术方案的基本构思是:一种细胞源质控品的制备方法,包括如下步骤:
(1)、细胞的准备
1)细胞的复苏:提前备好42℃的温水,按要求从液氮罐中取出对应细胞冻存管,立即放入备好的温水中快速摇动,直至管中的液体恢复常温。于超净台中将冻存管用质量百分含量75%酒精擦拭消毒后,打开盖子,用吸管将细胞悬液注入离心管中,再滴加5mL培养液。在1500r/min速度下离心5分钟,弃去上层液,加入适量培养液后接种于培养皿中,置37℃温箱静置培养。观察生长情况,若细胞密度较高,几乎全部铺满皿底时及时进行传代。培养过程中严禁摇动和来回振荡,以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败;
2)细胞传代培养:本步骤须在超净台中操作。取生长适宜的培养细胞,吸去培养皿中的培养液,沿皿壁加入2mL(视培养皿大小加入适量即可)的1xPBS轻轻清洗细胞,吸去PBS;再用PBS再清洗一次;
向培养皿中加入0.5mL的质量百分含量为0.25%胰酶,轻轻摇晃培养皿使胰酶与皿底细胞充分接触消化,1min后吸去胰酶,于显微镜下观察细胞状态,若细胞基本恢复圆滑状态,即可进行下一步操作,若还有贴壁情况,则继续消化直至细胞变得圆滑。注意胰酶消化时间过短过长都不好,过短消化不完全,过长可能对细胞膜造成一定损伤,都不利于细胞的继续传代;
向培养皿中加入3mL培养液(视培养大小加入适量即可),用移液器将皿底细胞轻轻来回吹打混匀,显微镜下观察细胞浓度,视细胞浓度向另一培养皿中加入600~1500μl的细胞悬浮液,并加入3mL培养液,用移液器轻轻吹打混匀,显微镜下观察细胞密度。注意步骤中的培养液及细胞悬浮液均可根据实际情况进行变动;
置37℃温箱静置培养。观察生长情况,若细胞密度较高,几乎全部铺满皿底时及时进行传代;
3)细胞的收集:贴壁生长于培养皿中的细胞,当需要收集时,在用胰酶消化完全后可加入适量PBS,然后直接回收到离心管中。或者不加PBS直接收集胰酶消化的细胞。收集完毕的细胞可暂时放在0℃冰箱保存,长时间不用的细胞最好保存在-80℃冰箱中备用;
(2)、细胞的石蜡包埋
1)细胞收集:将培养出的已经计数好的细胞收集于离心管中,1500r/min离心5分钟,弃上清;
2)细胞固定:向离心管中加入适量的质量百分含量10%的中性福尔马林,摇匀后斜放在4度冰箱中固定60分钟,然后1500r/min离心5分钟,弃上清;加入适量PBS清洗一次,1500r/min离心5分钟,弃上清,保留少许PBS以用作混匀细胞;
3)细胞脱水:按照乙醇浓度从低到高的梯度进行,每步脱水完成时1500r/min离心5分钟,弃上清:50%乙醇30分钟;
70%乙醇30分钟;85%乙醇30分钟;95%乙醇30分钟;100%乙醇20分钟;100%乙醇20分钟;
4)石蜡包埋:在62℃环境下于通风橱中进行操作,具体操作如下:1/2体积二甲苯加1/2体积的石蜡30分钟,吸去二甲苯及石蜡;完全石蜡1小时,对细胞进行初步包埋,待石蜡冷却后对包埋的细胞块进行修剪,得到含有细胞的石蜡包埋块;然后进行二次包埋,用石蜡包埋1小时,降温,待石蜡凝固即可。
作为本发明的优选方案,所述步骤(1)中2)细胞传代培养和3)细胞的收集之间还包括细胞的冻存,具体步骤如下:
配制冻存液:按如下体积比例DMEM:FBS:DMSO=7:2:1来配制冻存液。(一定要现配现用)将细胞培养液、PBS、胰蛋白酶和冻存液温浴到37℃。
冻存时的细胞要生长状态好、生长旺的细胞(最好在第3或者4带时冻存),用细胞传代方法消化细胞,用适量细胞培养液终止消化,重悬细胞。室温200g离心10分钟收集细胞,用冻存液重悬细胞,并调节浓度至约1x106个细胞,4℃30min,转到-20℃30min,再在-80℃过夜;将细胞转入液氮中。
作为本发明的优选方案,所述步骤(2)中3)细胞脱水和4)石蜡包埋之间还包括:细胞透明,具体过程如下:用二甲苯逐步替代掉无水乙醇,在通风橱中进行,具体操作如下:先以1/2体积的无水乙醇加1/2体积的二甲苯20分钟,吸去上清;再1/3体积无水乙醇加2/3体积二甲苯20分钟,吸去上清;然后换做二甲苯20分钟,吸去二甲苯后即可进行细胞的石蜡包埋步骤。
采用上述技术方案后,本发明与现有技术相比具有以下有益效果:
(1)本制备方法是直接用含有相关基因片段的细胞来制备质控品,其质控品本身就是来源于含有相同突变的肿瘤细胞,和样本的来源相同,其与要检测的样本本身同源性更好,与样本更接近,使得检测结果更具有说服力,适合于大范围推广;
(2)将细胞制备成石蜡切片,其储存方便,与质粒易降解相比稳定性更好,同时可与样本同时提取,与样本有着同样的操作过程,相较于质粒,减小了实验过程中的误差以及对突变检测结果的影响;
(3)此制备方法制备的细胞源性质控品适合于所有肿瘤突变检测,只要有相关的肿瘤细胞,即可进行相关检测对应的质控品,有利于提高肿瘤突变检测的准确性,更完美的配合肿瘤疾病的治疗。
附图说明
图1为采用荧光定量PCR仪检B-raf基因突变细胞源性质控品得到的曲线;
图2-1为B-raf基因20%突变比例测序结果;
图2-2为B-raf基因50%突变比例测序结果;
图2-3为B-raf基因纯突变比例测序结果;
图2-4为B-raf基因无突变比例测序结果;
图3为B-raf基因突变细胞源性质控品石蜡切片放置3个月后的检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图对本发明做进一步解释说明。
B-raf基因突变细胞源性质控品的制备
1.细胞的准备:针对B-raf基因突变选择肿瘤细胞株人恶性黑色素瘤细胞A375以及无B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK293V。
(1)细胞的复苏:提前备好42℃的温水,按要求从液氮罐中取出肿瘤细胞株人恶性黑色素瘤细胞A375以及无B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK293V,立即放入备好的温水中快速摇动,直至管中的液体恢复常温。于超净台中将冻存管用75%酒精擦拭消毒后,打开盖子,用吸管将细胞悬液分别注入离心管中,再滴加5mL培养液。在1500r/min速度下离心5分钟,弃去上层液,将肿瘤细胞株人恶性黑色素瘤细胞A375加入到BMEM高糖培养液、将无B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK293V加入到RPMI1640培养液中,接种于培养皿中,置37℃温箱静置培养。观察生长情况,若细胞密度较高,几乎全部铺满皿底时及时进行传代。
(2)细胞传代培养:本步骤须在超净台中操作。分别取生长适宜的肿瘤细胞株人恶性黑色素瘤细胞A375以及无B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK293V,吸去培养皿中的培养液,沿皿壁加入2mL(视培养皿大小加入适量即可)的1xPBS轻轻清洗细胞,吸去PBS;再用PBS再清洗一次;
向培养皿中分别加入0.5mL的质量百分含量为0.25%的胰酶,轻轻摇晃培养皿使胰酶与皿底细胞充分接触消化,1min后吸去胰酶,于显微镜下观察细胞状态,若细胞基本恢复圆滑状态,即可进行下一步操作,若还有贴壁情况,则继续消化直至细胞变得圆滑。
分别向培养皿中加入3mL对应的培养液(视培养大小加入适量即可),用移液器将皿底细胞轻轻来回吹打混匀,显微镜下观察细胞浓度,视细胞浓度向另一培养皿中加入600~1500μl的细胞悬浮液,并加入3mL对应的培养液,用移液器轻轻吹打混匀,显微镜下观察细胞密度。
置37℃温箱静置培养。观察生长情况,若细胞密度较高,几乎全部铺满皿底时及时进行传代。
(3)细胞的收集:贴壁生长于培养皿中的细胞,在用胰酶消化完全后可加入适量PBS,然后直接回收到离心管中,获取足够多的细胞并进行细胞计数以备实验使用。
2.细胞石蜡包埋:
共计4份样本细胞,分别如下:
将B-raf基因突变选择肿瘤细胞株人恶性黑色素瘤细胞A375与无B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK293V按照1:4混合,得到20%突变比例的细胞混合液;
将B-raf基因突变选择肿瘤细胞株人恶性黑色素瘤细胞A375与无B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK293V按照1:1混合,得到50%突变比例的细胞混合液;
B-raf基因突变选择肿瘤细胞株人恶性黑色素瘤细胞A375的细胞液;
无B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK293V的细胞液。
下边以无B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK293V为例,按照石蜡包埋的步骤,从细胞的收集,固定,细胞脱水,细胞透明,细胞的石蜡包埋步骤,完成细胞的石蜡包埋步骤,具体介绍如下:
(1)细胞收集:将培养出的已经计数好的细胞收集于离心管中,1500r/min离心5分钟,弃上清。
(2)细胞固定:向离心管中加入适量的10%的中性福尔马林,摇匀后斜放在4度冰箱中固定60分钟,然后1500r/min离心5分钟,弃上清;加入适量PBS清洗一次,1500r/min离心5分钟,弃上清,保留少许PBS以用作混匀细胞。
(3)细胞脱水:按照乙醇浓度从低到高的梯度进行,每步脱水完成时1500r/min离心5分钟,弃上清:50%乙醇30分钟;
70%乙醇30分钟;85%乙醇30分钟;95%乙醇30分钟;100%乙醇20分钟;100%乙醇20分钟。
(4)细胞透明:用二甲苯逐步替代掉无水乙醇,在通风橱中进行,具体操作如下:先以1/2的无水乙醇加1/2的二甲苯20分钟,吸去上清;再1/3无水乙醇加2/3二甲苯20分钟,吸去上清;然后换成二甲苯20分钟,吸去二甲苯后即可进行细胞的石蜡包埋步骤。
(5)石蜡包埋:用石蜡逐步替代二甲苯,在62℃环境下于通风橱中进行操作,具体操作如下:1/2二甲苯加1/2的石蜡30分钟,吸去二甲苯及石蜡;完全石蜡1小时,对细胞进行初步包埋,待石蜡冷却后对包埋的细胞块进行修剪,得到含有细胞的石蜡包埋块;然后进行二次包埋,用石蜡包埋1小时,降温,待石蜡凝固即可。
按照上述步骤制备其余3种样本细胞。
利用石蜡提取试剂盒(天根石蜡包埋组织提取试剂盒DP331,天根生化科技(北京)有限公司)对制备的细胞石蜡切片进行核算提取,获取各混合的DNA,做好标记,以备使用。
3.检测反应:采用B-raf检测试剂盒,所述试剂盒包括Real-TimePCRMasterMixture和B-raf基因突变引物探针混合液,取Real-TimePCRMasterMixture12.5μl,B-raf基因突变引物探针混合液4.5μl配制成反应体系,再加入灭菌双蒸水6μl,然后加入2.0μl待检模板。
每批次反应均设置阴性质控(H2O)。
反应条件:94℃,4分钟;94℃,15秒;60℃,35秒,40个循环。
采用steponeplus荧光定量PCR仪,荧光信号收集时设定为FAM荧光素,荧光信号收集设在60℃。
4.结果判断:依次确定各反应管突变Ct值(CtM)和外控Ct值(CtW),计算各管的△Ct值(CtM-CtW),根据突变比例的不同,可将检测结果分为阴性(或低于试剂盒检测下限:0%-1%突变)、阳性(5%-100%突变)。
利用上述方法对制备的20%突变比例及50%突变比例的细胞混合物的石蜡切片,纯突变以及无突变石蜡切片,共计4份样本进行检测,结果如图1所示,测序结果如图2-1、2-2、2-3、2-4所示。
其中,无B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK293V的样本检测结果△Ct值(CtM-CtW)大于8,其余组的均小于8,符合预期实验结果要求。
在样品制备3个月后,进行同样实验,即对上述4份样本进行检测,结果如图3所示。
其中,无B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK293V的样本检测结果△Ct值(CtM-CtW)大于8,其余组的均小于8,符合预期实验结果要求,同时,本次检测结果与三个月前结果比较,无明显ct值的变化,证实稳定性较好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种细胞源性质控品的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)、细胞的准备
1)细胞的复苏:从液氮罐中取出对应细胞冻存管,放入备好的42℃温水中快速摇动,直至管中的液体恢复常温;于超净台中将冻存管用质量百分含量75%酒精擦拭消毒后,打开盖子,用吸管将细胞悬液注入离心管中,再滴加5mL培养液,在1500r/min速度下离心5分钟,弃去上层液,加入培养液后接种于培养皿中,置37℃温箱静置培养;
2)细胞传代培养:于超净台中取复苏的培养细胞,吸去培养皿中的培养液,沿皿壁加入2mL的1×PBS清洗细胞,吸去PBS,再用PBS清洗一次;
向培养皿中加入0.5mL的质量百分含量为0.25%胰酶,摇晃培养皿使胰酶与皿底细胞充分接触消化,1min后吸去胰酶,于显微镜下观察细胞状态,至细胞基本恢复圆滑状态;
向培养皿中加入3mL培养液,用移液器将皿底细胞来回吹打混匀,显微镜下观察细胞浓度,视细胞浓度向另一培养皿中加入600~1500μl的细胞悬浮液,并加入3mL培养液,用移液器轻轻吹打混匀,显微镜下观察细胞密度;
置37℃温箱静置培养,观察生长情况;
3)细胞的收集:贴壁生长于培养皿中的细胞,用胰酶消化完全后直接回收到离心管中,收集完毕的细胞放在0℃冰箱保存;
(2)、细胞的石蜡包埋
1)细胞收集:将培养出的已经计数好的细胞收集于离心管中,1500r/min离心5分钟,弃上清;
2)细胞固定:向离心管中加入质量百分含量10%的中性福尔马林,摇匀后斜放在4度冰箱中固定60分钟,然后1500r/min离心5分钟,弃上清;加入适量PBS清洗一次,1500r/min离心5分钟,弃上清,保留少许PBS以用作混匀细胞;
3)细胞脱水:按照乙醇浓度从低到高的梯度进行,每步脱水完成时1500r/min离心5分钟,弃上清:50%乙醇30分钟;
70%乙醇30分钟;85%乙醇30分钟;95%乙醇30分钟;100%乙醇20分钟;100%乙醇20分钟;
4)石蜡包埋:在62℃环境下于通风橱中进行操作,具体操作如下:1/2体积的二甲苯加1/2体积的石蜡30分钟,吸去二甲苯及石蜡;完全石蜡1小时,对细胞进行初步包埋,待石蜡冷却后对包埋的细胞块进行修剪,得到含有细胞的石蜡包埋块;然后进行二次包埋,用石蜡包埋1小时,降温,待石蜡凝固即可。
2.如权利要求1所述的细胞源性质控品的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中2)细胞传代培养和3)细胞的收集之间还包括细胞的冻存,具体步骤如下:
配制冻存液:按如下体积比例DMEM:FBS:DMSO=7:2:1来配制冻存液,将细胞培养液、PBS、胰蛋白酶和冻存液温浴到37℃;
冻存时的细胞要生长状态好、生长旺的细胞,用细胞传代方法消化细胞,用适量细胞培养液终止消化,重悬细胞;室温200g离心10分钟收集细胞,用冻存液重悬细胞,并调节浓度至约1×106个细胞,4℃30min,转到-20℃30min,再在-80℃过夜;将细胞转入液氮中。
3.如权利要求1所述的细胞源性质控品的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中3)细胞脱水和4)石蜡包埋之间还包括:细胞透明,具体过程如下:用二甲苯逐步替代掉无水乙醇,在通风橱中进行,具体操作如下:先以1/2体积的无水乙醇加1/2体积的二甲苯20分钟,吸去上清;再1/3体积无水乙醇加2/3体积二甲苯20分钟,吸去上清;然后换成二甲苯20分钟,吸去二甲苯后即可进行细胞的石蜡包埋步骤。
4.如权利要求1所述的细胞源质控品的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中的3)细胞的收集,具体为:贴壁生长于培养皿中的细胞,在用胰酶消化完全后可加入PBS,然后直接回收到离心管中。
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