CN105177124A - 一种细胞源性质控品的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞系质控品制备方法，具体讲，涉及一种细胞源性质控品的制备方法。所述制备方法包括如下步骤：细胞的准备和细胞的石蜡包埋；其中，细胞的准备包括细胞的复苏、细胞传代培养和细胞的收集；细胞的石蜡包埋包括细胞收集、细胞固定、细胞脱水、石蜡包埋。所述制备方法是直接用含有相关基因片段的细胞来制备质控品，其质控品本身就是来源于含有相同突变的肿瘤细胞，和样本的来源相同，其与要检测的样本本身同源性更好，与样本更接近，使得检测结果更具有说服力，适合于大范围推广。

Description

一种细胞源性质控品的制备方法
技术领域
本发明涉及细胞系质控品制备方法，具体讲，涉及一种细胞源性质控品的制备方法及其应用。
背景技术
随着生物技术及分子生物学的发展，各种疾病诊断试剂盒也越来越多，随着技术的成熟，其中的质控品部分是检测试剂盒非常重要的组成部分，特别是定量检测试剂盒。目前市面上的试剂盒质控品主要使用的是质粒，质粒适用范围广，几乎所有的基因检测类试剂盒质控品均可选择使用质粒。但是质粒制备不仅过程繁琐，而且需要在-20℃下低温储存，随着冻融次数增加，降解情况严重，稳定性不好，给试剂盒质控带来诸多不便；同时质粒作为一种质控品，与待检样本同源性存在较大差异，特别是一些需要定量检测的产品，用质粒进行定量不具有说服力；并且对于不同批次间的产品，也会由于质粒的生产时间不同而导致检测结果的不同，给疾病检测带来诸多不便。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明提供一种细胞源性质控品的制备方法；
本发明提供一种细胞源性质控品在肿瘤基因突变检测中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：一种细胞源质控品的制备方法，包括如下步骤：
(1)、细胞的准备
1)细胞的复苏：提前备好42℃的温水，按要求从液氮罐中取出对应细胞冻存管，立即放入备好的温水中快速摇动，直至管中的液体恢复常温。于超净台中将冻存管用质量百分含量75％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加5mL培养液。在1500r/min速度下离心5分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养皿中，置37℃温箱静置培养。观察生长情况，若细胞密度较高，几乎全部铺满皿底时及时进行传代。培养过程中严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败；
2)细胞传代培养：本步骤须在超净台中操作。取生长适宜的培养细胞，吸去培养皿中的培养液，沿皿壁加入2mL(视培养皿大小加入适量即可)的1xPBS轻轻清洗细胞，吸去PBS；再用PBS再清洗一次；
向培养皿中加入0.5mL的质量百分含量为0.25％胰酶，轻轻摇晃培养皿使胰酶与皿底细胞充分接触消化，1min后吸去胰酶，于显微镜下观察细胞状态，若细胞基本恢复圆滑状态，即可进行下一步操作，若还有贴壁情况，则继续消化直至细胞变得圆滑。注意胰酶消化时间过短过长都不好，过短消化不完全，过长可能对细胞膜造成一定损伤，都不利于细胞的继续传代；
向培养皿中加入3mL培养液(视培养大小加入适量即可)，用移液器将皿底细胞轻轻来回吹打混匀，显微镜下观察细胞浓度，视细胞浓度向另一培养皿中加入600～1500μl的细胞悬浮液，并加入3mL培养液，用移液器轻轻吹打混匀，显微镜下观察细胞密度。注意步骤中的培养液及细胞悬浮液均可根据实际情况进行变动；
置37℃温箱静置培养。观察生长情况，若细胞密度较高，几乎全部铺满皿底时及时进行传代；
3)细胞的收集：贴壁生长于培养皿中的细胞，当需要收集时，在用胰酶消化完全后可加入适量PBS，然后直接回收到离心管中。或者不加PBS直接收集胰酶消化的细胞。收集完毕的细胞可暂时放在0℃冰箱保存，长时间不用的细胞最好保存在-80℃冰箱中备用；
(2)、细胞的石蜡包埋
1)细胞收集：将培养出的已经计数好的细胞收集于离心管中，1500r/min离心5分钟，弃上清；
2)细胞固定：向离心管中加入适量的质量百分含量10％的中性福尔马林，摇匀后斜放在4度冰箱中固定60分钟，然后1500r/min离心5分钟，弃上清；加入适量PBS清洗一次，1500r/min离心5分钟，弃上清，保留少许PBS以用作混匀细胞；
3)细胞脱水：按照乙醇浓度从低到高的梯度进行，每步脱水完成时1500r/min离心5分钟，弃上清：50％乙醇30分钟；
70％乙醇30分钟；85％乙醇30分钟；95％乙醇30分钟；100％乙醇20分钟；100％乙醇20分钟；
4)石蜡包埋：在62℃环境下于通风橱中进行操作，具体操作如下：1/2体积二甲苯加1/2体积的石蜡30分钟，吸去二甲苯及石蜡；完全石蜡1小时，对细胞进行初步包埋，待石蜡冷却后对包埋的细胞块进行修剪，得到含有细胞的石蜡包埋块；然后进行二次包埋，用石蜡包埋1小时，降温，待石蜡凝固即可。
作为本发明的优选方案，所述步骤(1)中2)细胞传代培养和3)细胞的收集之间还包括细胞的冻存，具体步骤如下：
配制冻存液：按如下体积比例DMEM:FBS:DMSO＝7:2:1来配制冻存液。(一定要现配现用)将细胞培养液、PBS、胰蛋白酶和冻存液温浴到37℃。
冻存时的细胞要生长状态好、生长旺的细胞(最好在第3或者4带时冻存)，用细胞传代方法消化细胞，用适量细胞培养液终止消化，重悬细胞。室温200g离心10分钟收集细胞，用冻存液重悬细胞，并调节浓度至约1x106个细胞，4℃30min，转到-20℃30min，再在-80℃过夜；将细胞转入液氮中。
作为本发明的优选方案，所述步骤(2)中3)细胞脱水和4)石蜡包埋之间还包括：细胞透明，具体过程如下：用二甲苯逐步替代掉无水乙醇，在通风橱中进行，具体操作如下：先以1/2体积的无水乙醇加1/2体积的二甲苯20分钟，吸去上清；再1/3体积无水乙醇加2/3体积二甲苯20分钟，吸去上清；然后换做二甲苯20分钟，吸去二甲苯后即可进行细胞的石蜡包埋步骤。
采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
(1)本制备方法是直接用含有相关基因片段的细胞来制备质控品，其质控品本身就是来源于含有相同突变的肿瘤细胞，和样本的来源相同，其与要检测的样本本身同源性更好，与样本更接近，使得检测结果更具有说服力，适合于大范围推广；
(2)将细胞制备成石蜡切片，其储存方便，与质粒易降解相比稳定性更好，同时可与样本同时提取，与样本有着同样的操作过程，相较于质粒，减小了实验过程中的误差以及对突变检测结果的影响；
(3)此制备方法制备的细胞源性质控品适合于所有肿瘤突变检测，只要有相关的肿瘤细胞，即可进行相关检测对应的质控品，有利于提高肿瘤突变检测的准确性，更完美的配合肿瘤疾病的治疗。
附图说明
图1为采用荧光定量PCR仪检B-raf基因突变细胞源性质控品得到的曲线；
图2-1为B-raf基因20％突变比例测序结果；
图2-2为B-raf基因50％突变比例测序结果；
图2-3为B-raf基因纯突变比例测序结果；
图2-4为B-raf基因无突变比例测序结果；
图3为B-raf基因突变细胞源性质控品石蜡切片放置3个月后的检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图对本发明做进一步解释说明。
B-raf基因突变细胞源性质控品的制备
1.细胞的准备：针对B-raf基因突变选择肿瘤细胞株人恶性黑色素瘤细胞A375以及无B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK293V。
(1)细胞的复苏：提前备好42℃的温水，按要求从液氮罐中取出肿瘤细胞株人恶性黑色素瘤细胞A375以及无B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK293V，立即放入备好的温水中快速摇动，直至管中的液体恢复常温。于超净台中将冻存管用75％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液分别注入离心管中，再滴加5mL培养液。在1500r/min速度下离心5分钟，弃去上层液，将肿瘤细胞株人恶性黑色素瘤细胞A375加入到BMEM高糖培养液、将无B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK293V加入到RPMI1640培养液中，接种于培养皿中，置37℃温箱静置培养。观察生长情况，若细胞密度较高，几乎全部铺满皿底时及时进行传代。
(2)细胞传代培养：本步骤须在超净台中操作。分别取生长适宜的肿瘤细胞株人恶性黑色素瘤细胞A375以及无B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK293V，吸去培养皿中的培养液，沿皿壁加入2mL(视培养皿大小加入适量即可)的1xPBS轻轻清洗细胞，吸去PBS；再用PBS再清洗一次；
向培养皿中分别加入0.5mL的质量百分含量为0.25％的胰酶，轻轻摇晃培养皿使胰酶与皿底细胞充分接触消化，1min后吸去胰酶，于显微镜下观察细胞状态，若细胞基本恢复圆滑状态，即可进行下一步操作，若还有贴壁情况，则继续消化直至细胞变得圆滑。
分别向培养皿中加入3mL对应的培养液(视培养大小加入适量即可)，用移液器将皿底细胞轻轻来回吹打混匀，显微镜下观察细胞浓度，视细胞浓度向另一培养皿中加入600～1500μl的细胞悬浮液，并加入3mL对应的培养液，用移液器轻轻吹打混匀，显微镜下观察细胞密度。
置37℃温箱静置培养。观察生长情况，若细胞密度较高，几乎全部铺满皿底时及时进行传代。
(3)细胞的收集：贴壁生长于培养皿中的细胞，在用胰酶消化完全后可加入适量PBS，然后直接回收到离心管中，获取足够多的细胞并进行细胞计数以备实验使用。
2.细胞石蜡包埋：
共计4份样本细胞，分别如下：
将B-raf基因突变选择肿瘤细胞株人恶性黑色素瘤细胞A375与无B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK293V按照1：4混合，得到20％突变比例的细胞混合液；
将B-raf基因突变选择肿瘤细胞株人恶性黑色素瘤细胞A375与无B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK293V按照1：1混合，得到50％突变比例的细胞混合液；
B-raf基因突变选择肿瘤细胞株人恶性黑色素瘤细胞A375的细胞液；
无B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK293V的细胞液。
下边以无B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK293V为例，按照石蜡包埋的步骤，从细胞的收集，固定，细胞脱水，细胞透明，细胞的石蜡包埋步骤，完成细胞的石蜡包埋步骤，具体介绍如下：
(1)细胞收集：将培养出的已经计数好的细胞收集于离心管中，1500r/min离心5分钟，弃上清。
(2)细胞固定：向离心管中加入适量的10％的中性福尔马林，摇匀后斜放在4度冰箱中固定60分钟，然后1500r/min离心5分钟，弃上清；加入适量PBS清洗一次，1500r/min离心5分钟，弃上清，保留少许PBS以用作混匀细胞。
(3)细胞脱水：按照乙醇浓度从低到高的梯度进行，每步脱水完成时1500r/min离心5分钟，弃上清：50％乙醇30分钟；
70％乙醇30分钟；85％乙醇30分钟；95％乙醇30分钟；100％乙醇20分钟；100％乙醇20分钟。
(4)细胞透明：用二甲苯逐步替代掉无水乙醇，在通风橱中进行，具体操作如下：先以1/2的无水乙醇加1/2的二甲苯20分钟，吸去上清；再1/3无水乙醇加2/3二甲苯20分钟，吸去上清；然后换成二甲苯20分钟，吸去二甲苯后即可进行细胞的石蜡包埋步骤。
(5)石蜡包埋：用石蜡逐步替代二甲苯，在62℃环境下于通风橱中进行操作，具体操作如下：1/2二甲苯加1/2的石蜡30分钟，吸去二甲苯及石蜡；完全石蜡1小时，对细胞进行初步包埋，待石蜡冷却后对包埋的细胞块进行修剪，得到含有细胞的石蜡包埋块；然后进行二次包埋，用石蜡包埋1小时，降温，待石蜡凝固即可。
按照上述步骤制备其余3种样本细胞。
利用石蜡提取试剂盒(天根石蜡包埋组织提取试剂盒DP331，天根生化科技(北京)有限公司)对制备的细胞石蜡切片进行核算提取，获取各混合的DNA，做好标记，以备使用。
3.检测反应：采用B-raf检测试剂盒，所述试剂盒包括Real-TimePCRMasterMixture和B-raf基因突变引物探针混合液，取Real-TimePCRMasterMixture12.5μl，B-raf基因突变引物探针混合液4.5μl配制成反应体系，再加入灭菌双蒸水6μl，然后加入2.0μl待检模板。
每批次反应均设置阴性质控(H2O)。
反应条件：94℃，4分钟；94℃，15秒；60℃，35秒，40个循环。
采用steponeplus荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为FAM荧光素，荧光信号收集设在60℃。
4.结果判断：依次确定各反应管突变Ct值(CtM)和外控Ct值(CtW)，计算各管的△Ct值(CtM-CtW)，根据突变比例的不同，可将检测结果分为阴性(或低于试剂盒检测下限：0％-1％突变)、阳性(5％-100％突变)。
利用上述方法对制备的20％突变比例及50％突变比例的细胞混合物的石蜡切片，纯突变以及无突变石蜡切片，共计4份样本进行检测，结果如图1所示，测序结果如图2-1、2-2、2-3、2-4所示。
其中，无B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK293V的样本检测结果△Ct值(CtM-CtW)大于8，其余组的均小于8，符合预期实验结果要求。
在样品制备3个月后，进行同样实验，即对上述4份样本进行检测，结果如图3所示。
其中，无B-raf基因突变的细胞株人胚肾细胞HEK293V的样本检测结果△Ct值(CtM-CtW)大于8，其余组的均小于8，符合预期实验结果要求，同时，本次检测结果与三个月前结果比较，无明显ct值的变化，证实稳定性较好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种细胞源性质控品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、细胞的准备
1)细胞的复苏：从液氮罐中取出对应细胞冻存管，放入备好的42℃温水中快速摇动，直至管中的液体恢复常温；于超净台中将冻存管用质量百分含量75％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加5mL培养液，在1500r/min速度下离心5分钟，弃去上层液，加入培养液后接种于培养皿中，置37℃温箱静置培养；
2)细胞传代培养：于超净台中取复苏的培养细胞，吸去培养皿中的培养液，沿皿壁加入2mL的1×PBS清洗细胞，吸去PBS，再用PBS清洗一次；
向培养皿中加入0.5mL的质量百分含量为0.25％胰酶，摇晃培养皿使胰酶与皿底细胞充分接触消化，1min后吸去胰酶，于显微镜下观察细胞状态，至细胞基本恢复圆滑状态；
向培养皿中加入3mL培养液，用移液器将皿底细胞来回吹打混匀，显微镜下观察细胞浓度，视细胞浓度向另一培养皿中加入600～1500μl的细胞悬浮液，并加入3mL培养液，用移液器轻轻吹打混匀，显微镜下观察细胞密度；
置37℃温箱静置培养，观察生长情况；
3)细胞的收集：贴壁生长于培养皿中的细胞，用胰酶消化完全后直接回收到离心管中，收集完毕的细胞放在0℃冰箱保存；
(2)、细胞的石蜡包埋
1)细胞收集：将培养出的已经计数好的细胞收集于离心管中，1500r/min离心5分钟，弃上清；
2)细胞固定：向离心管中加入质量百分含量10％的中性福尔马林，摇匀后斜放在4度冰箱中固定60分钟，然后1500r/min离心5分钟，弃上清；加入适量PBS清洗一次，1500r/min离心5分钟，弃上清，保留少许PBS以用作混匀细胞；
3)细胞脱水：按照乙醇浓度从低到高的梯度进行，每步脱水完成时1500r/min离心5分钟，弃上清：50％乙醇30分钟；
70％乙醇30分钟；85％乙醇30分钟；95％乙醇30分钟；100％乙醇20分钟；100％乙醇20分钟；
4)石蜡包埋：在62℃环境下于通风橱中进行操作，具体操作如下：1/2体积的二甲苯加1/2体积的石蜡30分钟，吸去二甲苯及石蜡；完全石蜡1小时，对细胞进行初步包埋，待石蜡冷却后对包埋的细胞块进行修剪，得到含有细胞的石蜡包埋块；然后进行二次包埋，用石蜡包埋1小时，降温，待石蜡凝固即可。
2.如权利要求1所述的细胞源性质控品的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中2)细胞传代培养和3)细胞的收集之间还包括细胞的冻存，具体步骤如下：
配制冻存液：按如下体积比例DMEM:FBS:DMSO＝7:2:1来配制冻存液，将细胞培养液、PBS、胰蛋白酶和冻存液温浴到37℃；
冻存时的细胞要生长状态好、生长旺的细胞，用细胞传代方法消化细胞，用适量细胞培养液终止消化，重悬细胞；室温200g离心10分钟收集细胞，用冻存液重悬细胞，并调节浓度至约1×106个细胞，4℃30min，转到-20℃30min，再在-80℃过夜；将细胞转入液氮中。
3.如权利要求1所述的细胞源性质控品的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中3)细胞脱水和4)石蜡包埋之间还包括：细胞透明，具体过程如下：用二甲苯逐步替代掉无水乙醇，在通风橱中进行，具体操作如下：先以1/2体积的无水乙醇加1/2体积的二甲苯20分钟，吸去上清；再1/3体积无水乙醇加2/3体积二甲苯20分钟，吸去上清；然后换成二甲苯20分钟，吸去二甲苯后即可进行细胞的石蜡包埋步骤。
4.如权利要求1所述的细胞源质控品的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的3)细胞的收集，具体为：贴壁生长于培养皿中的细胞，在用胰酶消化完全后可加入PBS，然后直接回收到离心管中。
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